專利名稱：：肺活素的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種從動物肺臟中提取出生物活性成分用于預防和治療呼吸系統疾病的組合物，原名肺細胞活化素，簡稱肺活素，其英文名稱PulmonaryCellActiveFartor(簡稱PCAF)。在治療哮喘等呼吸系統疾病中，以往單獨使用支氣管舒張藥物進行治療是不夠全面的，對于中、重度哮喘，僅依靠規律地使用支氣管舒張劑(如β2激動劑)甚至是有害的，因為β2激動劑無抗炎作用，單純對癥治療會掩蓋炎癥發展，使AHR加重，因而必須聯合應用抗炎藥物治療。在應用抗炎藥物治療后，雖然哮喘得到緩解或預防措施得以暫時控制，但大多數患者存在輕重度或間隔長短不等的復發，這主要是由于抗菌素對肺組織沒有修復和促再生作用，所以復發率居高不下，出現停藥犯病現象，專家普遍認為哮喘病人的療效與巨噬細胞對各種藥物的易感程度有關。針對以上提出的問題，本發明提供一種能夠激活巨噬細胞的物質，其目的在于調節機體免疫功能，改善肺功能指標。本發明是通過以下技術方案來實現的用于預防和治療呼吸系統疾病的肺活素，含有分子量小于20KDa的組合物，并且具有下列特性1.1可從哺乳動物肺臟組織提取；1.2組合物的主要成份多肽、核酸；1.3生物活性特征1.3.1能夠在體內外刺激單核細胞和巨噬細胞吞噬功能；1.3.2能夠調節IL-1和IL-2等淋巴因子產生。此外，肺活素的技術特征還有2.1大分子蛋白質試驗—磺柳酸法測試其蛋白定性為陰性。2.2本組合物的水溶液經190-400nm紫外分光掃描可見兩個峰，即205±10nm，260±10nm處，兩峰中間的谷位在235±10nm處。2.3本組合物的水溶液經高效液相色譜法分析，有三、四個主要吸收峰，其主峰的相對面積百分比在40％以上。肺活素能夠保護動物和人的肺與支氣管；能夠修復動物和人的肺與支氣管的損傷；促進人肺和支氣管組織細胞的再生，從而增強抗菌素療效；能在體外促進組織細胞生長。肺活素從新生小牛的肺臟組織中提取，并能預防和治療慢性支氣管炎、哮喘、肺癌、肺氣腫、肺結核、肺炎、呼衰、支氣管擴張、肺膿腫等呼吸系統疾病。制備肺活素的方法，其特征在于1.清洗新鮮或冰凍保存的哺乳動物肺臟；2.將肺臟組織細胞進行破碎；3.然后加入肺重量0.5-3.0倍的蒸餾水；4.分離及澄清；5.將分離及澄清后的產物提取；6.除菌、分裝；7.將肺活素制成水針或凍干粉針。制備方法采用高速組織搗碎機、膠體磨等機械和超聲方法進行肺臟組織破碎。制備方法在破碎后加入蒸餾水的產物可反復凍融。制備方法采用超濾方法將分離及澄清后的產物提取，超濾分子量截留20KDa以下的物質。制備方法的成品標示量采用多肽含量標示法、核酸含量標示法和生物活性單位標示法。本發明的優點是1、肺活素作為肺細胞生長因子成份的一部分，補充了哮喘病人生長細胞因子的缺如，中醫學理論以臟補臟；現在醫學觀點以某種動物臟內的細胞因子可以補充人該種臟器內的細胞因子是十分理想的，因為它重建了細胞因子網絡的完整，這是現有技術所達不到的。2、肺活素可增強肺內巨噬細胞吞噬功能和分泌功能—這是肺內最重要的防御和保護體系，如此促進吞噬和消滅引起肺部疾病的致敏原和致炎細菌及病毒，既控制了I型變態反應的發生，減輕了氣道慢性炎癥的發展，又減少了支氣管平滑肌的收縮與痙攣。3、動物實驗和臨床應用未見任何毒副反應。下面通過實施方式對本發明加以具體描述肺活素為新生小牛的肺臟提取液，新鮮的胎肺經清洗、破碎，破碎采用高速組織搗碎機、膠體磨等機械或超聲方法進行肺臟組織破碎，然后加入肺重量0.5-3.0倍的蒸餾水，可反復凍融，然后進行分離及澄清；分離的方法可采用布過濾、篩網過濾、濾紙過濾、濾斗過濾、濾板過濾；澄清采用離心、甩干等方法。