白三烯b4或其類似物作為抗病毒劑和抗腫瘤劑的用途的制作方法

專利名稱：白三烯b4或其類似物作為抗病毒劑和抗腫瘤劑的用途的制作方法
背景技術：
(a)發明領域本發明涉及白三烯B4(LTB4)的抗病毒活性，并涉及白三烯B4(LTB4)作為治療由人和動物病毒引起之病毒感染的治療劑的用途。
(b)現有技術的描述很多折磨人類的重要傳染病是由病毒引起的。一些傳染病之所以重要是由于它們經常是致命的；這些傳染病是狂犬病，天花，脊髓灰質炎，肝炎，黃熱病，免疫缺損和多種腦炎。其它傳染病也重要的原因是它們極具傳染性，并會出現急性不適，如流感，麻疹，腮腺炎和水痘，以及呼吸道-胃腸道不適。如風疹的其它傳染病和巨細胞病毒可導致先天性異常。最后，還有已知為腫瘤病毒的病毒，該病毒可導致人和動物的腫瘤和癌癥。
在病毒中，皰疹病毒家族有很高的研究價值。皰疹病毒在自然界中極易傳播，而且對人類極具病原性。例如，已知Epstein-Barr病毒(EBV)可導致童年后期，青春期或年輕人中的傳染性單核細胞增多癥。急性傳染性單核細胞增多癥的特點是咽喉疼痛，發燒，頭痛，淋巴結病，扁桃體腫大和外周血中淋巴細胞的異常分裂。其它現象經常包括輕度肝炎，脾大和腦炎(參見MillerG.，病毒學，B.N.Fields和D.M.Knipe編，Raven出版社，1990,1921-1958頁)。EBV也與兩種形式的癌癥有關非洲Burkitt's淋巴瘤(BL)和鼻咽癌(NPC)。在赤道非洲的地方性流行病區域，BL是最常見的童年期惡性腫瘤，在兒童中約80％的癌癥是BL。盡管在北美白種人中只觀察到適量的NPC，但NPC是中國南部26-55歲年齡段的人當中最常見的癌癥之一。EBV與巨細胞病毒類似，也與移植后的淋巴增殖性疾病相關，該病是實體器官或骨髓移植后慢性免疫抑制的潛在致命的并發癥。
另一種皰疹病毒，即單純皰疹病毒1型(HSV-1)被鑒定為齦口炎的病原體。齦口炎的表現是發燒，咽喉疼痛和口腔潰瘍及小泡損害。HSV引起的最嚴重的臨床狀態是原發性生殖器皰疹感染。盡管HSV-1能導致生殖器皰疹感染，但HSV-2是與此病相關的主要病毒。與這種HSV感染相伴隨的是小水泡，膿皰和導致生殖器部分損害的潰瘍，還可能會遇到尿潴留綜合征。80％以上的人對HSV-1或HSV-2呈血清陽性，已經研究出的成果表明復發或病毒重新激活的頻率高達60％。其它疾病也與HSV相關，所述疾病如皮膚感染和包括脈絡膜視網膜炎和角膜結膜炎的眼感染。在美國，每年診斷出約30萬例眼部HSV感染。
人皰疹病毒-6(HHV-6)對免疫系統的細胞具有顯著的向性，因此，HHV-6感染可導致免疫應答的改變。現在已清楚地知道HHV-6是作為兒童初次感染的嬰兒薔薇疹(exanthem subitum)的病因。最新研究表明相當比例的移植前呈血清陽性的器官移植受體顯示出免疫抑制之后重新激活的血清學證據。非嗜異的單核細胞增多癥類疾病和非甲非乙肝炎也與活躍的HHV-6感染有關。經常從患有人免疫缺損病毒(HIV)感染的患者中分離HHV-6。從HIV和HHV-6可寄生于相同的靶細胞中這一事實推測出在HIV-血清陽性患者向有癥狀的AIDS發展的過程中，HHV-6感染可能起輔因子的作用。最新研究也暗示人皰疹病毒與HIV疾病密切相關。實際上，已發現一種主要出現于被HIV感染的人當中的腫瘤，即卡波西肉瘤(KS)具有傳染性的病因學。盡管此病毒已被稱為KS-相關的皰疹病毒，但其正式的分類可能是HHV-8。
自從本世紀80年代早期，已鑒定出一種新的疾病，并將它稱之為獲得性免疫缺損綜合征(AIDS)。人免疫缺損病毒(HIV)屬于逆轉錄病毒科家族，已知它是AIDS的病原體。人的HIV感染可導致多種疾病狀態，如單核細胞增多癥類綜合征，長期無癥狀的感染和AIDS。AIDS相關疾病包括卡波西肉瘤，肺炎，慢性腹瀉，腦膜炎，弓形體病，腦病，肝腸癌和B-淋巴細胞淋巴瘤。急性感染的有所區別的綜合征包括淋巴結病，發燒，肌痛，關節痛，頭痛，疲勞，腹瀉，咽喉疼痛和神經學表現。
目前為人接受的是HIV由3種主要的途徑傳遞a)性接觸，b)被污染的血液，c)由母親向胎兒傳播。通過病毒包膜蛋白gp120和細胞表面受體CD4的相互作用，人的多種器官和組織可被HIV侵害，包括骨髓，淋巴結，血液，腦和皮膚。
1993年底，據估計有1400萬個個體已感染了HIV，到2000年時，此數字可高達2400萬。目前，藥物治療僅局限于使用抗病毒藥物(特別是3-疊氮-3′-脫氧胸苷，AZT)，也局限于很多偶發感染的治療。然而，那些治療在控制HIV感染方面仍不是完全有效，因此，用于治療HIV感染的新分子的合成應給予足夠的重視。
在所有傳染性疾病中，療法的效力經常取決于宿主的免疫應答，對于皰疹病毒而言尤其如此。實際上，在免疫減弱的患者中，所有皰疹病毒建立潛伏感染的能力導致非常高的重新激活感染發病率。在腎移植受體中，40％-70％重新激活了潛伏的HSV感染，80％-100％重新激活了CMV感染。在HIV陽性患者(AIDS)中也觀察到這種病毒重新激活。
目前，用于治療病毒感染的治療劑的數目相對有限。治療皰疹病毒感染中所用的主要化合物是碘苷，阿糖腺苷，無環鳥苷和丙氧鳥苷，最新使用的是泛西洛維，它在體內可轉化為噴西洛維。它們的效力是有限的，并可導致很多副作用。據報道，在使用僅用于治療眼部HSV感染的碘苷治療的患者中，35％的患者有變應性反應。阿糖腺苷最常見的副作用是胃腸道不適(15％的患者)。無環鳥苷主要的副作用是腎功能的改變。由于無環鳥苷是既能摻入病毒DNA也能摻入宿主細胞DNA的核苷類似物，因此宿主細胞的正常分裂會受影響。丙氧鳥苷最重要的副作用是發生于約40％的AIDS患者中的嗜中性白細胞減少癥和血小板減少癥。
因此，迫切需要開發更有效的治療劑以治療病毒感染，同時具有較少的副作用。
白三烯B4(LTB4)[5S,12R-6,8,10,14(Z,E,E,Z)-廿碳四烯酸楚]是已知的天然分子。LTB4是衍生自5-脂氧合酶途徑的廿碳四烯酸的代謝物。LTB4具有很多已報道的生物活性。具體地說，LTB4被認為是有效的前-炎性化合物；其最重要的生物活性是對白細胞的趨化和化學增活作用。實際上，已顯示出LTB4在體外和體內都是人多形核白細胞，單核細胞和巨噬細胞的強有力的化學吸引劑(chemo-attractant)。LTB4也激活其它的白細胞功能，如脫粒和超氧陰離子合成。由于這些前-炎性效應，LTB4被認為是防御機制中推定的成分。另外，LTB4由如多形核白細胞，單核細胞和巨噬細胞的炎性細胞合成，也可由淋巴細胞合成。
LTB4也顯示出可產生免疫調節的活性，實際上，在人外周血單核白細胞培養物中發現LTB4可誘導抑制性細胞的活性；被誘導的抑制性細胞的活性可抑制人淋巴細胞對促細胞分裂劑的增殖反應(Rola-PleszczynskiM.等人，Biochem.Biophys.Res.Comm,1982,108:1531)。也已顯示出LTB4可增強人類天生的細胞毒細胞活性，該活性針對的是K562紅白血病細胞和未被感染或被單純皰疹病毒Ⅰ型(HSV-1)持續感染的人前列腺癌MA-160細胞(Rola-PleszczynskiM.等人，Biochem.Biophys.Res.Comm,1983,113:531；GagnonL.等人，細胞免疫學，1987,110:243)。其它研究顯示除了LTB4,LTA4,LTD4外，5-過氧羥基(hydroperoxy)-廿碳四烯酸和15-過氧羥基-廿碳四烯酸也能增強人天生的殺傷細胞細胞毒性(Rola-PleszczynskiM.等人，前列腺素白三烯藥物(Prostaglandins LeukotrienesMed),1984,13:113；Bray,RA.等人，免疫學雜志，1986,136:1783)。
