專利名稱：：抗人纖維蛋白單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區基因及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及抗人纖維蛋白單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區基因，由所述基因編碼的多肽，含有所述基因的載體及所述的基因在制備血栓定位診斷試劑和溶血栓藥物中的應用。免疫球蛋白是由多基因重排產生的糖蛋白大分子，其由兩條重鏈和兩條輕鏈結合而成，其中根據其不同種屬來源的免疫球蛋白的氨基酸序列的保守性，重鏈和輕鏈又可分為恒定區和可變區。重鏈和輕鏈可變區構成的抗原結合單位是免疫球蛋白特異性識別和結合抗原的關鍵，因此，重組可變區基因產生的肽鏈有小抗體之稱。這種由免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區組成的單鏈抗體分子(scFV)只有30KDa左右，能進入機體的各種組織，又能很快地從機體中清除，而且沒有FC受體導致的非抗原特異性結合，是病變定位診斷的理想探針。由免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區基因重組產生的功能性小抗體scFv能特異性識別和結合抗原。但因缺少恒定區效應分子，scFv本身不會引起全抗體的生物學效應。利用scFv的抗原結合特異性把其它效應分子帶到靶位，是人工制備功能性小抗體的目的。用放射性核素標記的scFV定位診斷腫瘤已有報導(ColcherD.etal，J.Natl.CancerInst.1990，821191-1197)。不同scFV分子還能共價結合構成雙功能抗體(GruberM.etal，J.Immun.1994，1525368-5374；JongeJDetal，Mole.Immun.1995，321405-1412)，或與其它效應分子如免疫毒素、細胞毒藥物、細胞因子或放射性核素等結合構成“魔彈”，已在腫瘤治療中顯示了好的應用前景(WinterG.etal，Nature，1991，349293-299；ChaudharyVKetal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1990，871066-1070；YangJ.etal，Mole.Immun.1995，32873-881；WelsW.etal，CancerRes.1992，526310-6317)，促進了各種各樣基因工程抗體的研究。針對嚴重危害人類生命的癌瘤，Chaudhqry等(文獻同上)用anti-Tac可變區把免疫毒素帶到惡性淋巴細胞，Xiang等(CancerBiother，1993，8327-337)用抗腫瘤細胞單抗可變區與Gamma干擾素或腫瘤壞死因子在基因水平拼接，產生融合子，提高了這些細胞因子在腫瘤局部的濃度，減少了它們的毒副作用。這是腫瘤治療研究中一些成功的例子。除癌瘤外，由纖維蛋白凝塊構成的血栓是這類研究的又一個重要目標，研究結果表明抗纖維蛋白scFV可用于深部靜脈血栓的定位診斷，也可與溶栓藥物如尿激酶結合延長后者的半清除時間和增加導向性能(HolvoetP.etal，Blood，1993，81696-703)。由此提示采用上述融合分子治療血栓病時可用較低的劑量，從而減少尿激酶等溶栓藥物的嚴重副作用，是目前溶栓治療中最具希望的途徑。蛋白水平拼接產生的抗纖維蛋白可變區和尿激酶的融合分子在動物實驗中顯示的良好溶栓性能，促進了基因水平拼接抗纖維蛋白可變區和各種溶栓藥物的研究。本發明人以能分泌抗人纖維蛋白單克隆抗體的雜交瘤為出發點，利用聚合酶鏈反應從雜交瘤的總RNA中擴增出免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區基因，經過重組表達出能識別人纖維蛋白的scFV，由此完成了本發明。因此，本發明的一個目的在于提供一種抗人纖維蛋白單克隆抗體重鏈可變區基因和輕鏈可變區基因，兩者重組后可表達出特異性識別和結合人纖維蛋白的抗體活性片段。本發明的另一個目的在于提供由所述的抗人纖維蛋白單克隆抗體重鏈可變區基因和輕鏈可變區基因編碼的多肽產物。本發明的再一目的在于提供含重鏈可變區基因和輕鏈可變區基因的表達載體。