將分離及澄清后的產物提取；提取采用超濾方法和其它物理及化學方法，超濾分子量截留20KDa以下的物質。然后進行除菌、分裝；將肺活素制成水針或凍干粉針。成品標示量方法采用多肽含量標示法、核酸含量標示法和生物活性單位標示法。所得的肺活素，具有以下技術特征1.大分子蛋白質試驗—磺柳酸法測試其蛋白定性為陰性。2.本組合物的水溶液經190-400nm紫外分光掃描可見兩個峰，即205±10nm，260±10nm處，兩峰中間的谷位在235±10nm處。3.本組合物的水溶液經高效液相色譜法分析，有三個主要吸收峰，其主峰的相對面積百分比在40％以上。下面通過各項實驗對本發明作進一步闡述一、藥理、藥效、毒理研究1、一般藥理本品對貓進行了一般藥理試驗，試驗表明肺活素對動物的神經系統、心血管系統(心率、心電圖、血壓等)和呼吸系統(頻率、深度等)均無明顯影響。2、藥效學試驗肺活素增強大白鼠肺支氣管灌洗液中巨噬細胞吞噬功能。肺活素有促進小白鼠IL-1生成的功能。肺活素有促進小白鼠IL-2生成的功能。3、毒理研究熱原質試驗嚴格按《中華人民共和國藥典》二部進行，合格。異常毒性試驗小白鼠尾靜脈注射本品0.5ml，無異常，合格。安全性試驗豚鼠腹腔注射本品5ml，健康增重，合格。過敏試驗按《中華人民共和國藥典》二部細胞色素C溶液過敏試驗方法進行試驗，合格。延長一倍時間攻擊試驗亦合格。降壓物質檢查嚴格按《中華人民共和國藥典》二部進行的，不含降壓物質。急性毒性試驗兩種動物(小白鼠、大白鼠)進行三種途徑(即肌注、靜注、腹腔注)給藥，證明625以上倍于人體用量，無任何毒性反應，安全可靠。長期毒性試驗80只大白鼠、12只狗，分別以三種劑量，兩種途徑給藥十二周，觀察一般體征、體重、外觀、行為、尿常規、血常規、肝腎功能，肉眼觀察和病理檢查，未發現毒性反應，證明長期用本品無毒性反應，安全可靠。局部刺激性觀察大白鼠局部刺激試驗未發現注射部位皮膚異常。毒理結論經各種毒理試驗證明，肺活素安全范圍極大，短、長期應用不會有明顯毒性反應。總結肺活素安全性</tables>二、肌注肺活素對小白鼠慢性支氣管炎療效的實驗研究(摘要)目的本研究以小白鼠為實驗對象，經肌肉注射給藥，研究了肺活素對小白鼠慢性支氣管炎的療效。1、慢性氣管炎模型小白鼠吸入SO2300-400ppm，每天2小時，每周5天，共6周，用病理方法確定氣管炎的形成。2、給藥方法分預防性給藥和治療性給藥。預防性給藥染毒開始即肌肉注肺活素，設2個劑量組，即高劑量組和低劑量組，每周5天，給藥共6周。治療性給藥動物染毒6周后，氣管炎模型已經建立，給予肺活素治療，亦分為高劑量組和低劑量組，每周5天，共給藥4周。此時SO2濃度降至100-200ppm的維持量。另設中毒對照(染毒不給治療)和空白對照組(不作任何處理在同樣條件下飼養)。3、實驗結果無論是預防性給藥還是治療性給藥。給藥組動物在體重增長、平均咳嗽次數和肺臟器系數等項指標均比中毒對照組有明顯改善；用光學顯微鏡對肺組織作病理檢查，治療組肺組織炎癥病程度較輕；對氣管作透射電鏡和掃描電鏡觀察顯示，治療組氣管粘膜上皮纖毛細胞的損傷亦較輕。綜上所述，肺活素對小白鼠吸入SO2所致的氣管炎均有較好的預防和治療作用1、氣管的掃描電鏡觀察正常小鼠氣管掃描電鏡觀察結果如圖1所示，可見細胞飽滿，纖毛清晰自然。而中毒對照組氣管的掃描電鏡如圖2所示，見細胞收縮、纖毛脫落且纖毛少而短。圖3、4、5、6為給藥組小鼠氣管掃描電鏡圖，與圖2比較，纖毛生長情況比中毒對照組好。采用每個視野內纖毛所占面積的大小來表示氣管病損的程度以示肺活素的療效，纖毛在視野內所占比例大，氣管受損輕。