結構與LTB4相關，被總稱為前列腺素(前列腺素A,B,D,J,E和I)的分子家族已被多次闡明可在體外和體內系統產生抗病毒和抗癌活性。與LTB4相同，前列腺素衍生自廿碳四烯酸，但起源于不同的生物合成途徑，即環加氧酶途徑。
Sugiura等人于1987年8月25日公布的美國專利4,689,426中描述了與前列腺素A或D相關的環戊烯酮衍生物具有抗腫瘤和抗病毒活性。
盡管一些前列腺素顯示出具有抗病毒活性，但它們會引起不必要的副作用，并顯示出相對較低的活性。
很有必要提供具有較高效力，并且不存在已知抗病毒劑不必要的副作用的抗病毒劑。
發明概述本發明的一個目的是提供抗病毒劑及其用途，其對于預防和治療病毒感染會更加有效，并且不存在已知抗病毒劑不必要的副作用。
本發明的另一個目的是提供抗病毒劑，該抗病毒劑可用于預防或治療由如逆轉錄病毒，乳頭瘤病毒，腺病毒和皰疹病毒的腫瘤病毒引起的癌癥。
本發明的另一個目的是提供抗病毒劑，該抗病毒劑可用于預防或治療免疫抑制的病人和動物中的病毒感染。
本發明的另一個目的是提供抗腫瘤劑以治療癌癥。
根據本發明的一個方面，提供了藥物可接受的治療有效量的白三烯B4(LTB4)藥劑用于預防或治療人或動物中的病毒感染的用途。
根據本發明的另一個方面，提供了抗病毒的藥物組合物，其中含有藥物可接受的治療有效量的LTB4藥劑和藥物可接受的載體。
因此，根據本發明提供了白三烯B4(LTB4)藥劑作為例如抗皰疹病毒的抗病毒劑的用途，所述皰疹病毒選自由EBV,HSV-1,HSV-2,CMV,VZV,HHV-6,HHV-7和HHV-8組成的組中。
根據本發明提供了LTB4藥劑作為抗HIV-1和HIV-2，以及抗其它人和動物病毒的抗病毒劑的用途，所述其它病毒包括但不限于屬于微小RNA病毒的豬腸道病毒，或屬于披膜病毒的牛腹瀉病毒，或屬于副粘病毒的牛呼吸道合胞病毒。
根據本發明提供了LTB4藥劑作為抗病毒劑在與其它抗病毒劑聯合以治療人和動物的病毒感染中的用途，其它抗病毒劑包括但不限于干擾素-α,-β,-γ，腫瘤壞死因子α，丙氧鳥苷，無環鳥苷，阿糖腺苷，碘苷，泛西洛維3TC，克瑞克泛(crixivan)，奈韋拉平(nevarepine)和前列腺素或前列腺素類似物。
根據本發明提供了LTB4藥劑作為抗病毒劑用于預防和治療由如逆轉錄病毒，乳頭瘤病毒，腺病毒和皰疹病毒的腫瘤病毒引起的癌癥的用途。
根據本發明提供了LTB4藥劑作為抗病毒劑與其它抗腫瘤劑聯合以治療由腫瘤病毒引起的癌癥的用途，該其它抗腫瘤劑包括但不限于阿霉素，環磷酰胺和甲氨蝶呤。
根據本發明提供了LTB4藥劑作為抗病毒劑以預防和治療免疫抑制的病人和動物中的病毒感染的用途。
免疫抑制的病人包括接受器官或組織移植的病人，和接受免疫抑制劑治療的病人，所述免疫抑制劑包括但不限于硫唑嘌呤，皮質類固醇，阿霉素，環磷酰胺和甲氨蝶呤。免疫抑制的病人也包括接受或未接受抗腫瘤的化學治療劑治療的任何形式的癌癥或腫瘤疾病患者，所述治療劑包括但不限于阿霉素，環磷酰胺和甲氨蝶呤。免疫抑制的病人也包括經抗炎癥藥劑治療的炎癥疾病的患者，所述抗炎癥劑包括但不限于皮質類固醇，甲氨蝶呤，硫唑嘌呤和環磷酰胺。免疫抑制的病人也包括休克或嚴重創傷的患者，或接受慢性血透析的患者，所述嚴重損傷包括但不限于燒傷。
根據本發明提供了LTB4藥劑作為抗病毒劑與其它抗病毒劑聯合以治療免疫抑制的病人和動物的病毒感染的用途。
根據本發明提供了LTB4藥劑作為抗腫瘤劑以治療癌癥的用途。
根據本發明提供了LTB4藥劑作為抗腫瘤劑與其它抗腫瘤劑聯合以治療癌癥的用途，其它抗腫瘤劑包括但不限于阿霉素，環磷酰胺和甲氨蝶呤。
根據本發明提供了LTB4藥劑作為治療劑單獨或與其它抗細菌劑或抗真菌劑聯合以抗革蘭氏陽性和陰性細菌的感染或真菌感染的用途。
根據本發明提供了LTB4藥劑作為抗病毒劑與其它藥劑聯合以預防和治療人和動物中的病毒感染的用途，其它藥劑包括但不限于粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)，干擾素，腫瘤壞死因子α，白介素-3和白介素-5，這些藥劑已顯示出可引發白細胞合成LTB4或其它廿碳四烯酸代謝物(包括幾種LTB4藥劑)，并可加強LTB4藥劑的抗病毒活性。
根據本發明提供了LTB4藥劑作為抗病毒劑與視黃酸類(retinoids)聯合以預防和治療人和動物中的病毒感染的用途，視黃酸類藥劑包括但不限于9-順式-視黃酸和類似物(如13-順式-視黃酸或全反式-視黃酸)，它們是視黃酸類受體的配體，并可加強LTB4藥劑的抗病毒活性。
根據本發明提供了LTB4藥劑作為抗病毒劑與非類固醇抗炎癥藥物聯合以預防和治療人和動物中的病毒感染的用途，所述抗炎癥藥物包括但不限于N-乙酰水楊酸，吲哚美辛，布洛芬，氟比洛芬和萘普生，它們是Ⅰ型(組成型)和Ⅱ型(誘導型)環加氧酶的抑制劑，可能對抑制人和動物施用LTB4藥劑后潛在的副作用有用。
圖的簡述

圖1表示LTB4對EBV誘導的團塊(clump)形成的影響；圖2表示LTB4對EBV-誘導的Epstein-Barr核抗原(EBNA)蛋白的合成的影響；圖3表示LTB4對EBV顆粒產生的影響；圖4表示LTB4對HSV-1-誘導的胞質抗原的合成的影響；圖5表示LTB4對HSV-1顆粒產生的影響；圖6表示LTB4對被HIV-1感染的外周血單核細胞中逆轉錄酶活性的影響；圖7表示LTB4對細胞生存力的影響；和圖8A和8B表示LTB4和無環鳥苷對EBV-誘導的EBNA蛋白的合成的影響(A)，和對HSV-1-誘導的病毒蛋白質的合成的影響(B)。
發明的詳述ⅰ)LTB4本發明的白三烯B4(LTB4)藥劑是LTB4或某些結構相關的多不飽和脂肪酸，或與脂肪酸結構不相關的物質，這些藥劑可刺激細胞合成LTB4或其它LTB4藥劑，或者模擬它們的生物活性。它們是天然物質或是這種天然物質的類似物。所有的LTB4藥劑都可通過文獻中所述的化學合成方法獲得，而且大部分可以購得。
在本文中，術語“LTB4劑”指一種或多種如下多不飽和脂肪酸，它們除LTB4本身外，是LTB4的類似物，或LTB4或LTB4類似物的前體或代謝物LTB4,14,15-二氫-LTB4,17,18-脫氫-LTB4,19-羥基-LTB4,20-羥基-LTB4，及其5(R)-羥基，5-酮基，5(S)-過氧羥基，5(R)-過氧羥基和5-脫氧類似物；LTA4；14,15-二氫-LTA4,17,18-脫氫-LTA4,5(S)-羥基-6,8,11,14(E,Z,Z,Z)-廿碳四烯酸(“5-HETE”),14,15-二氫-HETE,17,18-脫氫-5-HETE及其5(R)-羥基，5-酮基，5(S)-過氧羥基，5(R)-過氧羥基類似物；12(R)-羥基-5,8,10,14(Z,Z,E,Z)-廿碳四烯酸(“12-HETE”),5,6-二氫-12-HETE,14,15-二氫-12-HETE,17,18-脫氫-12-HETE及其12(S)-羥基，12-酮基，12(S)-過氧羥基和12(R)-過氧羥基類似物和12-氧代-5,8,10(Z,Z,E)-十二碳三烯酸，15(S)-羥基-5,8,11,13(Z,Z,Z,E)-廿碳四烯酸(“15-HETE”),5,6-二氫-15-HETE,17,18-脫氫-15-HETE及其15(R)-羥基，15-酮基，15(S)-過氧羥基和15(R)-過氧羥基類似物。
