合成的hiv基因的制作方法

專利名稱：合成的hiv基因的制作方法
相關申請的相互參照這是于1996年2月22日申請的美國序號60/012,082相關的非臨時申請。關于聯邦資助的R&D的聲明不適用微縮膠片附錄的參照不適用發明領域HIV疫苗發明背景1．HIV感染人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)是獲得性人類免疫缺陷綜合癥(AIDS)和相關失調的致病劑。HIV是逆轉錄病毒家族的一種RNA病毒，并表現出所有逆轉錄病毒的5’LTR-gag-pol-env-LTR3’結構。另外，HIV-1包含少數具有調節或未知功能的基因，包括tat和REV基因。env基因編碼病毒被膜糖蛋白，這種糖蛋白作為160千道爾頓(kDa)的前體(gp160)翻譯，然后被細胞蛋白酶酶切，產生外部120-kDa被膜糖蛋白(gp120)和跨膜41-kDa被膜糖蛋白(gp41)。gp120和gp41保持相連并且呈現在病毒顆粒和HIV感染的細胞表面上。gp120與存在于輔助T-淋巴細胞、巨噬細胞和其它靶細胞表面上的CD4受體結合。gp120與CD4結合后，gp41介導負責病毒侵入的融合事件。
當病毒粒子上的gp120與T4淋巴細胞或其它靶細胞表面上的CD4受體結合時，感染開始。結合的病毒與靶細胞融合，并逆轉錄它的RNA基因組到細胞的的雙鏈DNA中。病毒DNA被整合到細胞核的遺傳物質中，在那里病毒DNA指導新病毒RNA、病毒蛋白質和新病毒粒子的產生。新粒子從靶細胞膜上芽生，并感染其它細胞。
對免疫防御很關鍵的T淋巴細胞的破壞是作為HIV感染標志的進行性免疫機能障礙的主要原因。靶細胞的喪失嚴重地損壞了機體對大部分侵入者的抵抗能力，但它對于針對病毒、真菌、寄生蟲和包括分枝桿菌的某些細菌的防御有特別嚴重的影響。
HIV-1通過復制、從細胞中芽生和損壞細胞膜殺傷它感染的細胞。HIV可能間接地利用呈現在被感染細胞表面上的病毒gp120來殺傷靶細胞。因為T細胞上的CD4受體對gp120有強的親合力，表達CD4受體的健康細胞可以結合gp120，并與被感染細胞融合形成合胞體。合胞體不能存活。
HIV還能引起針對被感染細胞的正常細胞免疫防御。有或沒有抗體的協助，細胞毒性的防御細胞都能夠破壞在其表面呈現病毒蛋白質的被感染細胞。最后，游離的gp120能在感染有HIV的個體的血液中循環。游離的蛋白質能結合到未感染細胞的CD4受體上，使它們看來似乎被感染，因此引起免疫應答。
HIV-1感染幾乎都是致命的，目前還沒有HIV-1感染的治療方法。也沒有得到預防HIV-1感染的有效疫苗。活的減毒病毒因為有回復或感染的危險，不能作為疫苗使用。大多數亞單位疫苗方法尚未成功地預防HIV感染。對于HIV感染的治療，盡管延長一些被感染的人的生命，但有嚴重的副作用。因此很需要有效的治療和疫苗，來與這種致命的感染作斗爭。2．疫苗接種疫苗是疾病預防的一種有效形式，并已證明能成功地抵抗幾種類型的病毒感染。決定把HIV-1抗原提呈給人免疫系統以便引起保護性體液免疫和細胞免疫的方法是一項困難的工作。到目前為止，試圖生產有效的HIV疫苗還未成功。在AIDS病人中，游離的病毒僅以低水平出現。HIV-1的傳染被通過融合和合胞體形成的細胞與細胞的相互作用所加強。因此，針對游離病毒或病毒亞基所產生的抗體一般對消除病毒感染的細胞無效。
疫苗利用機體的“記憶”抗原的能力。第一次與給定的抗原相遇后，免疫系統就產生在個體的一生中保持該抗原免疫學記憶的細胞。以后接觸該抗原就刺激免疫應答，并導致消除或滅活該病原體。
免疫系統以兩種方式對付病原體通過體液應答和通過細胞-介導的應答。在體液應答中，淋巴細胞產生與該抗原結合的專一性抗體，由此使病原體失活。細胞介導的應答涉及細胞毒性和專一性攻擊和消滅被感染細胞的協助T淋巴細胞。
用HIV-1病毒研制的疫苗存在一些問題，因為HIV-1感染一些在免疫系統中疫苗需要激活的相同的細胞(如T4淋巴細胞)。研制在免疫系統損害發生之前使HIV失活的疫苗是有益的。特別合適的一類型的HIV疫苗能產生識別HIV變異體的抗-HIV免疫應答，該免疫應答在處于感染開始時的HIV-陽性個體中起作用。
研制針對病毒的疫苗的主要挑戰是在不同的病毒分離物或毒株中的病毒被膜蛋白的多樣性；特別是那些具有高突變率的病毒，例如人類免疫缺陷病毒，針對這種病毒誘出中和性和保護性免疫應答是合乎需要的。因為在小鼠和人類中的細胞毒性的T-淋巴細胞(CTL)能夠識別得自保守的內部病毒蛋白質的抗原決定基，被認為在針對病毒的免疫應答中是重要的，因此已做了研制能夠提供針對不同病毒株的異源性保護的CTL疫苗的努力。
已經知道CD8+CTL當其T細胞受體識別與MHCⅠ型分子相結合的病毒肽時，殺傷病毒感染的細胞。這些病毒肽得自內源性合成的病毒蛋白質，與該蛋白質在病毒中的定位或功能無關。這樣，CTL通過識別來自保守的病毒蛋白的抗原決定基，可提供交叉毒株保護。能夠與用于CTL識別的MHCⅠ型結合的肽來源于存在于或穿過細胞質或內質網的蛋白質，一般來說，進入核內體加工途徑的外源性蛋白質(如在由MHCⅡ型分子呈遞的抗原的情況下)在產生CD8+CTL應答中無效。
產生CTL應答的大多數嘗試已用復制型載體在細胞內產生蛋白質抗原，或這些嘗試集中于將肽導入細胞胞質中。這些方法有一些限制，可減低它們作為疫苗的實用性。逆轉錄病毒載體在可以作為融合蛋白表達而同時保持重組體病毒復制能力的多肽的大小和結構上有限制，用于后續免疫接種的載體(例如牛痘)效力可被針對所述載體本身的免疫應答所損害。另外，病毒載體和修飾的病原體有在人類中阻礙其用途的固有的風險。此外，呈現出來的抗原決定基的選擇依賴于個體的MHC抗原的結構，因此，由于在遠系繁殖的群體中MHC單倍型的多樣性，肽疫苗可能具有有限的功效。3．DNA疫苗Benvenisty,N.和Reshf.L(PNAS 83,9551-9555,(1986))顯示腹膜內(i.p.)、靜脈內(i.v)或肌內(i.m.)導入小鼠中的CaCl2-沉淀的DNA能夠被表達。在鼠中i.m.注射不用CaCl2處理的DNA表達載體導致肌肉細胞攝取DNA，并表達該DNA所編碼的蛋白質。該質粒以附加體形式保持并且不復制。隨后，在大鼠、魚和靈長類骨骼肌和大鼠的心肌內i.m.注射后，已經觀察到持續的表達。用核酸作為治療劑的技術已在WO90/11092(1990年10月4日)中報道，其中裸露的多核苷酸用來接種脊椎動物。
肌內免疫方法的成功不是必須的。將覆蓋有編碼牛生長激素(BGH)的DNA的金微彈導入小鼠皮膚中，導致鼠中抗-BGH抗體的產生。噴射注射器已用來轉染活動物的皮膚、肌肉、脂肪和乳房組織。導入核的不同方法已有綜述。Zhu顯示了在小鼠中靜脈內注射DNA陽離子脂質體復合物(Science 261:209-211(1993年7月9日)產生克隆的轉移基因的系統表達。Ulmer等(Science 259:1745-1749,(1993))報道了通過肌肉內注射編碼病毒蛋白的DNA異源性保護抵抗流感病毒感染。
本發明滿足對能夠引起對病原體和腫瘤抗原所需免疫應答的專一性治療劑和預防劑的需要。在這種治療方法中特別重要的是誘導T細胞免疫應答的能力，這種免疫應答可以預防感染或甚至由與獲取該抗原基因的毒株異源的病毒毒株引起的疾病。當處理HIV時，這是特別需考慮的，因為這種病毒已被認為能快速突變，并已鑒定了許多毒性分離物(見例如LaRosa等Science 249:932-935(1990)，鑒定245個獨立的HIV分離物)。為了響應這種識別的多樣性，研究者們已試圖產生基于肽免疫的CTL。因此，Takahashi等(Science 255:333-336(1992))報道了誘導識別HIV被膜(gp160)決定簇的廣譜交叉反應細胞毒性的T細胞。然而，那些工作者認識到在達到真正的交叉反應性CTL反應的困難，并提示在非常嚴格的引發或重刺激T細胞和引起包括來自已刺激的CTL的細胞毒性在內的效應物功能之間有二叉分枝。
Wang等報道了通過肌肉內接種克隆的基因組(未剪接型)HIV基因，引起小鼠中針對HIV的免疫應答。然而，在這些研究中得到的免疫應答水平是很低的。另外，Wang等的DNA構成物利用編碼鄰接Ta+/REV-gp/160-Tat/REV編碼序列的HIV必需基因組片段。如在下面詳細描述的，有一獲取高水平表達gp160的次優系統。這也是一潛在的危險，因為Tat的表達有助于Kaposis氏肉瘤的發展。
WO93/17706描述用于針對病毒給動物接種疫苗的方法，其中載體粒子包有基因構成物，并且將包被粒子加速到動物的細胞中。對于HIV，建議使用失去長末端重復片段的基本上整個基因。這個方法指出了接受者的實質風險。一般認為HIV構成物應包含少于大約50％的HIV基因，以保證疫苗的安全；這保證已消除酶部分和病毒調節蛋白質，它們中的許多其功能是未知或了解很少。這樣，如果由該基因傳遞技術生產出有用的人類HIV疫苗，尚存在許多問題。
本發明設想將多核苷酸導入活體組織中來誘導蛋白質表達的任何已知的方法。然而，本發明提供了一新型免疫原，用于將HIV和其它蛋白質導入抗原加工途徑中，以有效地產生HIV-專一性CTL和抗體。作為誘導細胞和體液抗-HIV和HIV中和免疫應答的疫苗，在藥物學上是有效的。在本發明中，談到前面所提到的問題，并通過提供多核苷酸免疫原來解決，這種免疫原當被導入動物體時，指導HIV蛋白和抗原決定基的有效表達，而沒有與那些方法有關的相伴的風險。這樣產生的免疫應答對識別HIV、抑制HIV的復制、鑒別和殺傷被HIV感染的細胞是有效的，并對許多HIV毒株為交叉反應性的。4．密碼子用法和密碼子上下文有機體的密碼子配對是高度非隨機的，并從有機體到有機體不同，這一信息已用來構建和表達具有所需水平翻譯效率的改變的和合成的基因、決定基因組的哪一區域是蛋白編碼區、將翻譯中止位點導入異源性基因上和確定核苷酸序列的關系或祖先起源。
在轉化的有機體中外來的異源基因的表達現在已是常事。大量的哺乳動物基因包括例如鼠和人類的基因已被成功地插入到單細胞有機體中。這方面的標準技術包括待表達的外來基因導入例如質粒或噬菌體的載體中，并利用這種載體將該基因插入到有機體中。這類基因的天然啟動子通常用與該基因所插入到的宿主相容的強啟動子所取代。蛋白質測序儀能夠闡明甚至是極小量的天然蛋白質的氨基酸序列。從這些氨基酸序列可推斷編碼這些蛋白質的DNA序列。DNA合成也是一快速發展的技術。能容易地構建對應于這些推斷的DNA序列的合成基因。
盡管有高速增長的表達系統和重組DNA的知識，但當人們試圖在有機體中表達異種或合成基因時，仍存在很大的阻礙，許多天然的活性蛋白質例如以不同于它們在異種宿主中表達時出現的形式糖基化。因為這一原因，對于表達許多哺乳動物基因，例如酵母的真核生物宿主可能優于細菌宿主。糖基化的問題是繼續研究的課題。
另一個問題了解的更少。通常合成基因甚至當與一強啟動子偶聯時，其翻譯進行的效率比所期望的低得多。非表達有機體原有的外源基因通常也是如此。甚至當該基因以生產可回收量翻譯產物的充分有效的方式轉錄時，該蛋白質通常為無活性的或在性質上不同于天然蛋白質。
已經認識到后一個問題通常是由于不同有機體中蛋白質折疊的差異。這一問題的解釋是難以理解的，而且對控制蛋白質折疊的機制知之甚少。
與翻譯效率相關的問題被認為是與密碼字上下文作用有關聯的。在所有有機體中基因的蛋白編碼區受到很多種功能上的限制，其中的一些限制取決于編碼合適功能的蛋白質的需求和適宜的翻譯起始和終止信號。然而，已分辨出蛋白編碼區的幾個特征，按照這些限制因素不容易理解這些特征。這些特征的兩個重要類型是涉及密碼子用法和密碼子上下文的那些特征。
已經知道在不同有機體之間密碼子利用是有高度傾向性的，并且變異相當大。已經顯示密碼子用法的類型是與tRNA同工受體的相對豐度相關連的。高與低豐度的編碼蛋白質的基因在它們的密碼子傾向性上顯示了差異。已廣泛討論了密碼子用法的傾向性改變肽延伸速率的可能性。盡管密碼子用法的差異是與翻譯速率上的差異相關聯的，但要證實密碼子選擇對翻譯的直接作用是困難的。其它已提出的密碼子用法類型上的限制包括把翻譯的可靠性增加到最大程度和使蛋白質合成的動力學效率最佳化。
除密碼子的非隨機用法外，已積累了相當多的證據證明密碼子/反密碼子識別是受該密碼子本身之外的序列影響的，即稱為“密碼子上下文”的現象。鄰近的核苷酸對無義密碼子和錯義密碼子的抑制效率存在強烈的影響。顯然，天然細菌群體中抑制基因活性的豐度和編碼硒代胱氨酸和磷酸絲氨酸“終止”密碼子的使用需要終止為上下文依賴性的。已經顯示了類似的上下文效應影響翻譯的可靠性和翻譯起始的效率。
大腸桿菌蛋白編碼區的統計分析表明了另一種“密碼子上下文”形式。在一位置的特定密碼子的存在強烈地影響鄰近密碼子的某些核苷酸同時出現的頻率，這些上下文的限制在高水平和低水平表達的基因中差異很大。盡管已認識到上下文效應，但與鄰近密碼子的優選核苷酸相聯系的統計規律的預計值是相對低的。這就限制了選擇密碼子以達到所需水平翻譯效率的這些核苷酸選擇數據的實用性。
自動化核苷酸序列儀的出現已使得得到許多種有機體的大量序列數據。弄懂這些數據存在實際的困難。例如，為了將該遺傳序列數據與蛋白序列聯系起來而鑒定該基因組的編碼區是很重要的。另外，某些有機體基因組的祖先是有實質價值。已知一些有機體的基因組是來自混合祖先的。在起源上是病毒的一些序列現在已穩定地整合到真核有機體的基因組中。這些病毒序列本身可能起源于另外實質不相關連的物種。了解基因的祖先對獲取相關基因和它們在其它有機體中的翻譯產物之間的合適相似性可能是重要的。
需要更好地了解密碼子上下文對翻譯的作用和確定任何所需的翻譯作用合適的密碼子的方法。也需要用于鑒定來自核苷酸序列數據的該基因組編碼區的方法。還需要用于控制蛋白質折疊和保證當異種基因在宿主中表達時異種基因合適地折疊的方法。按照所需的翻譯效率來改變或構建的基因將是非常有價值的。
用于微生物表達工業上和藥物學上有價值的蛋白質的另一方面的重組DNA技術的實踐是“密碼子優先權”現象。盡管已較早注意到用于基因表達的現存機構是遺傳轉化的宿主細胞，它將“工作”來構建給定的所需產物，但在微生物中達到的表達水平能夠受到很大的變異，這部分依賴存在于插入的外源基因中氨基酸專一化的遺傳密碼的特定選擇形式。四個可能的核苷酸堿基的“三聯體”密碼子能夠以64個變異體形式存在。這些形式為僅僅20個不同的氨基酸(還有轉錄起始和終止)提供信息，這就意味著一些氨基酸能被不止一個密碼子所編碼。的確，一些氨基酸具有多達6個“豐余的”可供選擇的密碼子，同時一些氨基酸只有單個所需的密碼子。因為不完全了解的原因，可供選擇的密碼子不都是均勻地存在于不同類型細胞的內源性DNA中，并且在某些類型的細胞中對某些密碼子似乎存在可用的天然等級制度或“優先權”。
