專利名稱：：膠質細胞神經營養因子(gdnf)在治療聽覺疾病中的用途的制作方法發明的背景一般來說，本發明涉及經過施用膠質細胞系產生的神經營養因子(GDNF)蛋白產物來防止和/或治療內耳感覺細胞，如毛細胞和聽覺神經元的損傷或退化的方法。更具體地說，本發明涉及防止和/或治療由各種原因引起的聽力喪失的方法。神經營養因子是在神經系統或由神經系統的神經支配的非神經組織中發現的天然蛋白質，其功能是促進存活并維持某些神經和/或膠質細胞群體的表型分化(Varon等，神經科學回顧年報，1327，1979；Thoenen等，科學，229238，1985)。由于該生理作用，神經營養因子在治療這類神經細胞的退化和由神經損傷引起的分化功能喪失中有用。由損傷一種或多種類型的神經細胞的存活和/或適當功能的情況引起的神經損傷包括(1)物理損傷，它引起軸突突起(它隨后引起神經細胞死亡)和/或靠近損傷位點的神經細胞體退化，(2)部分神經系統的暫時或永久性停止血流(局部缺血)，如中風，(3)有意或偶爾接觸神經毒素，如癌和AIDS化學治療劑，分別為順氯氨鉑和雙脫氧胞苷，(4)慢性代謝疾病，如糖尿病或腎機能障礙，或(5)諸如帕金森氏疾病，阿耳氏海默癥和肌萎縮性側索硬化的神經退化性疾病，它由特定神經元群體的退化引起。為了使特定神經營養因子在治療神經損傷中有用，損傷神經細胞的一種或多種類型必須對該因子反應。已確定不是所有的神經元群體都對所有的神經營養因子應答或同等受其影響。待鑒定的第一個神經營養因子是神經生長因子(NGF)。NGF是定義的營養因子家族的第一個成員，其中該營養因子稱為神經營養蛋白，一般包括大腦來源的神經營養因子(BDNF)，神經營養蛋白-3(NT-3)，NT-4/5，和NT-6(Thoenen，神經科學動向14165-170，1991；Snider，細胞，77627-638，1994；Bothwell，神經科學回顧年報，18223-253，1995)。已知這些神經營養蛋白經過trk酪氨酸激酶受體家族，即trkA，trkB，trkC和低親合力的p75受體發揮作用(Snider，細胞，77627-638，1994；Bothwell，神經科學回顧年報，18223-253，1995；Chao等，TINS18321-326，1995)。膠質細胞系來源的神經營養因子(GDNF)是一種最近發現的蛋白質，使用基于其在體外促進存活和刺激中腦多巴胺能的神經元的遞質表型的效力的試驗來鑒定和純化(Lin等，科學，2601130-1132，1993)。GDNF是糖苷化的二硫鍵連接的同型二聚體，它與轉化生長因子β(TGF-β)超家族蛋白質有一些結構同源性(Lin等，科學，2601130-1132，1993；Krieglstein等，EMBOJ.14736-742，1995；Poulsen等，神經元，131245-1252，1994)。在外周神經系統肌肉和Schwann細胞中(Henderson等，科學，2661062-1064，1994；Trupp等，細胞生物學雜志，130137-148，1995)以及在中央神經系統I型星形細胞中(Schaar等，神經學實驗，124368-371，1993)已檢測到GDNFmRNA。在體內，用外源性GDNF處理刺激灰質神經元的多巴胺能表型并恢復在帕金森氏疾病動物模型中由軸突切除或多巴胺能神經毒素引起的功能缺陷(Hudson等，大腦研究通報，36425-432，1995；Beck等，自然，373339-341，1995；Tomac等，自然，373335-339，1995；Hoffer等，神經科學通訊，182107-111，1994)。盡管最初認為至少在體外GDNF對多巴胺能神經元具有相對的特異性，但現在出現的證據表明GDNF除對中腦多巴胺能和軀體運動神經元外具有更廣泛的神經營養靶向(Yan和Matheson，自然，373341-344，1995；Oppenheim等，自然，373344-346，1995；Matheson等，神經科學聯合會交流文摘，21，544，1995；Trupp等，細胞生物學雜志，130137-148，1995)。具體地說，發現GDNF對體內和體外的腦干和脊髓膽堿能運動神經元(Oppenheim等，自然，373344-346，1995；Zurn等，神經報道，6113-118，1994；Yan等，自然，373341-344，1995；Henderson等，科學，2661062-1064，1994)，對視神經元，如體外光感受器(申請日為1995年11月29日，Louis的目前未決的美國申請流水號08/564,833)和體外及體內的視神經節細胞(申請日為1995年11月29日的Yan的目前未決的美國申請流水號08/564,458)和對來自后根神經節的感覺神經元在體外和體內(申請日為1995年11月29日的Yan等的目前未決的美國申請流水號08/564,844)都有神經營養效力。對本發明一般感興趣的是1993年4月1日公開的WO93/06116(Lin等，Syntex-SynergenNeuroscienceJointVenture)，它報道了GDNF對于治療神經損傷，包括與帕金森氏疾病相關的損傷有用。還感興趣的是在Schmidt-Kastner等，分子大腦研究，26325-330，1994中報道的可檢測到GDNFmRNA且在毛果堿誘導的發作后GDNFmRNA上調；在Schaar等，神經學實驗，124368-371，1993和Schaar等，神經學實驗，130387-393，1994中報道的在培養條件下基部前腦星形細胞表達中等水平的GDNFmRNA，但GDNF不改變基部前腦ChAT活性；在1995年9月28日申請的目前未決的美國申請流水號08/535,682中報道了GDNF對于治療基部前腦膽堿能神經元的損傷或退化有用。但以前未顯示GDNF促進對諸如毛細胞和聽神經元的內耳細胞退化的存活，再生或保護。內耳Corti器官的神經上皮毛細胞將聲音轉導成神經活性，沿第八腦神經的耳蝸部分傳遞。這一神經由來自3類神經元的纖維組成(Spoendlin，H.H.在Friedmann，I.Ballantyne，J.，編輯，內耳的超微結構圖譜；倫敦，Butterworth，pp.133-164，1984)1)傳入神經元，位于螺旋神經節且連接耳蝸與腦干。2)傳出橄欖體耳蝸神經，它在上橄欖復合物中產生，3)自主腎上腺素能神經元，它在頸交感神經于中產生并支配耳蝸。在人類，有大約30,000個具有有髓軸突的傳入耳蝸神經元，各軸突由大約50層的薄層組成，直徑4-6μm。該組織學結構形成了均勻傳導速率的基礎，它是一個重要的功能特征。在聽神經的全長上，有傳入纖維的營養結構，具有以螺旋繩狀方式繞中央放置的“頂端”纖維包裹的“基部”纖維。Spoendlin(Spoendlin，H.H.在Naunton，R.F.，Fernadex，C.編輯，聽神經系統的誘發電活性。倫敦，學院出版社，pp.21-39，1978)根據形態學區別在螺旋神經節中鑒定了兩類傳入神經元I型細胞(95％)具有兩極且具有有髓細胞體和伸向內部毛細胞的軸突。II型細胞(5％)是單極的且具有無髓軸突并伸向Corti器外部毛細胞。每個內部毛細胞受大約20個纖維支配，每根纖維僅與一個細胞有突觸。相反，每個外部毛細胞受大約6根纖維支配，且每根纖維分枝支持大約10個細胞。在耳蝸內，纖維分成1)內部螺旋組，它最初從同側產生并以傳入神經元突觸內部毛細胞，和2)更多的外部輻射組，主要從相反側產生并直接與外部毛細胞突觸。在一個頻率，特征性或最佳頻率處有最小閾值，但對于頻率高于和低于該水平時閾值突然升高(Pickles，J.O.在聽力生理學入門，倫敦，學院出版社，pp.71-106，1982)。因此單個聽神經纖維似乎作為帶通過濾波器發揮作用。基膜沿其長度在不同的距離時振動偏向不同的頻率，各耳蝸神經纖維的頻率選擇與纖維所連接的內部毛細胞相似。因此，各耳蝸神經纖維表現出從其相鄰纖維覆蓋不同頻率范圍的轉變曲線(Evans，E.F.在BeagleyH.A.編輯，聽覺研究科學和技術基礎。紐約，Oxord大學出版社，1979)。以該機制，內耳濾波器將復合聲音分解成頻率成份(頻率分解)。足以影響交際和與工作有關的聯系的聽力喪失程度是在美國公眾中最常見的慢性神經損傷。根據健康訪問資料(生命和健康統計。系列10，第176號，華盛頓區，(DHHS出版號，(PHS)90-1504))，估計大約4％的45歲以下的人和大約29％的65歲或以上的人具有障礙性聽力喪失。估計超過2千8百萬的美國人具有聽力損傷且其中2百萬之多的人極度耳聾(國家統計計劃任務報告，Bethesda，Md.國家衛生研究院，1989)。聽力喪失的流行隨年齡顯著增加。大約每1000個嬰兒中有1個聽力喪失的嚴重程度足以阻止口語的獨立發展(Gentile，A等，聽力損傷的病人特征美國，1962-1963，系列10，第35號。華盛頓區政府出版室，1967(DHHS出版號，(PHS)1000)(人類交往和其疾病綜述，Bethesda，Md.國家衛生研究院，1970)。75歲以上每1000人中超過360人具有障礙性聽力喪失(生命和健康統計。系列10，第176號，華盛頓區(DHHS出版號(PHS)90-1504)。估計對于聽，說和語言疾病每年花費的產值損失，特殊教育和醫學治療超過300億美元(國家耳聾和其它交往疾病顧問委員會1990年年度報告，華盛頓區政府出版室，1991。(DHHS出版號(NIH)91-3189)。兒童極度耳聾的大多數常見病因是遺傳疾病和腦膜炎，分別占總數的大約13％和9％(Hotchkiss，D.聽力損傷的人口統計情況問題和答案。第二版，華盛頓，D.C.Gallaudet大學出版社，1989)。在兒童耳聾的病例中大約50％的病例不知其病因，但很可能是由于遺傳原因或誘因(NanceWE.SweeneyA.Otolaryngol.Clin.NorthAm1975；819-48)。從外部聽覺通道到中央神經系統，沿聽覺途徑的任意一處的損傷都可能導致聽力喪失。聽覺器官可分成外耳、中耳、內耳和聽覺神經及中央聽覺途徑。經過內耳大約15,000個神經上皮細胞(毛細胞)和30,000第一級神經元(螺旋神經節細胞)的活動將人類的聽覺信息從機械信號轉導成神經傳導的電脈沖。所有的螺旋神經節神經元的中央纖維在腦干橋的耳蝸核中形成突觸。從耳蝸到聽覺腦干和聽覺腦皮層，與聽力有關的神經元數目顯著增加。所有聽覺信息僅由15,000個毛細胞轉導，其中數目為3500個的所謂的內部毛細胞十分重要，因為它們與30,000一級聽覺神經元的大約90％形成突觸。因此，在聽覺外周相當少數細胞的損傷可能導致基本上喪失聽力。因而，感覺神經喪失的大多數原因可能歸因于內耳病灶(Nadol，J.B.，新英格蘭醫學雜志，1993，3291092-1102)。聽力喪失可能在傳導水平，感覺神經和中央水平上。傳導性聽力喪失由涉及外耳或中耳的病灶引起，導致由鼓膜和聽小骨放大的空氣傳播的聲音向內耳流體的正常途徑破壞。感覺神經性聽力喪失由耳蝸或第八腦神經聽覺部分的病灶引起。中央聽覺喪失由中央聽覺途徑的損傷引起。它們由耳蝸和背側橄欖核復合物，下丘腦，中間膝狀體，顳葉聽覺腦皮層和互相連系的傳入和傳出纖維束組成(Adams.R.D.和Maurice，V.編輯，在神經學原理，1989。McGraw-Hill信息服務公司，p226-246)。如前所述，至少50％的極度耳聾的兒童病例具有遺傳學原因(Brown.K.S.