專利名稱：：含白蛋白為有效成分的藥物組合物的制作方法
技術領域：
：本發明提供了一種含有白蛋白為有效成分的藥物組合物。本發明的組合物對于治療如角膜和結膜損傷及干眼等疾病是有用的。本發明的組合物能增加眼表上皮粘蛋白的分泌，并能擴散油。此外本發明提供利用該組合物治療角膜和結膜損傷、治療干眼病、以及增加眼表上皮粘蛋白分泌的方法。
背景技術：
：角膜和結膜損傷是由表皮至上皮形成缺損而造成的。其原因可能包括病理因素如干性角膜結膜炎(干眼)、各種角膜結膜炎、過敏及微生物(例如病毒、細菌、真菌等)感染；化學因素如化學藥品引起的細胞毒性以及酸和堿形成的腐蝕；物理因素如眼干燥、外界物質(例如隱形眼鏡等)及熱水造成的損傷等。近來報導眼組合物(例如氯化苯甲烴銨、氯丁醇等)和眼藥(例如氨基糖苷類抗菌素、非甾類消炎藥、碘苷、匹馬菌素等)中的抗菌劑造成角膜上皮(角膜外層)損傷。目前，為治療角膜和結膜損傷，施用硫酸軟骨素、谷胱甘肽、透明質酸、纖連蛋白、EGF等，或為了補充淚液，也施用人造淚液，但這些治療的效果仍不理想。干眼被定義為淚水質量下降或改變的一種疾病，而不論角膜和結膜損傷是否存在(YamadaetalGANKI43，1289-1293(1992))。有多種因素可導致干眼，但尚未發現合適的方法來恢復正常淚水的減少量。目前，為了治療干眼，已使用人造淚液用于補充眼淚并使用硫酸軟骨素、谷胱甘肽、透明質酸、纖連蛋白、EGF等以減輕主觀癥狀，但效果仍不理想。從新近的研究看，據信正常眼表上皮表達粘蛋白樣糖蛋白，這種糖蛋白積極參與維持淚膜。另外，已知從結膜生發細胞分泌的粘蛋白負責穩定淚膜。因此，由任何因素造成的眼表上皮缺損都可能誘發異常的眼粘蛋白分泌以及由此形成的不穩定淚膜。這種不穩定淚膜可能降低上皮和淚膜的相互作用水平，從而角膜和結膜損傷可能變得更加嚴重(NorihikoYokoiinGANKACHIRYONOKOTSUTOOTOSHIANA(眼科領域的治療技術)FUMIOKOGURE編輯，KABUSHIKIKAISHANAKAYAMASHOTEN出版，東京，日本，26-27頁(1995))。從上述觀點可知，如果通過增加粘蛋白分泌或其他任何方式來穩定淚膜，就能治療如角膜和結膜損傷或干眼等疾病。白蛋白是廣泛存在于動植物組織或體液，如人血清、淚液中的一種蛋白。例如人血清白蛋白用于治療血白蛋白減少、出血性休克等。在眼科領域，已知用白蛋白作為蛋白制品如纖連蛋白或干擾素的穩定劑。已建議用上述制品如纖連蛋白和干擾素來治療角膜損傷(日本特開昭61-103838和平6-271478)，但人們尚未認識到白蛋白本身可有效治療角膜和結膜損傷或干眼。發明的公開內容本發明提供了一種含白蛋白為有效成分的眼科藥物組合物。本發明的組合物對于治療角膜和結膜損傷是有用的。同時本組合物對治療干眼有用。本發明組合物所用的白蛋白來源不作特別限制。但當白蛋白具有抗原性時，出現如過敏等問題，就不優選。優選使用人類來源的白蛋白例如人血清白蛋白。在本發明中優選使用人血清白蛋白而無任何特殊問題，此蛋白純化到通常醫藥用所需的適宜純度。即，優選那些含不低于80％白蛋白(在電泳分析中)的蛋白制品。為滅活病毒等，優選熱處理得到的白蛋白。特別是，優選使用商業上作為藥物銷售的人血清白蛋白。在本發明中也優選由基因重組獲得的微生物所生產的白蛋白。對于本領域技術人員，根據基因重組技術的生產方法是眾所周知的。簡單地說，可將含編碼所需白蛋白(如人白蛋白)基因的載體導入宿主細胞使之轉化。挑選和培養能產生所需蛋白的轉化細胞，然后可以從培養上清液或細胞提取物中分離和純化人白蛋白。宿主細胞的實例包括酵母、大腸桿菌等，這些細胞常常為本領域技術人員用來生產蛋白。