作為一個例子，氨基酸亮氨酸被6個DNA密碼子的任何一個所指定，包括CTA、CTC、CTG、CTT、TTA和TTG(它們分別對應于mRNA密碼子CUA、CUC、CUG、CUU、UUA和UUG)。微生物的基因組密碼子頻率的完全分析揭示大腸桿菌的內源性DNA最常包含CTG亮氨酸特定性密碼子，而酵母和粘菌的DNA最常包含TTA亮氨酸特定性密碼子。考慮到這種等級制度，通常認為獲得大腸桿菌宿主高水平表達富含亮氨酸多肽的可能性將在某種程序上依賴于密碼子使用頻率。例如，富含TTA密碼子的基因很可能在大腸桿菌中表達差，而富含CTG的基因將可能高水平表達該多肽。同樣，當酵母細胞為用于表達富含亮氨酸的多肽的預定轉化宿主細胞，在插入DNA中使用的優選密碼子將是TTA。
密碼子優先權現象在重組DNA技術上的意義是顯而易見的，這種現象可用來解釋為在成功轉化的宿主有機體中獲取外源性基因的高水平表達的許多以前的失敗即較少“優選的”密碼子在插入的基因中可重復出現，用于表達的宿主細胞機構可能不能有效地運作。這個現象提示已設計成包含預定宿主細胞的優選密碼子的合成基因為重組DNA技術的實踐提供異種遺傳物質的一種優選形式。5．蛋白質運送象征真核細胞的功能多樣性依賴于它們的膜邊界結構上的差異。為了產生和保持這些結構，蛋白質必須貫穿細胞，從它們在內質網的合成部位運送到預定的目的地。這需要運送的蛋白質顯示位于主要運送通道入口點的負責通道選擇的分子機構所識別的分類信號。大部分蛋白質橫穿其生物合成途徑時，其分類決定僅需進行一次，因為它們的最終目的地，即行使其功能的細胞位置成為它們的永久居住點。
胞間完整性的維持部分依賴于蛋白質的選擇性分類和將其精確轉運到它們的正確目的地。過去的幾年，很活躍地研究了用于蛋白質導向和定位的分子機構的分析。在可以作為“地址標記”的蛋白質上已鑒定了定義的序列的基序。已發現許多分類標記是與膜蛋白的胞質結構域相聯系的。發明概述提供編碼HIV env的合成DNA分子和HIV env的修飾。該合成分子的密碼子包括預定宿主細胞的優選密碼子。該合成分子提供異種遺傳物質的優選形式。該合成分子可作為多核苷酸疫苗使用，這種疫苗通過中和抗體和細胞介導的免疫作用來提供針對HIV感染的有效的免疫預防。本發明提供多核苷酸，當這種多核苷酸直接導入包括哺乳動物(例如靈長類和人類)的脊椎動物體內時，誘導該動物中編碼蛋白質的表達。附圖簡述

圖1顯示基于HIV env盒的表達策略。
圖2表示DNA疫苗介導的抗gp120反應。
圖3表示鼠的DNA疫苗血清的抗gp120 ELISA效價。
圖4表示HIV env PNV細胞培養物轉染后，gp120的相對表達。
圖5表示tPA-gp143/optA對optB DNA接種后的普通抗gp120 ELISA反應。
圖6表示鼠的DNA疫苗血清對HIV的中和作用。
圖7顯示來自鼠HIV env DNA疫苗的血清對HIV的中和作用。
圖8是最佳化HIV env DNA構成物的免疫印跡分析。本發明的詳細描述提供編碼HIV env的合成DNA分子和編碼修飾形式的HIV env的合成DNA分子。設計所述合成分子的密碼子以便使用預定宿主細胞優選的密碼子。所述合成分子能作為多核苷酸疫苗使用，這種疫苗通過中和抗體和細胞介導的免疫作用來提供針對HIV有效的免疫預防。所述合成分子能作為免疫原組合物使用。本發明提供多核苷酸，當這種多核苷酸直接導入包括哺乳動物(如靈長類和人類)的脊椎動物體內時，誘導該動物中編碼的蛋白質的表達。
如本文中所用的，多核苷酸是一種含有調節元件的核酸組合物，使得導入活的脊椎動物細胞中時，該多核苷酸能夠指導細胞機構產生包含該多核苷酸的核酸所編碼的翻譯產物。在本發明的一實施方案中，該多核苷酸是包含至少一個在操作上與轉錄啟動子相連的HIV基因的多聚脫氧核糖核酸。在本發明的另一實施方案中，該多核苷酸疫苗(PNV)包含編碼至少一個經得起真核細胞機構(核糖體、tRNA和其它翻譯因子)翻譯檢驗的HIV基因的多聚核糖核酸。該多核苷酸編碼的蛋白質是那些在動物中除非在病理條件下出現而通常不出現的蛋白質(如異源性蛋白質)時，例如為與獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)致病劑人類免疫缺陷病毒(HIV)相關的蛋白質時，則該動物的免疫系統被激活，引起保護性免疫應答。因為這些外源性蛋白質是由該動物組織產生的，表達的蛋白質由主要組織相容性系統MHC以類似于相關生物(HIV)真正感染時的形式加工。結果就是誘導針對同種病原體的免疫應答。
本說明書的多核苷酸當導入生物系統中時，誘導HIV蛋白質與抗原決定基的表達和專一性免疫應答的產生。誘導的抗體反應是專一性針對表達的HIV蛋白質，并中和HIV。另外，誘導專一性識別和破壞HIV感染的細胞的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。
本說明書提供導入哺乳動物組織時在體內在單個細胞中誘導不連續基因產物表達的多核苷酸的使用方法。本說明書提供不需要多次操縱REV賴性HIV基因來獲得不依賴REV的基因的方法。這里描述的不依賴REV的表達系統對于它自身的機制是有用的，并且是用于證明在體內單個細胞中表達所需單個基因產物的系統。
因為本發明的許多應用運用于抗病毒接種疫苗，所述多核苷酸通常稱為核苷酸疫苗或PNV。這不是說在免疫刺激中和抗腫瘤治療中，這些多核苷酸另外的應用被認為在本發明發范圍之外。
在一實施方案中，將編碼HIV基因產物的基因加入表達載體中。該載體含有真核細胞RNA聚合酶識別的轉錄啟動子和一個位于HIV基因編碼序列末端的轉錄終止子。在一優選實施方案中，該啟動子是帶有內含子A序列的巨細胞病毒啟動子(CMV-intA)，盡管那些熟知這一技術的人將認識到可以使用許多其它已知啟動子的任何一種，例如強免疫球蛋白或其它真核基因啟動子。一個優選的轉錄終止子是牛生長激素終止子。特別推薦CMVint A-BGH終止子組合物。
為了幫助制備原核細胞中的多核苷酸，抗生素抗性標記可包含到該表達載體中；該標記可在原核細胞啟動子的轉錄控制之下，以至該標記的表達不發生在真核細胞中。可以利用氨芐青霉素抗性基因、新霉素抗性基因和其它藥學上可接受的抗生素抗性標記。為了幫助通過原核生物的發酵高水平地生產多核苷酸，該載體可能最好含有原核生物的復制起點并且是高拷貝數目。許多市售的原核生物克隆載體提供這些益處。最好是去掉非必需的DNA序列并保證該載體在真核細胞中不能夠復制。這就將多核苷酸疫苗序列整合到受體的基因組的風險降低到最低程度。只要當需要將該多核苷酸表達限于特定的組織類型時，可使用組織專一性的啟動子或增強子。
在一實施方案中，使用了表達載體pnRSV，其中勞氏肉瘤病毒(RSV)長末端重復(LTR)是作為該啟動子使用的。在另一實施方案中，使用了突變的pBR322載體V1，這個載體中克隆有CMV啟動子和BGH轉錄終止子。在另一實施方案中，已將元件V1和pUC19結合，用來生產命名為V1J的表達載體。在V1J或另一個希望的表達載體中克隆了一個HIV基因，例如gp120、gp41、gp160、gag、pol、env或能夠誘導抗HIV免疫應答的任何其它的HIV基因。在另一實施方案中，從VIJ中去掉氨芐青霉素抗性基因，并用新霉素抗性基因代替，以在按本發明使用的已克隆出的不同HIV基因中產生V1J-neo。在另一實施方案中，該載體是V1Jns，它和V1Jneo一樣，區別是唯一的SfiⅠ限制性位點已加工到V1J-neo位置2114的單個KnpⅠ位點中。在人類基因組DNA中SfiⅠ位點的發生率是非常低的(大約每100,000個堿基一個位點)。因此，這個載體允許簡單地通過SfiⅠ消化提取的基因組DNA，小心地監測表達載體整合到宿主DNA中。在進一步的精制中，該載體是V1R。在這個載體中，盡可能多的非必需DNA從載體中“修剪”掉，產生一高度緊密的載體。這個載體是V1Jns的衍生物。該載體允許利用大的插入，較少考慮不適宜的序列被編碼和使細胞的攝取最佳化。
本發明的一個實施方案加入來自實驗室采用的HIV毒株(例如SF2、ⅢB或MN)的編碼HIV的gp160、gp120、gag和其它基因產物的基因。熟知這一技術的人將認識到利用具有與HIV-1的基因類似功能的HIV-2毒株的基因，期望產生類似于在這里對HIV-1構成物所描述的免疫應答。熟知這項技術的人員已知道獲得這些基因的克隆和操作方法。
已經認識到引起針對實驗室采用的HIV毒株的免疫應答可能不足以提供HIV原始現場分離物的中和作用。這樣，在本發明的另一實施方案中，將來自毒性HIV原始現場分離物的基因加入該多核苷酸免疫原中。這是通過制備該病毒基因的cDNA拷貝，然后將各個基因亞克隆到該多核苷酸免疫原中來完成的。許多HIV毒株的很多基因的序列現在能在GENEBANK公開獲得，并且這些HIV的原始現場分離物能從國立變態反應和感染病研究所(NIAID)獲取，這個研究所已與QualityBiological,Inc.[7581 Lindbergh Drive,Gaithersburg，馬里蘭20879]訂有合約使得可得到這些毒株。這些毒株也能從世界衛生組織(WHO)獲取[HIV分離和特征記述網絡，疫苗研制單位，研究所，世界AIDS方案，CH-1211 Geneva 27，瑞士)。從這一工作中那些熟知這項技術的人將認識到本發明的一個應用是提供用于體內和體外檢驗和分析的系統，使得能夠作出HIV序列多樣性與HIV中和作用的血清學和其它參數的相互關系。加入來自HIV毒株原始分離物的基因提供誘導針對該病毒臨床分離物的免疫應答的免疫原，這樣，就滿足了此領域尚未遇到的需求。此外，由于所述毒性分離物改變，可修飾該免疫原來反映所需要的新序列。
為了保持術語上的一致，遵照下面的本文為描述多核苷酸免疫原構成物的慣例“載體名稱-HIV毒株-基因-附加元件”。這樣，其中MN毒株的gp160基因克隆到表達載體V1Jneo上的構成物，這里它給出的名稱是“V1Jneo-MN-gp160”。加入到該構成物的另外的元件在下面進一步詳細描述。因為該病毒的病原毒株改變，可改變在藥物學上最適宜加入的精確基因。然而，如下面所表明的，因為誘導能夠保護抵抗異源性毒株的CTL應答，與完整病毒或基于亞單位多核苷酸的疫苗相比，該毒株的變異性在本發明的免疫原和疫苗中是較不關鍵的。另外，因為該藥物容易操作插入新基因，這是容易用分子生物學的標準技術進行的調整。
這里所使用的術語“啟動子”是指DNA鏈上的識別位點，在這一點上RNA聚合酶與之結合。該啟動子與RNA聚合酶形成起始復合物，來起始和驅動轉錄活性，該復合物能夠被命名為“增強子”的激活序列或命名為“沉默子”的抑制序列所修飾。
這里所使用的術語“前導序列”是指位于結構基因5’末端與該基因一起被轉錄的DNA序列。前導序列通常產生具有N末端肽延伸的有時稱為原序列的蛋白質。對于注定或分泌到胞外介質或膜上的蛋白質，這種信號序列一般為疏水性序列，指導蛋白質到內質網中，蛋白質從內質網被運輸到合適的目的地。
這里所使用的術語“內含子”是指出現于基因中間的DNA區域，這一區域不編碼該基因產物中的氨基酸。該內含子的前體RNA被切斷，因此既不被轉錄mRNA，也不被翻譯成蛋白質。
術語“盒”是指含有待表達核酸序列的本發明的序列。該盒在概念上類似于盒式磁帶。每個盒將有它自身的序列。這樣通過交換該盒，該載體將表達不同的序列。因為限制性位點位于5’和3’末端，因此該盒能夠容易地被插入、去除或用另一個盒代替。
術語“3’非翻譯區域”或“3’UTR”是指通常與該基因一起轉錄的位于結構基因3’末端的序列。這個3’UTR區通常含有poly A序列。盡管3’UTR從該DNA轉錄，但在翻譯成蛋白質之前它從DNA上被切下。
術語“非編碼區”或“NCR”是指與該結構基因的3’UTR區鄰近的區域。NCR區含有轉錄終止信號。
術語“限制性位點”是指限制性內切酶的序列專一性切割位點。
術語“載體”是指一些工具，通過這些工具可以將DNA片段導入宿主有機體或宿主組織中。有各種類型的載體，包括質粒、噬菌體和粘粒。
術語“有效量”表示注射足夠的PNA以產生足夠水平的多肽。熟知這一技術的人認識到這一水平可以變化。
為了提供本發明的說明，現提供下面的HIV背景資料。人類免疫缺陷病毒有一核糖核酸(RNA)基因組，其結構描述在圖1中。這個RNA基因按照本領域已知的方法必須反轉錄，以便產生用于克隆和按照這里所指出方法的操縱的cDNA拷貝。在該基因組的每個末端是一用作啟動子的長末端重復。在這些末端中間，該基因組在不同的閱讀框架中編碼作為主要基因產物的gag-pol-env:gag是基團專一性抗原；pol是逆轉錄酶或聚合酶；也由這一區域編碼、在另一的閱讀框架中的是負責將例如gp160翻譯后加工為gp120和gp41的病毒蛋白酶；env是被膜蛋白；vif是病毒粒子感染性因子；REV是病毒粒子蛋白質表達調節因子；neg是負調節因子；vpu是病毒粒子產率因子“u”；tat是轉錄的凡是激活因子；vpr是病毒蛋白r。已描述了這些成分的每一種的功能。
在本發明的一個實施方案中，將編碼HIV或SIV蛋白質的基因直接連接到轉錄啟動子上。env基因編碼大的膜結合蛋白質gp160，它翻譯后修飾為gp41和gp120。gp120基因可放在用于表達的巨細胞病毒啟動子的控制之下。然而，gp120不是膜結合的，因此，表達時，它可從細胞中分泌出來。因為HIV趨向在被感染細胞中保持休眠狀態，最好是也產生針對細胞結合的HIV抗原決定基的免疫應答。另外，最好是疫苗產生在結構上類似于病毒感染產生的膜結合的寡聚ENV抗原，以產生用于中和病毒的最有效的抗體反應。在這里這一目標通過在體內表達細胞膜結合的抗原決定基gp160，以引發免疫系統來完成。但是，由于從未剪接的基因的核中沒有輸出，因此在缺少REV的情況下，gp160的表達被抑制。為了了解該系統，必須進一步詳細描述HIV的生活周期。