反之，受損重，統計結果見表。從表可以看出，無論是預防性給藥組或是治療性給藥組，視野內纖毛平均所占面積均大于中毒對照組，有統計學差異(P(0.05)，說明治療后纖毛受損大大減輕。2、氣管的透射電鏡觀察給藥組的透射電鏡如圖9、10、11、12所示，從預防和治療性給藥組氣管透射電鏡可以看出纖毛的生長和線粒體的數量均無明顯改變，說明肺活素對SO2所致氣管的損傷具有一定的保護和治療作用。3、肺臟病理檢查備組動物肺組織均有不同程度的炎癥反應，見表2，從表2可見，給藥組肺組織炎癥發現明顯低于中毒對照組。表1肺活素實驗性治療各組氣管掃描電鏡每個視野平均纖毛所占面積統計(X±SD)組別動物數(n)每個視野纖毛面積比例(％)空白對照591.5±10.0中毒對照914.0±7.6預防性給藥高劑量851.5±11.9預防性鉿藥低劑量740.0±7.8治療性給藥高劑量668.5±8.7治療性給藥低劑量745.1±7.1表2肺活素實驗性治療組肺炎的發生率預防性給藥組治療性給藥組組別動物數肺炎動物數發生率動物數肺炎數發生率(只)(只)(％)(只)(只)(％)空白對照組1011010220中毒對照組1044012866高劑量給藥組911114642低劑量給藥組711410550肺活素對小鼠白介素II水平的影響1.藥品肺活素，胸腺肽，氯化鈉注射液。2.實驗方法2.1IL-2的產生抗凝血加入培養板各孔，再加TPA和PHA，培養24小時，每孔吸出20ul上清液作IL-2活性測定。2.2ConA誘導IL-2反應細胞制備C57BL/6小鼠脾臟磨碎后配成細胞懸液，加入ConA，培養48小時。分層取界面層細胞即為IL-2反應細胞(淋巴母細胞)。2.3檢測方法反應細胞加入各孔，再加待測血清，培養。每孔再加入3H-TdR繼續培養。收獲細胞，液體閃爍記數儀測定cpm值。3.結果肺活素各組的IL-2結果均明顯增加(p＜0.001)。附表肺活素對IL-2的影響分組動物數IL-2P只(X±SD)空白對照組1446.14±9.42＜0.001胸腺肽組1495.04±23.96＜0.001肺活素1組14114.51±21.09＜0.001肺活素2組14274.01±48.55＜0.001肺活素3組14493.49±63.42＜0.0014.結論(1)肺活素能促進小白鼠白細胞介素II的產生(P＜0.001)，即肺活素可以提高小白鼠的免疫功能。(2)小白鼠白細胞介素II的產生隨注射肺活素的劑量增多而提高。肺活素對大鼠肺巨噬細胞吞噬功能的影響1、藥品空白對照品—氯化鈉注射液。陽性對照品—(小牛)注射用胸腺肽。實驗藥品—注射用肺活素。2、動物實驗動物分組空白胸腺肽肺活素1組肺活素2組肺活素3組肌肉組6只6只6只6只6只靜脈組6只6只6只6只6只3、誘導動物注射藥品后，放塑料桶中吸粉筆灰塵3分鐘，以誘導單核細胞滲出，每日一次，連續七天。4、肺灌注—收集肺巨噬細胞第八天分別用10％苯巴比妥鈉1ml腹腔注射麻醉，解剖分離出完整的肺和氣管，行氣管插管，以氯化鈉注射液洗去表面血漬，以20毫升HANK′S液灌洗支氣管三次，吸出肺灌洗液，2000轉/分離心5分鐘，棄上清，其沉淀為肺巨噬細胞。5、孵育時間向反應板孔中加入肺巨噬細胞0.5ml，2％雞紅細胞0.5ml，HANK′S液0.5ml混合，于37℃水浴30分鐘，其間再吹打勻兩次。計數在倒置鏡下100計數個巨噬細胞，計算巨噬細胞吞噬率和吞噬指數。6、結果附表大鼠肺巨噬細胞吞噬雞紅細胞率和指數表中p值為各組與空白對照組比較值。7、從表中結果可以看出(1)肺活素各組的大鼠肺巨噬細胞吞噬功能均增強，其吞噬指數和吞噬率比空白對照組和胸腺肽組均明顯增多(p＜0.001)。