為避免其中含病毒等，更加優選作為上述基因重組產物的白蛋白。在此處，術語“角膜和結膜損傷”包括病理因素如干性角膜結膜炎(干眼)、各種角膜結膜炎、過敏和微生物(例如病毒、細菌、真菌等)感染，化學因素如化學藥品引起的細胞毒性和酸堿造成的腐蝕，物理因素如眼干燥，外界物質(例如隱形眼鏡等)及熱水等，眼組合物(例如氯化苯甲烴銨、氯丁醇等)以及眼藥(例如氨基糖苷類抗菌素、非甾類消炎藥、IDU、匹馬菌素等)所含的抗菌劑所引起的角膜和結膜損傷；角膜外層缺損；角膜磨損；角膜潰瘍等。在此處，術語“干眼”不僅包括簡單干眼(淚水減少)，其定義為“淚水質量降低或變化的一種疾病，而不論角膜和結膜損傷是否存在”，而且包括無淚、眼干燥、斯耶格倫綜合癥、干性角膜結膜炎、斯-約二氏綜合癥及眼皰瘡、瞼炎等多種干眼病。此外，術語“干眼”包括白內障手術后及伴隨過敏性結膜炎的干眼，以及VDT(視覺顯示終端)工作者的淚水減少和由例如空調引起房間干燥所致的無任何系統癥狀的淚水減少等于干眼樣疾病。在此處，術語“治療”指控制這些疾病的任何方法，包括這些疾病的預防、治療和緩解，以及這些疾病發展的停滯或緩解。發明人進一步發現白蛋白增加眼表上皮粘蛋白的分泌。由此本發明進一步提供了一種藥物組合物，用于增加眼表粘蛋白分泌，該組合物包含白蛋白為有效成分。此外發明人發現白蛋白具有擴散油的表面活性劑活性。這提示白蛋白的這種表面活性劑活性有助于眼表淚膜的穩定。本發明的藥物組合物可以如下劑型存在如片劑、藥丸、藥粉、懸浮液、膠囊、栓劑、注射制品、藥膏、眼藥水等。特別優選局部施用眼藥水。倘若本發明的組合物配制成眼藥水，此組合物可包含含量大約1-1000mg/ml的白蛋白，更加優選大約10-1000mg/ml，進一步優選大約50-1000mg/ml。此外這種組合物包含一種藥物可接受的稀釋劑。在此處，“藥物可接受的稀釋劑”可以是本領域技術人員所知的用于眼組合物的任何稀釋劑，例如水、生理鹽水、人造淚液等。此外本發明的藥物組合物可包括用于常規眼組合物的各種成分，如穩定劑、滅菌劑、緩沖劑、等滲劑、螯合劑、pH調節劑、表面活性劑等。穩定劑的實例包括正常L型氨基酸，如甘氨酸和丙氨酸等；葡萄糖和甘露糖等單糖；蔗糖和麥芽糖等雙糖；甘露醇和木糖醇等糖醇，葡聚糖等多糖。滅菌劑的實例包括芐烷銨鹽、洗必太鹽及對羥基苯甲酸酯等。緩沖劑的實例包括硼酸、磷酸、乙酸和檸檬酸或其鹽類。等滲劑的實例包括氯化鈉、氯化鉀和糖類等。螯合劑的實例包括乙二胺四乙酸鈉和檸檬酸等。由于它是一種眼組合物，pH值優選從5至8。本組合物可按劑量大約1-100μl/眼施用，優選大約10-50μl/眼，更加優選大約30-50μl/眼。另一方面，本發明也提供了白蛋白用于生產本發明藥物組合物的用途。另一方面，本發明也提供了一種角膜和結膜損傷的治療方法，包括對需要這種治療的患者施用有效量的白蛋白。在此處，術語“需要治療角膜和結膜損傷的患者”包括真正有角膜和結膜損傷的病人和懷疑有以上損傷的病人。它不僅包括已實際確認有角膜和結膜損傷的病人而且包括懷疑有角膜和結膜損傷的病人以及很有可能發生這種疾病的病人，例如角膜移植術后的病人。另一方面，本發明提供了一種干眼治療方法，包括對需要這種治療的患者施用有效量的白蛋白。在此處，術語“需要干眼治療的患者”包括患干眼病的病人和懷疑患干眼病的病人。在本發明的這些方法中，白蛋白和上述組合物所用的白蛋白可以是相同的。在本發明的這些方法中，白蛋白可作為本發明的藥物組合物來施用。施藥途徑不限于但最優選眼局部施藥。在本發明的這些方法中，白蛋白的“有效量”為良好的治療所需的量，可依據病人癥狀、年齡、性別、體重、飲食、同時使用的其它藥物以及醫藥領域技術人員了解的各種因素來選擇最適量。