在HIV的生活周期中，感染宿主細胞時，HIV RNA基因被反轉錄成前病毒DNA，這一DNA整合到宿主基因組的DNA中，作為單個轉錄單位。LTR提供從5’到3’的方向轉錄HIV基因(gag、pol、env)的啟動子，形成整個基因組未剪接的轉錄物。未剪接轉錄物作為翻譯gag和pol的mRNA；而為了翻譯env編碼基因，必須發生有限的剪接。關于該表達的調節基因產物REV，必須發生不止一個剪接事件，因為如在圖1所示的基因組的裝置中REV和env重疊。為了轉錄env,REV轉錄必須停止，反之也一樣。另外，從細胞核輸出未剪接的RNA，需要REV的存在。但是，為了REV以這種方式起作用，REV反應性元件(RRE)必須存在于轉錄物上(Malim等，Nature 338:254-259(1989))。
在本發明的多核苷酸疫苗中，通過提供完整的剪接基因來消除某些HIV基因必須的剪接(即提供所需基因產物的完全的開放閱讀框架，在該閱讀框架中不需要開關或消除非編碼區；熟知這項技術的那些人將認識到當剪接一特定的基因時，在產生的準確的序列中有一些變化幅度；但是只要能得到功能性編碼序列，這是可接受的)。因此，在一實施方案中，剪接gp160的整個編碼序列，以至于不需要每個基因產物間斷的表達。
已知HIV在群體和被感染個體中突變的傾向，按照本發明產生的二元體液免疫應答和細胞免疫應答特別明顯地抑制HIV感染。為了配制對HIV的有效保護性疫苗，最好既產生例如對gp160的多價抗體反應(在各種美國人群體中的流行毒株HIV、分化體(clade)B毒株中env的保守性大約為80％)、以HIV為靶子的主要中和作用，也產生對gp160的保守部分和gag編碼的病毒內部蛋白有反應性的細胞毒性T細胞。我們已經制備了一包含gp160基因的HIV疫苗，這些gp160基因選自普通實驗室毒株、被感染的人群中發現的主要原始病毒分離物、設計成來暴露交叉毒株中和抗體抗原決定基的突變gp160和其它代表性HIV基因，例如gag和pol基因(在HIV分離物中-95％保守)。
實際上，還沒有朝免疫缺陷狀態發展的所有HIV血清陽性的病人都含有抗gag CTL，同時這些病人中的大約60％顯示交叉毒株gp160專一性的CTL。然而，在已經發展成已知為AIDS疾病狀態的被感染個體中發現的HIV專一性CTL的量非常低，這證明了我們下述發現的重要性我們能夠誘導交叉毒株CTL反應。
在小鼠和靈長類動物中證實了我們的env和gag多核苷酸疫苗構成物誘導的免疫應答。監視小鼠中監測針對env的抗體產生允許證實給予的構成物是合適的免疫原，即高比率的接種疫苗的動物顯示抗體反應。小鼠還提供適合于檢驗我們的構成物對CTL誘導的最易得到的動物模型，并因此用來評價特定的構成物是否能夠產生這種活性。猴(非洲綠猴、恒河猴、黑猩猩)提供用于在大的非嚙齒類動物中抗體評價的另外的物種，包括靈長類。由于在小鼠血清中觀察到針對逆轉錄病毒的高水平的內源性中和作用活性，對于抗血清中和作用檢驗這些物種也優于小鼠。這些數據表明我們的疫苗產生足夠的免疫原性，以在這一系統已知保護水平中和性抗體的基礎上在實驗中獲得黑猩猩/HIVⅢB攻擊免疫模型的保護。然而，現在在科學界出現的和日益接受的保護的定義是遠離所謂的“消毒性免疫”，這表示免于HIV感染的完全保護，來預防疾病。這一目標的許多相關物包括通過或者HIV逆轉錄酶活性、血清樣品的傳染性、p24 ELISA檢驗或者血液中其它的HIV抗原濃度、增加的CD4+T細胞濃度和增加的存活率來測定的降低的血液病毒效價。(參見例如Cohen,J.,Science 262:1820-1821,1993，關于抗HIV疫苗效力的發展的定義的討論)。本發明的免疫原還產生針對傳染性(臨床，基礎領域)的HIV分離物的中和性免疫應答。免疫學A．對env的抗體反應1．gp160和gp120.用ELISA分析來確定表達或是分泌型gp120、或是膜結合型gp160的疫苗載體對env專一性抗體的生產是否是有效的。通過gp160轉染細胞的溶胞產物的免疫印跡分析，提供我們疫苗接種載體的env表達的最初體外特征記述。這些數據證實并定量分析gp160的表達，用抗gp41和抗gp120單克隆抗體使轉染子細胞gp160的表達可見。在本發明的一實施方案中，因為下列原因gp160較gp120優選(1)原始的gp120載體在鼠中產生不一致的免疫原性，并且在非洲綠猴中反應性非常差或無反應性；(2)gp160通過由于包含gp41而提供增加的大約190個氨基酸殘基，來貢獻出額外的中和抗體和CTL抗原決定基。(3)就四聚體裝配和總體構象而論，gp160的表達更類似于病毒的env，這可提供寡聚物依賴性中和作用抗原決定基；并且(4)我們發現，象在小鼠、白鼬和非人類的靈長類中產生中和抗體反應的膜結合流感HA構成物的成功一樣，抗gp160抗體的產生勝過抗gp120抗體產生。選擇哪種類型的env或是否優選env亞片段的混合物是由下面略述的實驗決定的。
2．中和活性的存在和廣度檢測來自猴的ELISA陽性抗血清，顯示它既中和同源性HIV毒株，也中和異源性HIV毒株。
3．V3對非V3中和抗體對于env PNV的主要目標是產生廣譜中和抗體。現在已經表明針對V3環的抗體是非常毒株專一性的，這一反應的血清學已用來定義毒株。
a．非V3中和抗體似乎主要識別gp120之中負責與CD4結合的不連續的結構抗原決定基。可能由于病毒與其細胞配體結合的需要所施加的突變上的限制，對這一結構域的抗體是多克隆的并具有更寬范圍交叉中和性。體外分析用來檢驗免疫動物的血清阻止gp120與固定在96孔板的CD4的結合。第二個體外分析檢測與代表固定在塑料上的選定V3域的合成多肽的直接抗體結合。這些分析適用于來源于我們研究中所用的任何動物類型的抗血清，并定義我們的疫苗已產生中和抗體的類型，以及提供在體外與病毒中和作用的關聯。
b．gp41含有至少一個主要中和決定簇，對應于廣譜中和2F5單克隆抗體(可由Viral Testing Systems Corp.,Texas Commerce Tower,600Travis street,Suite 4750,Houston,TX 77002-3005(美國)得到，或由Waldheim Pharmazeutika GmbH,Boltzmangasse 11,A-1091 Wien,Austria得到)識別的高度保守的線狀抗原決定基和其它潛在的位點，包括位于gp41 N末端保守性好的“融合肽”域。除了上面描述的通過免疫印跡來檢測針對gp41的抗體外，用一用于抗體的體外分析檢驗，所述抗體與代表固定在塑料上的這些域的合成肽結合。
4．抗體反應的成熟。在HIV血清陽性病人中，中和抗體反應從主要的抗V3發展到包括更廣譜的中和抗體，這些抗體包含上面描述的(#3)結構gp120域抗原決定基，包括gp41抗原決定基。在當時和隨后的疫苗接種的過程中監測這些類型的抗體反應。B．針對env和gag的T細胞反應性。
1．CTL反應的產生。在細胞內合成的病毒蛋白質引起MHCI限制的CTL反應。這些蛋白質中的每一種在血清陽性病人中都誘出CTL。我們的疫苗還能夠在小鼠中誘出CTL。這些小鼠毒株的免疫遺傳學有助于這些研究，如用流感NP所證明的。已在Balb/C的鼠中定義了HIV蛋白質env、REV、nef和gag的幾個抗原決定基，這樣有利于體外的CTL培養和細胞毒性分析。最好使用同源腫瘤品系，例如用這些基因轉染的鼠肥大細胞瘤P815，以提供CTL和體外抗原專一性再刺激的靶子。已經知道定義能夠誘出MHCI型限制性細胞毒性T淋巴細胞的方法。還發現包含氨基酸152-176的肽誘導HIV中和抗體，這些方法可用來鑒定包含在本發明的PNV中的致免疫性的抗原決定基。另一方面，可以使用編碼gp160、gp120、蛋白酶或gag的整個基因。如這里所使用，T細胞效應物功能是與成熟T細胞表型相聯系的，例如細胞毒性、用于B細胞激活的細胞因子的分泌和/或巨噬細胞和嗜中性白細胞的補充或刺激。
2．TH活性的測定。通過加入或重組蛋白質或肽抗原決定基，檢驗得自免疫動物的回憶專一性抗體的脾臟細胞培養物。通過這些培養物的增殖或細胞因子的產生來監測T細胞被伴隨性脾臟抗原提呈細胞APC提呈的這些抗原的激活作用。細胞因子產生的類型還允許將TH反應分類為1型和2型。因為占優勢的TH2反應似乎與免疫平衡的血清陽性病人中的細胞免疫排斥相關聯，定義在病人中給定的PNV所引起的反應類型是可能的，允許操縱產生的免疫應答。
3．延遲型超敏感性(DTH)。i.d.注射后，DTH對病毒抗原表示細胞的主要MHCⅡ限制的免疫作用。因為可得到商品形式的重組體HIV蛋白質和已知抗原決定基的合成肽，用這些試劑容易在接種疫苗的脊椎動物中測定DTH反應，這樣就提供誘導細胞免疫的另一體內關聯。保護基于上面的免疫學研究，可預言我們的疫苗在脊椎動物中對毒性HIV的攻擊是有效的。在用PNV構成物或包含gp160ⅢB、gagⅢB、nefⅢB和REVⅢB的PNV構成物混合物充分地疫苗接種黑猩猩后的HIVⅢB/黑猩猩攻擊模型中完成這些研究。ⅢB毒株在這方面是有用的，因為已經建立了這種毒株的致死劑量的黑猩猩效價。然而，用HIV的任何毒株和對于給定毒株專一性或異源性的抗原決定基來設想同樣的研究。除了黑猩猩外，第二個疫苗接種/攻擊模型是Scid-hu PBL小鼠。在這個模型允許用隨后的HIV攻擊小鼠宿主檢驗人類淋巴系統免疫系統和我們的疫苗。這個系統是有益的，因為它容易適合于與任何HIV毒株一起使用，并且它提供針對HIV原始現場分離物的多種毒株的保護證據。第三種攻擊模型利用雜種HIV/SIV病毒(SHIV)，它們中一些已顯示感染恒河猴并引起導致死亡的免疫缺陷(參見Li,J.等J.AIDS 5:639-646,1992)。用我們的多核苷酸疫苗構成物接種恒河猴，對用致死劑量的SHIV的后續攻擊是有保護性的。PNV構成物概述將HIV和其它基因連接到最適于多核苷酸疫苗接種的表達載體中。基本上去掉所有的外來DNA，留下轉錄啟動子、免疫原性的抗原決定基、轉錄終止子、細菌的復制起點和抗生素抗性基因這些必須元件。
HIV晚期基因如env和gag的表達是REV依賴性的，并需要REV反應元件(RRE)存在于病毒基因轉錄物上。在沒有REV的情況下，通過用例如來自tPA(組織型血纖維蛋白溶酶激活物)的異源前導序列，更優選是用例如在高度表達的哺乳動物蛋白質(如免疫球蛋白)前導肽中發現的前導肽來取代gp120前導肽，可以產生一分泌形式的gp120。我們已將tPA-gp120嵌合基因插入到在被轉染細胞中(RD，人橫紋肌肉瘤系)有效表達分泌gp120的V1Jns中。不加入REV表達載體，單順反子gp160轉染時不產生任何蛋白質。典型的構成物組分包括(但不局限于)1．TPA-gp120MN；3．gp160ⅢB；10．gagⅢB對于抗gag CTL；11．tPA-gp120ⅢB；12．具有結構突變的gp160:V1、V2、和/或V3環缺失或取代20．編碼抗原的基因，這些抗原由非HIV病原體表達，例如(但不局限于)流感病毒核蛋白質、血細胞凝集素、基質、神經氨酸苷酶和其它抗原性蛋白質；單純皰疹病毒基因；人乳頭瘤病毒基因；肺結核抗原；甲、乙或丙性肝炎病毒抗原。
用本發明的非復制型質粒DNA進行免疫，證明多核苷酸HIV免疫原針對后續病毒攻擊的保護性效力。這是有益的，因為沒有牽涉感染性因子，不需要病毒粒子的裝配，并允許選擇決定簇。此外，因為gag序列和蛋白酶和幾個其它病毒基因產物在HIV的不同的毒株中是保守的，因此使得能夠保護抵抗與與獲得克隆基因的毒株同源的和異源的毒性HIV毒株的后續攻擊。
i.m.注射編碼gp160的DNA表達載體，導致產生針對后續病毒攻擊的顯著保護性免疫。特別是，產生gp160專一性抗體和原始的CTL。盡管可變的被膜蛋白的抗原性變化和漂變，但針對保守的蛋白質的免疫應答可以是有效的。因為每個HIV基因產物顯示某種程度的保守性，并因為響應胞內表達和MHC加工而產生CTL，因此可予測許多病毒基因引起類似于gp160所取得的反應。這樣，如在表達載體中克隆的和測序的接點所顯示的(見下面)，已克隆出許多這些基因，使得這些構成物為可利用形式的免疫原劑。
本發明提供一種手段，不需要自主復制型因子或佐劑，來誘導交叉毒株保護性免疫。另外，用本發明的多核苷酸進行免疫提供許多其它的益處。該疫苗接種方法應適用于腫瘤和感染性因子，因為CD8+CTL反應對病理生理過程都是重要的[K.Tanaka等，Annu.Rev.Immunol.6,359(1988)]。因此，引起針對對于轉化過程為決定性的蛋白質的免疫應答，可能是一種有效的腫瘤預防或免疫治療手段。注射病毒蛋白質和人生長激素DNA后，產生針對表達的蛋白質的高效價抗體提示這是制備或單獨的、或與導向保守抗原的細胞毒性T淋巴細胞疫苗聯合的、基于抗體的疫苗的一種易做到的和高效的手段。
生產和純化DNA構成物的容易性可有利地與傳統純化蛋白質的方法相比較，這樣有利于產生聯合疫苗。因此，可以制備、混合和共給與例如編碼gp160、gp120、gp41或任何其它HIV基因的多種構成物。因為DNA注射后保持蛋白質的表達，因此可提高B-和T-細胞記憶的持久性，借此引起長效的體液免疫和細胞介導的免疫。
用于制備和純化DNA構成物的分子生物學的標準技術，使制備本發明的DNA免疫原成為可能。盡管標準的分子生物學技術因此足以用來生產本發明的產物，但這里公開的專一性構成物提供驚人地產生交叉毒株和原始HIV分離物中和作用的新型多核苷酸免疫原，這是用標準失活的全病毒或亞基蛋白質疫苗到目前為止未得到的結果。
待導入疫苗受體中可表達的DNA或轉錄的RNA的量將取決于所使用的轉錄和翻譯啟動子的強度和表達的基因產物的免疫原性。一般來說，將大約1ng-100mg，最好為10μg-300μg的免疫學或預防有效劑量直接給予到肌肉組織中。也設想皮下注射、皮內導入、通過皮膚壓印、和其它的給藥模式，例如腹膜內、靜脈內、或吸入傳送。還設想了提供加強免疫接種。還設想了在用HIV多核苷酸免疫原疫苗接種后，用HIV蛋白質免疫原(例如gp160、gp120和gag基因產物)加強免疫。例如靜脈內、肌內、皮下或其它給藥方式的腸胃外給與白細胞介素-12蛋白質，同時或隨后腸胃外導入本發明的PNV也是有益的。
該多核苷酸可以是裸露的，就是說，不與對接受者免疫系統有影響的任何蛋白質、佐劑或其它試劑結合。在這種情況下，最好該多核苷酸是存在于生理上可接受的溶液中，例如但不局限于無菌鹽水或無菌緩沖鹽水。另一方面，該DNA可與脂質體、例如卵磷脂脂質體或其它本領域已知的脂質體結合，作為DNA-脂質體混合物，或該DNA可與本領域已知的佐劑(例如蛋白質或其它載體)結合，來加強免疫應答。例如但不局限于鈣離子的幫助細胞攝入DNA的試劑，也能有益地應用。這些試劑在這里通常被稱為轉染促進劑和藥學上可接受的載體。用于包被包被有多核苷酸的微彈的技術是本領域已知的，而且也可用來與本發明相結合。
