專利名稱：：干擾素結合物的制作方法干擾素，尤其是干擾素2α為一有藥物活性的蛋白質，其具有抗病毒及抗增殖的活性。例如，干擾素可用來治療毛狀細胞白血病及卡波濟肉瘤，并且其還具有抗肝類的活性。具有藥物活性的蛋白質如干擾素，為了改善穩定性及可溶性，并減低免疫原性，藥物活性蛋白如干擾素可與聚合物聚乙二醇(PEG)結合。蛋白質治療的生物利用度常因其較短的血漿半衰期而受到限制，這樣也就阻止了這類藥物的最大臨床效力。近年來，PEG結合的生物分子已經顯現出臨床上有用途的性質(Inadaetal.，J.Bioact.andCompatiblePolymers5，343(1990)；delgadoetal.，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystem9，249(1992)；Katre，AdvancedDrugDeliverysystems10，91(1993))。其優點是有較好的物理及熱穩定性，防止酶的降解，增加可溶性，在體內更長的循環半衰期，清除率降低及效力增強。據報道支鏈PEG結合物較線性PEG結合物具有更高的pH值及更好的熱穩定性，并且更不容易被蛋白分解(Monfardinietal.，BioconjugateChem.6，62(1995))。PEG蛋白質的其它特性為不僅降低毒性，而且減低了免疫原性及抗原性。某些蛋白質PEG化的另一個作用是伴隨著體內活性的增強而體外活性下降。已經觀察到的有這種作用的蛋白質有G-CSF(Satake-Ishikawaetal.，CellStructureandFunction17，157-160(1992))，IL-2(Katreetal.，Proc.Natl.Acad.Sci，USA84，1487(1987))，TNFα(Tsutsumietal.，Jpn.J.CancerRes.85，9(1984))，IL-6(Inoueetal.，J.Lab.Clin.Med.124，529(1994))及CD4-IgG(Chamowetal.，Bioconj.Chem.5，133(1994))等。有關干擾素，現已觀察到PEG化后在體外實驗中降低了其抗病毒的活性，但卻增加了對人腫瘤細胞抗增殖的活性。本發明新的PEG干擾素結合物有一個顯著的特點在于，其抗增殖的活性不僅遠遠高于干擾素也遠遠高于其它的PEG干擾素結合物。雖然該結合物抗增殖的活性大大高于其它PEG干擾素α結合物，然而它們的抗病毒活性下降卻是類似的。此外，本發明的PEG干擾素α結合物無免疫原性，所以實際上不引起抗體的產生。相反地其它的PEG干擾素α結合物卻可引起有限的抗體產生。因此，本發明所述的為一種新類型的干擾素α(IFNα)PEG衍生物。本發明結合物為下面我們還會看到的支鏈PEG結構。支鏈PEG優點是在一個結合位點可以結合2個線性PEG分子，這樣就可以在不增加PEG化位點的情況下加倍地結合PEG數量、與未經修飾的IFNα(即未結合PEG的IFNα)比較，伴隨著體外抗病毒活性下降，結合物增加了循環半衰期及血中住留時間，降低了免疫原性，清除率下降，并且增加了抗增殖活性。與其它的PEG-IFNα結合物比較，本發明的結合物有更強的抗增殖活性，其它的特性也有不成比例的增高或減低，并且實際上沒有免疫原性。本發明生理活性PEG-IFNα結合物具有下式與IFNα一樣，本發明結合物具有同樣的用途，例如抗增殖用途。另外，本發明的PEG干擾素α結合物還可用來治療免疫調節異常性疾病，例如腫瘤。同理IFNα類藥物(尤其IFNα2a)也用來治療如毛狀細胞白血病，CML，卡波濟肉瘤及感染疾病等。但本發明結合物改善了一些特性，這包括優良的穩定性，更大的溶解性，循環半衰期及血漿住留時間延長。此外，還有這些結合物的抗增殖活性要比IFNα增強。