北美臨床醫學，1969；53741-72)。如果考慮到遺傳素質是老年性或與年齡相關的聽力喪失(影響75歲以上的1/3的人)的主要引發因素的可能性，遺傳和遺傳因素很可能是聽力喪失的一個最常見的誘因。遺傳異常表現為感覺神經性聽力喪失比傳導性聽力喪失要常見得多。遺傳決定的感覺神經性聽力喪失很明顯占大多數，如果感覺神經性喪失不是主要的原因，特別是在兒童中(NanceWE，SweeneyA.北美臨床耳鼻喉科學1975；819-48)。感覺神經喪失的最常見的綜合癥形式是Waardenburg氏綜合癥，Alport氏綜合癥和Usher氏綜合癥。許多常用的藥品具有聽覺毒性特征。最熟知的是氨基糖苷抗生素(Lerner，S.A.等編輯，氨基糖苷聽覺毒性。BostonLittle，Brown，1981；Smith，C.R.等，新英格蘭醫學雜志，1980；3021106-9)，環狀利尿劑(Bosher，S.K.，耳鼻喉科學報，(Stockh)1980；904-54)，水楊酸鹽(Myers，E.N.等，新英格蘭醫學雜志，1965；273587-90)和抗腫瘤劑，如順氯氨鉑(Strauss，M.等，喉鏡，1983；1431263-5)。也描述了口服或腸胃外施用紅霉素的聽覺毒性(Kroboth，P.D.等，Arch.Intern.Med.1983；116979；Achweitzer，V.G.，Olson.N.耳鼻喉科學學報，1984；110258-60)。大多數聽覺毒性物質經過損傷耳蝸，特別是聽毛細胞和負責液體和電解質內環境穩定的內耳特化的上皮器官血管紋引起聽力喪失(Nadol，J.B.新英格蘭醫學雜志1993，3291092-1102)。次級神經退化可在聽覺毒性過程影響毛細胞后許多年才發生。有證據表明盡管使用間斷的全身性用藥，但某些聽毒性物質可能選擇性地在內耳濃縮，導致感覺神經逐漸喪失(Federspil，P.等，傳染病雜志，1976；134增刊S200-S205)。過強聲刺激引起的創傷是耳聾的另一起因。有些個體對噪聲創傷敏感。臨床上重要的感覺神經聽力喪失可能出現在接觸高強度噪聲的一些人中，即使在職業安全和健康機構批準的噪聲水平之下(Osguthorpe，J.P編輯，華盛頓區美國耳鼻喉科學院-頭頸外科基金會，1988)。脫髓鞘過程，如多處硬化可能引起感覺神經聽力喪失(Noffsinger，D等，耳鼻喉科學學報增刊(Stockh)1972；3031-63)。最近，已識別一種免疫介導的感覺神經聽力喪失形式(McCabe，B.F.耳鼻喉科學年報，1979；88585-9)。聽力喪失通常是雙側的且迅速惡化(在12周和幾月內測出)，可能與前庭癥狀相關或無關。各種腫瘤，包括原發性和轉移性腫瘤都經過侵入內耳或聽神經產生傳導性聽力喪失或感覺神經聽力喪失(Houck，J.R.等，耳鼻喉科學頭頸外科，1992；10692-7)。各種未知原因的退化性疾病可能產生感覺神經性聽力喪失。Meniere氏綜合癥(Nadol，J.B.編輯，Meniere氏疾病，病因，病理，診斷和治療。AmsterdamKugler和Ghedini1989)特征為波動性感覺神經聽力喪失，間斷性退化和耳鳴，它似乎由內耳液體內環境平衡性疾病引起，盡管發病機理仍然未知。引起中度至嚴重感覺神經性耳聾的突然自發性感覺神經性聽力喪失(Wilson，W.R.等，耳鼻喉科學學報，1980；106772-6)可能由各種原因引起，包括內耳局部缺血和病毒性迷路炎。老年性耳聾，與年齡相關的聽力喪失影響超過1/3的75歲以上的老年人。老年性耳聾最常見的組織病理學關聯是失去神經上皮(毛)細胞，神經元和外周聽覺系統的血管紋(SchuknechtH.F.耳病理學，Cambridge，Mass哈佛大學出版社，1974388-403)。老年性耳聾最好理解為由生活中的一些有害影響，包括噪聲創傷、耳毒性和遺傳引起的退化的累積效應產生。某些神經營養性因子已顯示出在發育過程中調節神經元分化和存活(KorschingS.J.神經科學，132739-2748，1993)并在成年人中保護神經元抵抗損傷和毒性(Hefti，神經科學，62155-2162，1986；Apfel等，神經學年報2987-89，1991；Hyman等，自然，350230-233，1991；Knusel等，神經科學雜志，124391-4402，1992；Yan等，自然，360753-755，1992；Koliatsos等，神經元，10359-367，1993)。原位雜交研究表明神經營養蛋白受體TrkB和TrkC的mRNA由發育的耳蝸前庭神經節表達(Ylikoski等，聽力研究，6569-78，1993；Schecterson等，聽力研究，7392-100，1994)，BDNF和NT-3的mRNA在內耳，包括Corti氏器中發現(Pirvola等，美國國家科學院院刊，899915-9919，1992；Schecterson等，聽力研究，7392-100，1994；Wheeler等，聽力研究，7346-56，1994)。在攜帶缺失了BDNF和/或NT-3基因的小鼠中研究了在前庭和聽覺系統發育中BDNF和NT-3的生理作用(Ernfors等，神經元141153-1164，1995)。在耳蝸中，BDNF突變體失去2型螺旋神經元，引起外毛細胞缺乏神經支配。NT-3突變體顯示出缺乏傳入神經和失去87％的螺旋神經元。很可能相應于1型神經元，它支配內毛細胞。雙重突變體進一步缺失，失去所有的前庭和螺旋神經元。經過研究攜帶在這些基因酪氨酸激酶催化區有種系突變的小鼠證實特定神經元群體的存活和內耳外周感覺系統靶神經支配的維持需要TrkB和TrkC受體(Schimmang等，發育，1213381-3391，1995)。Gao等，(神經科學雜志，155079-5087，1995)顯示了NT-4/5，BDNF和NT-3對解離的培養物中大鼠出生后的螺旋神經節神經元的促進存活效力且NT-4/5保護這些神經元抵抗抗癌藥，順氯氨鉑的神經毒性影響。另外，還顯示BDNF和NT-3支持解離的培養物中成年大鼠聽覺神經元的存活(Lefebvre等，神經報道，5865-868，1994)。以前尚無報道使用GDNF治療聽力喪失。由于聽力損傷是嚴重的疾病，鑒定能保護聽神經元和毛細胞免受損傷的任何試劑和治療方法都將會有極大的益處。發明概述本發明提供了治療感覺神經性聽力喪失的方法，包含給具有內耳損傷的受試者施用治療上有效量的膠質細胞系產生的神經營養因子(GDNF)蛋白質產物。例如，聽力喪失可以與神經上皮毛細胞(耳蝸毛細胞)或內耳螺旋神經節神經元的損傷或退化相聯系。本發明是基于毛細胞對GDNF應答，抵抗諸如順氯氨鉑和新霉素的聽覺毒素的有毒效應，聽覺神經元也對GDNF應答抵抗諸如例如順氯氨鉑，新霉素和水楊酸鈉的各種聽覺毒素的有毒效應的發現。因此，可施用治療上有效量的GDNF蛋白產物以促進毛細胞和螺旋神經節神經元的保護、存活或再生。也已經發現前庭器的損傷或障礙也可經過給具有該損傷或障礙的受試者施用治療上有效量的GDNF蛋白質產物來進行治療。這類損傷可導致頭暈，眩暈或失去平衡。預期該GDNF蛋白質產物可包括諸如圖1(SEQIDNO1)所示的氨基酸序列描述的GDNF蛋白質及其變異體和衍生物。還預期該GDNF蛋白質產物可包括[Met-1]GDNF。根據本發明，經腸胃外施用GDNF蛋白質產物的劑量范圍從大約1μg/kg/天到大約100mg/kg/天，典型的劑量為大約0.1mg/kg/天到大約25mg/kg/天，通常的劑量為大約5mg/kg/天到大約20mg/kg/天。還預期根據不同病人的需要和用藥途徑，以較低的頻率，如每周一次或每周幾次，而不是每天一次提供GDNF蛋白質產物。還預期GDNF蛋白質產物可直接施用到中耳或內耳。本領域的技術人員可預料到可使用更少量的GDNF蛋白產物用藥，例如，在一次注射或多次注射中，直接中耳或內耳用藥劑量范圍大約為1μg/耳到大約1mg/耳。還預期該GDNF蛋白質產物可與有效量的第二治療劑，如BDNF和NT-3組合或連接來用藥。本發明還提供了GDNF蛋白產物在生產用于治療各種病因的感覺神經性聽力喪失中毛細胞和聽神經元損傷或退化的藥物或藥用組合物中的應用。該藥用組合物包括局部用藥，口服劑或中耳及內耳GDNF蛋白產物組合物或與耳蝸埋植體結合。本領域的技術人員可預料到用藥方法可經過細胞治療和基因治療方法實現，如下作進一步的描述。例如，在基因治療方法中，細胞被修飾成生產和分泌GDNF蛋白產物。細胞可取自體外或在體內進行修飾。考慮到以目前優選的其實施方案進行描述的本發明的下列詳細描述，本發明的許多其它的方面和優勢對本領域的技術人員而言將是顯而易見的。發明詳述本發明提供了經過施用治療上有效量的膠質細胞系來源的神經營養因子(GDNF)蛋白產物來防止和/或治療感覺神經性聽力喪失的方法。根據本發明的一個方面，提供了經過以藥用組合物的方式施用治療上有效量的GDNF蛋白產物，植入表達GDNF的細胞或GDNF基因治療來治療損傷的毛細胞和聽神經元的方法。使用任何生物學活性GDNF蛋白質產物，包括在SEQIDNO1中描述的氨基酸序列所代表的GDNF蛋白質，包括其變異體和衍生物可實施本發明。除了口服，胃腸外或局部傳遞GDNF蛋白質產物外，經過細胞治療和基因治療方法用藥也是可預料到的。本發明所基于的最初的發現是在大鼠耳蝸分離塊培養物中和從成年大鼠培養物中解離的螺旋神經節神經元中GDNF保護毛細胞免受聽覺毒素誘導的細胞死亡。預期施用外源性GDNF蛋白質產物會保護毛細胞和螺旋神經節神經元免受創傷(如噪聲創傷和順氯氨鉑及氨基糖苷抗生素的急性或慢性治療)或免受因阻斷該因子從軸突運輸到細胞體引起缺乏神經營養因子而產生的損傷。預期該治療使毛細胞和/或聽神經元能耐受由環境噪聲損傷或用聽覺毒素治療引起的間歇性損害并延緩聽神經元和毛細胞的逐漸退化，該退化在諸如老年性耳聾(與年齡有關的聽力喪失)，遺傳的感覺神經退化和后天自發性聽力喪失的病理情況下導致聽力喪失且該治療能保護內耳的功能完整性。它還支持聽覺神經元使耳蝸植入體更好和更長地工作。根據本發明，可將GDNF蛋白產物施用進中耳的劑量范圍從大約1μg/kg/天到大約100mg/kg/天，典型的劑量為大約0.1mg/kg/天到大約25mg/kg/天，通常的劑量為大約5mg/kg/天到大約20mg/kg/天。在發病已經在內耳位置，如在耳蝸植入過程或內耳手術的情況下，可將GDNF蛋白產物直接用藥進內耳。在這些情況下，可施用較小量的GDNF蛋白質產物，例如，在單次注射或多次注射中從大約1μg/耳到大約1mg/耳。在需要慢性施用該因子的情況下，可將Alzet微型泵附著于一個插管上，插管尖端導入中耳或內耳以連續釋放該因子。GDNF也可形成穿透Bulla的鼓膜的滴耳劑形式。還可預期GDNF蛋白質產物與有效量的第二治療劑一起施用以治療聽神經元退化，以及與BDNF和NT-3以及其它因子或藥品一起使用以便現在或將來用于治療各種內耳病理。各種藥物制劑和不同的傳遞技術在下面進行更詳細的描述。本文所使用的術語“GDNF蛋白質產物”包括純化的天然的，合成的或重組的膠質細胞系來源的神經營養因子，具有生物學活性的GDNF變異體(包括插入，取代和缺失變異)和其化學修飾的衍生物。也包括與具有SEQIDNO1描述的氨基酸序列的人GDNF基本上同源的GDNF。在其生物學活性形式中，GDNF蛋白產物可能以同型二聚體或異型二聚體存在。