下面的實施例是以說明的方式提供，并且不希望以任何方式限制本發明。
實施例1材料說明載體pF411和pF412這些載體是從R.Gallo實驗室構建的載體pSP62亞克隆來的。pSP62是從Biotech Research Laboratories,Inc.得到的試劑。pSP62有一從λHXB2亞克隆得到的HXB2基因組的12.5kb XbaⅠ片段。pSP62的SalⅠ和XbaⅠ消化產生HXB2片段5’-XbaⅠ/SalⅠ,6.5kb和3’-SalⅠ/XbaⅠ,6kb。將這些插入物亞克隆到pUC 18的SmaⅠ和SalⅠ位點上，產生pF411(5’-XbaⅠ/SalⅠ)和pF412(3’-XbaⅠ/SalⅠ)。pF411含有gag/pol，而pF412含有tat/env/nef。Repligen試劑重組rev(ⅢB),#RP1024-10rec.gp120(ⅢB),#RP1001-10抗rev單克隆抗體，#RP1029-10抗gp120 mAB,#1C1,#RP1010-10AIDS研究和參考試劑方案抗gp41 mAB雜交瘤，Chessie8,#526設計了方案來誘導對HIV、主要是針對HIV gag(～95％保守)和env(gp160或gp120；70-80％保守)基因產物的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)和中和抗體反應。gp160含有僅已知的HIV粒子上的中和抗體抗原決定基，而抗env和抗gag CTL反應的重要性被已知的這些細胞免疫的觸發與感染后原發性病毒血癥的清除的關系所突出，這一反應發生在中和抗體出現之前，以及CTL在維持無病狀況方面起作用。因為HIV的遺傳多樣性是眾所周知的，我們希望通過包括得自臨床分離物和gp41(～90％保守)的幾個代表性env基因，來獲得更寬范圍的中和抗體，同時高度保守的gag基因應產生廣譜的交叉毒株CTL反應。
實施例2HIV晚期基因產物的異源性表達例如env和gag的HIV結構基因需要HIV調節基因rev的表達，以有效地產生全長蛋白質。我們已發現rev依賴性的gag表達產生低水平的蛋白質，并且rev自身對細胞可能是毒性的。盡管在體外我們獲得了相對高水平的rev依賴性的gp160表達，但在體內用rev/gp160 DNA免疫后，這一疫苗引出低水平的針對gp160的抗體。這可能產生于rev已知的細胞毒性和在含有數以百計核的肌小管中獲得rev功能的日益增加的困難(rev蛋白需要在和發生gag或env蛋白表達的rev依賴性轉錄物相同的核中)。然而，用env基因、gag的選定修飾來獲得不依賴rev的表達已是可能的。這些用于疫苗目的質粒的評價正在進行之中。
一般來說，我們的疫苗已利用原始的HIV(ⅢB)env和gag基因，來使在我們的泛化疫苗接種載體V1Jns中的表達最佳化，V1Jns由CMV立即早期(IE)啟動子、BGH多腺苷酸化位點和pUC骨架組成。不依賴rev的env表達的不同效率取決于使用多大的基因片段(例如gp120對gp160)，可以通過用來自組織專一性血纖維蛋白質溶酶激活子(tPA)基因的前導肽取代其天然分泌性前導肽，并且表達CMVIE啟動子后面的產生的具有CMV內含子A的嵌合基因來得到。tPA-gp120是一分泌的gp120載體的例子，以這種形式構成的載體行使的作用足以在疫苗接種的小鼠和猴中引起抗gp120免疫應答。
因為據報道膜錨著蛋白與分泌的蛋白質相比，可以誘導實質得多的(并可能對HIV中和更專一性)的抗體反應和得到另外的免疫抗原決定基，我們制備了V1Jns-tPA-gp160和V1Jns-rev/gp160。如轉染細胞的免疫印跡分析所顯示的，不加入rev，該tPA-gp160載體產生可檢測量的gp160和gp120，盡管表達水平比rev依賴型gp160表達質粒rev/gp160得到的低得多。這可能是因為賦予rev依賴于gp160轉錄物的抑制區域(命名為INS)出現在gp160之中包括在gp41的COOH末端的多個位點上(參見下面圖示)。制備了tPA-gp160的COOH末端截短形式的載體tPA-gp143，設計這種載體，以通過消除這些抑制序列來提供env的總體表達水平。該gp143載體還消除了包含已知引起膜蛋白質轉移到溶酶體上而不是細胞表面的肽基序(例如Leu-Leu)的胞內gp41區域。這樣，與全長gp160相比，可能期望gp143既提高env蛋白的表達水平(通過降低rev依賴性)，也提高蛋白質運送到細胞表面的效率，在那里這些蛋白質更能夠在DNA疫苗接種后誘出抗gp60抗體。通過rev反應元件(RRE)序列(350bp)廣泛的沉默誘變來進一步修飾tPA-gp143，以消除另外的表達抑制序列。這個構成物gp143/mutRRE以兩種形式制備或消除(形式A)、或保留(形式B)gp120/41的蛋白酶解位點。制備了兩種形式，因為文獻報道用在牛痘中表達的不可酶切的gp160疫苗接種小鼠，誘出的抗體比可酶切形式的gp160接種小鼠的水平高得多。
開發了在細胞轉染子中gp160/gp120表達的定量ELISA，來測定這些載體的相對表達能力。在體外轉染293細胞后，定量測定細胞結合的對分泌的/釋放的gp120產生下列結果(1)tPA-gp160表達的gp120比rev/gp160低5-10倍，胞內gp120與運送到細胞表面的gp120保持相似的比率。(2)tPA-gp143產生的gp120的分泌比rev/gp160大3-6倍，僅具有低水平的細胞結合gp143，這證明gp160的胞質尾引起gp160胞內滯留，這一現象能通過部分缺失該序列來克服；并且，(3)tPA-gp143/mutRREA和B產生的蛋白表達水平比親代tPA-gp143大～10倍，同時證明形式A消除了蛋白酶解加工。
因此，我們為增加不依賴rev的表達的策略，已導致逐漸增加總體表達水平以及使膜錨著gp143遠離溶酶體、重導向細胞表面。重要的是注意到將得自不同的原始病毒分離物的gp120序列插入含有或位于NH2末端(tPA引物)或位于COOH末端(gp41)的這些修飾的載體盒之中應該是可能的，這兩個末端在不同的病毒毒株間幾乎沒有抗原差異。換句話說，這是可以容易地通過插入得自不同原始病毒分離物的gp120來修飾的種屬構成物，以獲得臨床相關的疫苗。
將這些表達策略應用到與疫苗目的有關的病毒上，并確定我們方法的通用性，我們還制備了得自原始HIV分離物(含有北美人共有V3肽環；巨噬細胞向性和非合胞體誘導表型)的tPA-gp120載體。這個載體在轉化的293細胞中產生gp120的高度表達/分泌，并在小鼠中誘出抗gp120抗體，表明它以功能形式克隆。原始分離物gp160基因也可以用于與得自實驗室毒株的gp160同樣的方式表達。
實施例3對HIV-1 env多核苷酸疫苗的免疫應答接受gp120 DNA疫苗的非洲綠猴(AGM)和恒河猴(RHM)在疫苗接種2-3次后，顯示低水平的中和抗體，這不能通過額外的疫苗接種來增加。在HIV疫苗領域日益認識到對于誘出中和性抗體，寡聚gp160可能是比gp120單體更妥當的靶抗原(Moore和Ho,J.Virol.67:863(1993))，這些結果和這種認識引導我們致力于得到基于gp160載體的有效表達(見上文)。小鼠和AGM也用原始分離物來源的tPA-gp120疫苗來接種。這些動物顯示抗V3肽(用同源性序列)交互的終點抗體效價，范圍為500～5000，這證實該疫苗設計對于臨床相關的病毒分離物是有作用的。
基于gp160的疫苗rev-gp160和tPA-gp160在小鼠和非人類靈長類動物中不能持續地誘出抗體反應，或產生低的抗體效價。我們用tPA-gp143質粒的在鼠中和AGM中兩次疫苗接種后，產生的幾何平均效價＞103。這些數據表明，我們通過提高表達水平，已顯著改進了gp160樣疫苗的免疫原性。將繼續記述該構成物以及tPA-gp143/mutRRE A和B載體的抗體反應的特征，特別是病毒中和的特征。
顯然，gp120 DNA疫苗接種在所有受試的淋巴區(脾臟、血液、腹股溝淋巴結、腸系膜淋巴結和髂骨淋巴結)都產生有效的輔助T細胞反應，具有TH1樣細胞因子分泌輪廓(即g-干擾素和IL-2的產生，幾乎沒有或沒有IL-4)。這些細胞因子一般啟動強細胞免疫，并已經與HIV血清陽性病人無病狀態的維持有關聯。已經表明淋巴結是HIV復制的主要部位，當病毒不易在血液中檢測到時，淋巴結含有大儲藏量的病毒。能夠在各種各樣的淋巴部位中引起抗HIV免疫應答的疫苗，例如用我們的DNA疫苗已經顯示的，可以協助阻止最初感染后淋巴管的成功移生。
如前面所述的，我們認為實現下面的目標，對于把我們這一項目成功的機會增加到最大程度是最重要的(1)能夠在靈長類中產生較強中和抗體反應的基于env的載體；(2)在靈長類動物中引起以CTL和輔助效應物功能為特征的強T淋巴細胞反應的gag和env載體；(3)在我們的疫苗中利用來自臨床上相關HIV-1毒株的env和gag基因并記述它們引起的免疫學反應特征，特別是對原始分離物的中和作用；(4)用合適的最優化疫苗證明在例如黑猩猩/HIV(ⅢB)或恒河猴/SHIV的動物攻擊模型中的保護作用；以及，(5)確定適于臨床應用的免疫應答的持續時間。這些目標的前三個已取得了顯著的進展，確定我們最近的gp160和gag疫苗接種構成物是否改善這些最初結果的實驗正在進行之中。
實施例4用于疫苗生產的載體A．V1Jneo表達載體去除用于含有V1J的細菌的抗生素選擇的ampr基因是必要的，因為氨芐青霉素不能用在大規模的發酵罐中。通過用SspⅠ和Eam1105I限制性內切酶消化，從V1J的pUC骨架中去除ampr基因。用瓊脂糖凝膠電泳純化剩下的質粒，用T4 DNA聚合酶鈍化末端，然后用小牛腸的堿性磷酸酶處理。用PstⅠ限制性內切酶切除包含在pUC4K質粒內的得自轉座子903的市售kanr基因，用瓊脂糖凝膠電泳純化，用T4 DNA聚合酶鈍化末端。將這一片段與V1J骨架相連接，并衍生出具有任意方向kanr基因的質粒，這些質粒被命名為V1Jneo#’s 1和3。用限制性酶消化分析、接合點區域的DNA測序證實這些質粒的每一種，表明產生和V1J類似量的質粒。異源性基因產物的表達也可與V1J的這些V1Jneo載體相比擬。我們任意選擇其中包含的kanr基因的方向與V1J中的ampr基因相同的V1Jneo#3(下文稱為V1Jneo)作為該表達構成物。B．V1Jns表達載體將一SfiⅠ位點加入V1Jneo中以有利于整合作用研究。將一市售的13個堿基對的SfiⅠ接頭(New England Biolabs)加入該載體BGH序列中的KpnⅠ位點上。V1Jneo用KpnⅠ線狀化、用凝膠純化、用T4 DNA聚合酶鈍化并連接到鈍化的SfiⅠ接頭上。通過限制性圖譜分析來選擇克隆的分離物，并通過該接頭的測序來確認克隆分離物。這個新的載體命名為V1Jns。V1Jns中(有SfiⅠ)異源基因的表達可與V1Jneo中(有KpnⅠ)的相同基因的表達相比擬。C．V1Jns-tPA為了將異源前導肽序列提供給分泌蛋白和/或膜蛋上，將V1Jn修飾，以包含人組織專一性血纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)前導序列。將兩個合成的互補寡聚物退火，然后連接到已被BgⅢ消化的V1Jn上。有義寡聚物和反義寡聚物是5’-GATC ACC ATG GAT GCA ATG AAGAGA GGG CTC TGC TGT GTG CTG CTG CTG TGT GGA GCA GTCTTC GTT TCG CCC AGC GA-3’,SEQ.ID:18和5’-GAT CTC GCT GGGCGA AAC GAA GAC TGC TCC ACA CAG CAG CAG CAC ACA GCAGAG CCC TCT CTT CAT TGC ATC CAT GGT-3’。Kozak序列是有義寡聚物的下劃線部分。這些寡聚物有突出的堿基，適合于連接到BgⅢ切割的序列上。連接后破壞上游BgⅢ位點，而保留下游BgⅢ用于后續的連接。通過DNA測序證實連接點以及整個tPA前導序列。另外，為了與我們的一致最佳化載體V1Jns(=具有SfiⅠ位點的V1Jneo)一致，通過用T4 DNA聚合酶鈍化KpnⅠ位點，接著與SfiⅠ接頭(分類號#1138,NewEngland Biolabs)連接，將SfiⅠ限制位點置于V1Jn-tPA的BGH終止子區域中的KpnⅠ位點上。用限制消化和瓊脂糖凝膠電泳確認這種修飾。
實施例5Ⅰ．HIV env疫苗構成物產生分泌型env來源抗原(gp120和gp140)的疫苗如gp120的rev依賴型env基因的表達是如下進行的將gp120從HIV的MN毒株用PCR克隆出來，該毒株或帶有天然前導肽序列(V1Jns-gp120)，或是作為于組織特異性纖維蛋白的溶酶原激活劑(tPA)前導肽的融合物而取代天然前導肽(V1Jns-tPA-gp120)。已顯示tPA-gp120的表達不依賴rev[B.S Chapman等，Nuc.Acids Res.19,3979(1991)；應注意的是其它前導序列可能提供類似的功能，使gp120基因不依賴rev]。這可以通過用上面描述過的載體制備下列gp120構成物來完成
實施例6gp120疫苗構成物A．V1Jns-tPA-HIVMNgp120用設計以除去該肽前導序列前30個氨基酸并且促進克隆于V1Jns-tPA中的寡聚物，PCR擴增HIVMNgp120基因(Medimmune)，以產生含有tPA前導肽、在氨基酸殘基30后接剩余的gp120序列的嵌合蛋白。這種設計允許不依賴rev的gp120表達，以及從包含有這種質粒的細胞中分泌可溶性gp120。所用有義和反義PCR寡聚物是5’-CCC CGG ATCCTG ATC ACA GAA AAA TTG TGG GTC ACA GTC-3’和5’-C CCCAGG AATC CAC CTG TTA GCG CTT TTC TCT CTG CAC CAC TCTTCT C-3’。翻譯終止密碼已劃下劃線標出。這些寡聚物在該翻譯開放閱讀框架的任一末端含有BamHI限制性酶切位點，而在有義寡聚物的3’端有一BClⅠ位點。該PCR產物相繼用內切酶BClⅠ和BamHI消化，再連接到已被BglⅡ消化隨后用小牛腸堿性磷酸酶處理過的V1Jns-tPA中。產生的載體經序列分析證實，在tPA前導序列和pg120編碼序列之間有框內融合；并且通過轉染的RB細胞免疫印跡法分析證實gp120的表達和分泌。B．V1Jns-tPA-HIVⅢBgp120此載體與I.A.類似，其差別是HIVⅢB毒株用于gp120序列。有義和反義PCR寡聚物分別是5’-GGT ACA TGA TCA CA GAA AAA TTGTGG GTC ACA GTC-3’和5’-CCA CAT TGA TCA GAT ATC TTA TCTTTT TTC TCT CTG CAC CAC TCT TC-3’。這些寡聚物提供位于該插入物任一末端的BclⅠ位點和恰好位于3’末端的BclⅠ位點上游的EcoRV。5’末端的BclⅠ位點充許連接到V1Jns-tPA的BglⅡ位點，以形成一個嵌合tPA-gp120基因，它編碼tPA前導序列和gp120，而沒有其天然前導序列。連接產物通過限制性消化和DNA序列分析而證實。