另外，正如上面已經提到的該結合物顯示出出人意料的抗病毒活性及抗增殖活性差別。這一特點對于增加結合物所需的活性，而減少或消除其所不需要的活性是很有用的。例如，如果所不需要的副作用是與其抗病毒的活性聯系在一起的，那么消除抗病毒活性應能夠消除該副作用而保留其抗增殖活性。因此，本發明還包括基于式I化合物或者其鹽的藥物組合物，以及制備它們的方法。用來控制或預防疾病的本發明藥物組合物包括通式I的干擾素結合物和無治療作用，無毒的及治療上可接受的載體物質。所使用的藥物組合物可根據要治療的疾病，病人個體的情況，蛋白質結合物的給藥位點，給藥方式及其它一些因素來制備并制成一定劑量的劑型。權利要求的結合物為具有下式的生理活性PEG-IFNα結合物其中R和R’為獨立的低級烷基；X為NH或O(X至少是選自IFNα分子中NH2或OH的一個功能基團)；n及n’為總數600至1500的整數；在上述的結合物中，聚乙二醇單位平均分子量為26000道爾頓至約66000道爾頓。式I結合物為一支鏈結構，其中兩個PEG部分可通過一個單鍵與蛋白質直接。n及n’數目的選擇應使所得的式I結合物具有IFNα的生理活性，其活性可與未經修飾過的IFNα活性相同，或者高于未修飾的IFNα，或者只有未經修飾IFNα的部分活性。n及n’(n及n’可以相同或者不同)代表PEG中乙二醇單位的數量。一個單一PEG的OCH2CH2其分子量約為44道爾頓。結合物的分子量(IFNα的分子量除外)主要是依n及n’的數目而定。式I結合物的n及n’的總數目為600至1500，所制得的結合物的PEG部分總的平均分子量約從26000到66000道爾頓，優選約從35000到45000道爾頓，更優選約從39000到45000道爾頓，最優選是40000道爾頓。一般n及n’的優選總數約從800到1200，平均約從850到1000，但以總數約為910較好。n及n’可以分別地為420或520，或者都為420或520，或者都為455。n與n’的優選比例一般地約從0.5到1.5，但最好是約從0.8到1.2。分子量的有關“大約”數目指使用常規分析技術測得的在合理范圍內的數字。IFNα為IFNα2a的式I結合物也是較好的，其中R及R’為甲基，X為NH，n及n’可以分別是或者都是420或520。具有上述特征的結合物是優選的。R及R’可為任何一種低級烷基，烷基指具有1至6個碳原子的烷基如甲基，乙基及異丙基等。烷基也包括支鏈烷基。烷基優選為甲基。有關式I中的兩個PEG基團，其中R及R’可以相同或者不同。IFNα(干擾素α)及其亞類IFN2α是指天然的或重組的蛋白質，最好為人類蛋白質，這些蛋白質可通過常規的來源獲得，例如組織，蛋白質合成，天然或重組細胞培養。任何具有IFNα活性的蛋白質，例如突變的蛋白質或修飾過的蛋白質都包括在內。目前已知可通過天然或重組途徑得到及分離IFNα(Pestka，Arch.Biochem.Biophys.221，1(1993))。上述的IFN2α為一種較優選的IFNα，其可通過已知的方法得到(Pestka，Sci.Am.249，36(1993)；EuropeanPatentNo.43980))。分子式I的生理活性結合物具有IFNα的活性，其具有通過本領域已知各種分析技術測得的部分或多種IFNα活性。尤其是本發明的結合物對腫瘤細胞有抗增殖活性，以及對病毒感梁的細胞有抗病毒的活性。這些是IFNα的已知活性。結合物的這種活性可通過本領域已知的分析方法，例如下面所述的方法來測得(見Rubinsteinetal.，J.virol.37，755(1981)；bordenetal.，Canc.Res.42，4948(1982))。本發明部分為式I結合物，其與未經修飾的IFNα比較，它具有比其更強的抗增殖活性及比其更弱的抗病毒活性。