除上述因素外，這種有效量也可以根據白蛋白的種類或活性而變動。有效量的確定是一種通常由醫藥領域技術人員完成的工作。在本發明的這些方法中，藥物組合物可按大約1-100μl/眼的劑量施用，優選大約10-50μl/眼，更加優選約30-50μl/眼，每天約1-20次，更加優選每天大約5-10次，這并不意味著限制本發明的范圍。在本發明的這些方法中，已用于治療角膜和結膜損傷或干眼的人造淚液可與白蛋白同時施用。在此情況下，人造淚液可按通常用量和服法來施用。在本發明的另一方面，本發明提供了一種增加眼表上皮粘蛋白分泌的方法，包括對需要這種施藥的患者施用有效量的白蛋白。根據本方法，可增加眼表上皮粘蛋白分泌，由此可穩定眼表面淚膜。在此處，“需要施藥的患者”包括眼表粘蛋白分泌異常的患者以及因眼表上皮缺失而懷疑有眼表粘蛋白分泌異常的病人，例如干眼或角膜和結膜損傷的病人。在本發明的這種方法中，白蛋白可以以本發明的藥物組合物進行施用。施藥途徑不受限制，但最優選的是對眼局部施藥。在本發明的這種方法中，白蛋白的“有效量”是增加眼表粘蛋白分泌的量，可根據病人的癥狀、年齡、性別、體重、飲食、同時使用的其它藥物以及醫藥領域技術人員了解的各種因素而選擇最適量。除上述因素外，這種有效量也可以隨白蛋白種類或活性而變動。這種有效量的確定是一種通常由醫藥領域技術人員完成的工作。在本發明的這種方法中，這種藥物組合物可按約為1-100μl/眼的劑量施用，優選約為10-50μl/眼，更加優選約為30-50μl/眼，每天大約1-20次，更加優選每天約5-10次，這并不意味著限制本發明的范圍。在本發明的這種方法中，已用于治療角膜和結膜損傷或干眼的人造淚液可與白蛋白同時施用。在此情況下，人造淚液可按通常用量和服法來施用。制劑實施例在本申請的實施例中，使用由綠十字公司(日本大阪)生產的捐贈血液白蛋白制品。這些白蛋白制品的獲得方法是使用根據Cohn′s冰冷乙醇分級分離法將作為原材料的供血者血漿進行分離/純化而得到的白蛋白級分，依據下述制劑實施例1和2制備，并于60℃熱處理10個小時。制劑實施例1(白蛋白含量25％)人血清白蛋白250mg/ml乙酰色氨酸鈉5.37mg/ml辛酸鈉3.32mg/ml制劑實施例2(白蛋白含量5％)人血清白蛋白50mg/gml乙酰色氨酸鈉1.07mg/ml辛酸鈉0.66mg/ml測試實施例1對具有角膜和結膜損傷的三位干眼病人(女64歲、女61歲和女34歲)的眼睛施用制劑實施例1的25％人血清白蛋白(白蛋白含量250mg/ml)，每天10次，劑量為30-50μl/眼。在施用白蛋白同時，施用人造淚液。在施藥前后進行活體染色檢查來估計角膜和結膜損傷的程度。象活體染色檢查一樣，進行玫瑰二碘曙紅染色和熒光染色。玫瑰二碘曙紅染色(RB)提供了角膜和結膜損傷的指標，通過估計球結膜和角膜的鼻側和耳側染色程度，按0-3(總分為9)來記分。熒光染色(F)提供了角膜損傷的指標。通過估計角膜損傷程度按0-3記分。在以上兩種情況中，根據VanBijsterreld′s估測方法記分。在以上兩種情況中，數值越高損傷越嚴重。結果示于表1。表1白蛋白施用的效果*除干眼外，該患者還患有上緣角膜結膜炎測試實施例2角膜移植術后具有角膜外層缺損的62歲男性右眼深入角膜移植術后，仍有角膜外層缺損，施用0.1％Hyaleinmini(商標)(含0.1％透明質酸)。然而未觀察到任何效果，因此終止施用0.1％Hyaleinmini。此后對眼睛施用制劑實施例1的25％人血清白蛋白(白蛋白含量250mg/ml)一周，每天10次，劑量30-50μl/眼。施藥開始后一周，形成角膜外層并且角膜外層的缺損好轉了。測試實施例3角膜移植術后有角膜外層缺損的64歲女性左眼深入角膜移植術、邊緣移植和羊膜移植后，熒光染色檢測到角膜外層缺損。