本文使用的術語“生物學活性”指GDNF蛋白產物與具有SEQIDNO1描述的氨基酸序列的GDNF相比表現出相似的神經營養特性，但不必具有全部相同的特征，也不必具有相同的程度。感興趣的具體神經營養特征的選擇取決于施用GDNF蛋白產物的用途。本文使用的術語“基本上同源”指與具有SEQIDNO1描述的氨基酸序列的GDNF的同源程度優選超過70％，最優選超過80％，更優選超過90％或95％。例如，大鼠和人蛋白質的同源程度為大約93％，預期優選的哺乳動物GDNF同樣具有高程度的同源性。本文描述的同源性百分數典型地以在兩個序列中較小的一個中發現的氨基酸殘基百分數來計算，該較小的序列與被比較的序列中的相同氨基酸殘基進行序列對比，其中為了幫助該對比可在100個氨基酸長度中導入4個缺口(如Dayhoff在蛋白質序列和結構圖譜，Vol5，p124，國家生化研究基金會，華盛頓區(1972)中所述，其內容以參考文獻編入本文)。優選的上文所述的同源性百分數以在兩個序列中較小的序列上發現的各單元也在兩個序列的較大序列中發現的百分數來計算(導入缺口)，一個單元定義為4個連續氨基酸的序列。基本上同源還包括用與抗SEQIDNO1的GDNF的抗體的交叉反應性特征分離的任意GDNF蛋白質產物或可通過與編碼SEQIDNO1的GDNF的基因或基因片段雜交分離的其基因。根據本發明的GDNF蛋白質產物可用本領域的技術人員已知的任意方法分離或產生。在本發明中有用的生產GDNF蛋白質產物的舉例性方法在1994年5月23日申請的英國申請系列號08/182,183和其母申請；1992年9月17日申請的，以WO93/06116公開的PCT申請號PCT/US92/07888(Lin等，Syntex-SynergenNeuroscienceJointVenture)；以EP610254公開的歐洲專利申請號92921022.7和1995年9月28日申請的共同擁有，共同未決的美國申請系列號08/535,681中描述(“截短的膠質細胞系來源的神經營養因子”)，這些文獻的內容以參考文獻編入本文。天然存在的GDNF蛋白質產物可從哺乳動物神經元細胞制品或從分泌或表達GDNF的哺乳動物細胞系中分離。例如，WO93/06116描述了從B49膠質母細胞瘤細胞的無血清生長條件培養基中分離GDNF。GDNF蛋白質產品也可用本領域的技術人員已知的任意方法經化學合成。優選經重組技術生產GDNF蛋白質產物，因為它們能獲得相對更高純度的更大量的蛋白質。重組GDNF蛋白質產物形式包括該蛋白質的糖基化和非糖基化形式以及在細菌，哺乳動物或昆蟲細胞系統中表達的蛋白質。一般來說，重組技術包括分離編碼GDNF的基因，在合適的載體和細胞類型中克隆該基因，如果需要，將基因修飾成編碼所述的變異體，表達該基因以產生GDNF蛋白質產物。另外，編碼所需GDNF蛋白質產物的核苷酸序列可經化學合成。預期使用由于遺傳密碼的簡并性或等位基因變異在密碼子使用上有區別的核苷酸序列可表達GDNF蛋白質。WO93/06116描述了大鼠GDNF基因cDNA克隆的分離和測序以及人GDNF基因基因組DNA克隆的測序和表達。WO93/06116也描述了表達GDNF蛋白產物的載體、宿主細胞和培養物生長條件。適于在大腸桿菌中表達GDNF蛋白質產物的其它載體在1991年4月24日公開的歐洲專利申請號EP0423980(“干細胞因子”)中公開，其說明書以參考文獻編入本文。編碼成熟人GDNF的基因的DNA序列和GDNF的氨基酸序列在WO93/06116圖19(SEQIDNO5)中顯示。圖19未顯示GDNF前體原(Pre-Pro)部分的完整編碼序列，但人GDNF前體原的前50個氨基酸在WO93/06116圖22(SEQIDNO8)中顯示。天然存在的GDNF在其生物學活性形式中是二硫鍵二聚體。在細菌系統表達后分離的物質基本上具有生物學活性，且以單體存在。再折疊對生產生物學活性二硫鍵型二聚體是必需的。細菌系統中表達的GDNF的再折疊和復性方法在WO93/06116中描述。測定GDNF活性的標準體外試驗在WO93/06116和1995年9月28日申請的共同擁有，共同未決美國申請系列號08/535,681中描述，本文引用以供參考。A.GDNF變異體本文使用的術語“GDNF變異體”包括在天然存在的GDNF氨基酸序列中發生了氨基酸殘基的缺失(“缺失變異體”)，插入(“添加變異體”)或取代(“取代變異體”)的多肽。經過將合適的核苷酸改變導入編碼該多肽的DNA中或經體外化學合成所需的多肽制備該變異體。本領域的技術人員可預料得到可制備缺失、插入和取代的許多組合，只要最終的分子具有GDNF生物學活性。取代，插入或缺失一個或多個選定的氨基酸殘基的誘變技術對本領域的技術人員來說是熟知的(例如，美國專利號4,518,584，其說明書以參考文獻引入本文)。在變異體構建中有兩類基本的變化突變位點的位置和突變特征。在設計GDNF變異體時，突變位點和突變特性的選擇取決于待修飾的GDNF的特征。突變位點可單獨或進行一系列的修飾，例如，經過(1)首先選擇保守氨基酸取代，然后根據要達到的結果用更多的基團選擇取代，(2)缺失靶氨基酸殘基，或(3)插入與選定位點相鄰的氨基酸殘基。優選從1到20個氨基酸的保守改變。一旦測定所需GDNF蛋白質產物的氨基酸序列，就容易測定表達該蛋白質所用的核酸序列。也可經蛋白水解酶產生N端和C端的缺失變異體。對于GDNF缺失變異體，缺失一般大小從大約1到30個殘基，更通常的是從大約1到10個殘基，典型地從大約1到5個連續的殘基。預期可以是N端，C端和內部序列內缺失。可將缺失導入與其它TGF-β超家族成員且有低同源性的區域以修飾GDNF的活性。在與其它TGF-β超家族序列基本上同源的區域的缺失很可能更明顯地改變GDNF生物學活性。保守缺失的數目的選擇應保護GDNF蛋白質產物在受影響區域的三級結構，例如，半胱氨酸的交聯。缺失變異體的非限制性例子包括缺失GDNF1至40個N端氨基酸的截短的GDNF蛋白質產物或缺失GDNFC端殘基的變異體或其組合，如在1995年9月28日申請的共同擁有，共同未決美國申請系列號08/535,681中所述，本文以參考文獻引用。對于GDNF添加變異體，氨基酸序列的添加典型地包括長度范圍從一個殘基到含一百或更多殘基的多肽的N和C端融合以及內部序列內添加一個或多個氨基酸殘基。內部添加一般范圍可從大約1到10個殘基，更典型的是從大約1到5個殘基，通常從大約1到3個氨基酸殘基。N端添加變異體的例子包括命名為[Met-1]GDNF的具有N端甲硫氨酰殘基的GDNF(GDNF在細菌重組細胞培養物中直接表達的假象)，以及為了利于從重組宿主細胞分泌成熟GDNF而融合到GDNFN端的異源性N-端信號序列。這些信號序列一般從目的宿主細胞種類獲得因而與之同源。添加也可包括來自其它神經營養因子的序列的氨基酸序列。根據本發明使用的優選的GDNF蛋白質產物是重組人[Met-1]GDNF。GDNF取代變異體去掉GDNF氨基酸序列中的至少一個氨基酸殘基且在其位置插入不同的殘基。這種取代變異體包括等位基因變異體，其特征在于群體種類中天然存在的核苷酸序列改變可能或不會導致氨基酸改變。取代變異體的例子(例如，見SEQIDNO50)在共同擁有、共同未決的1995年9月28日申請的美國申請系列號08/535,681中公開，本文引用以供參考。GDNF氨基酸序列的具體突變可包括對糖基化位點(例如，絲氨酸，蘇氨酸或天冬酰胺)的修飾。糖基化的缺乏或僅部分糖基化由在連接糖基化識別位點的天冬酰胺上或在經添加O-連接的糖類修飾分子的任意位點上氨基酸的取代或缺失引起。天冬酰胺連接的糖基化識別位點包括由合適的細胞糖基化酶特異性識別的三肽序列。這些三肽序列是Asn-Xaa-Thr或Asn-Xaa-Ser，其中Xaa可以是非Pro的任意氨基酸。在糖基化識別位點的第一或第三氨基酸位置中的一個或兩個位置上的各種氨基酸取代或缺失(和/或在第二位置的氨基酸缺失)導致在修飾的三肽序列上無糖基化。因此，表達適當改變的核苷酸序列產生在該位點未糖基化的變異體。另外，GDNF氨基酸序列可修飾成增加糖基化位點。鑒定GDNF氨基酸殘基或區域誘變的一個方法是Cunningham和Wells(科學，2441081-1085，1989)所述的所謂的“丙氨酸掃描誘變”。在該方法中，鑒定一個氨基酸殘基或靶殘基組(例如，諸如Arg，Asp，His，Lys和Glu的帶電殘基)并用中性或帶負電的氨基酸(最優選丙氨酸或多聚丙氨酸)取代以影響該氨基酸與細胞內或外的周圍水環境的相互作用。然后經過在取代位點導入添加的或改變的殘基挑選出顯示對取代具有功能敏感性的區域。從而確定導入氨基酸序列改變的靶位點，在相應的靶密碼子或DNA序列區域進行丙氨酸掃描或隨機誘變，篩選具有所需活性和活性程度的最佳組合的表達的GDNF變異體。取代誘變最感興趣的位點包括從不同種類的GDNF蛋白質中發現的氨基酸在側鏈大小，電荷和/或疏水性方面基本上不同的位點。其它感興趣的位點是從不同種類獲得的GDNF樣蛋白質的特定殘基是相同的那些位點。這些位置一般對蛋白質的生物學活性是重要的。最初，這些位點以相當保守的方式進行取代。這些保守的取代在表1中顯示，表頭下面是優選的取代。如果該取代導致生物學活性改變，那占導入更重大的改變(舉例性取代)，和/或進行其它的添加或缺失并篩選所得產物的活性。表1氨基酸取代原始殘基優選的取代舉例性取代Ala(A)ValVal；Leu；IleArg(R)LysLys；Gln；AsnAsn(N)GlnGln；His；Lys；ArgAsp(D)GluGluCys(C)SerSerGln(Q)AsnAsnGlu(E)AspAspGly(G)ProProHis(H)ArgAsn；Gln；Lys；ArgIle(I)LeuLeu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸Leu(L)Ile正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；PheLys(K)ArgArg；Gln；AsnMet(M)LeuLeu；Phe；IlePhe(F)LeuLeu；Val；Ile；AlaPro(P)GlyGlySer(S)ThrThrThr(T)SerSerTrp(W)TyrTyrTyr(Y)PheTrp；Phe；Thr；SerVal(V)LeuIle；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸對氨基酸序列的保守性修飾(和對編碼核苷酸序列的相應修飾)預期產生具有相似于天然GDNF的功能和化學特征的GDNF蛋白質產物。相反，GDNF蛋白質產物功能和/或化學特征的重大改變可經過選擇其對保持下列特征的影響上明顯不同的取代來實現，(a)取代區域多肽骨架的結構，例如，片層或螺旋構象，(b)分子在靶位點上的電荷或疏水性，或(c)側鏈的大小。根據常見的側鏈特征將天然存在的殘基分成組1)疏水正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；2)中性親水Cys，Ser，Thr；3)酸性Asp，Glu；4)堿性Asn，Gln，His，Lys，Arg；5)影響鏈方向的殘基Gly，Pro；6)芳環的Trp，Tyr，Phe。非保守性取代可包含這些類別中的一個成員被另一個交換。該取代的殘基可導入與其它TGF-β超家族蛋白同源的GDNF蛋白質區或該分子的不同源區。