術語LTB4劑也包括多不飽和脂肪酸的其它衍生物；一些是由環加氧酶途徑，脂氧合酶途徑(5-,12-和15-脂氧合酶)或細胞色素p450途徑衍生的；其它的是天然形成的化合物的異構體，類似物或衍生物12(S)-羥基-5,8,10(Z,E,E)-十七碳三烯酸；白三烯C4,D4和E4及其14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；白三烯C4,D4和E4及其14,15-二氫或17,18-脫氫類似物的N-酰基或N-烷基衍生物；所有異構的5,12-二羥基-6,8,10,14-廿碳四烯酸及其14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；所有異構的5,6-二羥基-7,9,11,14-廿碳四烯酸及其14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；所有異構的5,15-二羥基-6,8,11,13-廿碳四烯酸(包括5(S),15(S)-二羥基-6,8,10,13(E,Z,Z,E)-廿碳四烯酸)及其17,18-脫氫類似物；所有異構的8-羥基-11(12)-環氧-5,9,14-廿碳三烯酸(包括肝氧靈A3(hepoxilinA3))及其5,6-二氫或14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；所有異構的10-羥基-11(12)-環氧-5,8,14-廿碳三烯酸(包括肝氧靈B3(hepoxilinB3))及其5,6-二氫或14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；所有異構的8,11,12-三羥基-5,9,14-廿碳三烯酸(包括三氧靈A3(trioxilinA3))及其5,6-二氫或14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；所有異構的10,11,12-三羥基-5,8,14-廿碳三烯酸(包括三氧靈B3(trioxilinB3))及其5,6-二氫或14,15-二氫或17,18～脫氫類似物；所有異構的11(12)-環氧-5,7,9,14-廿碳四烯酸及其14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；所有異構的11,12-二羥基-5,7,9,14-廿碳四烯酸及其14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；所有異構的8(9)-環氧-5,10,12,14-廿碳四烯酸及其5,6-二氫或17,18-脫氫類似物；所有異構的8,9-二羥基-5,10,12,14-廿碳四烯酸及其5,6-二氫或17,18-脫氫類似物；所有異構的8,15-二羥基-5,9,11,13-廿碳四烯酸及其5,6-二氫或17,18-脫氫類似物；所有異構的14(15)-環氧-5,8,10,12-廿碳四烯酸及其5,6-二氫或17,18-脫氫類似物；所有異構的14,15-二羥基-5,8,10,12-廿碳四烯酸及其5,6-二氫或17,18-脫氫類似物；所有異構的5-羥基-14(15)-環氧-6,8,10,12-廿碳四烯酸及其17,18-脫氫類似物；所有異構的5,14,15-三羥基-6,8,10,12-廿碳四烯酸(包括脂氧精B4(1ipoxinB4))及其17,18-脫氫類似物；所有異構的5,6,15-三羥基-7,9,11,13-廿碳四烯酸(包括脂氧精A4(1ipoxinA4))及其17,18-脫氫類似物；所有異構的5-羥基-5(6)-環氧-15-羥基-7,9,11,13-廿碳四烯酸及其17,18-脫氫類似物；所有異構的6,8,11,14-廿碳四烯酸及其14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；所有異構的8-羥基-5,9,11,14-廿碳四烯酸及其5,6-二氫或14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；所有異構的9-羥基-5,7,11,14-廿碳四烯酸及其14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；所有異構的11-羥基-5,8,12,14-廿碳四烯酸及其5,6-二氫或17,18-脫氫類似物；所有異構的12-羥基-5,8,10,14-廿碳四烯酸及其5,6-二氫或14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；所有異構的15-羥基-5,8,11,13-廿碳四烯酸及其5,6-二氫或17,18-脫氫類似物；所有異構的9-羥基-10,12-十八碳二烯酸；所有異構的13-羥基-9,11-十八碳二烯酸；12(R)-羥基-5,8,14(Z,Z,Z)-廿碳三烯酸；所有異構的5(6)環氧-或5,6-二羥基-8,11,14-廿碳三烯酸及其14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；所有異構的8(9)-環氧-或8,9-二羥基-5,11,14-廿碳三烯酸及其5,6-二氫或14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；所有異構的11(12)-環氧-或11,12-二羥基-5,8,14-廿碳三烯酸及其5,6-二氫或14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；所有異構的14(15)-環氧-或14,15-二羥基-5,8,11-廿碳三烯酸及其5,6-二氫或17,18-脫氫類似物。
術語LTB4也包括非-共價修飾的脂肪酸如LTB4劑的鈉或鉀鹽變體。
術語LTB4劑也包括通過脂肪酸的靶官能團與可以與選定的官能團反應(產生例如LTB4劑的酯和醚衍生物)的有機衍生劑反應而引入分子中的修飾或引起分子內重排(如與羥基化的脂肪酸形成內酯)的變體。產生的化合物可以具有改變的生物活性和/或生物效力。因此，共價修飾的脂肪酸可以是具有降低的生物活性的前藥，它在體內給藥后緩慢轉化為更有活性的分子(未衍生化的LTB4劑)。變體也可以是以將會導致化合物延緩安排(retarded disposition)的方式改變的LTB4劑的代謝穩定和生物活性類似物(降低代謝和/或消除)。在ω-端修飾的變體(如20,20,20-三氟甲基-LTB4)對ω-氧化(不飽和脂肪酸的降解代謝過程)顯示增加的阻力；在碳13至20的水平面在ω-端修飾的其它變體(如19-甲基-LTB4或19,19-二甲基-LTB4或19-氟-LTB4或19,19-二氟-LTB4或18,20-二氟-LTB4或20-氟-LTB4)可以對ω)-氧化顯示增加的阻力，而在羧酸端，在碳1,2,3或4的水平面修飾的變體(例如，3-硫代-LTB4,3-羥基-LTB4,3-甲基-LTB4或3,3-二甲基-LTB4或3-氟-LTB4或3,3-二氟-LTB4，或2,3-二氟-LTB4,LTB4甲基磺酰胺，LTB4甲基酰胺，1-四疊氮LTB4)，可以對β-氧化和/或消除(如通過4-(二丙基氨磺酰基)苯甲酸-敏感的有機酸轉運蛋白攝取)顯示增加的降解代謝阻力。在碳12修飾的其它變體，如12(R)-甲基LTB4，可以對11,12-雙鍵的還原(LTB4的一種代謝途徑)顯示增加的阻力。其它變體是具有結構變化的LTB4劑的類似物，如在鏈長方面的變化(多至4個碳原子的鏈長增加或降低)，雙鍵的加成，雙鍵的飽和，雙鍵幾何方面的變化(順式至反式或反過來)，雙鍵與叁鍵的變化，一個或幾個官能團構型的變化(R至S或S至R)，或其中一個或幾個官能團或取代基要么被除去，要么被加入或變為其它官能團或取代基(包括但不限于過氧羥基，羰基，巰基，亞磺酰基，磺酰基，半胱氨酰基，谷胱甘肽基，半胱氨酰-甘氨酸，甲基，異丙基，芐基，氯，氟)，或其中一個或幾個官能團和/或一個或幾個雙鍵的位置相對于ω-端移動了1,2或3個碳原子。LTB4劑可以是具有一種或幾種上述結構修飾的變體。