(2)大鼠肺巨噬細胞吞噬指數和吞噬率隨注射肺活素的劑量增多而提高，注射途徑對其影響不明顯。8、結論肺活素可以促進大鼠肺巨噬細胞吞噬功能，即肺活素可以使巨噬細胞呈激活狀態，對異物顆粒的吞噬作用增強。在炎性組織內，如果活化肺泡巨噬細胞選擇性分泌物的質量強勁有效，則在遏制肺炎發展、增進病變吸收和防止組織纖維化，以及增進肺臟防御功能等方面，皆具有重要作用。9、巨噬細胞的主要功能(1)吞噬作用，是機體內吞噬能力最強的細胞。(2)加工、傳遞抗原給T細胞及B細胞，調節免疫反應，參與特異性免疫。(3)是細胞免疫中的重要效應細胞，致敏T細胞釋放淋巴因子作用于巨噬細胞，增強其殺傷能力。(4)參與IV型變態反應的炎癥過程。(5)能夠產生多種因子如白細胞介素III，彈力蛋白酶、膠原酶、溶菌酶、前列腺素、中性粒細胞趨化因子、熱原質、干擾素、補體等。臨床療效初步觀察對兩組60例支氣管哮喘病人進行臨床觀察，治療方法是1、常規治療組采用抗炎、解痙進行常規治療；解痙采用口服2、肺活素輔助治療組在常規治療的基礎上，每日給肺活素3mg(50kg)。觀察指標結果1、肺活素對支氣管哮喘患者T淋巴細胞亞群的影響組別CD3+CD4+CD8+CD4+/CD8+常規治療前50.22±13.446.40±12.024.22±9.131.54±0.31常規治療后48.69±11.8243.34±8.4925.90±7.261.48±5.26肺活素治療前49.36±9.6049.70±10.022.92±7.61.47±0.86肺活素治療后45.47±12.533.56±8.4523.43±4.561.21±0.46常規治療支氣管哮喘患者前后外周血CD3、CD4、CD8、CD4/CD8無明顯改變(P＞0.05)。肺活素治療后的患者外周血CD4、均明顯降低(P＜0.05)，CD8無明顯改變(P＞0.5)。肺活素對支氣管哮喘患者白細胞介素II及受體的影響表肺活素對哮喘IL-2和IL-2R的影響組別IL-2(％)IL-2R(u/L)常規治療前36.81±7.2525±270常規治療后41.23±8.7497±342肺活素治療前35.92±6.9532±324肺活素治療后52.45±9.7321±167常規治療前后支氣管哮喘患者IL-2無明顯改變(P＞0.05)，IL-2R亦無明顯改變(P＞0.05)，肺活素治療后IL-2明顯增高(p＜0.01)，IL-2R明顯降低(p＜0.01)。肺活素對支氣管哮喘患者癥狀體征的影響組別咳嗽痰量喘息哮鳴音呼吸困難常規治療前+++++++++++++常規治療后+++++肺活素治療前+++++++++++++肺活素治療后＿＿＿＿＿肺活素治療支氣管哮喘患者前后FEV1、PEER改變情況組別例數FEV1PEER常規治療前6052±7.634±5.6常規治療后6078±5.426±3.4肺活素治療前6054±6.632±4.8肺活素治療后6088±4.816±5.2肺活素輔助治療支氣管哮喘療效對比表肺活素治療與常規治療的療效對比組別例數療效顯效及以上者臨床控制顯效好轉無效常規治療組6082619734/60(56.7％)肺活素治療組608328250/60(83.3％)臨床療效結論1、肺活素具有增強細胞免疫功能作用，在支氣管哮喘時T細胞功能受影響，而肺活素作為免疫調節劑，有助于T細胞功能的提高。2、肺活素具有調節機體細胞因子平衡的作用，在支氣管哮喘細胞因子之間的平衡失調，肺活素可以促進IL-2產生，調節體內細胞因子平衡。3、肺活素具有增強巨噬細胞吞噬功能的作用，在支氣管哮喘時能激活巨噬細胞吞噬功能，使其膜活性增強，溶酶體及溶菌酶含量增高。