B.BDNF衍生物GDNF的化學修飾的衍生物或GDNF變異體可按本文說明書的教導由本領域的技術人員來制備。最適于衍變的化學基團包括水溶性多聚體。水溶性多聚體是需要的，因為附著于其上的蛋白質在含水環境如生理環境中不沉淀。優選的多聚體對于制備治療性產品或組合物是藥用上可接受的。本領域的技術人員將根據諸如多聚體/蛋白質連接物是否在治療上使用，如果是，所需的劑量，循環時，對蛋白水解的抗性和其它因素的考慮選擇所需的多聚體。衍變的效果可經過以所需的形式(即，經過滲壓泵，或更優選的是經注射或輸注或進一步配成口服，肺或其它傳遞途徑)施用該衍生物并測定其效果來證實。合適的水溶性多聚體包括，但不限于聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇的共聚物，羧甲基纖維素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚1，3-二氧戊環，聚1，3，6-三氧六環，乙烯/馬來酸酐共聚物，多聚氨基酸(同型多聚體或隨機共聚物)，葡聚糖或多聚(正-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，聚丙二醇同型多聚體，聚氧丙烯/氧乙烯共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)，聚乙烯醇和其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的穩定性可能在生產上具有優勢。多聚體可以是任意分子量的，且可以是分枝或不分枝的。對于聚乙二醇，為便于處理和生產優選的分子量范圍以大約2kDa到大約100kDa(術語“大約”表示在聚乙二醇制品中，有些分子可能比所述分子量更大或更小)。根據所需的治療情況可使用其它大小(例如，所需的緩釋期限，效果，如果對生物學活性有影響的話，便于操作，抗原性程度或無以及聚乙二醇對治療性蛋白質或變異體的其它已知影響)。這樣附著上的多聚體分子的數目可以改變，本領域的技術人員可證實對功能的影響。可進行單一衍變，或用相同或不同化學基團(例如，多聚體，如不同分子量的聚乙二醇)提供雙重，三重，四重衍變或其組合。多聚體分子與蛋白質(或肽)分子的比例可以隨其在反應混合物中的濃度而改變。一般來說，最佳比例(關于反應效率，沒有剩余的未反應的蛋白質或多聚體)可用諸如所需衍變程度(例如，單一，二重，三重等)，選定多聚體的分子量，多聚體是否分枝和反應條件的因素來確定。考慮到對蛋白質功能或抗原區的影響，聚乙二醇分子(或其它化學部分)應附著于蛋白質上。對本領域的技術人員來說有許多附著方法可使用。例如，見EP0401384，本文引用其說明書以供參考(將PEG偶聯到G-CSF上)，也見Malik等，Exp.Hematol.，201028-1035，1992(報道了使用tresylchloride使GM-CSFPEG化)。例如，聚乙二醇可經過反應基團，如自由氧基或羧基共價結合到氨基酸上。反應性基團是活化的聚乙二醇分子可結合的那些基團。具有自由氨基的氨基酸殘基可包括賴氨酸殘基和N末端氨基酸殘基。具有自由羧基的那些氨基酸殘基包括天冬氨酸殘基，谷氨酸殘基，和C末端氨基酸殘基。巰基也可用作附著聚乙二醇分子的反應性基團。為達到治療目的，優選在氨基上附著，如在N端或賴氨酸基團上附著。如果需要受體結合，應避免在對受體結合較重要的殘基上附著。可能特別需要一種N端化學修飾的蛋白質。使用聚乙二醇作為對本發明的組合物的一種解釋，選擇各種聚乙二醇分子(以分子量，分枝等)，反應混合物中聚乙二醇分子對蛋白質(或肽)分子的比例，所進行的PEG化反應的類型和獲得選定的N端PEG化蛋白質的方法。獲得N端PEG化制品(即，如果需要的話從其它單個PEG化群體中分離該部分)的方法可經過從PEG化蛋白質分子群體中純化N端PEG化物質。選擇性N端化學修飾可經過利用可獲得的不同類第一氨基(賴氨酸與N末端)的不同反應性經還原性烷基化在特定蛋白質中衍變來實現。在合適的反應條件下，實現蛋白質在N端與含羰基的多聚體的明顯選擇性衍化。例如，可經過在允許利用賴氨酸殘基ε-氨基和該蛋白質N端殘基α-氨基之間的pKa差異的pH下進行反應來選擇性地在N端PEG化該蛋白質。經過這種選擇性衍化，控制水溶性多聚體附著于蛋白質上與多聚體的連接主要發生在該蛋白質的N末端，且對其它反應性基團，如賴氨酸側鏈氨基不發生明顯的修飾。使用還原性烷基化時，水溶性多聚體可以是上面所述的類型，且應具有單個反應性醛基以偶聯蛋白質。可使用含單個反應醛基的聚乙二醇丙醛。本發明包含使用原核生物表達的GDNF或其變異體的衍生物，與至少一個聚乙二醇分子相聯，以及使用GDNF或其變異體經酰基或烷基鍵附著于一個或多個聚乙二醇分子上。用本領域已知的任意PEG化反應可實現PEG化。例如，見生長因子聚焦，3(2)4-10，1992；EP0154316，(本文引用其說明書以供參考)，EP0401384；和本文引用的涉及PEG化的其它文獻。經過與反應性聚乙二醇分子(或類似的反應性水溶性多聚體)進行酰基化反應或烷基化反應可實現PEG化。以酰基化進行的PEG化一般包含將聚乙二醇的活性酯衍生物與GDNF蛋白質或變異體進行反應，任何已知的或隨后發現的反應性PEG分子可用于實現對GDNF蛋白質或變異體的PEG化。優選的活化PEG酯是酯化到N-羥基琥珀酰亞胺上的PEG。本文使用的“酰基化”預期包括非限制性的治療性蛋白質與諸如PEG的水溶性多聚體之間的下列類型的鍵酰胺，氨基甲酸酯，尿烷等。見生物連接化學，5133-140，1994。反應條件可從任意PEG化技術中已知的條件或隨后建立的條件中選擇，但應避免使待修飾的GDNF或變異體失活的溫度，溶劑和pH條件。經乙酰化的PEG化一般產生多個PEG化的GDNF蛋白質或變異體。優選的是，連接鍵可以是酰胺。還優選的是，所得的產品基本上只有(例如，＞95％)單個，雙重或三重PEG化。然而，根據使用的特異性反應條件可形成一定量的更高程度的PEG化的一些種類。如果需要，更純化的PEG化種類可用標準純化技術，包括透析，鹽析，超濾，離子交換色譜，凝膠過濾色譜和電泳等從混合物，特別是未反應的種類中分離。經烷化進行的PEG化一般涉及在還原劑存在的條件下將PEG的末端醛衍生物與GDNF蛋白質或變異體發生反應。經烷化進行的PEG化也能產生多個PEG化的GDNF蛋白質或變異體。另外，可控制反應條件以便基本上僅在GDNF蛋白質或變異體的N端α-氨基上進行PEG化(即，單個PEG化的蛋白質)。在單個PEG化或多個PEG化的情況下，PEG基團優選經-CH2-NH-基團附著到蛋白質上。特別是對于-CH2基團，這類鍵本文稱為“烷基”鍵。經還原性烷基化產生單個PEG化產品的衍變利用了可用于衍化的不同類第一氨基(賴氨酸與N未端)的不同反應性。反應在允許利用賴氨酸殘基ε-氨基和蛋白質N端殘基α-氨基之間的pKa區別的pH下進行。經過該選擇性衍變，控制含有諸如醛的反應基團的水溶性多聚體附著到蛋白質上與多聚體的連接主要發生在該蛋白質的N端且諸如賴氨酸側鏈氨基的其它反應性基團不發生明顯的修飾。在一個重要的方面中，本發明包含使用單個多聚體/GDNF蛋白質(或變異體)連接分子的基本上勻質的制品(指多聚體分子基本上僅(即，＞95％)在單個位置附著于GDNF蛋白質或變異體上)。更具體地說，如果使用聚乙二醇，本發明還包含使用缺乏可能的抗原性連接基團，且具有直接偶聯到GDNF蛋白質或變異體上的聚乙二醇分子的PEG化的GDNF蛋白質或變異體。因此，可預期根據本發明使用的GDNF蛋白質產品可包括PEG化的GDNF蛋白質或變異體，其中PEG基團經酰基或烷基附著。如上所述，該產品可以是單個PFG化的或多個PFG化的(例如，含2-6，優選2-5個PEG基團)。PEG基團一般在氨基酸的α-或ε-氨基上附著于蛋白質上，但也包含PEG基團附著于蛋白質的任意氨基上，只要該氨基有足夠的反應性，能在合適的反應條件下附著于PEG基團上。用于酰基化和烷基化研究的多聚體分子可選自如上所述的水溶性多聚體。選擇的多聚體應修飾成具有單個反應基團，如優選用于酰基化的活性酯或用于烷基化的醛、以便按本方法控制多聚化程度。舉例性的活性PEG醛是聚乙二醇丙醛(它具有水穩定性)或其單個C1-C10烷氧或芳氧衍生物(見，美國專利5252714)。多聚體可以是分枝的或不分枝的。對于酰化反應，選擇的多聚體應具有單個反應性酯基。對于還原性烷基化，選擇的多聚體應具有單個反應性醛基。一般來說，水溶性多聚體不應從天然存在的糖苷殘基中選擇，因為它們通常更便于由哺乳動物重組表達系統制備。多聚體可以是任意分子量，且可以是分枝或不分枝的。本文使用的特別優選的水溶性多聚體是聚乙二醇。本文使用的聚乙二醇意味著包含用于衍變其它蛋白質的PEG的任意形式，如單個(C1-C10)烷氧基或芳氧基聚乙二醇。一般來說，化學衍變可在用于使生物活性物質與活化的多聚體分子反應的任意合適條件下進行。制備PEG化GDNF分子或變異體的方法一般包含下列步驟(a)在蛋白質被一個或多個PEG基團附著的條件下使GDNF蛋白質或變異體與聚乙二醇(如PEG的反應性酯或醛衍生物)反應，(b)獲得反應產物。一般來說，酰基化反應的最佳反應條件可根據已知參數和所需結果逐項測定。例如，PEG蛋白質的比率越大，多個PEG化的產品百分數越大。生產單個多聚體/GDNF蛋白質(或變異體)連接物分子的基本上均一的群體的還原性烷基化一般包括下列步驟(a)在還原性烷基化條件下，在適于在所說GDNF蛋白質或變異體氨基末端的α-氨基上進行選擇性修飾的pH下將GDNF蛋白質或變并體與反應性PEG分子進行反應；(b)獲得反應產物。對于單個多聚體/GDNF蛋白質(或變異體)連接體分子的基本上均一的群體；還原性烷化反應條件是允許水溶性多聚體基團選擇性附著到GDNF蛋白質或變異體N端的那些條件該反應條件一般提供賴氨酸氨基和N端α-氨基之間的pKa差異(pKa指50％的氨基質子化而50％未質子化時的pH)。pH也影響所使用的多聚體與蛋白質的比率。一般來說，如果pH較低，需要的多聚體超過蛋白質的量越大(即，N-端α-氨基的反應性越小，實現最佳條件所需的多聚體越多)。如果pH更高，多聚體蛋白質比率就不必這樣大(即，可利用的反應基團越多，所需的多聚體分子越小)。為達到本發明的目的，pH一般落入3-9的范圍內，優選3-6的范圍。另一種重要的考慮是多聚體的分子量。一般來說，多聚體的分子量越高，可附著于蛋白質上的多聚體分子越少。同樣，當選擇這些參數時應考慮多聚體的分枝。一般來說，分子量越高(或分枝越多)，多聚體蛋白質比率越高。一般情況下，對于本文涉及的PEG化反應，優選平均分子量為大約2kDa到大約100kDa。優選的平均分子量是大約5kDa到大約50kDa，特別優選大約12kDa到大約25kDa。水溶性多聚體與GDNF蛋白質或變異體的比率一般范圍從1∶1到100∶1，優選(對多個PEG化)1∶1到20∶1和(對于單個PEG化)1∶1到5∶1。使用上面所述的條件，進行還原性烷基化以便將多聚體選擇性地附著到在氨基末端具有α-氨基的任意GDNF蛋白質或變異體上，并提供單個多聚體/GDNF蛋白質(或變異體)連接物的基本上均一的制品。這里使用的術語“單個多聚體/GDNF蛋白質(或變異體)連接物”指由單個多聚體分子附著到GDNF蛋白質或GDNF變異體蛋白質分子上組成的組合物。單個多聚體/GDNF蛋白質(或變異體)連接物優選多聚體分子位于N端，而不在賴氨酸氨基側鏈上。