LTB4劑和LTB4劑變體是結構上與LTB4相關的，并且以不同的親和力與存在于各種白細胞(及其它細胞類)的LTB4(或其它相關的二十烷酸(eicosanoids)，包括但不限于5-HETE,LTD4，脂氧精(lipoxin)A4)的細胞表面結合位點，或LTB4的核結合位點，轉錄因子PPARα(過氧化物酶體增殖物一激活的受體α)(DevchandP.R，等人，自然384:39,1996)，或LTB4的其它未知結合位點結合，導致LTB4和LTB4劑生物活性的表達。LTB4劑和變體顯示或可能顯示與LTB4性質上相似的生物活性(但可能比LTB4本身有更多或更少的活性)并因此可以期望發揮類似于LTB4的抗病毒活性。LTB4劑及其變體包括在本發明的范圍內。
術語LTB4藥劑也包括在結構上不與LTB4相關的藥劑，包括但不限于趨化性肽甲酰基-met-leu-phe(fMLP)(和類似物如N-甲酰基-nle-leu-phe,N-甲酰基-met-leu-phe-芐基酰胺，N-甲酰基-met-leu-phe-甲基酯和N-甲酰基-Nle-leu-phe-nle-tyr-lys)，補體片段C5a和類似物，生物活性磷脂血小板-活化因子，1-O-十六烷基-2-O-乙酰基-sn-甘油基-3-膽堿磷酸(和類似物如1-O-十八烷基-2-O-sn-甘油基-3-膽堿磷酸和1-O-十六烷基-2-N-甲基氨基甲酰基-sn-甘油基-3-膽堿磷酸)，它們刺激或可能刺激不飽和脂肪酸在細胞中的釋放(主要是花生四烯酸)并必然形成一種或幾種LTB4藥劑，并因而顯示與LTB4類似的抗病毒活性。因此，上述在結構上不與LTB4相似的LTB4藥劑包括在本發明的范圍內。
術語LTB4藥劑也包括可能含有兩種或幾種LTB4藥劑的混合物或LTB4藥劑和一種或幾種活性等于或小于LTB4藥劑異構體(位置，幾何或光學異構體)復合的制劑。
術語LTB4藥劑也包括針對LTB4受體的抗體，或針對抗LTB4或上述類似物之一或LTB4的變體產生之抗體的抗獨特型抗體，希望它們能引發LTB4類生物學反應，如抗病毒作用。
ⅱ)病毒感染可用本發明的LTB4藥劑治療的病毒感染是由人和/或動物病毒引起的感染。
術語“人和/或動物病毒”欲包括但不限于一般的DNA和RNA病毒以及逆轉錄病毒。DNA病毒包括細小病毒科，乳多空病毒科，腺病毒科，皰疹病毒科，痘病毒科和嗜肝DNA病毒科。RNA病毒包括小RNA病毒科，披膜病毒科，正粘病毒科，副粘病毒科，冠狀病毒科，呼腸孤病毒科，RNA腫瘤病毒科和線狀病毒科。
已研究了LTB4抗兩種皰疹病毒，即EBV和HSV-1，和抗HIV的抗病毒活性。在不同濃度的LTB4存在或不存在的情況下培養人外周血單核細胞。培養10-12天后，評價兩個參數一是團塊(clump)或玫瑰花結的形成，它在形態學上可鑒定被EBV感染的細胞；二是在被EBV感染的細胞中合成的病毒抗原，即Epstein-Barr核抗原(EBNA)的存在。所得結果表明LTB4可顯著影響團塊的形成。類似地，30nMLTB4可使EBNA-陽性細胞的百分比降低56％以上，而濃度為100nM的LTB4可使相應的百分比降低70％以上。用HSV-1和HIV-1也能得到類似的結果。實際上，細胞培養物中LTB4的存在(100nM)可強烈抑制特異性HSV-1抗原的合成達60％以上，在被HIV-1感染的PBMC中，抑制逆轉錄酶活性達70％以上。有趣的是，在所有細胞培養物中，細胞的存活力與相同時間期內培養的未經刺激的細胞(對照)的存活力差不多，這表明LTB4對細胞未產生直接的細胞毒效應。另外，還發現LTB4可抑制B95-8細胞中產生的新的EBV顆粒的形成(＞80％)。使用Vero細胞和J1.1細胞，分別觀察到LTB4對HSV-1(75％抑制)和HIV-1(＞55％抑制)也有此效應。在體內實驗模型中(裸鼠)，對于接受LTB4(10μg腹膜內)治療的動物而言，接種HSV-1產生的皮膚損害較小，并且消失得更快。這些結果清楚地說明LTB4產生了很強的抗兩種皰疹病毒和HIV-1的抗病毒作用，也產生了體內抗HSV-1的保護性作用，而對未被感染的細胞沒有細胞毒作用。
檢測了一些LTB4藥劑(非LTB4自身)，發現它們在體外對HSV-1或EBV產生了抗病毒作用。當被加入細胞培養基中時(在7-10天的保溫期內，以100pmol/ml的濃度分4次連續加入)，LTB4藥劑20-羥基-LTB4,12(R)-HETE,14,15-二氫-LTA4甲基酯和N-甲酰基-met-leu-phe可抑制HSV-1感染外周血單核白細胞(通過HSV-1抗原的存在評估)，或抑制Vero細胞中HSV-1顆粒的產生達40％或更高。在相同的實驗中，使用濃度高10倍的抗病毒劑無環鳥苷也有類似的作用。LTB4藥劑5(S),15(S)-二羥基-6,8,11,13-(E,Z,Z,E)-廿碳四烯酸(5,15-二HETE),14,15-二氫-LTA4甲基酯，LTB4甲基酯和N-甲酰基-met-leu-phe可抑制EBV感染外周血單核白細胞(通過EBV抗原EBNA的存在評估)，或抑制B95-8細胞中EBV顆粒的產生達40％或更高。盡管LTB4藥劑的抗病毒作用機制是未知的，但觀察到的一些LTB4藥劑，尤其是5,15-二HETE(它是LTB4細胞膜受體微弱的刺激物)的抗病毒活性暗示LTB4藥劑作用的位點可能不是LTB4的細胞表面受體，而是LTB4的細胞內(核)結合位點，即由轉錄因子過氧化物酶體增殖物-激活的受體(PPARα)。實際上，已知PPARα對很多種親脂的分子有反應，所述分子包括不飽和脂肪酸，降血脂藥物(貝丁酯(fibrates))，糖皮質激素，前列環素(PGI2)穩定的類似物伊落前列素(Iloprost)和生物異源物質(Xenobiotics)，這顯示出PPARα結合位點-配體相互作用的相對低的選擇性。因此，看上去如5,15-二HETE的親脂化合物似乎能成為PPARα的配體，5,15-二HETE是LTB4結構密切相關的類似物(這兩種化合物都是廿碳四烯酸的二羥基化衍生物)。實際上，結構與LTB4相關的廣泛的不飽和脂肪酸可能都可與PPARα結合。PPAR組成了轉錄因子家族，該家族控制涉及脂質代謝(包括脂肪酸的降解)的多種酶的表達，因此可控制脂質的穩態。由于病毒復制意指含有脂質之結構(衣殼，包膜)的形成，LTB4藥劑對PPARα的激活作用可通過干擾病毒的裝配過程以產生抗病毒作用。有趣的是SteinhartW.L.等人(病毒學，70:241,1976)和MehlJ.K.等人(Antimicrob.AgentsCh.18:269,1980)以前已報道了氯貝丁酯和降脂異丙酯(兩種已知可激活PPARα的降血脂藥物)在體外對HSV-1的抗病毒活性。然而，很明顯LTB4與PPARα的結合和對PPARα的激活可引發仍未知的細胞事件，所述事件導致抗病毒活性；另外，不排除LTB4藥劑可結合和激活其它轉錄因子。
值得注意的是在病毒復制的體外試驗中，丙氧鳥苷的IC50值顯示為1和2.4μM(分別針對EBV和HSV)(Matthews和Boehms,RevInf.Dis.,1988,10，增刊3:490)。初步的比較研究顯示與無環鳥苷相比，LTB4在體外產生了強有力的抗病毒活性。可以修飾LTB4的結構以提供具有甚至更高的抗病毒活性的分子，或者具有增強的生物利用率(例如降低的親脂性或對體內代謝增強的抗性)的分子。
因此，此結果表明LTB4對于治療人和動物的病毒感染是有用的。由于這些數據表明LTB4產生了抗三種類型病毒的抗病毒活性，因此對一種類型的病毒而言，LTB4不是特異性的，希望LTB4對于治療任何類型的病毒引起的病毒感染都是有用的。