本發明的又一目的在于所述的抗人纖維蛋白單克隆抗體重鏈可變區基因和輕鏈可變區基因在制備溶血栓藥物中的應用。根據本發明，提供了一種抗人纖維蛋白單克隆抗體重鏈可變區基因，稱為VH-8E5，全長為375bp，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO1所示。所述的基因包括IgG2b框架區和三個互補決定區(CDR)，其中CDR1為15bp，位于SEQIDNO.1的第85-99位核苷酸；CDR2為51bp，位于SEQIDNO.1的第142-192位核苷酸；CDR3為33bp，位于SEQIDNO.1的第289-321位核苷酸。此三個CDR區是特異性結合人纖維蛋白的重要結構。根據本發明，提供了一種抗人纖維蛋白單克隆抗體輕鏈鏈可變區基因，稱為VH-8E5，全長為366bp，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO2所示。所述的基因的特征是具有三個互補決定區(CDR)，其中CDR1為51bp，位于SEQIDNO.2的第70-120位核苷酸，CDR2為21bp，位于SEQIDNO.2的第166-186位核苷酸，CDR3為27bp，位于SEQIDNO.2的第283-309位核苷酸。同樣，此三個CDR區是特異性結合人纖維蛋白的重要結構。本發明的VH-8E5基因與輕鏈可變區基因VK-8E5匹配而表達的單鏈抗體分子scFv-8E5可用于血栓定位診斷和制備溶血栓融合蛋白。本發明的VH-8E5基因的DNA序列分析結果與數據庫中的DNA序列比較，證明我們分離的免疫球蛋白重鏈可變區基因是獨特的，數據庫中沒有與之完全相同的DNA序列。VH-8E5和同一來源的VK-8E5基因重組后的表達產物分子量約30KDa(見下述實施例3的結果)，其特異性識別和結合人纖維蛋白的能力說明這個scFv分子在宿主菌中進行了正確的折疊。本發明還涉及本發明的重鏈可變區基因VH-8E5與輕鏈可變區基因VK-8E5的重組表達產物scFv-gE5，其抗原決定簇為人纖維蛋白B鏈N端7肽，這種7肽只產生于纖維蛋白原水解之后，并暴露在纖維蛋白表面，因此這種單鏈抗體分子能特異性識別纖維蛋白。研究結果證明這個scFv分子確有抗原識別特異性，是與各種溶栓藥物作分子拼接的必要材料。其C末端的游離半胱氨酸，便利于放射性核素標記，用于深部靜脈血栓定位診斷。因此本發明的再一方面即為所述的抗人纖維蛋白單克隆抗體重鏈可變區基因和輕鏈可變區基因在制備血栓病的診斷和溶栓治療的藥物中的應用。本發明的又一方面是含所述重鏈可變區基因VH-8E5及輕鏈可變區基因VK-8E5的表達載體，所述的表達載體可以是原核表達載體，也可以是真核表達載體，優選為原核重組表達載體如pOPE51-8E5，pOPE51-8E5來源于pOPE51-215(后者得自Dubel博士，德國腫瘤研究中心)。pOPE51-215載體帶有lac啟動子和果膠酶先導序列，調控其下游的抗果蠅melanogasterRNA聚合酶II小鼠單克隆抗體scFv的表達，其3′末端的c-myc短肽密碼子可作為表達產物的標記，5個組氨酸密碼子用于表達產物的純化(KipriyanovSM等人，分子免疫學，1994，311047-1058)。pOPE51-8E5是用本發明的VH-8E5基因和VK-8E5基因代替pOPE51-215中相應的抗果蠅melanogasterRNA聚合酶II小鼠單克隆抗體scFv的基因。利用所述的表達載體可以很容易地表達單鏈抗體可變區重組蛋白。單克隆抗體原本產生于雜交瘤細胞，早期的基因工程抗體也是在真核細胞中表達。大腸桿菌能在低耗培養基中快速而大量的繁殖，已成為現代許多基因工程產品的宿主。用大腸桿菌表達工程抗體也是多數人的選擇。本發明中優選采用的表達系統pOPE51-8E5充分利用了細菌高產的優點。用果膠酶先導序列彌補了細菌不能處理加工蛋白的缺陷，只要通過過夜培養細菌和3小時的IPTG誘導表達就能獲得占總蛋白含量7.3％的功能性scFv，這非常有利于研究新的產品。為獲得高產，可增加誘導劑IPTG的濃度到100μM，此時表達產物可達宿主菌總蛋白的28.9％。但由于濃度太高，超過了細菌的加工處理能力，形成許多不溶解的包涵體。我們通過離心回收的包涵體中含有54％的表達產物。