該制品優選是超過90％的單個多聚體/GDNF蛋白質(或變異體)連接物，更優選超過95％的單個多聚體/GDNF蛋白質(或變異體)連接物，剩余的可觀察的分子是未反應的(即，沒有多聚體基團的蛋白質)。對于還原性烷基化，還原劑應在水溶液中是穩定的，且優選能僅能還原在還原性烷基化起始過程中形成的Schiff堿。優選的還原劑可選自氫硼化鈉，氰基氫硼化鈉，二甲胺甲硼烷，三甲胺甲硼烷和吡啶甲硼烷。特別優選的還原劑是氰基氫硼化鈉。其它反應參數，如溶劑，反應時間、溫度，等及產物純化的方法可根據涉及用水溶性多聚體衍變蛋白質的公開的信息(見本文引用的文獻)逐個測定。C.GDNF蛋白質產物的藥用組合物GDNF蛋白質產物的藥用組合物典型地包括與一種或多種藥用上和生理學上可接受的配制物質混合的治療上有效量的GDNF蛋白質產物。合適的配制物質包括，但不限于抗氧化劑，防腐劑，生色劑，調味劑和稀釋劑，乳化劑，懸浮劑，溶劑，填充劑，膨脹劑，緩沖液，傳遞載體，稀釋劑，賦形劑和/或藥用佐劑。例如，合適的載體可以是注射用水，生理鹽水溶液或人工外淋巴，很可能補充一些在腸胃外用藥的組合物中常用的其它物質。中性緩沖鹽水或與血清白蛋白混合的鹽水是另外的舉例性載體。載體中的第一溶劑可以是天然含水或不含水的。另外，載體可含有其它藥用上可接受的賦形劑以修飾或維持pH，滲透壓，粘滯度，澄清度，顏色，無菌性，穩定性，溶解率或組合物的氣味。同樣，載體還可含有其它的藥用上可接受的賦形劑以修飾或維持GDNF蛋白質產物的釋放率或促進GDNF蛋白產物的吸收或透過鼓膜。這些賦形劑是通常和習慣用于配制以單位劑量或多劑量形式中耳用藥的劑型的那些物質。一旦配制了治療性組合物，可作為溶液，懸液，凝膠，乳劑，固體或脫水的或凍干的粉末貯存于無菌小瓶中。這類配制品可以易于使用的形式或以諸如施用前需重新配制的凍干的形式貯存。最適的藥用配制品可由本領域的技術人員根據諸如用藥途徑和所需劑量的考慮來確定。例如，見Remington氏藥用科學，第18版(1990，Mack出版公司，Easton，PA18042)第1435-1712頁，本文引用其內容以供參考。該配制品可影響該GDNF蛋白質，變異體和衍生物的物理狀態，穩定性，體內釋放速率和體內清除速率。其它有效的用藥形式，如中耳緩釋型配方，吸入霧劑，或口服活性配方也是可想象的。例如，在緩釋型配方中，GDNF蛋白產物可結合到或摻入多聚體化合物(如聚乳酸，聚糖酸等)或脂質體的特定制品中。也可使用Hylauronicacid，它可能具有延長在循環中的滯留時間的效力。GDNF蛋白質產物的藥用組合物也可配制成用于中耳用藥，例如，經鼓膜輸注或注射，也可包括緩釋或滯留循環的配方。這類中耳用藥的治療組合物典型地以無熱原的包含溶于藥用上可接受的載體中的GDNF蛋白產物的中耳可接受的水溶液的形式。優選的載體是無菌蒸餾水。還預期含GDNF蛋白產物的某些配方經口服用藥。以該方式用藥的GDNF蛋白產物可用膠囊包裝且可使用或不用習慣用于混合固體劑量形式的那些載體來配制。膠囊可設計成在生物利用率最大和前期系統降解最小時在胃腸道釋放組合物的活性部分。可包括其它的賦形劑以利于GDNF蛋白產物的吸收。也可利用稀釋劑，調味劑，低溶點蠟，植物油，潤滑劑，懸浮劑，片劑分解劑和結合劑。包括中耳溶液，懸液和軟膏的局部耳制品的配制對本領域的技術人員而言是熟知的(見Remington氏藥用科學，第18版，第86章，第1581-1592頁，Mack出版公司，1990)。也可利用其它的用藥方式，包括注射進中耳。生產適于這類用藥方式的中耳制品的方法和方式也是熟知的。在本申請中使用的“中耳”指鼓膜與內耳之間的空間。該位置在所有內耳組織的外部，如果形成一種配制品使GDNF透過鼓膜就可不需侵害性程序來進入該區域。否則，將經過鼓膜注射將物質導入中耳，如果需要重復用藥，在鼓膜上將會形成一個孔。該系統的例子包括插入劑和可用于將治療物質傳遞到這些區域的“局部”應用的滴劑，凝膠或軟膏。在諸如中耳感染的病例中(通常是兒童)，在鼓膜上開口是根據臨床調查最常用的方法。幾天后開口自發關閉。在這里描述的治療內耳疾病或損傷的GDNF蛋白產物的應用中，局部應用的制劑包括促進治療劑穿透或運輸進中耳和內耳的試劑也具有優勢。該試劑在本領域中是已知的。例如，Ke等，美國專利5221696公開了使用物質來增強眼制品穿透角膜。內耳系統是那些適合于在內耳組織層內，之間或周圍的任何組織分室，如耳蝸和前庭器內使用的系統。這些位置包括耳蝸的不同結構，如血管紋，Reissner氏膜，柯蒂氏器，螺旋韌帶和耳蝸神經元。由于已顯示蛋白質能穿透窗孔周圍膜進入內耳外淋巴，所以不需侵害性程序就能進入這些結構。對于經穿透窗孔周圍膜將GDNF導入內耳特別合適的載體是人造外淋巴。該溶液由10.00mMD-葡萄糖，1.5mMCaCl，1.5mMMgCl溶液于1.0％Dulbeco氏磷酸鹽緩沖溶液的去離子水溶液中組成，滲透壓為280-300mOsm，pH為7.2。還有另一制品可包含GDNF蛋白產物與諸如可注射進中耳的微球體或脂質體的試劑的配制器，它提供了緩慢或持久釋放的蛋白質，然后可作為貯存注射物傳遞。將GDNF蛋白質產物導入內耳的其它合適的方法包括可植入的藥品傳遞裝置，它含有GDNF蛋白質產品以及具有一個通道的耳蝸埋植體，使GDNF能通過該通道連續傳遞進內耳。本發明的耳治療制品，特別是局部制品可包括其它成份，例如，中耳可接受的防腐劑，張力劑，潛溶劑，復合劑，緩沖劑，抗微生物劑，抗氧化劑和表面活性劑，正如本領域所熟知的。例如，合適的張力增強劑包括堿金屬鹵鹽(優選氯化鈉或氯化鉀)，甘露醇，山梨醇等。加入足夠的張力增強劑是有利的，這可使滴入耳內的組合物與內和外淋巴的滲壓相配伍。合適的防腐劑包括但不限于氯芐烷氨，硫柳汞，苯乙醇，對羥苯甲酸甲酯，對羥苯甲酸丙酯，氯苯胍亭，山梨酸等。也可使用過氧化氫作防腐劑。合適的潛溶劑包括但不限于甘油，丙二醇和聚乙二醇。合適的復合劑包括咖啡因，聚乙烯吡咯烷酮，β-環糊精或羥丙基-β環糊精。緩沖液可以是常規緩沖液，如硼酸鹽，檸檬酸鹽，磷酸鹽，碳酸氫鹽或Tris-HCl。制劑的成份以中耳或內耳用藥位點可接受的濃度存在。例如，緩沖液用于將組合物維持在生理pH或略低的pH下，典型地在從大約5到大約8的pH范圍。其它的制劑成份可包括能延長施用的治療劑在中耳的停留時間以擴大局部接觸并促進通過窗孔周圍膜的吸收的物質。合適的物質包括使中耳制品粘度增加的多聚體或凝膠形成物質。用于控制內耳治療劑釋放(例如，滯留并延長傳遞)的本發明的制劑的合適性可用本領域已知的各種程序測定。另一耳制劑可包括與適于生產片劑的無毒性的中耳治療可接受的賦形劑混合的有效量的GDNF。經將片劑溶于無菌水或其它合適的載體中，可以單位劑量的形式制備中耳治療溶液。合適的賦形劑包括但不限于惰性稀釋劑，如碳酸鈣，碳酸鈉或碳酸氫鈉，乳糖，或磷酸鈣，或粘合劑，如淀粉，明膠或阿拉伯膠。GDNF蛋白產物的施用/傳遞GDNF蛋白產物經皮下，肌肉內，靜脈內，經肺部，經皮膚，膜內或腦內途徑腸胃外用藥。為了治療內耳癥狀，GDNF蛋白產物可經局部應用，插入，注射，埋植，細胞治療或基因治療施用進中耳(或直接施用進內耳，特別是已在該處發生侵害性程序的情況下)。例如，含有包埋于生物可降解的多聚體基質中的神經營養因子的緩釋型埋植體。GDNF蛋白質產物可經腦外以化學修飾或包裝的形式用藥以便經過血腦屏障，或可與一種或多種能促進GDNF蛋白質產物穿過屏障的試劑連接用藥。同樣，GDNF蛋白質產物可在中耳或內耳用藥，或可在鼓膜頂部與一種或多種能促使GDNF蛋白質產物穿透或運輸通過該耳膜的試劑連接用藥。劑量頻率取決于配制的GDNF蛋白質產物的藥物動力學參數和用藥途徑。可根據體重、體表面積或器官大小的考慮計算具體劑量。為確定包含各種上述組合物的合適治療劑量所必需的計算的進一步選擇可由本領域的普通技術人員按常規做出且在常規進行的工作范圍內，特別是在本文公開的劑量信息和試驗的教導下。合適的劑量可通過使用與合適的劑量反應數據結合使用的已建立的測定劑量的試驗來確定。本領域的技術人員可預料到內耳施用的組合物所用的劑量比系統注射或口服所用的劑量要小。涉及治療上述癥狀的方法的最終劑量方案由出診醫生考慮影響藥物作用的各種因素，例如，年齡，癥狀，體重，性別和病人食譜，感覺的嚴重性，用藥時間和其它臨床因素來確定。隨著所進行的研究，將會得到關于治療各種疾病和癥狀的合適的劑量水平的進一步的信息。可想象連續用藥或持久傳遞GDNF對于提供治療具有優勢。盡管連續用藥可經過機械裝置，如用一個輸注泵來實現，但預期可實施連續或幾乎連續用藥的其它方式。例如，化學衍變或包裝可產生持久釋放形式的蛋白質，根據確定的劑量方案，它具有以可預料的量連續存在的效應。因此，GDNF蛋白質產品包括衍生的或配制的蛋白質以實現該連續用藥。也包含GDNF蛋白質產物的細胞治療，例如，中耳或內耳埋植生產GDNF蛋白質產品的細胞。該實施方案也包含將能合成和分泌GDNF蛋白質產物的生物活性形式的細胞植入病人體內。該生產GDNF蛋白質產品的細胞可以是GDNF蛋白質產物天然生產者的細胞(類似于B49膠質母細胞瘤細胞)或可以是重組細胞，其生產GDNF蛋白質產物的能力經過用存在于適于促進其表達和分泌的載體中的編碼所需GDNF蛋白質產品的基因轉化進行了改變。為了減小在施用外源種類的GDNF蛋白質產物的病人中的潛在的免疫學反應，優選生長GDNF蛋白質產物的天然細胞來源于人類且產生人GDNF蛋白質產物同樣，優選生產GDNF蛋白質產物的重組體細胞用含編碼人GDNF蛋白質產物的基因的表達載體轉化。植入的細胞可被包裝以避免周圍組織滲入。人類或非人類哺乳動物細胞可在允許釋放GDNF蛋白產物，但防止病人免疫系統或周圍組織的其它有害因素破壞細胞的生物相容性、半透性多聚體外套或膜中植入病人體內，例如，這種埋植體可附著于中耳窗孔周圍膜上以便直接生產并釋放GDNF蛋白質產物進入外淋巴。還預期可體外轉化病人自身的細胞以生產GDNF蛋白產物并不經包裝直接植入。例如，可回收柯蒂氏器支持細胞，培養細胞并用合適的載體轉化，然后移植進病人內耳，移植細胞在此生產并釋放所需的GDNF蛋白質或GDNF蛋白質變異體。也可想象經定位注射核酸構建體或其它合適的傳遞載體將編碼GDNF蛋白質產物的基因導入靶向內耳細胞進行體內GDNF蛋白質產物的基因治療。(Hefti，神經生物學雜志，251418-1435，1994)。例如，編碼GDNF蛋白質產物的核酸序列可包含在腺伴隨病毒載體或腺病毒載體中以傳遞進內耳細胞。另外的病毒載體包括，但不限于，逆轉錄病毒，單純皰疹病毒和乳頭狀瘤病毒載體。合適的體內或體外的物理轉移也可經過脂質體介導的轉移，直接注射(裸露的DNA)，受體介導的轉移(配體-DNA復合物)。電穿孔，磷酸鈣沉淀或微粒轟擊(基因柱)實現。用于活細胞膜包裝的方法學是本領域的普通技術人員所熟悉的，包裝細胞的制備和其移入病人不需過多的實驗就能實施，例如，見美國專利號4,892,538，5,011,472和5,106,627，它們分別被特別地編入本文以供參考。包裝活細胞的系統在Aebischer等的PCT申請WO91/10425中描述，特別引入本文以供參考。也見Aebischer等的PCT申請WO91/10470，Winn等，實驗神經學，113322-329，1991；Aebischer等，實驗神經學，111269-275，1991；Tresco等，ASAIO，3817-23，1992，它們分別特別引入本文以供參考。