我們發現當在體外檢測時，前列腺素(A,B,D,J,E和I)在摩爾基礎上比LTB4的活性低。
ⅲ)劑量范圍所施用的LTB4的治療有效量隨所用的特殊LTB4藥劑，施用的類型或模式，其它活性化合物的同時施用，宿主的年齡和大小，感染的類型，嚴重程度和傳播，個體患者的反應等等的變化而變化。當施用LTB4時，需施用足夠的劑量以在血漿中得到約1nM-1000nM，通常約為200nM的有效峰或穩態濃度，該濃度如體外實驗(見實施例Ⅰ-Ⅳ)中被發現為有效(在抗病毒活性方面)的LTB4濃度所暗示。因此，臨床醫生考慮到所有上述規則之后即可確定LTB4藥劑的有效劑量。當施用LTB4藥劑而不是具有不同生物活性的LTB4時，有效峰或所需的穩態濃度可以不同，例如達到10μM。通過如Marleau等人，免疫學雜志，150:206,1993和Marleau等人，英國藥理學雜志，112:654,1994中所述的藥物動力學研究可測定在血液中得到所需濃度所必需的藥劑劑量。
ⅳ)藥物組合物可使用任何適當的施藥類型或模式給哺乳動物，尤其是人提供有效劑量的本發明的LTB4藥劑。例如，可使用口服，非腸道和局部施藥。劑量形式包括片劑，膠囊，粉末，溶液，分散劑，懸浮液，乳劑，軟膏和氣霧劑。
本發明的藥物組合物含有作為有效成分的LTB4藥劑，和藥物可接受的載體和任選的含有其它治療成分。
應理解可在體內以多種方法使用LTB4藥劑，根據任何已知的制備在藥物學上有用的組合物的方法將LTB4藥劑配制成藥物組合物。用此方法將脂肪酸與藥物可接受的載體混合，包括人蛋白質，如人血清白蛋白的適當的載體和它們的配制描述于例如Remington藥物科學(第16版，Osol,A編輯，Mack,Easton,PA)。為了形成適于有效施用的藥物可接受的組合物，這種組合物可含有治療有效量的LTB4藥劑或導致抗病毒活性的量的LTB4藥劑，以及適當量的載體，體內藥物學研究可測定抗病毒作用所需的量。
LTB4藥劑可被配制成無菌的適于靜脈內或動脈內施用的治療用的藥物組合物。產物可以是無溶劑的形式，并準備通過加入適當的載體或稀釋劑以重建使用，或者也可以是水溶液或有機溶液的形式。
為了重建本發明的無溶劑產物，可以使用無菌的稀釋劑，該稀釋劑中可含有一般情況下被認為是近于生理條件的物質。在此方法中，無菌稀釋劑可含有鹽和/或緩沖劑以達到生理上可接受的張力和pH，如含有氯化鈉，磷酸鹽和/或生理上可接受的和/或使用安全的其它物質。
當作為水溶液使用時，藥物組合物多半含有很多上述用于重建無溶劑產物的相同物質。當在有機溶劑的溶液中使用時，含有脂肪酸的少量溶液將被含有很多上述用于重建無溶劑產物的相同物質的水溶液稀釋，因此，藥物組合物多半含有很多上述用于重建無溶劑產物的相同物質。
可以以例如注射用的無菌溶液，或被膠囊化(如在脂質體中)或被包埋(如在栓劑中)以較緩慢地長期釋放的方式使用在本發明的方法中有用的LTB4藥劑。
LTB4藥劑可以與其它藥劑聯合使用，所述其它藥劑包括但不限于抗病毒劑，抗癌劑，免疫抑制劑，抗炎癥劑，細胞因子，視黃酸類和能降低LTB4的攝取，消除或代謝的化合物，如丙磺舒或氯貝丁酯。
當受試的LTB4藥劑作為抗病毒劑被施用給宿主時，可通過例如注射，栓劑等等動脈內，靜脈內，腹膜內，皮下，肌內施用該藥劑。由于大多數LTB4藥劑的高花費及其化學穩定性，LTB4的注射可代表給病人施用本發明組合物以得到較好的劑量控制的最為有利的方式。通過注射施藥的模式包括連續灌注以及單次或多次大丸劑(boluse)。假設循環中一些LTB4藥劑的半衰期短(Marleau等人，英國藥理學雜志，112:654,1994)，它們作為單次或多次大丸劑給藥可能意指同時使用延遲LTB4藥劑消除和/或抑制其代謝的藥劑，或者使用在循環中具有延長的半衰期的LTB4藥劑類似物。有用的施藥類型或模式也包括使用可植入體內的泵，用于將藥劑不斷地注入血管或不同的位點，如腹腔或皮下。這種技術公開于治療肝癌的Cecil藥物課本(第164章，第19版，1992)中。利用含有LTB4藥劑的膏藥經真皮給藥也是一種有用的給藥模式。
可使用另外的藥學方法控制作用的期限，例如，通過使用大分子絡合或吸收藥劑可得到控釋制品。通過選擇適當的大分子(例如聚酯，多氨基酸，聚乙烯，吡咯烷酮，乙烯-乙烯基乙酸酯，甲基纖維素，羧甲基纖維素，魚精蛋白硫酸酯或血清白蛋白)，適當的大分子濃度，以及摻入的方法可達到受控傳遞。通過此方法可控制藥劑的釋放。
另一種對于控制控釋制品的作用期限可能有用的方法是將藥劑摻入聚合物顆粒中，所述聚合物如聚酯，多氨基酸，水凝膠，多乳酸或乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物。
除了將受試的脂肪酸摻入聚合物顆粒外，也可以將這些物質包埋于例如通過團聚技術或界面聚合制備好的微膠囊(例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚甲基甲基丙烯酯微膠囊)中，膠態藥物傳遞系統(例如脂質體，白蛋白微球體，微乳，納顆粒(nanoparticle)和納膠囊(nanocapsule))中或巨乳液(macroemulsions)中。這種技術公開于Remington藥物科學(第16版，Osol,A編輯，Mack,Easton,PA)。
組合物包括適于口服或非腸道給藥的組合物，它們便于以單位劑量的形式存在，可通過制藥技術領域中眾所周知的任何方法制備所述組合物。
在實際應用中，可根據常規藥物學復合技術將LTB4藥劑作為緊密的混合物中的活性成分與藥物學載體相混合。根據給藥所需的制劑形式可利用多種形式的載體。在制備口服劑量形式的組合物時，可使用任何平常的藥物介質，例如在如懸浮液的口服液體制劑的情況下可使用水，二醇，油，醇，增味劑，防腐劑，著色劑等等；還可使用酏劑和溶液；或在如粉末，膠囊和片劑的口服固體制劑的情況下可使用如淀粉，糖，微晶纖維素的載體，稀釋劑，成粒劑，潤滑劑，結合劑，崩解劑等等。如有必要，可通過標準的含水或不含水的技術包被片劑。
適于口服的本發明的藥物組合物可以以獨立的單位存在，如各含有預定量LTB4藥劑的膠囊，扁囊劑或片劑，粉末或顆粒，或含水液體，不含水液體，水包油乳液或油包水乳液中的溶液或懸浮液。通過任何藥學方法都可制備這種組合物，這種方法包括將LTB4藥劑與包括一種或多種必需成分的載體聯合的步驟。一般地說，通過均勻地和緊密地將LTB4藥劑與液體載體或精細分開的固體載體或這兩種相混合，然后如有必要，將產物按所需的形式成形，即可制備組合物。例如，通過任選地用一個或多個附加的成分壓模可制備片劑。通過在適當的機器中壓制可制備壓縮的片劑，將自由流動形式的活性成分，如粉末或顆粒任選地與結合劑，潤滑劑，惰性的稀釋劑，表面活性劑或分散劑混合。通過在適當的機器中壓制可制備壓縮的片劑，用惰性的液體稀釋劑使粉末狀化合物變得潮濕。
應理解LTB4藥劑以藥理學或生理學可接受的量被施用，應理解所用的量應對病人無害，或所用量對個體病人的任何有害的副作用應遠小于其有利的作用。類似地，LTB4藥劑應以治療有效量被施用，應理解所用量要迎合欲達到的治療目的，并提供施用LTB4藥劑可得到的益處。
參考下列實施例將更易于理解本發明，給出實施例是為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。
實施例Ⅰ檢測外周血單核細胞中EBV-誘導的團塊(clump)形成和EBNA的合成團塊形成經BoyumA.(Scand.，免疫學雜志，1976,5(5):9)以前所述的葡聚糖沉降和Ficoll-PaqueTM梯度離心之后，從健康的供體體內得到外周血單核細胞(PBMC)。在病毒滴度為107個轉化單位(TFU)/ml的傳染性EBV毒株B95-8存在時，將細胞重新懸浮于添加了10％熱滅活的胎牛血清(FCS)的RPMI-1640培養基中。簡而言之，同時用不同濃度的LTB4，即分別為0.3,3.0和30nM的LTB4處理(單次加入)被EBV感染的PBMC。在96孔-培養板中培養細胞(106個細胞/ml,200μl/孔)12天，用反轉顯微鏡(100×)評價可表征被EBV感染之細胞的團塊形成(圖1)。
