專利名稱：檞寄生提取物及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域，是一種懈寄生提取物及其用途。
懈寄生中藥一般用于抗風濕，至今未有報道懈寄生拮抗PAF的作用，并對體內外PAF誘導的血小板聚集有顯著抑制作用等。
近幾年，醫療界對PAF病理生理作用認識為斷深入，研究也在不斷關注PAF拮抗劑的發現與開發，以期獲得天然PAF拮抗劑，以增加提取天然PAF拮抗劑的品種。
本發明的目的是，提供一種懈寄生提取物及其用途，增加一種天然PAF拮抗劑，對治療疾病無任何副作用。具有對體內外PAF誘導的血小板聚集有顯著抑制作用，對缺血性心臟病和腦血管病患者的PAF誘導的血小板聚集和釋放功能有明顯抑制作用。
本發明的懈寄生提取物為化合物，呈類白色結晶，其化合物為高圣草素-7-0-β-D-葡萄糖甙，分子式為C22H24O11。本發明懈寄生提取物的用途為，對體內外PAF誘導的血小板聚集有顯著抑制作用，對血小板活化和釋放功能有明顯抑制作用，對缺血性心臟病和腦血管病患者的PAF誘導的血小板聚集和釋放功能有明顯抑制作用。
本發明所述的懈寄生利用高效硅膠層析技術分離純化其有效化合物，經紅外光譜、核磁共振譜和質譜分析鑒定，其分子結構為高圣草素-7-0-β-D-葡萄糖甙，用受體放射配體結合實驗，證實其受體水平上發揮PAF的作用；然后對其有效部位和成分進一步分離、提取，其具體方法是1、血小板聚集試驗Born比濁法。血小板標本采自健康獻血員或志愿者。動物實驗采用新西蘭兔。
2、懈寄生有效部位和化學成分的提取生藥切片，95％乙醇熱回流提取，得浸膏。然后分別以石油醚、氯仿、乙酸乙酯提取，得各有機相和水相提取物。以兔灌胃體內實驗法進行藥效監測。對有效部位進一步行硅膠柱層析分離，以不同比例的氯仿和甲醇混合溶劑梯度洗脫，收集各洗脫組分，合并薄層層析Rf值相同的洗脫液，靜置等結晶析出。收集各結晶物作分子結構鑒定。
3、分子結構鑒定利用紅外光譜、核磁共振譜和質譜分析對各結晶化合物進行結構鑒定。
4、PAF受體結合競爭抑制實驗制備洗滌兔小板懸液(3×108／ml)，每管中各加血小板懸液0．92ml，總結全管加0．9％Nacl140μl，非特異性結合管加PAF40μl，25℃孵育5min，然后每管的[8H]PAF40μl，總體積為1ml，25℃孵育5min，用含0．1％牛自蛋白的冷生理鹽水(0．9％Nacl)終止反應，真空抽濾，用4ml同樣溶液中洗濾器4次，取下濾紙片，紅外燈烘干。每片濾紙置4ml二甲苯閃爍液中，測定放射性。計算[8H]PAF與血小板的結合量。總結合管結合量減去非特異性結合管結合量之差即為特異結合量。按上法在每管中加入不同濃度提取純化的有效PAF拮抗化合物-高圣草素-7-0-β-D-葡萄糖甙和血小板懸液，25℃孵育5分鐘，各加終濃度為0．5μmol／l[8H]PAF，沉淀并計算[8H]PAF特異結合量。其結果見下表。
表1-1懈寄生體外對血小板聚集功能的影響
與對照組比較P＜0．01懈寄生水提取物體外對PAF、AA、ADP三種誘導劑引起的血小板聚集均有顯著抑制作用。
表1-2懈寄生體內對血小板聚集功能的影響
與服藥前比較P＜0．05與服藥前比較P＞0．01結果表明口服懈寄生醇提取物和水提取物后均表現出對PAF誘導的血小板聚集明顯抑制作用，且呈劑量依賴性關系。
表1-3口服懈寄生對血小板釋放功能的影響
與服藥前比較P＜0．01口服懈寄生醇提取物后對血小板釋放功能亦表現出明顯抑制作用。
2、懈寄生抗PAF有效成分提取與鑒定各種數據證實了懈寄生含有抗PAF有效物質，再對其有效成分進行分離、提取
四種提取物均以兔灌胃法監測藥效，其實施結果見表2-1。
表2-1懈寄生提取物對兔血小板聚集的影響
與用藥前比較P＜0．01結果表明乙酸乙酯部分和水部分含有拮抗PAF有效成分，經初步鑒定乙酸乙酯部分有效物質為黃酮類化合物。