實施例7gp140疫苗構成物類似于tPA-gp120，用tPA前導序列取代該天然前導序列通過PCR制備這些構成物，但是通過緊接該跨膜蛋白的NH2末端終止基因，設計生產分泌型抗原(預定的羧基末端氨基酸序列=NH2-……TNWLWYIK-COOH)。不象產生gp120的構成物，gp140構成物應該產生低聚體的抗原，且保留有已知的含有gp41的抗體中和抗原決定基，如2F5單克隆抗體限定的ELDKWA。
根據gp160蛋白酶解切割位點在gp120和gp41的連接處是保留(B)還是通過Kieny等(Prot.Eng.2:219-255(1988))描述的用合適的氨基酸置換刪除(A)，以2種形式(A或B)制備構成物(野生型序列=NH2-…KAKRRV VQRERR…COOH；突變型序列=NH2-…KAQNHVVQNEHQ…COOH，劃線處示突變的氨基酸)。A．V1Jns-tPA-gp140/mutRRE-A/SRV-13’-UTR(基于HIV-1ⅢB)此構成物用以下有義和反義PCR寡聚物通過PCR方法獲得5’-CTGAA AGA CCA GCA ACT CCT AGG GAAT TTG GGG TTG CTCTGG-3’,SEG.ID和5’-CGC AGG GGA GGT GGT CTA GAT ATCTTA TTA TTT TAT ATA CCA CAG CCA ATT TGT TAT G-3’，以從載體ⅣB(含有最佳化的RRE-A區段)中得到一個AvrⅡ/EcoRⅤ區段。該3’-UTR為制備的合成基因片段，它來源于猿猴逆轉錄病毒1(SRV-1，參見下文)，已將其插入緊接gp140開放閱讀框架的3’端導入的SrfⅠ限制性酶切位點中。該UTR列先前已描述為促進HIV env和gag的不依賴rev的表達。B． V1Jns-tPA-gp140/mutRRE-B/SRV-13’-UTR(基于HIV-1ⅢB)此構成物與ⅡA類似，區別在于env蛋白酶解切割位點已通過用構成物ⅣC作為起始材料而被保留。C．V1Jns-tPA-gp140/opt30-A(基于HIV-1ⅢB)此構成物來源于ⅣB，通過AvrⅡ和SrfⅠ限制性內切酶消化后，接著通過對應于gp30、但包含最適于翻譯的密碼子(參見以下gp32-opt)的合成DNA區段的連接而成。該gp30-opt DNA通過PCR從gp32-opt擴增而獲得，使用的有義和反義寡聚物分別是5’-GGT ACA CCT AGG CATCTG GGG CTG CTC TGG-3’和5’-CCA CAT GAT ATC G CCC GGG CTTA TTA TTT GAT GTA CCA CAG CCA GTT GGT GAT G-3’。此DNA區段用限制性內切酶AvrⅡ和SrfⅠ消化，并連接到已用AvrⅡ和SrfⅠ消化的V1Jns-tPA-gp143/opt32-A(ⅣD)上，以除去相應的DNA區段。所形成的產物通過連接接點的DNA序列分析和免疫印跡法分析而證實。D．V1Jns-tPA-gp140/opt30-B(基于HIV-1ⅢB)此構成物與ⅡC類似，區別是已保留env蛋白酶解切割位點。E．V1Jns-tPA-gp140/opt全部為A這種構成物的env基因含有完整的最適密碼子。恒定區(C1、C5、gp32)是在ⅣB、D、H中描述的那些區域，用由最適于翻譯的密碼子構成的區段(見下列基于HIV-1 MN V1-V5的實施例)加入一條對應于可變區1-5的額外合成的DNA區段。F．V1Jns-tPA-gp140/opt全部為B此構成物與ⅡE相似，區別在于保留有env蛋白酶解切割位點。G．V1Jns-tPA-gp140/opt全部為A(非ⅢB毒株)此構成物與上面的ⅡE相似，區別是用來自于非ⅢB毒株的env氨基酸序列來確定整個可變區(V1-V5)的最適密碼子用法。H．V1Jns-tPA-gp140/opt全部為B(非ⅢB毒株)此構成物與ⅡG相似，區別是保留有env蛋白酶解切割位點。
實施例8gp160疫苗構成物按照上文描述的，依據哪一種gp160蛋白酶解切割位點，以2種形式(A或B)制備構成物。A．V1Jns-rev/env此載體是上述D節中描述載體的變異型，其區別是缺失外顯子1中完整的tat編碼區直至REV開放閱讀框架的開頭部分。V1Jns-gp160ⅢB(見上文A節)用限制性內切酶PstⅠ和KpnⅠ消化以切除gp160基因的5’區。用PCR擴增得到一個編碼第一個REV外顯子直至來源于HXB2基因組克隆的gp160中KpnⅠ位點的DNA區段。所述有義和反義PCR寡聚物分別是5’-GGT ACA CTG CAG TCA CCG TCC T ATG GCA GGA AGAAGC GGA GAC-3’和5’-CCA CAT CA GGT ACC CCA TAA TAG ACTGTG ACC-3’。這些寡聚物分別在該DNA片段的5’和3’末端提供PstⅠ和KpnⅠ限制性酶切位點。產生的DNA用PstⅠ和KpnⅠ消化，用瓊脂糖凝膠電泳純化，并與V1Jns-gp160(PstⅠ/KpnⅠ)連接。產生的質粒可通過限制性內切酶消化而證實。B．V1Jns-gp160通過從包含來源于HIVⅢb克隆HXB2的HIVⅢb基因組的3’末端一半的質粒pF412中PCR擴增而克隆HIVⅢbgp160。此PCR有義和反義寡聚物分別為5’-GGT ACA TGA TCA ACC ATG AGA GTG AAG GAGAAA TAT CAG C-3’和5’-CCA CAT TGA TCA GAT ATC CCC ATCTTA TAG CAA AAT CCT TTC C-3’。劃線部分為Kozak序列和翻譯終止密碼子。這些寡聚物在env基因兩端的翻譯開放閱讀框架外提供BclⅠ限制性酶切位點。(BclⅠ消化酶切位點適合于與BglⅡ消化酶切位點連接，隨后喪失了對兩種限制性酶的敏感性。選擇BclⅠ用于PCR克隆的gp160，因為該基因帶有內部BglⅠ位點和BamHI位點)。正象上文為其它PCR得到的基因描述的那樣，反義寡聚物也加入一個正好在BclⅠ位點之前的EcoRV位點。擴增的gp160基因用瓊脂糖凝膠電泳純化，用BclⅠ消化，連接到已用BglⅡ消化并用小牛腸堿性磷酸酶處理過的V1Jns上。此克隆基因的大小約為2.6kb，用DNA序列分析來證實V1Jns與gp160的每個連接點。C．V1Jns-tPA-gp160(基于HIV-1ⅢB)此載體與上面實施例1(C)類似，區別是用PCR法獲得不帶有天然前導序列的全長gp160。有義寡聚物與使用于I.C.中的相同，反義寡聚物為5’-CCA CAT TGA TCA GAT ATC CCC ATC TTA TAG CAA AATCCT TTC C-3’。這些寡聚物在該插入物一個末端提供BclⅠ位點，恰好在3’末端BclⅠ位點的上游提供一個EcoRV位點。5’末端BclⅠ位點允許連接到V1Jns-tPA的BglⅡ位點中，產生編碼tPA前導序列和不含有其天然前導序列的gp160的一個嵌合tPA-gp160基因。連接產物通過限制性消化和DNA序列分析而證實。D．V1Jns-tPA-gp160/opt C1/opt41-A(基于HIV-1ⅢB)此構成物基于ⅣH，帶有對于C5和gp41而非gp32完整的最適宜密碼子區段，帶有一個額外最適宜密碼子區段(見下文)來取代位于接著tPA前導序列后的gp120氨基末端的C1。通過SOE PCR法用合成連接的C1/143片段的下列PCR寡聚物，將該新C1區段連接到剩余的gp143的片段上5’-CCT GTG TGT GAG TTT AAA C TGC ACT GAT TTG AAGAAT GAT ACT AAT AC-3’。產生的gp143基因除了V1-V5區域以外含有合適的密碼子用法，且有一個獨特的PmeⅠ限制性酶切位點，它位于C1和V1的連接區域以利于加入其它HIV基因的可變區。E． V1Jns-tPA-gp160/opt C1/opt41-B(基于HIV-1ⅢB)此構成物與ⅢD相似，區別是保留有env蛋白酶解切割位點。F．V1Jns-tPA-gp160/opt全部為A(基于HIV-1ⅢB)此構成物的env基因由上述完整的最適宜密碼子組成。其恒定區(C1、C5、gp32)是那些已在ⅢD、作為盒子使用(用于所有完整的最適宜的gp160)的ⅢE中描述過的，而可變區V1-V5得自一個由最適宜密碼子組成的合成DNA區段。G．V1Jns-tPA-gp160/opt全部為B此構成物與ⅢF相似，區別是保留了env蛋白酶解切割位點。H．V1Jns-tPA-gp160/opt全部為A此構成物與上面的ⅢF相似，區別是來源于非ⅢB毒株的env氨基酸序列用于確定整個可變區(V1-V5)的最適密碼子用法。Ⅰ．V1Jns-tPA-gp160/opt全部為B(非ⅢB毒株)此構成物與ⅢH相似，區別是保留了env蛋白酶解切割位點。
實施例9gp143疫苗構成物類似于上述其它含有tPA的構成物(tPA-gp120、tPA-gp140和tPA-gp160)，通過PCR制備這些構成物，tPA前導序列取代其天然前導序列，但是設計產生COOH封端的膜結合env(預定的胞內氨基酸序列=NH2-NRVRQGYSP-COOH)。此構成物的設計目的是結合伴隨tPA導入的env較高的表達，并將對應于env胞內部分的轉錄物或肽區域可能對表達或蛋白質穩定性/轉移到細胞表面有負影響的可能性降低到最小程度。如上所述，根據gp160蛋白酶解切割位點是切除還是保留，以2種形式(A或B)制備構成物。產生于截短至gp143的殘余gp41片段稱為gp32。A．V1Jns-tPA-gp143用質粒pF412，用以下有義和反義寡聚物通過PCR制備此構成物5’-GGT ACA TGA TCA CA GAA AAA TTG TGG GTC ACA GTC-3’,SEQ.ID和5’-CCA CAT TGA TCA G CCC GGG C TTA GGG TGAATA GCC CTG CCT CAC TCT GTT CAC-3’。產生的DNA區段在任一末端含有BclⅠ限制性位點，以克隆入位于BglⅡ消化過的V1-Jns-tPA的緊接3’-到env開放閱讀框架的SrfⅠ位點上。所述構成物用連接接點的DNA序列分析以及轉染細胞的免疫印跡法分析來證實。B．V1Jns-tPA-gp143/mutRRE-A此構成物基于ⅣA，用上述獨特的MunⅠ限制性酶位點和下游的SrfⅠ位點切除該DNA區段。該區段與gp120 C5域的一部分和整個gp32相對應。合成的DNA區段對應于約350bp的gp160的rev反應元件(RRE A)，由對翻譯最適宜的密碼子組成，將其通過剪接重疊延伸(SOE)PCR方法在兩個區段的接點產生一個AvrⅡ限制性酶切位點(但在氨基酸序列上無改變)，連接到剩余的gp32片段上。為產生含有gp32的區域，用下列有義和反義PCR寡聚物來進行PCR反應，所述寡聚物分別為5’-CTGAA AGA CCA GCA ACT CCT AGG GAT TTG GGG TTG CTG TGG-3’和5’-CCA CAT TGA TCA G CCC GGG C TTA GGG TGA ATA GCCCTG CCT CAC TCT GTT CAC-3’(該寡聚物用作ⅣA的反義寡聚物)。通過SOE PCR方法，用以下寡聚物將突變型RRE(mutRRE-A)區段與gP32的野生型序列連接由于寡聚物為5’-GGT ACA CAA TTG GAGGAG CGA GTT ATA TAA ATA TAA G-3’，反義寡聚物用于產生gp32區段。產生的連接DNA區段用MunⅠ和SrfⅠ限制酶消化，并連接到母本gp143/MunⅠ/SrfⅠ消化的質粒中。產生的構成物通過連接和SOE PCR接點的DNA序列分析和轉染細胞的免疫印跡證實。C．V1Jns-tPA-gp143/murRRE2-B此構成物與ⅣB相似，區別是利用mutRRE-B合成基因區段取代mutRRE-A而保留有env蛋白酶解切割位點。D．V1Jns-tPA-gp143/opt32-A此構成物來源于ⅣB，通過AvrⅡ和SrfⅠ消化后連接與gp32相對應但由對翻譯最適宜密碼子(見下文gp32opt)組成的合成DNA區段而構建。產生構成物用連接接點的DNA序列分析和免疫印跡法證實。E．V1Jns-tPA-gp143/opt32-B此構成物與ⅣD相似，區別是通過用ⅣC作為最初的質粒而保留有env蛋白酶解切割位點。G．V1Jns-tPA-gp143/SRV-13’-UTR此構成物與ⅣA相似，區別是將來源于猿猴逆轉錄病毒-1(SRV-1，見下文)的3’-UTR加入緊接gp143開放閱讀框架3’端導入的SrfⅠ限制性酶切位點。此UTR序列前面已描述為促進HIV env和gag的rev非依賴型表達。H．V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32A此構成物基于ⅣD，它有C5和gp32的完整的最適宜密碼子區段段，帶有在tPA前導序列后的gp120的氨基末端取代C1的另一最適密碼子區段(見下文)。通過SOE PCR，用下列合成連接的C1/143區段的PCR寡聚物將這條新C1區段與剩余的gp143片段連接5’-CCT GTG TGTGAG TTT AAA C TGC ACT GAT TTG AAG AAT GAT ACT AAT AC-3’。產生的gp143基因除去V1-V5區外含有最適密碼子用法，且有一獨特的PmeⅠ限制酶切位點，該位點位于C1和V1的接合處，用于插入其它HIV基因的可變區。I．V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt 32 B此構成物與ⅣH相似，區別是仍保留有env蛋白酶解切割位點。J．V1Jns-tPA-gp143/opt全部為A此構成物的env基因全部由最適密碼子組成。其恒定區(C1、C5、gp32)是在4B、D、H中描述過的那些區域，用由對翻譯最適密碼子組成的合成DNA區段插入另一對應于可變區V1-V5的合成DNA片區段。K．V1Jns-tPA-gp143/opt全部為B此構成物與ⅣJ相似，區別是保留有env蛋白酶解切割位點。L．V1Jns-tPA-gp143/opt全部為A(非ⅢB毒株)此構成物與上面的ⅢG相似，區別是來源于非ⅢB毒株的env氨基酸序列用于確定整個可變區(V1-V5)的最適密碼子。M．V1Jns-tPA-gp143/opt全部為B(非ⅢB毒株)此構成物與ⅢG相似，區別是來源于非ⅢB毒株的env氨基酸序列用于確定整個可變區(V1-V5)最適密碼子。