在微量培養板中培養細胞，對各個孔中的團塊計數。結果顯示出代表兩個(2)其它實驗中的一個實驗中每個孔中團塊的平均數目+S.D.,NS未經刺激的細胞。
檢測Epstein-Barr核抗原(EBNA)在類似的實驗中，用EBV感染PBMC，并在存在或不存在LTB4的條件下培養細胞(CascadeBiochemLtd.,Berkshire,U.K.)(在培養的第0,3,6和9天加入到圖2所示濃度的LTB4)。培養10天后，收獲細胞以測定EBV感染所致的Epstein-Barr核抗原(EBNA)的存在。按ReedmanB.M.和KleinG.(Int.J.Cancer,1973,11:499)所述的方法制備細胞涂片，固定并通過抗-補體免疫熒光(ACIF)試驗檢測EBNA。通過將50μl經洗滌細胞的濃縮懸浮液(2×106/ml)涂在干凈的玻片上，風干并用冷丙酮(-20℃)固定10分鐘。EBV血清陽性供體的人血清(50μl)被用作補體的來源。在室溫下，潮濕的室中將玻片保溫45分鐘，然后用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)將玻片洗滌3次，并在室溫下，潮濕的室中用50μl異硫氰酸熒光素(FITC“異構體I”)-偶聯的山羊IgG組分抗-人補體C3(CappelResearchProducts,Durham,NC)將玻片染色60分鐘。用PBS洗滌玻片(3次)，在1∶1的PBS甘油中固定并檢測，分別使用Raji和U937細胞作為陽性和陰性對照。30nM的LTB4使EBNA-陽性細胞的百分比降低了55％以上，100nM的LTB4使相應百分比降低了70％以上(圖2)。圖2所示的結果是6個(6)其它實驗的代表。未暴露于EBV的細胞未顯示出可測的EBNA抗原。
EBV顆粒的合成為了評價LTB4對新合成的病毒顆粒產生的影響，在存在或不存在LTB4的條件下將其中可復制EBV的B95-8細胞(在培養的第0,5和10天加入圖3所示濃度的LTB4)培養14天。在添加了10％熱滅活的胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養基中培養細胞。當細胞的存活力＜20％時，收獲無細胞的上清液，并通過0.45μm孔徑的濾器過濾，通過超速離心(38,000×g,160分鐘，4℃)進一步濃縮病毒顆粒。通過對PBMC的ACIF試驗測定病毒滴度并表示成每ml的轉化單位(TFU/ml)。然后用這些不同的EBV制品感染PBMC，并通過免疫熒光(ACIF試驗)評估EBNA的存在。如EBNA抗原陽性細胞的減少(分別為70％和85％)所示，30nM和100nM的LTB4可強烈抑制EBV顆粒的產生(圖3)。圖3所示的結果是3個(3)其它實驗的代表。
實施例Ⅱ檢測外周血單核細胞的HSV-1感染檢測特異性的HSV-1抗原如實施例1所述，用TCID50為107/ml的HSV-1(McIntyre毒株)感染PBMC，并用或不用不同濃度的LTB4處理(在培養的第0,2和4天加入圖4所示濃度的LTB4)。培養5天后，使用單克隆抗體(H62)(ImmunoCorp，蒙特利爾，加拿大)，通過免疫熒光評價被感染細胞的胞質中合成的特異性HSV-1相關抗原的存在。在100nM的LTB4存在時，病毒抗原的合成被抑制60％(圖4)。圖4所示的結果是5個(5)其它實驗的代表。通過在免疫熒光試驗中使用特異性的抗血清(得自慢性感染的供體)可得到類似的結果(75％的抑制)。
HSV-1顆粒的合成為了評價LTB4對HSV-1顆粒合成的影響，使用Verp細胞(得自ATCC)進行實驗。在添加了10％熱滅活的FBS的M-199培養基(Gibco)中培養細胞。當細胞80％鋪滿時，棄去上清液，在添加了2％熱滅活的FBS的M-199培養基中用HSV-1(TCID50為107/ml)感染貼壁細胞，并用或不用LTB4處理(在培養的第0,1和3天加入圖5所示濃度的LTB4)。培養5天后，收獲無細胞的上清液，并通過0.45μm孔徑的濾器過濾，通過超速離心(38,000×g,160分鐘，4℃)進一步濃縮病毒顆粒。將濃縮的病毒制品懸浮于M-199培養基中，然后用這些不同的HSV-1制品感染新鮮培養的Vero細胞，通過使用特異性抗血清或H62單克隆抗體的免疫熒光評價被感染細胞的百分比。如HSV-1抗原陽性Vero細胞的減少(分別為60％和70％)所示，30nM和100nM的LTB4的存在可強烈抑制HSV-1顆粒的合成(圖5)。圖5所示的結果是4個(4)其它實驗的代表。通過感染PBMC可得到類似的結果。
體內測定HSV-1的感染在體內實驗模型中評價LTB4的抗病毒作用-在此研究中使用了裸鼠(SKHI系，得自CharlesRivers,5-6周齡的雌性)。通過0.22μm孔徑的濾器過濾溶于乙醇中的LTB4儲存液(得自CascadeBiochemLtd.,Berkshire,U.K.)，在NaCl0.9％+含有0.01％BSA的葡萄糖5％(50:50,v/v)中以10μg/100μl的濃度制備LTB4稀釋液。
為了接種病毒，固定小鼠，用27號針頭以交叉劃線的方式在小鼠后背的小區域劃傷6次。在劃傷皮膚區域使用40μl病毒懸浮液(HSV-1毒株E-377,107TCID50/ml)，使用塑料頭將病毒懸浮液在皮膚上摩擦20秒，由接種病毒誘導的感染產生了皮膚損傷，早至接種后的第3天在接種位點即出現了所述損害，并先朝小鼠側面然后朝小鼠腹部發展成4-5mm寬的損傷帶。一般情況下，接種后5-6天損傷完全展開并形成從脊柱區域向腹部中央延伸的連續帶。被HSV-1感染的小鼠中也出現如后肢炎癥，極瘦和顯示降低的活性水平(嗜眠癥)的癥狀。在此模型中，接種HSV-1后，動物可能死于腦炎。
在接種病毒之前立即(第0天)和在接種后的第1,3,5,7和9天，腹膜內注射LTB4(使用1ml注射器和23號針頭)。分5組飼養小鼠，組(5只動物/組)由下列組成1)未接種的小鼠(這些動物后背的小區域被劃傷，并用40μlMEM培養基摩擦)，2)用接受了NaCl葡萄糖+0.01％BSA腹膜內注射的HSV-1接種小鼠，和3)用接受了溶于NaCl葡萄糖+0.01％BSA中的LTB4腹膜內注射的HSV-1接種小鼠。1天2次觀察小鼠以測定皮膚損傷，評估其它癥狀和死亡率。
所得結果表明LTB4在體內產生了抗HSV-1感染的保護性作用。如表1所示，未被感染的動物(第1組)行為正常，安度14天的實驗期；由皮膚劃傷引起的損害在3或4天內消失。被HSV-1感染的動物(第2組)出現了損害(如上所述)，在第4-8天之間損害最大(長度)；與此同時，此組中的小鼠顯示出后肢炎癥，極瘦，當觸摸時很不活躍，近乎遲鈍。被HSV-1感染并經LTB4處理的動物(第3組)在第0-4天也出現了損害，但比在第2組動物中觀察到的要小很多(小80％)，從第8天起消除。另外，在整個實驗過程中，未觀察到后肢炎癥和極瘦的癥狀，未注意到動物一般狀況下的惡化，當按對待第1組動物的方式處理時，動物在籠中一直活躍。在實驗過程中所有動物都存活；在第14天處死所有存活的動物。
表1LTB4在體內對單純皰疹病毒1型感染的影響
1觀察到的被HSV-1感染的小鼠的癥狀a)后肢的炎癥(腫脹)；b)極瘦(肉眼觀察)；c)降低的活性(嗜眠癥)。
評分1癥狀a；2癥狀a+b；3癥狀a+b+c。