提高抗炎效果，并能減少反復呼吸道感染而誘發哮喘發作的因素。我們采用肺活素輔助治療60例支氣管哮喘，達臨床控制及顯效者的50例中有23例已連續隨訪3年以上，仍處于較穩定狀態。說明肺活素對減少和預防呼吸道感染，減少哮喘發作的感染誘因有一定作用。4、研究結果表明，采用肺活素輔助治療支氣管哮喘對改善病人的癥狀，體征和肺功能狀態均優于常規治療，在支氣管哮喘綜合療效中起到輔助治療作用，提高了支氣管哮喘的綜合治療效果。5、肺活素安全、無局部刺激作用、不產生過敏反應，無全身毒副作用，是治療支氣管哮喘較為理想的輔助治療藥物。權利要求1.一種用于預防和治療呼吸系統疾病的肺活素，含有分子量小于20KDa的組合物，并且具有下列特性1.1可從哺乳動物肺臟組織提取；1.2組合物的主要成份多肽、核酸；1.3生物活性特征1.3.1能夠在體內外刺激單核細胞和巨噬細胞吞噬功能；1.3.2能夠調節IL-1和IL-2等淋巴因子產生。2.根據權利要求1所述的肺活素，具有以下技術特征2.1大分子蛋白質試驗—磺柳酸法測試其蛋白定性為陰性。2.2本組合物的水溶液經190-400nm紫外分光掃描可見兩個峰，即205±10nm，260±10nm處，兩峰中間的谷位在235±10nm處。2.3本組合物的水溶液經高效液相色譜法分析，有三、四個主要吸收峰，其主峰的相對面積百分比在40％以上。3.根據權利要求1所述的肺活素，具有以下技術特征3.1能夠保護動物和人的肺與支氣管；3.2能夠修復動物和人的肺與支氣管的損傷；3.3促進人肺和支氣管組織細胞的再生，從而增強抗菌素療效；3.4能在體外促進組織細胞生長。4.根據權利要求1所述的肺活素，其特征在于可從牛的肺臟組織中提取，并能預防和治療慢性支氣管炎、哮喘、肺癌、肺氣腫、肺結核、肺炎、呼衰、支氣管擴張、肺膿腫等呼吸系統疾病。5.制備如權利要求1所述組合物的方法，其特征在于5.1清洗新鮮或冰凍保存的哺乳動物肺臟；5.2將肺臟組織細胞進行破碎；5.3然后加入肺重量0.5-3.0倍的蒸餾水；5.4分離及澄清；5.5將分離及澄清后的產物提取；5.6除菌、分裝；5.7將肺活素制成水針或凍干粉針。6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于采用高速組織搗碎機、膠體磨等機械和超聲方法進行肺臟組織破碎。7.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于破碎后加入蒸餾水的產物可反復凍融。8.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于采用超濾方法將分離及澄清后的產物提取，超濾分子量截留20KDa以下的物質。9.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于成品標示量方法如下4.1采用多肽含量標示法；4.2采用核酸含量標示法；4.3采用生物活性單位標示法。全文摘要本發明涉及一種從動物肺臟中提取出生物活性成分用于預防和治療呼吸系統疾病的組合物。含有分子量小于20KDa的組合物,主要成分為多肽、核酸,生物活性特征能夠在內外刺激單核細胞和巨噬細胞吞噬功能;能夠調節IL－1和IL－2等淋巴因子產生。本發明提供一種能夠激活巨噬細胞的物質,其目的在于調節機體免疫功能,改善肺功能指標。文檔編號A61K35/42GK1194833SQ9711973公開日1998年10月7日申請日期1997年10月8日優先權日1997年10月8日發明者劉柏宏,杜群君,皮建新申請人:劉柏宏