實施例10gp143/glyB疫苗構成物與上面的其它含tPA構成物(tPA-gp120、tPA-gp140、tPA-gp143和tPA-gp160)類似，通過PCR方法制備這些構成物，它們帶有取代其天然前導序列的tPA前導序列，但是設計用于產生COOH封端的膜結合env，正如gp143的情況一樣。然而，gp143/glyB構成物與gp143的區別在于，在設計以包含胞內肽域的6個氨基酸中，最后4個與人類血型糖蛋白B(glyB)蛋白質的C末端哪些氨基酸相同(預定的胞內氨基酸序列=NH2-NRLIKA-COOH，劃線的殘基與glyB對應，而“R”在env和glyB中都存在)。此構成物的設計目的是，通過用來源于含有一小段胞質區域(胞內氨基酸序列=NH2-RRLIKA-COOH)的豐度表達的蛋白質(glyB)肽序列取代可能對表達或蛋白質穩定性/轉移到細胞表面產生負影響的區域，完全消除對應于該env胞內部分的任何轉錄物或肽區域而獲得額外的env表達和導向細胞表面的尋靶。以2種形式(A或B)制備構成物，這取決于如上描述的gp160蛋白酶解切割位點是切除還是保留。A．V1Jns-tPA-gp143/opt32-A/glyB此構成物與ⅣD相似，區別是使用下列反義PCR寡聚物，用上述血型糖蛋白B取代gp143的胞內肽域，所述寡聚物為5’-CCA CAT GATATC G CCC GGG C TTA TTA GGC CTT GAT CAG CCG GTT CACAAT GGA CAG CAC AGG-3’。B．V1Jns-tPA-gp143/opt32-B/glyB此構成物與ⅤA相似，區別是保留有env蛋白酶解切割位點。C．V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32-A/glyB此構成物與ⅤA相似，區別是與ⅣH的情況一樣，gp120的第一個恒定區(C1)被最適于翻譯的密碼子取代。D．V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32-B/glyB此構成物與ⅤC相似，區別是保留有env蛋白酶解切割位點。E．V1Jns-tPA-gp143/opt全A/glyB此構成物的env基因完全由上述最適密碼子組成。F．V1Jns-tPA-gp143/opt全B/glyB此構成物與ⅤE相似，區別是保留有env蛋白酶解切割位點。G．V1Jns-tPA-gp143/opt全A/gly B(非ⅢB毒株)此構成物與上文介紹的ⅢG相似，區別是來自非ⅢB毒株的env氨基酸序列用于確定整個可變區(V1-V5)最適密碼子使用。H．V1Jns-tPA-gp143/opt all-B/gly B(非ⅢB毒株)此構成物與ⅤG相似，區別是保留有env蛋白酶解切割位點。具有可變環缺失的HIV env疫苗構成物這些構成物可以包含有上面列舉的所有env形式(gp120、gp140、gp143、gp160、gp143/glyB)，但是具有在制備過程中缺失的gp120區內的可變環(如V1、V2和/或V3)。這些修飾的目的是為了消除那些可能封閉保守的中和抗原決定基(如CD4結合位點)暴露的肽區段。例如，下面的寡聚物可用于PCR反應，以產生導致THE C1和C2片段連接的V1/V2缺失5’-CTG ACC CCC CTG TGT GTG GGG GCT GGC AGT TGTAAC ACC TCA GTC ATT ACA CAG-3’。
實施例11用于提高env基因表達的合成基因區段的設計將基因區段轉化為具有相同的翻譯序列(除去已注明的部位)的序列，但是具有R.Lathe在研究論文中定義的可選擇密碼子用法，該論文參見J.Molec.Biol.第183卷，第1-12頁(1985)，標題是“從氨基酸序列數據推斷的合成寡核苷酸探針理論上與實踐上考慮”。下述增加HIVenv基因區段的rev非依賴型表達的方法學基于我們的假說，即已知在哺乳動物細胞中該基因不能有效地表達是整個轉錄子組成的結果。因此，利用編碼同一蛋白序列的可選擇密碼子可能在缺少rev時解除rev表達的限制。env中密碼子用法的檢查顯示高百分比的密碼子出現在那些高表達的人類基因很少的密碼子中。如下用來自Lathe等的數據描述采用的特定密碼子置換方法1．鑒定用于適合的開放閱讀框架的密碼子的定位。
2．比較野生型密碼子以觀察人類基因使用的頻率(參見Lathe等論文中表3)。
3．如果密碼子不是最常用的，則用一個基于表5中數據的最適于高表達的密碼子替換它。
4．檢查新密碼子的第三個核苷酸和緊接該第一個密碼子3’端的相鄰密碼子的第一個核苷酸。如果配對已通過此新密碼子選擇而產生5’-CG-3’，則用表達5中指示的選擇替換它。
5．重復此步驟直至已替換完整基因區段。
6．檢查新基因序列中由這些密碼子替換產生不需要序列(如“ATTTA”序列、不慎產生的內含子剪接識別位點、不需要的限制性酶切位點等)和消除這些序列的替換密碼子。
7．裝配合成基因區段并測試其改善的表達。
這些方法用于產生下列HIV env合成基因區段，以產生一個完全由最適于表達的密碼子用法組成的基因(ⅰ)gp120-C1(opt)；(ⅱ)V1-V5(opt)；(ⅲ)RRE-A/B(mut或opt)；以及(ⅳ)gp30(opt)；每個區段獲得的密碼子替代/核苷酸取代的百分率分別為56/19、73/26、78/28和61/25。這些區段的每一個都已在上文中詳細描述過，其實際序列見下文。
gp120-C1(opt)這是一個從成熟N末端到V1起始點的gp120恒定區1(C1)的基因片段，設計具有最適于表達的密碼子用法。1TGATCACAGA GAAGCTGTGG GTGACAGTGT ATTATGGCGT GCCAGTCTGG51AAGGAGGCCA CCACCACCCT GTTCTGTGCC TCTGATGCCA AGGCCTATGA101CACAGAGGTG CACAATGTGT GGGCCACCCA TGCCTGTGTG CCCACAGACC151CCAACCCCCA GGAGGTGGTG CTGGTGAATG TGACTGAGAA CTTCAACATG201TGGAAGAACA ACATGGTGGA GCAGATGCAT GAGGACATCA TCAGCCTGTG251GGACCAGAGC CTGAAGCCCT GTGTGAAGCT GACCCCCCTG TGTGTGAGTT301TAAAC
MN V1-V5 (opt)這是一對應于具有最適于表達的密碼子用法的HIV MN V1-V5(1066BP)的衍生蛋白序列的基因區段。1 AGTTTAAACT GCACAGACCT GAGGAACACC ACCAACACCA ACAACTCCAC51 AGCCAACAAC AACTCCAACT CCGAGGGCAC CATCAAGGGG GGGGAGATGA101 AGAACTGCTC CTTCAACATC ACCACCTCCA TCAGGGACAA GATGCAGAAG151 GAGTATGCCC TGCTGTACAA GCTGGACATT GTGTCCATTG ACAATGACTC201 CACCTCCTAC AGGCTGATCT CCTGCAACAC CTCTGTCATC ACCCAGGCCT251 GCCCCAAAAT CTCCTTTGAG CCCATCCCCA TCCACTACTG TGCCCCTGCT301 GGCTTTGCCA TCCTGAAGTG CAATGACAAG AAGTTCTCTG GCAAGGGCTC351 CTGCAAGAAT GTGTCCACAG TGCAGTGCAC ACATGGCATC AGGCCTGTGG401 TGTCCACCCA GCTGCTGCTG AATGGCTCCC TGGCTGAGGA GGAGGTGGTC451 ATCAGGTCTG AGAACTTCAC AGACAATGCC AAGACCATCA TCGTGCACCT501 GAATGAGTCT GTGCAGATCA ACTGCACCAG GCCCAACTAC AACAAGAGGA551 AGAGGATCCA CATTGGCCCT GGCAGGGCCT TCTACACCAC CAAGAACATC601 ATTGGCACCA TCAGGCAGGC CCACTGCAAC ATCTCCAGGG CCAAGTGGAA651 TGACACCCTG AGGCAGATTG TGTCCAAGCT GAAGGAGCAG TTCAAGAACA701 AGACCATTGT GTTCAACCAG TCCTCTGGGG GGGACCCTGA GATTGTGATG751 CACTCCTTCA ACTGTGGGGG GGAGTTCTTC TACTGCAACA CCTCCCCCCT801 GTTCAACTCC ACCTGGAATG GCAACAACAC CTGGAACAAC ACCACAGGCT851 CCAACAACAA CATCACCCTC CAGTGCAAGA TCAAGCAGAT CATCAACATG901 TGGCAGGAGG TGGGCAAGGC CATGTATGCC CCCCCCATTG AGGGCCAGAT951 CAGGTGCTCC TCCAACATCA CAGGCCTGCT GCTGACCAGG GATGGGGGGA1001 AGGACACAGA CACCAACGAC ACCGAAATCT TCAGGCCTGG GGGGGGGGAC1051 ATGAGGGACA ATTGG
RRE.Mut(A)這是對應于HIV-1的rev反應元件(RRE)的由最適于表達的密碼子用法組成的DNA區段。“A”形式也已在gp120/gp41接點處用粗體所示的核苷酸去掉了已知的蛋白質水解切割位點。1 GACAATTGGA GGAGCGAGTT ATATAAATAT AAGGTGGTGA AGATTGAGCC51 CCTGGGGGTG GCCCCAACAA AAGCTCAGAA CCACGTGGTG CAGAACGAGC101 ACCAGGCCGT GGGCATTGGG GCCCTGTTTC TGGGCTTTCT GGGGGCTGCT151 GGCTCCACAA TGGGCGCCGC TAGCATGACC CTCACCGTGC AAGCTCGCCA201 GCTGCTGAGT GGCATCGTCC AGCAGCAGAA CAACCTGCTC CGCGCCATCG251 AAGCCCAGCA GCACCTCCTC CAGCTGACTG TGTGGGGGAT CAAACAGCTT301 CAGGCCCGGG TGCTGGCCGT CGAGCGCTAT CTGAAAGACC AGCAACTCCT351 AGGC
RRE.Mut(B)這是對應于HIV-1的rev反應元件(RRE)的由最適于表達的密碼子用法組成的DNA區段。“B”形式在gp120/gp41接點處保留已知的蛋白質水解切割位點。1 GACAATTGGA GGAGCGAGTT ATATAAATAT AAGGTGGTGA AGATTGAGCC51 CCTGGGGGTG GCCCCAACAA AAGCTAAGAG AAGAGTGGTG CAGAGAGAGA101 AGAGAGCCGT GGGCATTGGG GCCCTGTTTC TGGGCTTTCT GGGGGCTGCT151 GGCTCCACAA TGGGCGCCGC TAGCATGACC CTCACCGTGC AAGCTCGCCA201 GCTGCTGAGT GGCATCGTCC AGCAGCAGAA CAACCTGCTC CGCGCCATCG251 AAGCCCAGCA GCACCTCCTC CAGCTGACTG TGTGGGGGAT CAAACAGCTT301 CAGGCCCGGG TGCTGGCCGT CGAGCGCTAT CTGAAAGACC AGCAACTCCT351 AGGC
gp32(opt)這是從AvrⅡ位點(緊接RRE末端開始)到gp143末端的由最適于表達的密碼子用法構成的gp32基因區段。1 CCTAGGCA TCTGGGGCTG CTCTGGCAAG CTGATCTGCA CCACAGCTGT51 GCCCTGGAAT GCCTCCTGGT CCAACAAGAG CCTGGAGCAA ATCTGGAACA101 ACATGACCTG GATGGAGTGG GACAGAGAGA TCAACAACTA CACCTCCCTG151 ATCCACTCCC TGATTGAGGA GTCCCAGAAC CAGCAGGAGA AGAATGAGCA201 GGAGCTGCTG GAGCTGGACA AGTGGGCCTC CCTGTGGAAC TGGTTCAACA251 TCACCAACTG GCTGTGGTAC ATCAAAATCT TCATCATGAT TGTGGGGGGC301 CTGGTGGGGC TGCGGATTGT CTTTGCTGTG CTGTCCATTG TGAACCGGGT351 GAGACAGGGC TACTCCCCCT AATAAGCCCG GGCGATATC
SRV-1 CTE(A)這是對應于來自猿猴逆轉錄病毒-1基因組的3’-UTP的合成基因區段。該DNA按下面的方向置于HIV基因的3’末端，以增加不依賴rev的表達。