配制各種其它的持久的或控制型傳遞工具，如脂質體載體，生物腐蝕性顆粒或珠和貯存注射劑的技術也是本領域的技術人員已知的。應注意到本文描述的GDNF蛋白產物的配制品可用于獸醫學以及人類的應用，術語“病患者”不應以限制性方式進行解釋。在獸醫學應用的情況下，劑量范圍應與上面限定的相同。本發明的其它方面和優勢根據下面解釋性實施例的考慮應是可理解的。實施例1描述了GDNF蛋白產物用藥用耳蝸外植塊培養系統中的毛細胞的影響。實施例2闡述了GDNF蛋白質產物用藥對從耳蝸產生的解離細胞培養物中螺旋神經節神經元的影響。柯蒂氏器外植塊培養物研究的結果和成年大鼠螺旋神經節神經元培養物的結果證實了GDNF蛋白質產物對于聽神經元和柯蒂氏器毛細胞抵抗聽覺毒素具有神經營養和保護性活性，這是以前未知的GDNF活性。實施例實施例1GDNF蛋白質產物保護耳蝸毛細胞抵抗聽覺毒素材料用于下面實施例的材料獲得如下柯蒂氏器解剖液Dulbecco′氏磷酸鹽緩沖溶液(PBS；1×，無氯化鈣，無氯化鎂。產品目錄號14190-136，GibcoBRL)，含1.5g/LD-葡萄糖(葡萄糖，產品目錄號15023-021，GibcoBRL)。柯蒂氏器外植塊培養基1.高葡萄糖Dulbecco氏改良的Eagle培養基(DMEM；1×，含有L-谷氨酰胺，無丙酮酸鈉。產品目錄號11965-084，GibcoBRL)2.0.15g/100mlD-葡萄糖(葡萄糖，產品目錄號15023-021，GibcoBRL)3.1％N-2補充液(100×，產品目錄號17502-030，GibcoBRL)4.100單位/ml青霉素G鉀(青霉素；產品目錄號21840-020，GibcoBRL)方法培養基的制備DMEM用1％N-2補充液補充，加入D-葡萄糖至終濃度為1.5g/l。以100單位/ml加入青霉素。混合后，過濾培養基并在4℃下保存。培養基在用前新制備以減小實驗期間變化。全部使用塑料管和容器以減小蛋白質吸附。GDNF蛋白質產物溶液在含5％牛血清白蛋白的D-PBS(用蒸餾水制備的磷酸鹽緩沖液)中將純化的人重組GDNF蛋白質產品制備成1mg/ml的溶液。溶液在-85℃以等分試樣貯存。在96孔微量平板中制備系列稀釋(0.1；1；10；25；50ng/ml正常培養基)。向含聽毒素或不含(對照)的柯蒂氏器外植塊培養基(90μl)中加入10μl10倍濃縮的GDNF蛋白質產物溶液。對照培養物接受正常培養基(10μl)。在接種的當天開始用GDNF蛋白質產物處理。在第二天，培養基換成僅含聽毒素，含聽毒素與GDNF或都不含(對照)的培養基。解剖工具和培養皿1.4′和5″解剖鑷和4″解剖剪來自RobozSurgical，華盛頓區。2.Falcon無菌96孔微量平板(平底，產品目錄號3072)，組織培養塑料器皿和聚丙烯離心管來自Beckton-Dickinson，LincolnPark，NewJersey。聽毒素和有關試劑1.新霉素溶液(產品目錄號N1142，Sigma，St.Louis.MO)，以0.6mM的終濃度使用(每次實驗經加入90μl1mg/ml新霉素到1410μl培養基中制備新鮮溶液)。2.順氯氨鉑(Platinol-AQ。產品目錄號NDC0015-3220-22，Bristol-MyersSquibbLaboratories，Princeton，NewJersey)。以35μg/ml的終濃度使用(每次實驗經過向1447.5μl培養基中加入52.5μl1mg/ml的順氯氨鉑制備新鮮溶液)。3.TritonX-100(叔-辛基苯氧基聚乙氧乙醇，產品目錄號X-100，Sigma，St.Louis，MO)4.鬼筆環肽(FITC標記的。產品目錄號P-5282，Sigma，St.Louis，MO)5.Vectashield(封固培養基，產品目錄號H-1000，Vector，Burlingame，CA)大鼠柯蒂氏器外植塊的制備從P3-P4Wistar大鼠獲得柯蒂氏器外植塊。將大鼠斷頭，切下下頜并去掉皮肽。在解剖液中收集顳骨，暴露聽泡，小心從顳骨上分離骨-軟骨耳蝸泡。游離的耳蝸轉移到另一個含有解剖液的培養皿中進一步解剖。使用小顳子夾住中央VIII神經組織并將其去掉獲得完整的柯蒂氏器，然后從頂或底開始小心剝去血管紋膜。然后將柯蒂氏器轉移到含有補充了葡萄糖的冷PBS的35mm直徑培養皿中并準備培養。耳蝸外植體培養程序耳蝸外植體在未覆蓋的96孔微量平板上培養。將單個柯蒂氏器放于孔中并在培養基上漂浮維持。外植塊在正常培養基中維持24小時(90μl/孔)。將GDNF蛋白質溶液(10μl)加入“未處理”的培養物中，且將10μl培養基加入對照中。培養24小時后，更換培養基并將外植塊與含聽毒素的培養基(90μl)及GDNF蛋白質溶液(10μl)或無該蛋白質(對照)的培養液接觸。培養物再培養另外3天。然后用溶于0.1MD-PBS中的4％多聚甲醛在室溫下固定30分鐘并加工用于免疫染色。FITC-鬼筆環肽染色毛細胞為了鑒定和計數柯蒂氏器中的毛細胞，用直接免疫染色方法標記天然存在于毛細胞靜纖毛束中的肌動蛋白。用D-PBS(每孔200μl)洗滌外植塊三次并用1％TritonX-100的D-PBS在室溫下滲透15分鐘。在D-PBS中洗滌3次后，用FITC標記的鬼筆環肽(以1∶60來自貯液，50μl/孔)在室溫下培養外植塊45分鐘。用鋁箔覆蓋平板，因為鬼筆環肽具有光敏感性。用DPBS洗滌超過3次后，將標記的外植塊放于顯微鏡載玻片上的一滴甘油中，用蓋玻片覆蓋并用指甲油密封。外植塊在NikonDiaphot300倒置熒光顯微鏡下使用FITC濾光器和熒光鏡片觀察。毛細胞數的測定對于每個實驗點，使用2至4個耳蝸。在每個耳蝸中，在長度各為175μm的2-3個區域中計數毛細胞的數目。僅分析在耳蝸中央轉角的區域。各實驗重復幾次。每個實驗點分析40個耳蝸產生在對照和順氯氨鉑或新霉素處理的培養物中毛細胞的數目。結果在四天的實驗期間漂浮的外植塊培養物中的毛細胞不死亡。由此，在不存在聽毒素和處理的情況下，在4天實驗期間最后存在的鬼筆環肽染色的細胞數是105.4±6.9(n＝28)。在接種后第二天將聽毒素加入外植塊后在體外培養4天后發現引起毛細胞數明顯減少。接種后24小時接觸35μg/ml順氯氨鉑引起大約80％的毛細胞丟失，僅有21.2％±6.0(n＝40)的毛細胞起始數存活(表2)且接觸0.8mM新霉素后，僅7.4％±4.7(n＝43)的毛細胞存活(表2)。表2GDNF對接觸順氯氨鉑的耳蝸毛細胞的影響</tables>在接種的當天或24小時后將GDNF導入外植塊培養物。接種24小時后加順氯氨鉑(35μg/ml)，培養物再培養另外3天。用FITC-鬼筆環肽染色毛細胞。在耳蝸中央轉角的各175μm的2-3個區域中計算毛細胞數目。結果以體外培養4天后占存在于未處理的培養物中毛細胞的百分數來表達(105.4±6.9；n＝28)。各數目是平均值±n個耳蝸的SD。*與僅含順氯氨鉑有顯著的差異，p＜0.05(t檢驗)ND未測定在這兩種處理之間，柯蒂氏器的形態學有顯著的差異用新霉素處理導致毛細胞幾乎全部喪失，空出的部分仍有典型的4排結構(3排外毛細胞和一排內毛細胞)。另一方面，順氯氨鉑處理引起4排結構明顯破壞，存活的細胞隨機分布。在接種時接受GDNF的培養物中(預處理)，較大數目的毛細胞在與聽毒素接觸的3天(從第2到第4天)中存活。在接觸順氯氨鉑的培養物中，用濃度為0.05ng/ml之低的GDNF處理引起存活的毛細胞從21％(未處理的培養物)增加到35％。用0.1ng/mlGDNF達到最大保護活性(41％存活)(表3)。在接觸新霉素的培養物中，0.1ng/mlGDNF使毛細胞數從7％增加到22％；用10ng/mlGDNF可見到最大GDNF活性(37％存活)(表3)。在新霉素處理的培養物中GDNF處理保護4排的形態學，但不能防止順氯氨鉑對其破壞。為了試驗GDNF挽救毛細胞抵抗聽毒性的進一步的能力，進行了一套實驗，其中GDNF在接種24小時后與培養物接觸聽毒素的同時加入GDNF(共同處理)。結果表明在該實驗范例中，GDNF能與接觸內毒素前加入同樣程度地挽救毛細胞(表2和3)。表3GDNF對接觸新霉素的耳蝸毛細胞的影響</tables>在接種的當天(預處理)或接種24小時后(共同處理)將GDNF導入外植塊培養物中。接種24小時后加入新霉素(0.8M)，將培養物再培養另外3天。用FITC-鬼筆環肽染色毛細胞。在耳蝸中部轉角各175μm的2-3個區域中計算毛細胞數目。結果以占體外培養4天后未處理的培養物中存在的毛細胞數的百分數來表達(105.4±6.9；n＝28)，各數目是平均值±n個耳蝸的SD。*以p＜0.05與僅含新霉素有顯著的差異(t檢驗)。ND未檢測實施例2GDNF蛋白質產物促進內耳聽神經元(螺旋神經節神經元)的存活并保護其抵抗聽毒素材料用于下面實施例的材料按如下獲得。細胞培養基高葡萄糖Dulbecco氏改良的Eagle氏培養基(DMEM；#11965-092)，Ham氏F12培養基(F12#11765-021)，B27培養基補充液(#17504-010)，青霉素/鏈霉素(#15070-014)，L-谷氨酰胺(#25030-016)，Dulbecco氏磷酸鹽緩沖溶液(D-PBS；#14190-052)，小鼠層粘連蛋白(#23017-015)，牛血清白蛋白和部分V(#110-18-017)全部來自GIBCO/BRL，GrandIsland，NY。加熱滅活的馬血清來自HyClone，Logan，Utah。聚-L-鳥氨酸溴化氫(P-3655)，牛胰島素(I-5500)，人轉鐵蛋白(T-2252)，腐胺(P-6024)，孕酮(P-6149)和亞硒酸鈉(S-9133)都來自Sigma化學公司，Saint-Louis，MO。木瓜蛋白酶，脫氧核糖核酸酶[(DNA酶)和卵清蛋白(木瓜蛋白酶解離系統)來自Worthington生化公司，Freehold，NJ.Falcon無菌96孔微量平板(#3072)，組織培養塑料器皿和聚丙烯離心管來自Beckton-Dickinson，Oxnard，CA。Nitex20μm尼龍網(#460)來自Tetko，Elmsford，NY。4″解剖鑷和4″解剖剪來自RobozSurgieal，華盛頓區。抗體和有關試劑神經元特異性烯醇化酶(NSE)兔多克隆抗體來自Chemicon(#AB951)，生物素標記的羊抗兔IgG(#BA-1000)和過氧化物酶連接的抗生物素蛋白/生物素復合物(ABCElite；試劑盒PK-6100)來自載體實驗室，Burlingame，CA。3′，3′-二氨基聯苯胺來自Cappel實驗室，WestChester，PA。PBS中的超封閉封閉緩沖液(#37515)來自Pierce，Pockford，IL。TritonX-100(×100)，NonidetP-40(N6507)和過氧化氫(30％，v/v；H1009)來自Sigma。所有其它試劑從Sigma化學公司(Saint-Louis，MO)獲得，除非另有說明。聽毒素順氯氨鉑(Platinol-AQ，#NDC0015-3220-22)來自Bristol-Myers-Squibb，Princeton，NJ。水楊酸鈉來自J.T.Baker，Phillipsburg，NJ。(#3872-01)，新霉素來自Sigma(#N1142)。方法培養基的制備按1∶1混合DMEM和F12培養基，補充以50倍濃縮貯液加入的B27培養基補充液來制備基礎培養基。