式I制備是先形成式IIPEG的N-羥基琥珀酰亞胺酯衍生物(主要是單甲氧基PEG)，然后將通過取代PEG的羥基而激活的PEG與IFNα用連接基團經共價鍵連結在一起來制備的。上述的N-羥基琥珀酰亞胺酯衍生物可采用常規的方法來制得(Monfardinietal.，supra)。通過-酰胺或酯鍵來連結。結合物以通過酰胺鍵連結(X為NH)為較好。本發明部分是有關制備PEG-IFN結合物的方法，即通過上述的式II的試劑與IFNα連結形成PEG-IFN結合物，該結合物使IFNα的抗增殖活性增強，而IFNα的抗病毒活性減弱。X代表IFNα上式IIPEG試劑與IFNα結合的結合位點。該試劑也可與如賴氨酸的伯氨基基團(XH＝NH2)結合，或與IFNα的N末端結合。該試劑也可與如絲氨酸的羥基(XH＝OH)結合。式II試劑(PEG2-NHS)，其中共有2個單甲氧基PEG(m-PEG)分別通過氨基甲酸酯(氨基甲酸乙酯)鍵與賴氨酸的α及ε氨基連結，并且將賴氨酸的羧基激活為琥珀酰亞胺酯，可按制備R為低級烷基，n為所需要的數值的該試劑的已知步驟，采用常規方法來制得(Monfardinietal.，Supra)。該試劑也可從ShearwaterPolymers，Inc.(Huntsville，Alabama)公司購得。如果PEG2-NHS中總的PEG量為40000道爾頓，那么所得的PEG平均分子量最好約為2000(其它分子量也可使用常規的制備方法通過改變用于式II試劑的PEG一醇起始物質的n來得到)。可通過常規的方法使式lI試劑與IFNα結合。具體地講，式II試劑主要與IFNα(如IFN2α)中的伯氨基團(如N端及賴氨酸側鏈)反應，從而在IFNα與PEG聚合物的骨架之間形成酰胺鍵。PEG化反應也在PEG2-NHS與IFNα的游離(如有的話)羥基(如絲氨酸)之間進行從而形成酯鍵。反應機理如上所述。反應條件在下面有詳述，對于本領域技術人員來講，這些條件都是常規的。PEG反應試劑與IFNα的反應是在溫和堿性，適合于產生式I結合物的親核取代反應的較低溫度條件下進行的。在上面的反應機制中也可看到這一點。可通過常規的方法將該試劑與IFNα連結在一起。可使用本發明所選用的任何一種分子量的PEG。選擇反應條件使得權利要求的該結合物與該試劑連結。與單一式II反應試劑結合的式I結合物可通過常規的方法從未修飾的IFNα及結合了多個反應試劑分子的結合物中分離出來。可采用離子交換層析等純化方法根據帶電荷的不同分離結合物，通過這種方法可將各種分子量不同的結合物分離開。通過離子交換層析法所得的各部分含量可使用常規的方法如質譜，SDS-PAGE或其它已知的根據分子量來分離分子物質的方法根據分子量來檢出。這樣就可將含有式I結合物的部分從未經修飾的IFNα及已連結多個反應試劑的結合物中純化出來并鑒定。此外，在酸水解時，每個式II結合物可釋放出一個賴氨酸分子，這樣水解時賴氨酸的數目即代表結合于蛋白質上的PEG數目，從而也可確定結合于結合物上的反應試劑分子的數量。下述的實例只是用來說明本發明，但不局限于此。這些實例中所使用的為IFNα2a。其它種類的IFNα也可采用實例中的方法與PEG連結。附圖的說明圖1為用人類腎A498細胞皮下植入裸鼠的實驗中PEG2-IFNalpha2a的抗腫瘤活性。所有動物在研究前的33天經皮下植入2×106個人類腎A498細胞。在實驗開始時，即研究0天以PE-IFNalpha2a治療動物。按指定的劑量(30，60，120或300μg)在腫瘤的對側經皮下給予IFNalpha2a，用法為每周1次共4周。圖2為在用人類腎A498細胞皮下植入裸鼠的實驗中，IFNalpha2a的抗腫瘤活性。所有動物在研究前33天皮下植入2×106個人類腎A498細胞。研究0天，即實驗開始時，以IFNalpha2a治療動物。