對這位病人的眼睛施用制劑實施例2的5％人血清白蛋白(白蛋白含量50mg/ml)4周，每天10次，劑量30-50μl/眼。施藥開始后兩周，熒光染色表明角膜外層缺損好轉。施藥開始后四周，未觀察到染色，并且看到角膜外層缺損有明顯的改觀。測試實施例4患斯耶格倫綜合癥的72歲女性對患有角膜外層缺損并伴有斯耶格倫綜合癥的病人眼睛施用Intal(商標)(含色甘酸鈉)、0.1％Flumetholon(商標)(含氟甲脫氧潑尼松龍)和人造淚液。然而未觀察到角膜外層缺損的好轉，終止施藥。然后對病人眼睛施用制劑實施例2的5％人血清白蛋白(白蛋白含量50mg/ml)4周，每天6次，劑量30-50μl/眼。施藥開始后四周，未觀察到角膜外層缺損。測試實施例5患斯耶格倫綜合癥的45歲女性對患有角膜和結膜損傷并伴有斯耶格倫綜合癥的病人眼睛施用制劑實施例2的5％人血清白蛋白(白蛋白含量50mg/ml)4周，每天10次，劑量30-50μl/眼。在施藥前后，進行活體染色檢查(玫瑰二碘曙紅染色和熒光染色)來估計角膜和結膜損傷程度。活體染色檢查的過程如下將2μl含1％玫瑰二碘曙紅和1％熒光素的混合液，用微吸管準確地滴入病人的下眼瞼，讓病人眨眼幾次，然后觀察眼睛。用狹縫燈的白光測定玫瑰二碘曙紅染色(RB)，用鈷藍燈測定熒光染色(F)。染色程度從0至9記分。結果示于表2。表2白蛋白施用效果</tables>測試實施例6對三位干眼病人(女64歲、女61歲和女34歲)的眼睛施用制劑實施例1的25％人血清白蛋白(白蛋白含量250mg/ml)，每天10次，劑量30-50μl/眼。在施用白蛋白同時，對眼睛施用人造淚液。在施藥前后，估計病人的主觀癥狀并記分。主觀癥狀包括眼痛、眼干感覺和眼異體感覺。病人自已估計這些癥狀。最嚴重的主觀癥狀記分為100分，最好或正常為0。結果示于表3。表3施用白蛋白后主觀癥狀的改善除干眼外患者還患有上緣角膜結膜炎測試實施例7對伴有斯耶格倫綜合癥的干眼病人(74歲女性)的眼睛施用制劑實施例2的5％人血清白蛋白(白蛋白含量50mg/ml)8周，每天6次，劑量30-50μl/眼。8周后，主觀癥狀包括眼痛、眼干感覺和眼異體感覺幾乎完全消除。終止施用白蛋白。測試實施例8研究白蛋白增加眼上皮粘蛋白分泌的能力根據常規細胞培養條件，用途10％(w/v)人血清白蛋白(SIGMA)的TCM199培養基(GIBCO)培養CCL細胞(結膜上皮細胞株)24小時。對照組中，細胞用不含人血清白蛋白的TCM199培養基培養。從培養容器中用胰酶-EDTA收集培養細胞，用多聚甲醛固定30分鐘，并用磷酸緩沖液(PBS)沖洗3次。用正常羊血清封閉得到的細胞(4℃，30分鐘)，封閉細胞與小鼠抗粘蛋白抗體(Mucl)反應(4℃，30分鐘)，然后用PBS沖洗3次。細胞再與FITC標記的抗小鼠IgG抗體反應(4℃，30分鐘)，然后用PBS沖洗3次。通過流式細胞方法采用Epics(ColterCo.)對獲得的細胞進行檢測，以確定產生粘蛋白的細胞(陽性細胞)占總細胞的比例。結果示于表4。表4白蛋白增加粘蛋白分泌</tables>根據結果，在培養基中加入白蛋白明顯提高結膜上皮粘蛋白分泌的能力。測試實施例9白蛋白擴散油的能力在人造淚液中加入10％(體積)的蓖麻油。油與溶液分離并形成油滴。在此系統中，加入10％(人造淚液的體積比，v/v)的5％白蛋白溶液，油擴散至水相表面并且油滴消失。此實施例提示白蛋白可作為表面活性劑，防止淚液由眼表面蒸發。工業實用性本發明的藥物組合物、方法和用途對于治療角膜和結膜損傷及干眼是有用的。本發明的藥物組合物、方法和用途對增加眼表上皮粘蛋白分泌同樣有用。權利要求1.