B27培養基補充液由生物素，L-肉毒堿，皮質酮，乙醇胺，D(+)-半乳糖，還原的谷胱甘肽，亞油酸，亞麻酸，孕酮，腐胺，乙酸視黃酯，硒，T3(三碘-1-甲腺原氨酸，DL-α-生育酚；維生素E)，DL-α-生育酚乙酸酯，牛血清白蛋白，過氧化氫酶，胰島素，超氧化物歧化酶和轉鐵蛋白組成。以大約2mM的終濃度加入L-谷氨酰胺，青霉素為大約100IU/1，鏈霉素為大約100mg/l。加熱滅活的馬血清以大約2.5％的終濃度加入，D-葡萄糖以大約5g/l的終濃度加入，HEPES緩沖劑以大約20mM的終濃度加入，牛胰島素以大約2.5mg/ml的終濃度加入，人轉鐵蛋白以大約0.1mg/ml的終濃度加入。混合后，將pH調至大約7.3，培養基在大約4℃保存。培養基在用前新制備以減小實驗期間的變化。全部使用塑料的吸管和容器以減小蛋白質吸附。GDNF蛋白質產物溶液純化的人重組GDNF蛋白質產物在含5％牛血清白蛋白的D-PBS(用蒸餾水配制的磷酸鹽緩沖液)中制備成1mg/ml的溶液。溶液在-85℃以等分試樣貯存。在96孔微量平板中制備系列稀釋。將10μl10倍濃縮的GDNF蛋白質產物溶液加入含培養基的細胞培養物(90μl)中。對照培養物接受含5％白蛋白的D-PBS(10μl)。接種細胞1小時后向培養物中加入GDNF蛋白質產物處理劑或在24小時后單獨或與聽毒素一起加入。聽毒素制品直接從貯液(大約10-3M)以每孔10μl加入新霉素使終濃度為大約10-4M。用培養基稀釋貯液(1mg/ml)的順氯氨鉑至20μg/ml的溶液并以每孔10μl加入使終濃度為2μg/ml。從粉末將水楊酸鈉在PBS中配成1M的貯液，進一步在培養基中稀釋成100mM，當以10μl/孔加入培養物時產生10mM的終濃度。培養基質為了使螺旋神經節細胞在基質上最佳附著并使軸突過度生長，經過用聚L-鳥氨酸及隨后用層粘連蛋白根據下面程序依次覆蓋改良微滴度平板表面(培養基質)。平板表面用在0.1M硼酸(pH8.4)中的多聚鳥氨酸的0.1mg/ml無菌溶液在室溫下完全復蓋至少一小時，接著用Super-Q水無菌洗滌。然后吸出洗滌水并加入溶于PBS中的10μg/ml小鼠層粘連蛋白溶液在37℃培養2小時。這些程序在使用平板前臨時進行以保證結果的可重復性。大鼠螺旋神經節細胞培養物的制備用過量的下列溶液(Ketamine(100mg/ml)；Xylazine(20mg/ml)和AcopromazineMaleate910mg/ml)以3∶3∶1的比例)注射3至4周齡的Wistar大鼠(從Jackson實驗室獲得，BarHarbor，Maine)，經斷頭處死，解剖下帶耳蝸的顳骨并無菌轉移進冰上的含1.5g/l葡萄糖的PBS中。每次實驗處理最多30個耳蝸。打開耳蝸，將帶骨蝸軸的柯蒂氏器收集進50ml無菌管中，該管中含有5ml解離培養基(120單位的木瓜蛋白酶和2000單位的DNA酶存在于HBSS中)。將組織在大約37℃下在大約200rpm的旋轉平臺型搖床中培養30分鐘，然后將解離溶液替換成新鮮的并繼續培養另外30分鐘。經過用火磨光的巴斯德吸管搗碎分散細胞，通過一個40μm的Nitex尼龍網過濾以棄去未解離的組織，使用IEC臨床離心管在200×g下再離心5分鐘。所得的細胞沉淀重懸于含卵清蛋白和大約500單位DNA酶的HBSS中，在上面覆蓋4％的卵清蛋白溶液(在HBSS中)并在500×g下離心大約6分鐘。最后的沉淀重懸進大約6ml的培養基中并在預先覆蓋的平板上以90μl/孔接種。螺旋神經節細胞的免疫組織化學經過對神經元特異性的烯醇化酶(NSE)進行免疫組織化學染色鑒定螺旋神經節神經元。用8％的多聚甲醛D-PBS溶液(pH7.4)在室溫下固定螺旋神經節細胞培養物大約10分鐘，以100μl/孔加入培養基，然后用100μl4％多聚甲醛代替再10分鐘，接著在D-PBS(每6-mm孔200μl)中洗滌3次。然后在含1％NonidetP-40的PBS超封閉封閉緩沖液中培養固定的培養物以增強抗體的通透。然后將兔多克隆抗-NSE抗體(Chemicon)在相同的緩沖液中以1∶6000稀釋應用，培養物在搖床上37℃培養2小時。用D-PBS洗滌3次后，使用大約1∶300稀釋的羊抗免生物標記的IgG(來自Vector實驗室的Vectastain試劑盒，Burlmgame，CA)檢測螺旋神經節細胞結合的抗體。第二抗體在37℃下與細胞培養大約1小時，然后用D-PBS洗滌細胞3次。用1∶300稀釋的抗生物素蛋白，生物素過氧化物酶復合物標記第二抗體，在37℃下培養細胞大約60分鐘。用D-PBS洗滌超過3次后，標記的細胞培養物在含0.04％3′，3′-二氨基聯苯胺-(HCl)4，0.06％NiCl2和0.02％過氧化氫的0.1MTris-HCl，pH7.4的溶液中反應5分鐘。測定螺旋神經節細胞存活率培養不同時間后(24小時，3天和4天)，固定大鼠螺旋神經節細胞培養物，按上面所述加工并免疫染色NSE，用明視野鏡片在200×放大倍數下檢查培養物。計數存在于6-mm孔中的所有NSE陽性神經元。活的螺旋神經節細胞的特征為具有大小為15-40μm的圓細胞體并帶有軸突延伸。從計數值中排除顯示退化信號的螺旋神經節細胞，如具有不規則的，液泡化的核固體或片斷化的軸突(然而，大多數退化的螺旋神經節細胞從培養基質上脫離)、細胞數以每個6mm孔中的細胞數或相對于對照細胞密度的倍性改變來表達。結果大鼠螺旋神經節神經元培養物用于證實GDNF蛋白質產物對存活和抵抗聽毒素的影響。從3至4周齡的大鼠耳蝸獲得螺旋神經節細胞。將解離的細胞以大約每2孔1個耳蝸的密度接種進聚鳥氨酸-層粘連蛋白覆蓋的微滴度平板上，平板孔中含有補充有B27培養基補充液，2.5％加熱滅活的馬血清，D-葡萄糖，HEPES，胰島素和轉鐵蛋白的DMEM/F12。培養物由神經元和非神經元細胞的混合物組成。然而，只有存在的神經元是螺旋神經節神經元并用NSE免疫反應活性的存在進行了鑒定。在接種濃度下(一個解離的柯蒂氏器接種進2個孔中)，接種24小時后每孔NSE陽性細胞數在對照條件(未加處理)下是127±17(n＝7)。在實驗最后，接種4天后，每孔的神經元數目減少到64±4.7，它代表在對照條件下體外培養24小時后存在的數目的50.5％±3.7。評價了施用GDNF蛋白質產物對培養的大鼠螺旋神經節神經元的存活和形態學成熟的影響以及對其抵抗諸如順氯氨鉑的已知聽毒素的毒性效應的影響。螺旋神經節細胞培養物在接種24小時后用單獨的人重組GDNF蛋白質產物(范圍從50ng/ml至0.1ng/ml)或與順氯氨鉑(35μg/ml)結合處理。接種24小時后，對照培養物與用1ng/ml和10ng/mlGDNF處理的培養物之間聽神經元數目無區別(分別為127±17；126±24和125±19個神經元/孔)。再過3天后，以1ng/ml濃度的GDNF處理不產生明顯的神經元細胞數增加。然而有顯著的營養效應與對照相比神經元細胞體更大，纖維更長且更復雜在用10ng/mlGDNF處理的培養物中，存在的神經元在24小時后大約72％存活，表示比對照培養物增加44％(表4)。營養效應比用1ng/mlGDNF處理的培養物更強。GDNF也保護螺旋神經節神經元抵抗順氯氨鉑毒性(表4)。培養物接種24小時后與5μg/ml順氯氨鉑接觸導致4天后在培養物中喪失94％的神經元起始數(在24小時時)，當GDNF與順氯氨鉑一起加入時，4天后發現神經元數目明顯更高。GDNF的這些保護性效應是劑量依賴性的用1ng/ml，10ng/ml和25ng/ml濃度的GDNF分別發現毒性處理開始存在的神經元為20.1±5.1；27.5±3.2和32.8±1.0(數據未顯示)。這些結果表明與GDNF反應的大約63％的神經元(大約44％的螺旋神經節神經元群體)也能抵抗順氯氨鉑毒性。表4GDNF對螺旋神經節神經元存活率的影響</tables>GDNF和順氯氨鉑在接種24小時后加入解離的螺旋神經節神經元培養物中。培養物再培養另外3天，經計數NSE-免疫反應性細胞測定神經元數目。神經元細胞數目以體外培養24小時后存在的神經元百分數來表達。各結果是平均值±n個培養物的SD。*以p＜0.05與單獨用順氯氨鉑處理有顯著的差異(t-檢驗)。**以p＜0.05與未處理的對照有顯著的差異(t-檢驗)。實施例3GDNF蛋白質產物促進內耳毛細胞的體內存活下面實施例證實在動物模型中內耳施用GDNF蛋白質產物保護耳蝸毛細胞抵抗聽毒素。GDNF經過一個插管通過在耳蝸基部轉角鉆孔壓入鼓階而導入內耳。插管與裝有GDNF(50ng/ml)的Alzet微型泵相連，以0.5μl/小時的速率釋放14天。插管2天后開始肌肉內注射順氯氨鉑，以1mg/ml每天注射15天或以7.5mg/kg注射2次，間隔為5天(插圖2)。27天后終止實驗。用FITC鬼筆環肽染色毛細胞，在耳蝸中央轉角處(至少20％的中央轉角部分)測定其數目。結果以每只單個的豚鼠GDNF處理的耳(右耳)和未處理的耳(左耳)毛細胞丟失的百分數來表達。材料用于下述實施例的材料獲得如下微型泵制備材料醫用乙烯基管大小V/4，目錄號BB317-85來自BolabProducts[(800)331-7724]。使用Fisher牌5ml塑料吸管。使用微型腔聚亞胺管，目錄#8004853OG(TampaFlorida)。硅氧烷醫用產品MDX4-4210來自DowCorningCorporation，Midland，MI。Alzet滲壓微型泵流速調節器和Alzet滲壓微型泵，目錄號2002來自AlzaCorp.，PaloAlto，CA。Tap(TimeMedtape)。Prosil-28產品號11975-0來自PCRIncorparated，GainesvilleFlorida。純化的人重組GDNF蛋白質產品在D-PBS和0.1％BSA中配制成50ng/ml的溶液。無菌0.1％亞甲蘭(目錄號M-9140)溶于PBS，礦物油(目錄號400-5)來自Sigma。微型泵制備程序乙烯基管切成大約4英寸的部分并通過小型鉗放置。將一片微型腔聚亞腔管(7mm)放進乙烯管末端。經過加入大約10份堿和1份清除劑混合硅氧烷。使用細小的探針將一滴放于乙烯基管的開口端，將微型腔管壓進乙烯基管，使從乙烯基管延伸出3.75mm長。使用在探針上的一滴硅氧烷在微型腔管從頂端0.5mm處產生一個小球，使其過夜干燥。經過在吸管長度上應用3個同心層的帶增加5ml吸管的直徑。在吸管未覆蓋處留下一個均勻的缺口。將V/4管纏繞在吸管上，調節線圈使管的2端松散且所有線圈間連續相連。將2個薄層條形帶與吸管上帶的邊緣并排以確保線圈固定。在線圈上均勻地涂上2條細線型超強膠。干燥1小時后，松散端與吸管幾乎平行排列并保證用一條帶固定。用一滴超強膠將管固定于線圈上。干燥過夜后，去掉帶，線圈從吸管上滑下。將流速調節器插入一個松散端并用一滴超強膠固定。用1％Prosil-28水溶液沖洗線圈，用水徹底漂洗，然后用70％乙醇沖洗。借助于注射器或真空器去掉乙醇。將線圈放于帶真空器的干燥器內至少30分鐘并在密封干燥器內放置過夜，接著進行氣體滅菌。在裝載過程中，線圈裝置盡可能保持水平以防止GDNF，油和染料的重力牽引運動。避免在泵或線圈中形成氣泡。泵浸入無菌PBS中并在37℃保溫過夜。經過將泵固定于垂直位置進行用亞甲藍裝載泵。將一個裝有染料的注射器完全插入泵，注射染料直至泵溢出。避免將氣泡注射進泵。將短片無菌V/4管放在流速調節器上。使用與V/4管相連的注射器將總體積為230μl，溶于PBS+0.1％BSA的濃度為50ng/ml的GDNF上樣到大約10mm插管尖端內。