按指定的劑量(10，20，40或100μg)在腫瘤的對側經皮下給予IFNalpha2a，用法為每周3次，共用4周。圖3為在用人類腎臟A498細胞皮下植入裸鼠的實驗中PEG2-IFNalpha2a的抗腫瘤活性。所有動物在研究前的25天皮下植入2×106個人類腎A498細胞。研究0天，即實驗開始時，以PEG2-IFNalpha2a治療動物，按指定的劑量(30，60，120或300μg)在腫瘤的對側經皮下給予PEG2-IFNalpha2a，用法為每周1次，共用藥5周。圖4為在以人類腎ACHN細胞經皮下植入裸鼠的實驗中IFNalpha2a的抗腫瘤活性。所有動物在研究前的25天經皮下植入2×106個人類腎ACHN細胞。在研究0天，即實驗開始時以IFNalpha2a治療。按指定的劑量(10，20，40或100μg)在腫瘤的對側經皮下給予IFNalpha2a，用法為每周用藥3次，共用5周。圖5為在以人類腎G402細胞經皮下F植入裸鼠的實驗中，PEG2-IFNalpha2a的抗腫瘤活性。所有動物在實驗前45天經皮下植入2×106個人類腎G402細胞。實驗第0天，即實驗開始時以PEG2-IFNalpha2a來治療。按照指定的劑量(30，60，120或300μg)在腫瘤的對側經皮下給予PEG2-IFNalpha2a，用法為每周用藥1次，共用藥5周。圖6為在以人類腎G402細胞經皮下植入裸鼠的實驗中，IFNalpha2a的抗腫瘤活性。所有動物在實驗前45天經皮下植入2×106人類腎G402細胞。在實驗0天，即實驗開始時，開始以IFNalpha2a治療。按指定的劑量(10，20，40或100μg)在腫瘤的對側經皮下給予IFNalpha2a，用法為每周用藥3次，共用藥5周。實例1式I結合物的制備材料采用已知方法來制備干擾素α2a(Pestka，supra)。式II的聚乙二醇(PEG)試劑由ShearwaterPolymers，Inc.公司(Huntsuille，Ala)購得。粒徑為25-40μm的FractogelEMDCM650(S)樹脂由EMSeperations(Gibbstown，MA)提供。濃縮的(10X)的磷酸鹽緩沖液(PBS)，pH7.3，從Biowhittlaker(Walkersville，MD)購得。十二烷基硫酸鈉/聚丙烯酰胺凝膠電泳(SPS-PAGE)的灌膠前凝膠及電泳裝置由NOVEX(SonDiego，CA)購得。用于SDS-PAGE中PEG結合物蛋白染色的濃縮的快染色劑(FastStain)由ZoionResearch，Inc.(Newton，MA)購得。LAL內毒素測定試劑盒由AssociatesofCapeCod.Inc，(WoodsHole，MA)購得。所用的其它試劑也為最高質量。頸靜插管的大鼠及BOF-1小鼠由CharlesRiverLaboratories(Wilmington，MA)提供。實驗步驟A.式I結合物的小量制備將208mg(5.2μmol)的式II的試劑(平均分子量40000道爾頓)加到于10ml的pH為8.0的100mM硼酸鹽溶液中的50mg(2.6μmol)IFNα中。使最終的蛋白試劑摩爾比值為1∶2。在4℃下攪拌反應混合物2小時。用冰醋酸調節pH至4.5來終止反應。將反應混合物用水稀釋50倍，并通過一個0.2μ的過濾器過濾，裝Amicon柱。柱子為裝有100ml(3.2×13cm)FractogelEMDCM650(3)的Amicon柱子，流速為20ml/分鐘。該柱預先用pH4.5的10mM的醋酸銨平衡。于280nm采用紫外吸收監測柱子流出物。然后用平衡緩沖液沖洗柱子直到紫外吸收值恢復到基線。結合了多個式II試劑的PEG-INF結合物(PEG-IFN低聚物)用40mM的pH為4.5的乙酸銨洗脫，式I結合物用溶于40mM的乙酸銨緩沖液的0.12MNaCl洗脫。