一種治療角膜和結膜損傷的藥物組合物，該組合物包含白蛋白為有效成分。2.根據權利要求1的藥物組合物，其中所說的白蛋白是人類來源白蛋白。3.根據權利要求1的藥物組合物，其中所說的組合物適于作為眼藥水使用。4.根據權利要求1的藥物組合物，其中所說的組合物含10-1000mg/ml白蛋白。5.一種治療干眼的藥物組合物，該組合物包含白蛋白為有效成分。6.根據權利要求5的藥物組合物，其中所說的白蛋白是人類來源白蛋白。7.根據權利要求5的藥物組合物，其中所說的組合物適于作為眼藥水使用。8.根據權利要求5的藥物組合物，其中所說的組合物含10-1000mg/ml白蛋白。9.一種增加眼表上皮粘蛋白分泌的藥物組合物，該組合物包含白蛋白為有效成分。10.根據權利要求9的藥物組合物，其中所說的白蛋白是人類來源白蛋白。11.根據權利要求9的藥物組合物，其中所說的組合物適于作為眼藥水使用。12.根據權利要求9的藥物組合物，其中所說的組合物含10-1000mg/ml白蛋白。13.一種治療角膜和結膜損傷的方法，該方法包括對需要這種治療的患者施用有效量的白蛋白。14.根據權利要求13的方法，其中所說的白蛋白是人類來源白蛋白。15.根據權利要求13的方法，其中所說的白蛋白以眼藥水形式施用。16.根據權利要求13的方法，該方法包括施用一種含1-1000mg/ml白蛋白和藥物可接受的載體的藥物組合物。17.一種治療干眼的方法，該方法包括對需要這種治療的患者施用有效量的白蛋白。18.根據權利要求17的方法，其中所說的白蛋白是人類來源白蛋白。19.根據權利要求17的方法，其中所說的白蛋白以眼藥水形式施用。20.根據權利要求17的方法，該方法包括施用一種含1-1000mg/ml白蛋白和藥物可接受的載體的藥物組合物。21.一種增加眼表上皮粘蛋白分泌的方法，該方法包括對需要這種施藥的患者施用有效量的白蛋白。22.根據權利要求21的方法，其中所說的白蛋白是人類來源的白蛋白。23.根據權利要求21的方法，其中所說的白蛋白以眼藥水形式施用。24.根據權利要求21的方法，包括施用一種含1-1000mg/ml白蛋白和藥物可接受的載體的藥物組合物。25.白蛋白在生產治療角膜和結膜損傷的藥物組合物中的用途。26.根據權利要求25的用途，其中所說的白蛋白是人類來源白蛋白。27.根據權利要求25的用途，其中所說的藥物組合物適于作為眼藥水使用。28.根據權利要求25的用途，其中所說的藥物組合物含10-1000mg/ml白蛋白。29.白蛋白在生產治療干眼的藥物組合物中的用途。30.根據權利要求29的用途，其中所說的白蛋白是人類來源白蛋白。31.根據權利要求29的用途，其中所說的藥物組合物適于作為眼藥水使用。32.根據權利要求29的用途，其中所說的藥物組合物含10-1000mg/ml白蛋白。33.白蛋白在生產增加眼表上皮粘蛋白分泌的藥物組合物中的用途。34.根據權利要求33的用途，其中所說的白蛋白是人類來源白蛋白。35.根據權利要求33的用途，其中所說的藥物組合物適于作為眼藥水使用。36.根據權利要求33的用途，其中所說的藥物組合物含10-1000mg/ml白蛋白。全文摘要本發明提供了一種治療角膜和結膜損傷及干眼的藥物組合物,該組合物含白蛋白為有效成分。這種藥物組合物對增加眼表上皮粘蛋白分泌同樣有用。本發明進一步提供了角膜和結膜損傷及干眼的一種治療方法,包括對需要這種治療的患者施用有效量的白蛋白。此外,本發明提供了白蛋白在生產本發明的藥物組合物中的用途。文檔編號A61K38/00GK1195296SQ97190706公開日1998年10月7日申請日期1997年4月17日優先權日1996年4月19日發明者坪田一男申請人:株式會社·R-技術上野,坪田一男