實施例Ⅲ檢測外周血單核細胞的HIV-1感染也評價了LTB4對HIV-1感染的抗病毒特性。
被HIV-1感染的細胞中的逆轉錄酶活性以106個細胞/ml的密度將PBMC重新懸浮于培養基(添加了10％FBS的RPMI-1640)中，在37℃下，5％CO2的氣氛中，在3μg/ml的PHA-P(Sigma,St.Louis,MO)和30U/ml的重組人IL-2存在時將細胞培養2-3天。以1×106個細胞/ml的密度重新懸浮經PHA刺激的PBMC，并在缺乏或存在濃度漸增的LTB4(0,30,100和200nM)時，用HIV-1ⅢB感染細胞(多種感染復數傳染性病毒顆粒數目/靶細胞)。1周換2次培養基，每次換培養基時加入適當量的LTB4。在特異性的時間期冷凍無細胞的培養物上清液直至檢測。通過逆轉錄酶或p24測定法監控病毒復制。
由急性感染的細胞制備病毒儲存液，簡單地說，用HIV-1ⅢB感染Molt4克隆8。在病毒產量最高時和看到廣泛的細胞致病作用之前，以300×g離心細胞5分鐘，以2000×g澄清含有病毒的上清液30分鐘，并通過0.45μm的纖維素醋酸酯膜過濾以除去細胞碎片，隨后，以等分試樣將含病毒的上清液儲存于-80℃中。通過使用高度敏感的MT-4細胞系的終點稀釋的微量測定法進行感染性的滴定。
逆轉錄酶測定用50μl的無細胞上清液測定酶活性，所述上清液中加入了10μl的A溶液(5mM二硫蘇糖醇，50mMKCl,0.05％TritonX-100)和40μl的B溶液(5mMMgCl2,0.5MEGTA,0.04mg聚(rA)-寡(dT)12-18,3mCi[3H]TTP(40-70Ci/mmol))。在37℃下保溫1小時后，用1倍體積的含有0.15％焦磷酸鹽和1.66％三氯醋酸的溶液沉淀樣品，然后通過使用細胞收獲系統將細胞過濾到玻璃纖維濾器上。干燥濾器，在液體閃爍計數器(1205/1204BSβ-板；WallacOy,Turku，芬蘭)中測定放射性，進行3次重復測定。
酶p24試驗使用商購的酶聯免疫吸附測定(OrganonTeknika,Durham,NC)定量測定主要的病毒核心p24蛋白。
當培養基中存在LTB4時，培養2周后評價的PBMC中HIV-1的病毒活性降低了70％以上(見圖6)。圖6中所示的結果是3個(3)其它實驗的代表，通過監測上清液中p24的釋放可得到類似的結果。
HIV-1顆粒的合成用J1.1細胞系進行此套實驗，J1.1細胞系是衍生自母細胞系JurkatE6.1的被潛伏注入的細胞系(1atently iniected cell line)。以106個細胞/ml的密度將J1.1細胞重新懸浮于培養基(添加了10％FBS的RPMI-1640)中，并在缺乏或存在濃度漸增的LTB4(0,30,100nM)時，用佛波酯PMA(20ng/ml)刺激上述細胞。培養開始后24小時再加入LTB4(至相同的濃度)。培養48小時后，收集無細胞的上清液，通過終點滴定試驗定量測定傳染性HIV-1顆粒的存在。
終點滴定試驗(TCID50)使用4個平行系列的10倍稀釋的無細胞上清液，在平底微量培養板中進行終點滴定。與MT-4細胞保溫5-7天后，收集無細胞的上清液，使用商購的酶測定檢測主要的病毒核心p24蛋白。通過Reed和Muench的方法計算TCID50。
本發明人的結果清楚地表明100nM的LTB4將J1.1細胞中HIV-1顆粒的合成抑制了55％-79％(表2)。
表2LTB4對J1.1細胞中HIV-1顆粒合成的抑制
用或不用LTB4處理J1.1細胞1通過如實施例Ⅲ所述的終點滴定試驗(TCID50)評價的病毒顆粒數目，括號中的數目表示LTB4誘導的抑制作用的百分比。
實施例ⅣLTB4細胞毒性的測定在實施例Ⅰ和Ⅱ所述的細胞培養中，通過臺盼藍染料排斥試驗評估濃度達30nM的LTB4的細胞毒作用，發現LTB4未產生細胞毒作用(圖7)。通過臺盼藍染料排斥試驗評估細胞存活力；所得值(得自3個實驗中的1個代表)描述了細胞培養中的平均細胞存活力(n=24)。
實施例ⅤLTB4和無環鳥苷對HBV感染的抗病毒作用在微量培養板(96孔)中以2×105個細胞/孔的密度培養PBMC(106個細胞/ml)，并分別如實施例Ⅰ和Ⅱ所述，用EBV(107TFU/ml)或HSV-1(107TCID50/ml)感染細胞。感染后1小時，用LTB4(100nM)或無環鳥苷(1000nM)處理細胞培養物，每培養48小時加入藥物。分別在第7和6天，通過如實施例Ⅰ和Ⅱ所述評價病毒抗原的合成(圖8a和8b)來評價EBV和HSV-1的感染。圖8A和8B所示的結果是源于代表4個(4)其它實驗的1個。僅檢測了1μM的無環鳥苷。
通過對36個培養物進行免疫熒光試驗來檢測病毒抗原。
盡管結合了本發明的具體實施方案來描述本發明，但應理解可以進一步地修改，而且此應用欲覆蓋根據一般發明原理的任何的變化，用途或適應，并包括本發明所屬領域內已知或常規操作可接受的對本發明的背離，這一點可適用于前文所述的必要技術特征，并在所附權利要求書的范圍之內。
權利要求
1．藥物可接受的治療有效量的白三烯B4(LTB4)藥劑用于預防或治療人或動物中的病毒感染的用途。
2．根據權利要求1的用途，其中所述病毒感染是選自由DNA病毒，RNA病毒和逆轉錄病毒組成的組中的人或動物病毒的感染。
3．根據權利要求2的用途，其中所述病毒是DNA病毒，它選自由細小病毒科，乳多空病毒科，腺病毒科，皰疹病毒科，痘病毒科和嗜肝DNA病毒科組成的組中。
4．根據權利要求2的用途，其中所述病毒是皰疹病毒科的病毒，它選自由EBV,HSV-1,HSV-2,CMV,VZV,HHV-6,HHV-7和HHV-8組成的組中。
5．根據權利要求2的用途，其中所述病毒是RNA病毒，它選自由小RNA病毒科，披膜病毒科，正粘病毒科，副粘病毒科，冠狀病毒科，呼腸孤病毒科，RNA腫瘤病毒科和線狀病毒科組成的組中。
6．根據權利要求2的用途，其中所述病毒是牛腹瀉病毒，豬腸道病毒，副粘病毒科或牛呼吸道合胞病毒。
7．根據權利要求1的用途，其中所述LTB4藥劑是白三烯B4[5S,12R-6,8,10,14-(Z,E,E,Z)-廿碳四烯酸]。
8．根據權利要求2的用途，其中所述人病毒是選自HⅣ-1或HⅣ-2的逆轉錄病毒科的病毒。
9．根據權利要求1的用途，其中所述LTB4藥劑與一種或幾種不同的抗病毒劑聯合施用。
10．根據權利要求9的用途，其中所述不同的抗病毒劑選自由干擾素-α,-β,-γ，腫瘤壞死因子α，丙氧鳥苷，無環鳥苷，阿糖腺苷，碘苷，泛西洛維，3TC，克瑞克泛，奈韋拉平，前列腺素，前列腺素類似物和AZT組成的組中。
11．根據權利要求1的用途，其中所述人或動物是免疫抑制的病人或動物，或用已知可以增強病毒感染的發生的藥物處理過的病人。
12．根據權利要求11的用途，其中所述藥物選自由硫唑嘌呤，皮質類固醇，阿霉素，環磷酰胺和甲氨蝶呤組成的組中。
13．藥物可接受的治療有效量的白三烯B4(LTB4)藥劑用于預防或治療由癌基因病毒誘導之癌癥的用途。
14．根據權利要求1的用途，其中所述病毒感染是EBV的感染。
15．根據權利要求1的用途，其中所述病毒感染是HSV-1的感染。
16．根據權利要求1的用途，其中所述病毒感染是HIV-1的感染。