留在柱子中的未修飾的IFN用溶于同樣緩沖液中的0.5MNaCl洗脫。采用1.0MNaCl洗柱，之后再以平衡緩沖液洗柱使柱子再生。將收集到的式I結合物部分經一個帶YM10膜的Amicon攪拌細胞濃縮器將濃度濃縮至約1mg/ml。用于純化的FractogelCM650(S)離子交換樹脂可有效地吸附PEG及未修飾的IFN。吸附的能力與PEG化的程度有關。未修飾的IFN要比結合物與柱子的結合更緊密。PEG-lFN低聚物可用40mM的乙酸銨洗脫，而式I的結合物可用0.12M的NaCl來洗脫。未修飾的IFN可用0.5M的NaCl洗脫。所有制備物含有的內毒素＜5Eu/mg。所得的產物分子含＞99％的式I結合物，并且不含有未修飾的IFN。B.式I結合物的大量制備6240mg(156μmol)的式II試劑(平均分子量為40000道爾頓)，在4℃條件下溶于63ml1mM的鹽酸中，然后立即加到125ml溶于50mM硼酸鹽緩沖液，pH9.0的1000mg(52μmol)干擾素溶液中。蛋白/試劑的最終比值為1∶3，而最終反應混合物蛋白質的濃度為5.3mg/ml。將反應混合物在4℃條件下攪拌2小時。通過用冰醋酸調節pH至4.5來終止反應。用水將反應混合物稀釋10倍并上柱，柱子用600ml的FractogelEMDCM650(M)裝柱并先以pH為4.5的20mM乙酸鈉平衡，，柱子的線性流速為1.3cm/分鐘。用平衡緩沖液沖洗柱子，隨后用10mM的NaCl洗脫掉多余的試劑，反應副產物及PEG-IFN低聚物。用含有200mM的NaCl平衡緩沖液洗脫式I結合物。仍然吸附在柱上的未修飾干擾素用0.75MNaCl的平衡緩沖液洗脫。將以0.3-0.5mg/ml速度洗脫的式I結合物進一步濃縮，并經過濾進入含有150mMNaCl，pH為5.0的20mM乙酸鈉的最終緩沖液。式I結合物的總產率為40-50％。大量制備的純化PEG-IFN中式I結合物的成分＞99％。本實施例中式I結合物的平均分子量為62000道爾頓，包括其中IFNα2a的分子量為19241道爾頓，而試劑的平均分子量在40000至45000之間，約為43000道爾頓。實施例2式I結合物的特征蛋白質的測定采用IFNaα2a1mg/ml的溶液，其A280值為1.0來測定蛋白質濃度。SDS-PAGE分析在還原的條件下按照Laemmli的方法(Nature227，680(1970))，采用十二烷基硫酸鈉/聚丙烯酰胺(8-16％)凝膠電泳來分析結合物。可按照生產廠家的說明使用快染色劑(ZoionResearch，Inc.)對含有PEG-結合物的SDS-PAGE進行蛋白染色。內毒素水平的測定按照生產廠家的說明使用LAL方法測定內毒素水平。所有的制備出的產物含內毒素＜5Eu/mg。實施例3式I結合物的體外生物活性對牛腎細胞的抗病毒活性以泡狀口炎病毒(Rubinsteinetal.，supra)感染Madin-Darby牛腎細胞(MDBK)，用細胞培養生物分析的方法在體外測定IFNα2a及實施例1制備的式I結合物的抗病毒活性。抗病毒活性見表1，以起始IFN的百分比做為其相應的殘留的活性。表1抗病毒活性</tables>在體外對人體腫瘤的抗增殖活性象Borden等人描述的那樣，采用人Daudi(Burkitt氏淋巴肉瘤)細胞在體外分析抗增殖活性。將人類Daudi細胞在加有10％的小牛血清及2mM的谷氨酸(GrandIslandBiologicals，grandIslond，NY)的RPMI1540培養液中靜止懸浮培養。篩選細胞并確認無支原體。將100μl細胞(2×104)培養液加到微滴定板(Costar，MA)的孔內。再向孔內加入100μl各種濃度的IFN及實施1中制備的式I結合物。將板在37℃及5％CO2條件下孵育72小時。