SrfⅠ EcoRV5′ -GCCC GGGC GATATC TA GACCACCTCC CCTGCGAGCT AAGCTGGACAGCCAATGACG GGTAAGAGAG TGACATTTTT CACTAACCTA AGACAGGAGGGCCGTCAGAG CTACTGCCTA ATCCAAAGAC GGGTAAAAGT GATAAAAATGTATCACTCCA ACCTAAGACA GGCGCAGCTT CCGAGGGATT TGTCGTCTGTTTTATATATA TTTAAAAGGG TGACCTGTCC GGAGCCGTGC TGCCCGGATGATGTCTTGG GATATC GCCC GGGC -3′EcoRV SrfⅠ
SRV-1 CTE(B)此合成基因區段與上文所示SRV-1 CET(A)相同，區別是使用一個單核苷酸突變(用粗體表示)以消除一段ATTTA序列。此序列與較高的mRNA更新有關。
SrfⅠ EcoRV5′-GCCC GGGC GATATC TA GACCACCTCC CCTGCGAGCT AAGCTGGACAGCCAATGACG GGTAAGAGAG TGACATTTTT CACTAACCTA AGACAGGAGGGCCGTCAGAG CTACTGCCTA ATCCAAAGAC GGGTAAAAGT GATAAAAATGTATCACTCCA ACCTAAGACA GGCGCAGCTT CCGAGGGATT TGTCGTCTGTTTTATATATA TTAAAAAGGG TGACCTGTCC GGAGCCGTGC TGCCCGGATGATGTCTTGG GATATC GCCC GGGC -3′EcoRV SrfⅠ實施例11體外gp120疫苗的表達在轉染的人類橫紋肌肉瘤(RD)細胞中測試這些構成物的體外表達。從轉染的RD細胞分泌的tPA-gp120定量研究表明V1Jns-tPA-gp120載體產生分泌型gp120。體內gp120疫苗參見圖12(小鼠數據)V1Jns-tPA-gp120MNPNV誘導型Ⅱ類MHC限制性T淋巴細胞的gp120特異性抗原反應性。處死已用200μg V1Jns-tPA-gp120MN疫苗接種兩次的Balb/c小鼠，取其脾臟以在體外測定輔助T淋巴細胞對重組gp120的反應性。用PBMC(外周血單核細胞)用5μg/ml重組gp120ⅢB(Repligen，目錄號#RP1016-20)與4×105個細胞/ml進行T細胞增殖檢驗。通過在單獨培養基中培養這些細胞來獲得這些細胞攝入3H-胸苷的基礎水平，同時用2μg/ml的ConA刺激誘導最大增殖。ConA誘導的反應峰出現于大約第3天(at～3days)，并在此時刻與培養基對照樣本一起收獲，而用抗原處理的樣本與另一種培養基對照在第5天收獲。接種疫苗的小鼠的反應與天然的、年齡相匹配的同種系小鼠相比較。正如所期望的那樣，天然和免疫小鼠中的ConA陽性對照都產生很高的增殖。在接種疫苗的小鼠中用gp120處理得到非常強的輔助T細胞記憶反應，而天然小鼠中卻沒有反應(特異性反應性的閾值是＞3-4的刺激指數(SI)；SI值通按樣本cpm/培養基cpm的比值計算)。分別與抗gp120ELISA效價5643和11,900比較，接種疫苗的小鼠得到的SI分別是65和14。令人感興趣的是，對這兩種小鼠而言，對抗體較高的應答者比抗體效價較低的那些小鼠給出顯著低的T細胞反應性。此實驗表明分泌型gp120載體在體內有效地激活輔助T細胞和產生強抗體反應。此外，這些免疫應答的每一個均可用抗原測定，該抗原與那些由接種PNV(ⅢB對MN)編碼抗原相比是異源性的。
實施例12gp160疫苗除了分泌型gp120構成物以外，我們已制備了用于全長的膜結合gp160的表達構成物。除了gp120以外，gp160構成物的基本原理是(1)可利用更多的抗原決定基用于CTL刺激和包括gp41在內的中和抗體的產生，將有效的HIV中和單克隆抗體(2F5，見上文)導向所述抗原決定基；(2)可以得到與病毒產生的gp160相關的更天然的蛋白質結構；(3)膜結合的流感HA構成物免疫原性的成功[Ulmer等，Science 259:1745-1749,1993；Montgomery,D.等，DNA and Cell Biol.,12:777-783,1993]。gp160即使具有異源性前導肽序列，仍保留了實質的rev依賴性，因此制備進一步的構成物以在缺乏rev時增加表達。
實施例13Hiv細胞毒性T淋巴細胞的測定本節描述的方法闡明用于接種疫苗小鼠的測定。基本類似的分析可以用于靈長類，除了必須建立同源B細胞系以用作每種動物的靶細胞。這在人類可通過用EB病毒，而在恒河猴可用乙型皰疹病毒而完成。
外周血單核細胞(PBMNC)或來源于新鮮抽取的血液或來源脾臟，用Ficoll-Hypaque離心從白細胞中分離紅細胞；而對小鼠也可取用淋巴結。或通過體外在IL-2(20U/ml)和伴刀豆球蛋白A(2μg/ml)中培養6-12天或者使用特異性抗原，用等量的輻射抗原提呈細胞由PBMC中制備效應CTL。特異性抗原可以或者由合成肽(通常為9-15個氨基酸)組成，所述肽是CTL識別所用動物的MXC單倍型的已知抗原決定基；或者由設計表達合適抗原的痘苗病毒構成物組成。靶細胞不是同源細胞系，就是單倍型匹配的細胞系，所述細胞系已經過處理而呈現所述的合適抗原，用于體外刺激CTL。對Balb/c小鼠，P18肽(ArgIleHisIleGlyProGlyArgAlaPheTyrThrThrLysAsn,SEQ.ID:51:，用于HIV MN毒株)可以以10μM的濃度使用，以在體外用放射性同源脾細胞來再刺激CTL，并可以在細胞毒性分析中，在分析前通過在37℃培養約2小時而用于以1-10μM致敏靶細胞。對這些H-2dMHC單倍型小鼠而言，鼠肥大細胞系P815提供良好的靶細胞。通過在37℃下培養靶細胞1-2小時(～5×106細胞0.2mCi)，隨后清洗幾次靶細胞，抗原致敏的靶細胞中負載有在CTL殺傷時從靶細胞內部釋放的Na51CrO4。CTL群體與靶細胞按效應物與靶細胞的不同比例比例(例如100∶1、50∶1、25∶1等等)混合，一起沉淀，在收獲上清液前于37℃培養4-6小時，然后用r計數器檢驗上清液中放射性釋放量。細胞毒性以靶細胞(用0.2％TritonX-100處理得到)的總釋放量的百分率計算，這些靶細胞的自發釋放量已被扣除。
實施例14HIV專一性抗體的檢驗設計ELISA法，不是用特定的重組蛋白就是用合成肽作為底物抗原，來檢測針對HIV產生的抗體。用PBS(磷酸緩沖鹽水)溶液中的2μg/ml重組抗原，按每孔50μl于40℃在搖床上過夜包被96孔微量孔板。或者由抗原中重組蛋白(gp120,rev:Replign Corp；gp180,gp41:AmericanBio-technologies,Inc.)或者由合成肽(來源于ⅢB等的與病毒分離物序列相應的V3肽American Bio-technologies,Inc.；對于單克隆抗體2F5的gp41抗原決定基)。孔板用清洗緩中液(PBS/0.05％吐溫20)沖洗4次，隨后加入200μl/孔封閉緩沖液(PBS/0.05％吐溫20中的1％石竹乳(Camation milk)溶液)于室溫下搖動約1小時。免疫前血清和免疫血清在封閉緩沖液中按所需要的稀釋范圍進行稀釋并在每孔加入100μl。孔板在室溫下搖動保溫1小時，再用洗滌緩沖液洗4次。第二抗體與用封閉緩沖液按1∶2000稀釋的辣根過氧化物酶(抗恒河猴Ig,SouththernBiotechnology Associates；抗鼠Ig和抗免Ig,Jackson Immuno Research)結合，再以100μl/孔加入每個樣本中，于室溫下搖動保溫1小時。孔板用洗滌緩沖液洗4次，再按100μl/孔加入在100mM pH4.5的檸檬酸鹽緩沖液中1mg/ml的鄰苯二胺(o-PD,Calbiochem)溶液繼續反應。孔板在450nm處在動力學上(反應的最初10分鐘)和10與30分鐘的終點時讀出吸光度(Thermomax微孔板讀板儀，Molecular Devices)。
實施例15HIV中和抗體的檢驗使用來源于接種疫苗的動物血清如下在體外進行HIV分離物中和作用測定待測血清和免疫前血清在使用前在56℃加熱60分鐘滅活。將已知效價量的HIV-1在向96孔微量孔板中的105MT-4人類淋巴細胞加入之前，加到待測血清的1∶2系列稀釋液中，然后于室溫下孵育60分鐘。病毒/細胞混合物在37℃時孵育7天，再用四唑鎓染料對培養物染色以檢定病毒介導的細胞殺傷。病毒的中和可通過防止病毒介導的細胞死亡觀測到。
實施例16臨床Hiv分離物基因的分離從用ConA處理而激活的受感染PBMC中克隆HIV病毒基因。獲得所屬病毒基因的優選方法是使用所需基因側翼的特定寡聚物，從感染的細胞基因組中用PCR方法進行擴增。第二種獲得病毒基因的方法是從感染細胞的上清液中純化病毒RNA，并從這些材料中制備cDNA再進行PCR。此方法與上述克隆鼠B7基因的方法極相似，區別是使用的PCR寡聚物，使用隨機的六聚體而非特殊的引物寡聚物以制備cDNA。
從感染細胞沉淀通過將其在STE溶液(10mM NaCl,10mMEDTA,10mM Tris-HCl,pH8.0)中裂解純化基因組DNA,STE溶液中加入的蛋白酶K和SDS的終濃度分別為0.1mg/ml和0.5％。此混合物于56℃過夜孵育，再用0.5體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提。通過加入終濃度為0.3M的醋酸鈉和2倍體積冷乙醇來沉淀水相。從溶液中沉淀DNA后，將該DNA再懸浮于0.1X TE溶液中(1X TE=10mMTris-HCl,pH8.0,1mM EDTA)。此刻加入終濃度為0.1％的SDS和2U RNA酶A，于37℃孵育30分鐘。此溶液依上法用苯酚/氯仿/異戊醇抽提，然后用乙醇沉淀。將DNA懸浮于0.1X TE中并在260nm處通過測量其紫外吸收而定量。樣本貯存于-20℃貯存直至用于PCR。
用Perkin-Elmer Cetus試劑盒和方法進行PCR，所用的gp160有義和反義寡聚物分別是5’-GA AAG AGC AGA AGA CAG TGG CAATGA-3’和5’-GGG CTT TGC TAA ATG GGT GGC AAG TGG CCCGGG C ATG TGG-3’，這些寡聚物在所形成的DNA片段3’末端加入一個SrfⅠ位點。產生于PCR的區段克隆入或是V1Jns或是V1R疫苗接種載體中，通過DNA序列分析證實V3區域以及連接接點。
實施例17T細胞增殖檢驗得到PBMCs并檢驗通過PBMC群落中的增殖測定而測試對特定抗原的回憶反應。用在收獲前加入到細胞培養物中保溫最后18-24小時的3H-胸苷來監測增殖。如果增殖已發生，細胞收獲物在濾膜上保留含同位素的DNA，而休眠的細胞沒有加入同位素，同位素以游離形式不保留在濾膜上。將嚙齒類或靈長類物種的4×105細胞鋪在96孔微量滴定板上中總共200μl的完全培養基(RPMI/10％胎牛血清)中。用PBMC和單獨的培養基確定背景增殖反應，同時利用1-5μl/ml濃度的凝集素(例如植物凝集素(PHA)或伴刀豆球蛋白(ConA))以作為陽性對照，來產生非專一性反應。專一性抗原由或已知肽抗原決定基、純化的蛋白質，或滅活病毒組成。抗原濃度范圍對肽為1-10μM，對蛋白質為1-10μg/ml。凝集素誘導的增殖在細胞培養保溫的第3-5天到達最高點，而抗原專一性反應在第5-7天到達最高點。當得到至少高于培養基背景三倍的輻射計數時，發生特異性增殖，輻射計數常給出與背景之比值，或刺激指數(SI)。已知HIV gp160包含幾個已知引起gp160/gp120免疫的或HIV感染的個體的T細胞增殖的幾種肽。這些肽中最常用的是T1(LysGlnIleIleAsnMetTrpGlnGluValGlyLysAlaMetTyrAla)；T2(HisGluAspIleIleSerLeuTrpAspGlnSerLeuLys)；和TH4(AspArgValIleGluValValGlnGlyAalTyrArgAlaIleArg)。已證實這些肽刺激來自于抗原致敏的小鼠、非人類靈長類動物和人類的PBMC增殖。
實施例18載體V1R的制備在繼續優化我們的基礎接種疫苗載體的努力中，我們制備了一個命名為V1R的V1Jns衍生物。構建這一載體的目的是為了獲得最小尺寸的疫苗載體，即沒有不必要的DAN序列，這個載體仍保留V1J和V1Jns提供的總體最佳化的異源基因表達特征和高的質粒產量。我們從文獻和通過實驗確定(1)可以除掉該pUC骨架之中的包含大腸桿菌復制起點的區域，而不影響來自細菌的質粒產量；(2)如果插入一細菌終止子替代卡那霉素開放閱讀框架后的Kanr基因的3’區域，該區域可以去除掉，并且(3)來自BGH終止子的3’一半的大約300bp可以去除，而不影響它的調節功能(在BGH元件之中的原始KpnⅠ限制性酶切位點后面)。
通過利用PCR來分別合成源于V1Jns代表CMVintA啟動子/BGH終止子、復制起點和卡那霉素抗性元件的三個DNA區段，來構建V1R。用所述PCR寡聚物將用于每一區段的獨特限制性酶切位點加入每一片段末端SspⅠ和XholⅠ用于CMVintA/BGH；EcoRV和BamHI用于Kanr基因；和BclⅠ和SalⅠ用于Orir。選擇這些酶切位點，因為它們允許定向連接PCR衍生的每個DNA區段，隨后喪失每一位點EcoRV和SspⅠ留下適宜連接的平端DNA，而BamHI和BclⅠ留下互補的突出，SalⅠ和Xhol也一樣。通過PCR獲得這些區段后，用上面所提到的合適的限制性內切酶消化每一區段，然后在含有全部三種DNA區段的單一反應混合物中將每一區段連接起來。將Orir的5’末端設計成包括通常在這一區域內發現的不依賴T2 rho的終止子序列，以至于它能夠提供卡那酶素抗性基因的終止信息。用限制性酶消化(＞8種酶)和通過連接位點的DNA測序來確認該連接產物。產生DNA質粒，用V1R之中的病毒基因的異源性表達似乎類似于V1Jns。獲得的載體大小上的凈降低值是1346bp(V1Jns=4.86kb；V1R=3.52kb)，見圖11,SEQ.ID:45:。
用來合成V1R的PCR寡聚物序列(下劃線的是選擇性酶切位點，并序列后的括號中鑒定)