17．根據權利要求1的用途，其中所述LTB4藥劑選自由下列物質組成的組LTB4,14,15-二氫-LTB4,17,18-脫氫-LTB4,19-羥基-LTB4,20-羥基-LTB4，及其5(R)-羥基，5-酮基，5(S)-過氧羥基，5(R)-過氧羥基和5-脫氧類似物；白三烯A4(“LTA4”)；14,15-二氫-LTA4,17,18-脫氫-LTA4,5(S)-羥基-6,8,11,14(E,Z,Z,Z)-廿碳四烯酸(“5-HETE”),14,15-二氫-5-HETE,17,18-脫氫-5-HETE及其5(R)-羥基，5-酮基，5(S)-過氧羥基，5(R)-過氧羥基類似物；12(R)-羥基-5,8,10,14(Z,Z,E,Z)-廿碳四烯酸(“12-HETE”),5,6-二氫-12-HETE,14,15-二氫-12-HETE,17,18-脫氫-12-HETE及其12(S)-羥基，12-酮基，12(S)-過氧羥基和12(R)-過氧羥基類似物；和12-氧代-5,8,10(Z,Z,E)-十二碳三烯酸，15(S)-羥基-5,8,11,13(Z,Z,Z,E)-廿碳四烯酸(“15-HETE”),5,6-二氫-15-HETE,17,18-脫氫1 5-HETE及其15(R)-羥基，15-酮基，15(S)-過氧羥基和15(R)-過氧羥基類似物；12(S)-羥基-5,8,10(Z,E,E)-十七碳三烯酸；白三烯C4,D4和E4及其14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；白三烯C4,D4和E4及其14,15-二氫或17,18-脫氫類似物的N-酰基或N-烷基衍生物；5,12-二羥基-6,8,10,14-廿碳四烯酸，其異構體及其14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；5,6-二羥基7,9,11,14-廿碳四烯酸，其異構體及其14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；5,15-二羥基-6,8,11,13-廿碳四烯酸，5(S),15(S)-二羥基6,8,10,13(E,Z,Z,E)-廿碳四烯酸，其異構體，及其17,18-脫氫類似物；8-羥基-11(12)-環氧-5,9,14-廿碳三烯酸，肝氧靈A3，其異構體及其5,6-二氫或14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；10-羥基-11(12)-環氧-5,8,14-廿碳三烯酸，肝氧靈B3，其異構體及其5,6-二氫或14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；8,11,12-三羥基-5,9,14-廿碳三烯酸，三氧靈A3，其異構體及其5,6-二氫或14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；10,11,1 2-三羥基-5,8,14-廿碳三烯酸，三氧靈B3，其異構體及其5,6-二氫或14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；11(12)-環氧-5,7,9,14-廿碳四烯酸，其異構體及其14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；11,12-二羥基-5,7,9,14-廿碳四烯酸，其異構體及其14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；8(9)-環氧-5,10,12,14-廿碳四烯酸，其異構體及其5,6-二氫或17,18-脫氫類似物；8,9-二羥基-5,10,12,14-廿碳四烯酸，其異構體及其5,6-二氫或17,18-脫氫類似物；8,15-二羥基-5,9,11,13-廿碳四烯酸，其異構體及其5,6-二氫或17,18-脫氫類似物；14(15)-環氧-5,8,10,12-廿碳四烯酸，其異構體及其5,6-二氫或17,18-脫氫類似物；14,15-二羥基-5,8,10,12-廿碳四烯酸，其異構體及其5,6-二氫或17,18-脫氫類似物；5-羥基-14(15)-環氧-6,8,10,12-廿碳四烯酸，其異構體及其17,18-脫氫類似物；5,14,1 5-三羥基-6,8,10,12-廿碳四烯酸，脂氧精B4，其異構體及其17,18-脫氫類似物；5,6,15-三羥基-7,9,11,13-廿碳四烯酸，脂氧精A4，其異構體及其17,18-脫氫類似物；5(6)-環氧-15-羥基-7,9,11,13-廿碳四烯酸，其異構體及其17,18-脫氫類似物；5-羥基-6,8,11,14-廿碳四烯酸，其異構體及其14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；8-羥基-5,9,11,14-廿碳四烯酸，其異構體及其5,6-二氫或14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；9-羥基-5,7,11,14-廿碳四烯酸，其異構體及其14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；11-羥基-5,8,12,14廿碳四烯酸，其異構體及其5,6-二氫或17,18-脫氫類似物；12-羥基-5,8,10,14-廿碳四烯酸，其異構體及其5,6-二氫或14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；15-羥基-5,8,11,13廿碳四烯酸，其異構體及其5,6-二氫或17,18-脫氫類似物；9-羥基-10,12-十八碳二烯酸及其異構體；13-羥基-9,11-十八碳二烯酸及其異構體；12(R)-羥基-5,8,14(Z,Z,Z)-廿碳三烯酸及其異構體；5(6)環氧-或5,6-二羥基-8,11,14-廿碳三烯酸，其異構體及其14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；8(9)-環氧-或8,9-二羥基-5,11,14-廿碳三烯酸，其異構體及其5,6-二氫或14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；11(12)-環氧-或11,12-二羥基-5,8,14-廿碳三烯酸，其異構體及其5,6-二氫或14,15-二氫或17,18-脫氫類似物；14(15)-環氧-或14,15-二羥基-5,8,11-廿碳三烯酸，其異構體及其5,6-二氫或17,18-脫氫類似物；20,20,20-三氟甲基-LTB4,19-甲基-LTB4,19,19-二甲基-LTB4,19-氟-LTB4,19,19-二氟-LTB4,18,20-二氟-LTB4,20-氟-LTB4,3-硫代-LTB4,3-羥基-LTB4,3-甲基-LTB4,3,3-二甲基-LTB4,3-氟-LTB4,3,3-二氟-LTB4,2,3-二氟-LTB4,LTB4甲基磺酰胺，LTB4甲基酰胺，1-四疊氮LTB4；所述LTB4藥劑的鈉鹽或鉀鹽；和所述LTB4藥劑的酯或醚衍生物。
18．藥物可接受的治療有效量的LTB4藥劑用于治療人和動物中的癌癥，細菌或真菌感染的用途。
19．根據權利要求18的用途，其中所述LTB4藥劑是白三烯B4[5S,12R-6,8,10,14(Z,E,E,Z)-廿碳四烯酸]。
20．抗病毒的藥物組合物，含有與藥物可接受的載體的聯合的藥物可接受的治療有效量的LTB4藥劑。
21．根據權利要求20的組合物，其中所述LTB4藥劑是白三烯B4[5S,12R-6,8,10,14(Z,E,E,Z)-廿碳四烯酸]。
22．抗腫瘤，抗細菌或抗真菌的藥物組合物，含有與藥物可接受的載體的聯合的藥物可接受的治療有效量的LTB4藥劑。
全文摘要
本發明涉及白三烯B4(LTB
文檔編號A61K31/557GK1211184SQ97192276
公開日1999年3月17日 申請日期1997年2月12日 優先權日1996年2月15日
發明者瓊·戈塞林, 皮埃爾·伯吉特 申請人:維羅塞爾公司