作為載體對照實驗，將相同體積的PBS+0.1％BSA上樣到泵中。去掉短片V/4管。然后用注射器將礦物油上樣到線圈裝置上，其方式為使2mm空氣間隔和7mm礦物油插入泵液體和線路液(輸注液體)之間。將流速調節器完全插入進泵中。泵插入內耳材料組織粘附膠-氰基丙烯酸酯來自VetbondTissueAdhesive，3MAnimalCareProducts，St.Paul，MN。羧化粘合劑ESPEDurelon，目錄號#03828來自ESPF-PremierSalesCorp.，NorristownPA。異丁烯酸甲酯來自LangJetAcrylic，LangDentalMFG.Co.，Wheeling，IL。解剖工具來自RobozSurgical。使用甲苯噻嗪，氯胺酮和叔丁啡。潤滑眼膏(AKWATears)來自AkornInc.，AbitaSpringsLA。Xylocaine2％，目錄號NDC0186-0160-01來自ASTRA。醫用級硅氧烷脂，Art.No.51，300來自Unimed。Durelon粉碎的粉狀羧化粘合物，目錄號D-82229來自ESPE，Seefeld。硫酸軟膏(BacitracinZinc-新霉素，目錄號0168-0012-31)來自Fougera。方法用甲苯噻嗪10mg/kg，氯氨酮40mg/kg和叔丁啡0.05mg/kg的混合物麻醉Albino豚鼠(250-350g)。右耳區從尾部剃毛，從頭頂前端大約2cm開始到肩胛后骨和耳后4-5cm。剃毛的區域用聚烯吡酮碘洗滌。將Xylocaine經皮下注射進組織以便切開。使用無菌技術，做一個耳后切口。使用細針在耳泡上鉆一個孔以暴露中耳腔并觀察耳蝸。使用細針在圓窗孔下基部轉角的骨壁上手工鉆一小孔。將插管的頂端插入孔中直至硅氧烷滴抵住骨壁，它使插管尖端位于鼓階通道的大約中途。將一滴氰化丙烯酸酯放在耳泡孔處。在氰化丙烯酸酯上圍繞插管放置羧化粘合膠。一旦粘合膠變硬，證實其位置，剩余的孔在硅氧烷脂層的頂端用羧化粘合膠覆蓋。在肩胛骨之間制備一個皮下袋以容納隨后插入的泵。皮下袋用3ml溶于無菌PBS的呋喃西林溶液漂洗一次，然后用3ml無菌PBS加1％慶大霉素充滿以防止感染。在傷口周圍施用呋喃西林粉末后用傷口鉗關閉切口。致聾材料順氯氨鉑(Platmd-AQ)，目錄號NDC0015-3220-22來自Bristol-MyersSquibb實驗室，普林斯頓，新澤西州。方法在微型泵植入2天后開始注射順氯氨鉑(i.p.)。使用2種施用方法以5天的間隔注射2次，每次7.5mg/kg，或每天1mg/kg，注射15天。灌注4周后，豚鼠用甲苯噻嗪和氯氨酮的混合物深度麻醉，用冰冷的PBS及隨后用冰冷的4％多聚甲醛PBS溶液經心臟灌注。取出顳骨，將骨耳蝸放入4％多聚甲醛中4℃進行后固定過夜。染色表面制品和鬼筆環肽染色方法用于染色毛細胞。用細針或#11刀片打開骨耳蝸。使用小鑷子取出血管紋。在充滿PBS的培養皿中，用細針小心地從骨蝸軸中解剖出基底膜。小心將其完整取出。鬼筆環肽染色方法與體外外植塊所進行的相似，除了有下列變化通透進行20-30分鐘，鬼筆環肽加入90分鐘。在60×22蓋玻片上封固頂部，中央轉角和基部轉角塊。加入一滴VECTASHIELD封固培養基，用22×22mm蓋玻片覆蓋樣品并用指甲油密封以防止蒸發。數據分析各耳蝸在具有一套FITC濾光片的顯微鏡下檢查。選擇從基底膜中央轉角具有最大毛細胞丟失的8個區域并使用附著的計算機印像機照像。使用照片手工進行毛細胞計數。在每只動物中，將左耳毛細胞的丟失(作為對照，即，無GDNF輸注)與右耳中的毛細胞丟失(輸注GDNF)進行比較。結果順氯氨鉑注射導致耳蝸毛細胞明顯丟失。在用每天1mg/kg順氯氨鉑注射15天的3只豚鼠左耳中分析的中央轉角部分中該丟失為49.2％；21.2％和46.9％。在用7.5mg/kg兩次代替每天1mg/kg順氯氨鉑注射的豚鼠中，左耳毛細胞丟失42％。將GDNF導入各豚鼠右內耳導致毛細胞丟失的明顯減少。在耳蝸中計數的丟失的毛細胞數與總毛細胞數之間的比率如下在左耳(對照)中為241/486；113/530和244/513，而其相對側右耳(GDNF處理的)中分別為83/492；28/498和126/512。這些比率表示對3只動物而言每只動物左耳與右耳之間毛細胞丟失增加3倍；4.2倍和1.9倍。在用7.5mg/kg順氯氨鉑注射的豚鼠中，與處理的耳相比未處理的耳(左耳)毛細胞丟失增加2倍。(見圖2)。在用載體代替GDNF充滿微量泵植入的動物中，在左耳(未處理耳)和右側(植入的)耳中發現的毛細胞數目無區別。實施例4GDNF蛋白質產物注射促進體內耳蝸毛細胞的存活下面實施例證實GDNF蛋白質產物當施用進中耳時在動物模型中保護耳蝸毛細胞抵抗聽毒性。將125-135μl體積的以1mg/ml的濃度溶于PBS+1％BSA中的溶液通過鼓膜單次注射將GDNF導入右側中耳。在GDNF注射1天后以7.5mg/kg開始順氯氨鉑肌肉內注射2次，間隔5天。第二次順氯氨鉑注射3天后終止實驗。用FITC-鬼筆環肽染色毛細胞，在耳蝸中部轉角(至少20％的中部轉角部分)測定其數目。結果(圖3)以每只單個豚鼠GDNF處理的耳(右耳)和未處理耳(左耳)的毛細胞丟失百分數來表達。材料用于該實驗的材料與實施例3所用的相同。方法用甲苯噻嗪10mg/kg，氯氨酮40mg/kg和叔丁啡0.05mg/kg的混合物麻醉Albino豚鼠(重600-700g)。在手術顯微鏡下，經過將27號針頭插入膜在右耳鼓膜上打一孔。在鼓膜的另一位置，將人蛋白質GDNF(以1mg/ml的濃度溶于PBS+1％BSA中)注射進中耳腔使全腔充滿(125-135μl)。幾只動物僅用載體(PBS+0.1％BSA)代替GDNF注射。第二天，進行順氯氨鉑(7.5mg/kg)的肌肉內注射。5天后，以相同的濃度進行第二次注射。3天后(總實驗時間為8天)，按實施例3所述處死動物，固定組織并分析耳蝸。結果在第8天，用順氯氨鉑注射的4只豚鼠表現出耳蝸毛細胞的明顯丟失。在左耳(未接受GDNF的耳)中，耳蝸中部轉角毛細胞的丟失是34％；47％；42％和41％以1mg/ml將GDNF注射進右側中耳腔時，該丟失明顯減少；分別為16％；23％；21％和29％(圖3)。接受載體代替GDNF注射進右耳的豚鼠中，右(處理)和左(未處理)耳之間不表現出毛細胞數目的差異。考慮到本發明優選的其實施方案的上述描述，對本領域的技術人員而言可預期發生在本發明實施中的許多改良和變化。序列表(1)一般信息(i)申請人EllaMagal(ii)發明題目用膠質細胞系來源的神經營養因子(GDNF)蛋白質產物防止和治療感覺神經性聽力喪失和前庭疾病的方法(iii)序列數1個(iv)聯系地址(A)聯系人Amgen.Inc.(B)街道1840DeHavillandDrive(C)城市千橡樹(D)州加利福利亞州(E)國家美國(F)郵編91320(v)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBMPC兼容機(C)操作系統PCDOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，Version#1.25(iv)目前申請資料(A)申請號(B)申請日(C)分類(viii)委托/代理人信息(A)姓名Curry，DanielR.(B)登記號32,727(C)參考/存檔號A-392(ix)電信信息(A)電話805-447-8102(B)電傳805-499-8011(C)電報(2)SEQIDNO1信息(i)序列特征(A)長度134個氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ix)特征(A)名稱/鍵成熟人GDNF的推斷的氨基酸序列。(xi)序列描述SEQIDNO1SerProAspLysGlnMetAlaValLeuProArgArgGluArgAsnArg151015GlnAlaAlaAlaAlaAsnProGluAsnSerArgGlyLysGlyArgArg202530GlyGlnArgGlyLysAsnArgGlyCysValLeuThrAlaIleHisLeu354045AsnValThrAspLeuGlyLeuGlyTyrGluThrLysGluGluLeuIle505560PheArgTyrCysSerGlySerCysAspAlaAlaGluThrThrTyrAsp65707580LysIleLeuLysAsnLeuSerArgAsnArgArgLeuValSerAspLys859095ValGlyGlnAlaCysCysArgProIleAlaPheAspAspAspLeuSer100105110PheLeuAspAspAsnLeuValTyrHisIleLeuArgLysHisSerAla115120125LysArgCysGlyCysIle130權利要求1.膠質細胞系來源的神經營養因子(GDNF)蛋白質產物在用于生產治療神經性聽力喪失的藥用組合物的用途。2.根據權利要求1的用途，其中聽力喪失與內耳損傷相關。3.根據權利要求1的作用，其中聽力喪失與內耳神經上皮毛細胞的損傷或退化相關。4.根據權利要求1的用途，其中的聽力喪失與螺旋神經節神經元的損傷或退化相關。5.根據權利要求1的用途，其中的GDNF蛋白質產物是SEQIDNO1所述的氨基酸序列或其變異體或衍生物。6.根據權利要求5的用途，其中的GDNF蛋白質產物具有SEQIDNO1所述的氨基酸序列。7.根據權利要求5的用途，其中的GDNF蛋白質產物是[Met-1]GDNF。8.根據權利要求1的用途，其中GDNF蛋白質產物以大約1μg/kg/天到大約100mg/kg/天的劑量用藥。9.根據權利要求1的用途，其中GDNF蛋白質產物經細胞治療或基因治療方式用藥，其中細胞已被修飾成生產和分泌GDNF蛋白質產物。10.根據權利要求9的用途，其中的細胞已被體外修飾。11.根據權利要求9的用途，其中的細胞在體內進行了修飾。12.膠質細胞系來源的神經營養因子(GDNF)蛋白質產物在生產治療前庭器損傷或破壞的藥用組合物中的用途。13.根據權利要求12的用途，其中的損傷或破壞導致眩暈，頭暈或失去平衡。14.根據權利要求12的用途，其中的GDNF蛋白質產物是SEQIDNO1所述的氨基酸序列或其變異體或衍生物。15.根據權利要求14的用途，其中的GDNF蛋白質產物具有SEQIDNO1所述的氨基酸序列。16.根據權利要求14的用途，其中的GDNF蛋白質產物是[Met-1]GDNF。17.根據權利要求12的用途，其中GDNF蛋白質產物以大約1μg/kg/天到大約100mg/kg/天的劑量用藥。18.根據權利要求12的用途，其中的GDNF蛋白質產物經細胞治療或基因治療方式用藥，其中細胞已被修飾成生產和分泌GDNF蛋白質產物。19.根據權利要求18的用途，其中細胞在體外被修飾。20.根據權利要求18的用途，其中細胞在體內被修飾。全文摘要本發明一般涉及經過施用膠質細胞系來源的神經營養因子(GDNF)防止和/或治療耳蝸(和前庭)毛細胞和螺旋神經節神經元損傷或退化的方法。更具體地說,本發明涉及治療感覺神經性聽力喪失的方法。文檔編號A61K48/00GK1181704SQ97190100公開日1998年5月13日申請日期1997年2月14日優先權日1996年2月23日發明者E·馬加爾申請人:安姆根有限公司