對乙酸乙酯和水提取物行硅膠層析，得到五種結晶化合物。然后，對其中獲量較多的化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ作藥效追蹤，觀察其在體外對人和兔血小板聚集功能的影響，結果見表2-2。
表2-2化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ體外對血小板聚集的影響
與對照比較P＜0．01結果表明化合物Ⅱ對人和兔血小板PAF誘導的聚集均有顯著抑制作用。
利用紅外光譜分析、核磁共振譜分析和質譜分析對化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ進行分子結構鑒定結果如下。
化合物Ⅰ為白色狀結晶，譜系分析結果推斷為3-羥基-2-丁烯酸，分子式為C4H6O3，分子量為102。
化合物Ⅱ為拮抗PAF有效物質，呈類白色結晶，HCL-Mg反陽性，Molish反應陽性，NaBH4反應陽性，提示為二氫黃酮甙類化合物。譜系分析結果如下IRVmaxKBrCm-13406、1644、1451、1433、1272、1197、1032(
圖1)。
EI-MSm／z464[M]+、446[M-18]+、428[M-18-18]+、410[M-18-18-18]+、302[甙元]、301、152、150(圖2、3、4)。
H-NMR(500MHz、DMSO-d6)δ(PPm)2．73(H-3，cis)；3．14(1H，dd，J=7．4表明為β-D甙鍵)；6．48(1H，dd，J=2．6，13．0，H-2)(圖5、6)。
化合物Ⅴ為白色柱狀結晶，易溶于水，譜系分析推導為D-3-O-甲基肌醇，分子式為C7H14O6，分子量為194．19。
表2-3化合物Ⅱ13C-NMR數據(PPM)
根據以上數據推導該化合物為高圣草素-7-O-B-D-葡萄糖甙，分子式為C22H24O11，分子量為464。
對本發明所述的各種疾病所做的本發明實施例結果為懈寄生提取物對缺血性心臟病和腦血管病患者的臨床作用，懈寄生提取物對缺血性心臟病(IHD)患者的作用。
36例IHD患者口服懈寄生水提取物后血小板各指標變化見表4-1和4-2。
表4-1 IHD患者服藥后血小板聚集功能的變化
與服藥前比較P＜0．01表4-2 IHD患者服藥后對血小板釋放功能和花生四烯酸代謝的影響
與服藥前比較P＜0．0126例缺血性腦血管病(ICVD)患者口服懈寄生醇提取物80g后血小板各項指標的變化見表4-3。
表4-3 ICVD患者服藥后血小板功能的變化
與服藥前比較P＞0．05
結果表明IHD和ICVD患者口服懈寄生后PAF誘導的血小板聚集和血小板釋放功能及活化狀態均有顯著降低。
研究對象無論口服藥物水提取物或醇提取物均能良好耐受。僅個別出現輕度腹脹，口干或便秘等輕微消化道反應，未見其它嚴重副作用。服藥后患者的血尿常規和肝腎功能均未見異常改變。
附圖1是本發明懈寄生有效成份分離、提取工藝流程圖。
權利要求
1.懈寄生提取物，其特征在于為化合物，呈類白色結晶，其化合物為高圣草素-7-0-β-D葡萄糖甙，分子式為C22H24O11為拮抗PAF有效物質。
2.懈寄生提取物的用途，其特征在于對體內外PAF誘導的血小板聚集有顯著抑制作用。
3.按照權利要求2所述的懈寄生提取物的用途，其特征在于對血小板活化和釋放功能有明顯抑制作用。
4.按照權利要求2所述的懈寄生提取物的用途，其特征在于對缺血性心臟病和腦血管病患者的PAF誘導的血小板聚集和釋放功能有明顯抑制作用。
全文摘要
本發明涉及醫藥技術領域,是一種檞寄生提取物及其用途,本發明的檞寄生提取物為化合物,呈類白色結晶,其化合物為高圣草素－7—0－β－D－葡萄糖甙,分子式為C
文檔編號A61K31/70GK1203918SQ9710587
公開日1999年1月6日 申請日期1997年6月2日 優先權日1997年6月2日
發明者徐從高, 張茂宏, 李同義 申請人:山東醫科大學附屬醫院