在收集細胞前16小時，對培養細胞一次性給予0.25μCi/孔的3H胸腺嘧啶(NewEnglandNuclear，Boston，MA)。在玻璃濾器上收集細胞，并以液晶閃爍計數器計數。通過公式計算出的抑制百分比來表示結果。％抑制＝〔(A-B/A〕×100，其中A＝對照培養中的cpm值(僅以培養液培養細胞)B＝實驗培養中的cpm值樣品測定4次，標準差小于所有樣本均值的20％。比較結果的實驗至少重復2次。IFN及結合物的抗增殖活性(IC50)見表2。數據表明與IFN比較，分子式I結合物的抗增殖活性增長了28倍。表2在體外對人類Daudi(Burkitt氏淋巴肉瘤)細胞系的抗增殖活性樣品抗增殖活性活性IC50(ng/ml)增加倍數IFNα2a0.561X式I結合物0.0228X實施例4藥物動力學已經外科手術進行頸靜脈插管的雌性SpragueDawley大鼠，平均體重為240-260g，分別隔離裝籠飼養，并讓其自由進食及水，在12小時亮-暗節律的條件下飼養。動物到達的4-6小時內用PBS沖洗頸靜脈插管。第二天在用0.5-0.2mlPBS沖洗頸靜脈插管后，注射溶于0.2-0.4mlPBS的2×106單位的IFNα，隨后再注射0.15-0.2mlPBS以確保所有藥物注入動物體內。從而每個動物接受IFNα的劑量為8×106單位/公斤體重。在注射IFN及式I結合物后，不僅在1，3，5，12和24小時取血樣，也在5，15及30分鐘后取血樣。在所有的時間點，用新的注射器經頸靜脈抽取血樣，抽血樣時，棄去先抽得的0.15-0.2ml血，然后再抽取等分的0.5ml做為血樣。在室溫下，將血清裝入血清分離試管。當所有時間點的樣品收集之后，將試管放入一個冷凍的Eppendorf離心機以14000g的轉速離心10分鐘。將分離出的血清轉入1.5ml微型離心管內，并在-80℃的條件下治凍保存以備生物分析用。適當地稀釋血清，并按上述的方法在每個時間點測定抗病毒的活性。通過時間對活性作圖，可測得式I結合物及IFNα的最終半衰期，其中也包括血清住留時間，結果見表3。表3最終半衰期(t1/2)及平均血清住留時間樣品t1/2(小時)血清住留時間(小時)IFNα2a2.11.0式I結合物15.020.0采用對數線性回歸估算最終t1/2。實施例5免疫原性經腹腔給正常的BDF-1小鼠(每組10只)注射具有300000單位抗病毒活性的各種干擾素制劑，具體地是每天注射1次，每周5次。有些小鼠也注射聚集形式的IFNα2a，這種形式要較單體形式具有更強的免疫原性。在最后一次注射的19天取血樣，并用中和抗體來估算免疫原性。表4中可見，注射IFNα2a的小鼠可產生中和抗體，注射干擾素聚集物可大大加強這一反應。注射本發明結合物的大多數動物未檢測到抗體。表4免疫原性抗體(INu/ml)*治療均值范圍IFNα2a2400217-8533IFNα2a聚集物42667800-768000式I結合物00-1133*干擾素中和單位/ml實施例6體內抗腫瘤活性通過測定縮小經皮下植入小鼠各種人類腫瘤細胞的能力，來評估式I結合物(PEG2-IFNalpha2a)及未修飾的IFNalpha2a在體內的抗腫瘤活性。結果見圖1-6。步驟在小鼠身體的左右側方經皮下給無胸腺裸鼠(Harlan)植入2×106個人類腎A498細胞(圖1及2)，人腎ACHN細胞(圖3及4)，或人腎G402細胞(圖5和6)。依據上述，先經過3到6周使腫瘤建立起來。實驗要求的腫瘤大小標準是0.05到0.50立方厘米。給予小鼠PEG2-IFNalpha2a或未修飾的IFNalpha2a每周的總劑量為30，60，120或300μg。PEG2-IFNalpha2a治療的小鼠每周給藥1次(星期一)，每次的劑量為30，60，120或300μg。用未修飾的IFNalpha2a治療的小鼠每周治療3次(星期一、三、五)每次治療的劑量為10，20，40或100μg。