(1)5′-GGT ACA AAT ATT GG CTA TTG GCC ATT GCA TACG-3′[SspⅠ],SEQ.ID:,(2)5′-CCA CAT CTC GAG GAA CCG GGT CAA TTC TTC AGCACC-3′[XhoⅠ],SEQ.ID::
(用于CMVintA/BGH區段)(3)5′-GGT ACA GAT ATC GGA AAG CCA CGT TGT GTC TCAAAA TC-3′[EcoRV],SEQ.ID::
(4)5′-CCA CAT GGA TCC G TAA TGC TCT GCC AGT GTTACA ACC-3′[BamHI],SEQ.ID::
(用于卡那霉素抗性基因區段)(5)5′-GGT ACA TGA TCA CGT AGA AAA GAT CAA AGG ATCTTC TTG-3′[BclⅠ],SEQ.ID::,(6)5′-CCA CAT GTC GAC CC GTA AAA AGG CCG CGT TGCTGG-3′[SalⅠ],SEQ.ID::
(用于大腸桿菌的復制起點)用下面的寡聚物對V1R的連接接點進行測序5’-GAG CCA ATA TAA ATG TAC-3’,SEQ.ID::[CMVintA/kanr接點]5’-CAA TAG CAG GCA TGC-3’,SEQ.ID::[BGM/ori接點]5’-G CAA GCA GCA GAT TAC-3’,SEQ.ID::[ori/kanr接點]實施例19HIV晚期基因產物的異源性表達例如env和gag的HIV結構基因需要HIV調節基因rev的表達，以有效地生產全長的蛋白質。我們已發現rev依賴性的gag表達產生低水平的蛋白質，且rev自身對細胞是有毒性的。盡管我們得到了體外相對高水平的rev依賴性的gp160表達，但在體內用rev/gp160 DNA免疫后，這個疫苗誘出低水平的針對gp160的抗體。這可能是因為已知的rev細胞毒性和在含有數以百計的核的肌小管中獲得rev功能的日益增加的困難(rev蛋白需要與rev依賴性轉錄物在同一核中，以便表達gag或env蛋白)。然而，用選擇性修飾的env基因來獲得不依賴rev的表達已是可能的。1．不依賴rev的env表達一般來說，我們的疫苗已利用了原始HIV(ⅢB)的env和gag基因，來使我們泛化的疫苗接種載體V1Jns的表達最佳化，V1Jns是由一CMV立即早期(IE)啟動子、一BGH來源的多腺苷酸化和翻譯終止序列以及pUC骨架組成。根據所用的是多大的基因區段(例如gp120對gp160)，通過用從組織專一性血纖維蛋白質溶酶激活子(tPA)基因的前導肽取代它的天然分泌性前導肽，并在具有CMV內含子A的CMVIE啟動子后面表達產生的嵌合基因，可以得到不依賴rev的env表達的不同效率。tPA-gp120是以該方式構建的分泌型gp120載體的一個實例，它所起的作用足以在接種疫苗的小鼠和猴中引起抗gp120的免疫應答。
因為據報道膜固定的蛋白質可以誘導與分泌型蛋白質相比，實質得多的(并可能對HIV中和更專一性)的抗體反應和得到額外的抗原決定基，我們制備了V1Jns-tPA-gp160和V1Jns-rev/gp160。如轉染細胞的免疫印跡分析所顯示的，不加入rev，該tPA-gp160載體產生可檢測量的gp160和gp120，盡管表達水平比從rev依賴型gp160-表達質粒rev/gp160得到的低得多。這可能是因為賦予rev對gp160轉錄物依賴性的抑制區域出現在包括在gp41的COOH末端的gp160之中的多位點上。制備一COOH末端截短形式的tPA-gp160(tPA-gp143)載體，設計該載體以通過消除這些抑制序列來提高env的總體表達水平。該gp143載體還消除包含已知引起膜蛋白轉移到溶酶體上而不是細胞表面的肽基序(例如Leu-Leu)的胞內gp41區域。這樣，與全長gp160相比，可期望gp143表達env蛋白質的水平提高(通過降低rev依賴性)和蛋白質轉移到細胞表面的效率更大，在那里在DNA疫苗接種后，這些蛋白質可能更能夠誘出抗gp160抗體。通過廣泛地沉默誘變rev反應元件(RRE)序列(350bp)來消除另外的表達抑制序列，以進一步修飾tPA-gp143。構成物gp143/mutRRE以兩種形式制備或消除(形式A)或保留(形式B)gp120/41的蛋白水解切割位點。制備了兩種形式，因為文獻報道用在牛痘中表達的不可切割的gp160疫苗接種小鼠誘出的抗體水平比可切割形式高得多。
開發了用于細胞轉染物中gp160/gp120表達的定量ELISA，來確定這些載體的相對表達能力。在體外轉染293細胞后定量測定細胞結合型對分泌/釋放型gp120產生下列結果(1)tPA-gp160表達的gp120比rev/gp160少5-10倍，胞內對從細胞表面釋放的比例與此相似。(2)tPA-gp143產生的gp120分泌比rev/gp160大3-6倍，僅具有低水平的細胞結合gp143，這證明gp160的胞質尾部引起gp160的胞內滯留，這一現象能通過部分缺失這一序列來克服；并且(3)tPA-gp143/mutRRE A和B產生的蛋白表達水平比親本tPA-gp143大～10倍，同時證明消除形式A的蛋白酶解加工。
因此，我們增加不依賴rev的表達的策略已導致了在總體表達水平上的逐漸增加，并使膜固定的gp143遠離溶酶體、重導向細胞表面上。重要的是注意到這是一種種屬構成物，在該構成物的載體盒中應該可能插入得自不同原始病毒分離物的gp120序列，所述載體盒含有或在NH2末端(tPA前導序列)或在COOH末端(gp41)存在的這些修飾，在NH2末端和COOH末端不同的病毒毒株間幾乎沒有抗原差異。2．得自臨床分離物的gp120的表達為將這些表達策略應用到與疫苗目的有關的病毒上，并證明我們方法的通用性，我們還制備了得自原始HIV分離物(含有北美人的共有V3肽環；巨噬細胞向性的和非合胞體誘導表型)的一tPAgp120載體。這個載體在被轉染的293細胞中給出gp120的高度表達/分泌，并在鼠中誘出抗gp120抗體，因此表明它是以功能形式克隆的。也將原始分離物gp160基因以與得自實驗室毒株的gp160的同樣方式用于表達。B．對HIV1 env多核苷酸疫苗的免疫應答小鼠中疫苗接種途徑對免疫應答的作用在努力提高gp160表達的同時，我們利用了tPAgp120 DNA構成物來評價免疫應答和擴大它們的方式。在小鼠中以100、10、和1μg的劑量比較了該載體肌內(i.m.)和皮內(i.d.)接種疫苗的途徑。在所有三種劑量水平接種2-3次后的所有接受者中，兩種途徑的疫苗接種都誘出抗體反應(GMT=103-104)。每條途徑誘出具有清楚的劑量依賴型反應的相似的抗gp120抗體效價。然而，我們觀察到i.d.疫苗接種的反應變異性較大，特別是在初次接種后的低劑量時。而且，正如用在體外抗原專一性增殖和細胞因子分泌測定的，輔助T細胞反應在i.m.接種疫苗后比i.d.接種疫苗的反應高。我們的結論是與i.m.接種相比，該疫苗的i.d.接種不提供任何益處。2．在小鼠中gp120 DNA疫苗介導的輔助T細胞免疫gp120 DNA疫苗接種在所有被檢驗的淋巴區(脾臟、血液、腹股溝淋巴結、腸系膜淋巴結和髂骨淋巴結)產生強有力的輔助T細胞反應，并具有TH1樣的細胞因子分泌特征(即產生g-干擾素和IL-2，幾乎沒有或沒有IL-4)。這些細胞因子一般促進強細胞免疫，并與維持HIV陽性血清病人的無病狀態有關聯。已經表明淋巴結是HIV復制的主要部位，即使當在血液中不容易檢測到病毒時，淋巴結仍含有大儲藏量的病毒。一個能夠在許多淋巴部位誘出抗HIV免疫應答的疫苗，例如我們用我們的DNA疫苗顯示的，可以有助于阻止初次感染后淋巴管的成功移生。3．env DNA疫苗介導的抗體反應接受gp120 DNA疫苗的非洲綠猴(ACGM)和恒河猴(RHM)在接種疫苗2-3次后，顯示低水平的中和抗體，這不能通過另外的疫苗接種來增加。這些結果和在HIV疫苗領域日益增加的認識引導我們致力于得到基于gp160的載體(見上面)的有效表達，所述認識是對于誘出中和抗體，寡聚gp160可能是一比gp120單體更合適的靶抗原。小鼠和AGM也用原始分離物來源的tPA-gp120疫苗來接種。這些動物顯示出的抗V3肽(用同源性序列)交互終點抗體效價的范圍為500～5000，這證實這個疫苗設計對于臨床有關的病毒分離物是有作用的。
基于gp160的疫苗rev-gp160和tPA-gp160在小鼠和非人類靈長類動物中不能持續地誘出抗體反應，或產生低的抗體效價。我們用tPA-gp143質粒的最初結果在鼠中和AGM中兩次接種后，產生的幾何平均效價(GMT)＞103。這些數據提示我們通過提高表達水平和更有效地將env胞內轉移到細胞表面上，已顯著改善了gp160樣疫苗的免疫原性。這個構成物和tPA-gp143/mutRRE A和B載體，將繼續記述其抗體反應特征，特別是病毒中和特征。4．在猴中env DNA疫苗介導的CTL反應我們繼續闡明已用gp120和gp160/IRES/rev DNA疫苗免疫的RHM的CTL反應特征。接受這一疫苗的所有的四只猴子在兩次接種后顯示顯著的Ⅰ類MHC限制的CTL活性(在效應物/靶=20下20％-35％的專一性殺傷)。在第四次接種疫苗后，在類似的試驗條件下，這些活性增加到50-60％殺傷力，這表明額外的疫苗接種明顯地加強反應。CTL活性在最后一次接種后，在它們的峰值水平的約50％處保持至少7個月，這表明已建立了長期記憶。
權利要求
1．合成的多核苷酸，包含編碼HIV env蛋白或其片段的DNA序列，該DNA序列包含最適宜在哺乳動物宿主中表達的密碼子。
2．權利要求1的多核苷酸，它選自V1Jns-tPA-HIVMNgp120；V1Jns-tPA-HIVⅢBgp120；V1Jns-tPA-gp140/mutRRE-A/SRV-13′-UTR；V1Jns-tPA-gp140/mutRRE-B/SRV-13′-UTR；V1Jns-tPA-gp140/opt30-A；V1Jns-tPA-gp140/opt30-B；V1Jns-tPA-gp140/opt all-A；V1Jns-tPA-gp140/opt all-B；V1Jns-tPA-gp140/opt all-A；V1Jns-tPA-gp140/opt all-B；V1Jns-rev/env:；V1Jns-gp160；V1Jns-tPA-gp160；V1Jns-tPA-gp160/opt C1/opt41-A；V1Jns-tPA-gp160/opt C1/opt41-B；V1Jns-tPA-gp160/opt all-A；V1Jns-tPA-gp160/opt all-B；V1Jns-tPA-gp160/opt all-A；V1Jns-tPA-gp160/opt all-B；V1Jns-tPA-gp143；V1Jns-tPA-gp143/mutRRE-A；V1Jns-tPA-gp143/mutRRE-B；V1Jns-tPA-gp143/opt32-A；V1Jns-tPA-gp143/opt32-B；V1Jns-tPA-gp143/SRV-13′-UTR；V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32A；V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32B；V1Jns-tPA-gp143/opt all-A；V1Jns-tPA-gp143/opt all-B；V1Jns-tPA-gp143/opt all-A；V1Jns-tPA-gp143/opt all-B；V1Jns-tPA-gp143/opt32-A/glyB；V1Jns-tPA-gp143/opt32-B/glyB；V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32-A/glyB；V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32-B/glyB；V1Jns-tPA-gp143/opt all-A/glyB；V1Jns-tPA-gp143/opt all-B/glyB:V1Jns-tPA-gp143/opt all-A/glyB；V1Jns-tPA-gp143/opt all-B/glyB；和它們的組合物。
3．權利要求1的多核苷酸，它導入包括人組織的脊椎動物組織時，誘導抗-HIV中和抗體、HIV特異性T細胞免疫應答或體內保護性免疫應答，其中該多核苷酸包含編碼HIV gag、gag-蛋白酶或env基因產物的基因。
4．在脊椎動物中誘導針對HIV抗原決定基的免疫應答的方法，它包括將1ng-100mg的權利要求1的多核苷酸導入該脊椎動物的組織中。
5．在脊椎動物中誘導針對HIV毒性毒株引起的感染或疾病的免疫應答的方法，它包括將權利要求1的多核苷酸導入脊椎動物的組織中。
6．權利要求5的方法，它還包括給予減毒的HIV、殺死的HIV、HIV env蛋白、HIV gag蛋白、HIV pol蛋白和它們的組合物。
7．針對HIV感染的疫苗，它包含權利要求1的多核苷酸和藥學上可接受的載體。
8．在靈長類動物中誘導抗-HIV免疫應答的方法，它包括將權利要求1的多核苷酸導入該靈長類動物的組織中，并同時胃腸外給予白細胞介素12。
9．誘導刺激細胞毒性的輔助T-細胞增殖的抗原提呈細胞的效應物功能(包括對HIV抗原專一性的淋巴因子分泌)的方法，它包括將脊椎動物的細胞在體內顯露于權利要求1的多核苷酸。
10．增加編碼HIV蛋白或其片段的DNA表達的方法，包括(a)鑒定適宜的開放閱讀框架的密碼子的位置；(b)比較野生型密碼子觀察到的人類基因所使用的頻率；(c)用最適于人類基因高表達的密碼子取代野生型的密碼子；并(d)檢測提高的表達。
全文摘要
提供編碼HIV基因的合成DNA分子和HIV基因的修飾。所述合成分子的密碼子用預定宿主細胞優選的密碼子。所述合成分子可作為多核苷酸疫苗使用,這種疫苗通過中和抗體和細胞介導的免疫,來提供針對HIV感染的有效免疫預防。
文檔編號A61K31/711GK1216064SQ97193817
公開日1999年5月5日 申請日期1997年2月18日 優先權日1996年2月22日
發明者J·W·施維爾, M·E·達維斯, D·C·弗雷德, M·A·劉, H·C·佩爾賴 申請人:麥克公司