根據腫瘤的浸潤性，治療的療程在4到5周。每個星期一治療前測量腫瘤的大小。結果在開始治療后的7天，14天，21天及28天，與未修飾的IFNalpha2a比較，受測的所有每周劑量組的PEG2-IFNalpha2a治療組均可使A498腫瘤大小明顯減小(圖1和2)。治療持續4周。每組有3只小鼠治療7天后停止治療并處死。在用PE2-IFN-alpha2a治療的3只小鼠中未觀察到殘余的腫瘤。在用未修飾的IFNalpha2a治療的小鼠中，三只小鼠的每只A498腫瘤的重量分別為1.28g，0.62g和1.60g。對照組的小鼠每只A498腫瘤的重量分別為2.32g，2.37g和1.94g。在經過4周治療后的80天，通過觸摸7只小鼠來確定腫瘤的存在。通過觸摸所有7只小鼠都未發現腫瘤。在每周以60，120及130μg劑量治療的小鼠，分別在14天，21天，28天及35天測定ACHN腫瘤的大小，與未修飾的IFNalpha2a比較，PEG2-IFNalpha2a可明顯地減小腫瘤的大小(圖3和4)。在每周以60和120μg治療的小鼠，分別在14天，21天，28天及35天測定G402腫瘤的大上，與未修飾的IFNalpha2a比較，PEG2-IFNalpha2a可明顯地減小腫瘤的大小(圖5和6)。權利要求1.具有下式的生理活性的PEG-IFNα結合物，其中R和R’為獨立的低級烷基；X為NH或O；n及n’為總數從600到1500的整數；上述結合物中聚乙二醇單位的平均分子量約為從26000道爾頓到66000道爾頓。2.權利要求1中的結合物，其中的聚乙二醇單位的平均分子量約從35000到45000道爾頓。3.權利要求2中的結合物，其中的聚乙二醇單位的分子量約為40000道爾頓。4.權利要求1中的結合物，其中R和R’為甲基。5.權利要求1中的結合物，其中X為NH。6.權利要求1的結合物，其中IFNα為IFNα2a。7.權利要求1的結合物，其中n和n’的平均總數為850到1000。8.權利要求1的結合物，其中R和R’為甲基；X為NH，IFNα為IFNα2a；n和n’的其中之一或兩者均為420。9.權利要求1的結合物，其中R和R’為甲基；X為NH；IFNα為IFNα2a；n和n’之一或兩者均為520。10.權利要求1的結合物，其抗增殖活性較IFNα強，而抗病毒活性較IFNα弱。11.制備PEG-IFNα結合物的方法，該結合物與IFNα比較具有較強的抗增殖活性及較弱的抗病毒活性，該方法為將式II的試劑與INFα經共價鍵連結以產生上述的PEG-IFNα結合物。12.藥物組合物，其包括權利要求1-10中的任何一種PEG-IFNα結合物及治療惰性的載體。13.用于治療或預防免疫調節異常疾病如腫瘤或感染疾病的藥物組合物，其包括權利要求1-10中的任何一種PEG-IFNα結合物及治療惰性的載體。14.權利要求1-10中的任何一項要求的PEG-IFNα結合物用來生產預防或治療疾病的藥物。15.任何時候根據權利要求11中所述的方法制備的權利要求1-10中所要求的PEG-IFNα結合物。16.權利要求1-10中所要求的PEG-IFNα結合物的用于生產用來治療或預防疾病的PEG-IFNα結合物藥物。17.在此前敘述的產品，藥物組合物，過程及方法。18.治療或預防免疫調節異常疾病的方法，其包括給予權利要求1-10任何一項中的PEG-IFNα結合物。全文摘要具有右式的生理活性的PEG-IFNα結合物。文檔編號A61P37/02GK1167777SQ97113049公開日1997年12月17日申請日期1997年5月29日優先權日1996年5月31日發明者P·S·巴朗,A·V·帕勒羅尼申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司