附圖的簡述圖1為經逆向聚合酶鏈反應(RT-PCR)擴增8E5雜交瘤細胞的mRNA后的產物的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，M道示出分子量標記(由上至下依次為1631，517/506，396，221/220)，1-2道為本發明的輕鏈可變區VK-8E5基因，3-4道為本發明的重鏈可變區VH-8E5基因。圖2示出本發明的輕鏈可變區VK-8E5基因和重鏈可變區VH-8E5基因的克隆策略示意圖。圖3為包含本發明的輕鏈可變區VK-8E5基因和重鏈可變區VH-8E5基因的表達載體pOPE51-8E5的示意圖。圖4為本發明的表達載體pOPE51-8E5轉化大腸桿菌JM109后經或不經IPTG誘導后的表達產物的SDS-PAGE電泳圖(A)和相應的蛋白質印跡分析圖(B)。圖中，1道為未誘導的轉化子總蛋白，2道為100μMIPTG誘導的轉化子總蛋白，3道為未誘導的轉化子的壁膜間蛋白，4道為20μMIPTG誘導的轉化子的壁膜間蛋白，5道為未誘導的轉化子包涵體蛋白，6道為100μMIPTG誘導的轉化子包涵體蛋白。以下將參照實施例和附圖對本發明作進一步的描述，但并非限制本發明。實施例1抗人纖維蛋白單克隆抗體重鏈可變區基因VH-8E5及輕鏈可變區基因VK-8E5的分離1、細胞系和載體雜交瘤細胞系8E5由林漢教授提供(中國醫學科學院放射醫學研究所)。8E5細胞來源于人纖維蛋白β鏈N端7肽免疫小鼠，能分泌抗人纖維蛋白單克隆抗體，可用于免疫球蛋白可變區基因分離。基因克隆中間載體pUC18及基因分離過程中所需的Taq聚合酶、DNA聚合酶、限制性內切酶及化學試劑均購自Gibco公司。表達載體pOPE51-215由Dubel博士提供(德國腫瘤研究中心)。這個載體帶有lac啟動子和果膠酶先導序列，調控其下游的抗果蠅melanogasterRNA聚合酶II小鼠單克隆抗體scFv的表達，其3′末端的c-myc短肽密碼子可作為表達產物的標記，5個組氨酸密碼子用于表達產物的純化(KipriyanovSM等人，分子免疫學，1994，311047-1058)。2、重鏈可變區和輕鏈可變區cDNA克隆和序列分析克隆策略如圖2所示，采用常規的硫氰酸胍提取和氯化銫離心方法(分子克隆實驗手冊，第2版)從107個8E5雜交瘤細胞制備總RNA，再用oligo-dT柱分離mRNA作為模板，用oligo-dT引物和逆轉錄酶制備第一鏈cDNA后，通過聚合酶鏈式反應(PCR)獲得免疫球蛋白重鏈可變區cDNA。為了擴增gamma重鏈可變區cDNA，設計使用VH-5′引物(5′AGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTG)和VH-3′引物(5′TGGATAGACAAGCTTGGGTGTCGTTTTGGC)。PCR擴增進行于100μl反應系統，其中有第一鏈cDNA20-25ng，上述引物各25pmol，dNTPs各200μM，和1單位TaqDNA聚合酶。用Hybaid控溫儀(英國Hook公司)改變溫度，95℃變性1分鐘，50℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，經過25個循環獲得擴增產物。PCR產物經瓊脂糖電泳鑒定，檢出380bp左右的擴增帶，如圖1所示。擴增產物經瓊脂糖電泳純化后用DNA聚合酶Klenow大片段補平，插入經SmaI酶消化和脫磷酸的中間載體pUC18中，得到的載體命名為pUC18VH，用其轉化大腸桿菌JM109，在LB培養基中用XGal和異丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)篩選白色陽性菌落。取單菌落擴增后提取重組質粒pUC18VH，酶切后瓊脂糖電泳鑒定。為了DNA序列分析，選取鑒定無誤的陽性克隆，擴增后提取質粒DNA，用SmaI切下VH基因片段并用DNA聚合酶Klenow大片段補平，再插入測序載體M13mp19的SmaI切點，轉化大腸桿菌JM109，再用XGal和IPTG篩選。取陽性單個菌落擴增，離心沉淀細菌，收集上清提取單鏈DNA，用熒光素標記的雙脫氧核苷酸和Taq酶測序試劑盒(美國ABI公司)在ABI370A型序列儀(美國ABI公司)上作DNA序列分析。根據DNA序列分析結果，選出框架正確的VHcDNA克隆，該克隆被命名為VH-8E5，其序列如序列表的SEQIDNO.1所示。將VH-8E5的DNA序列與Kabatdatabase資料庫中的DNA序列比較，檢索了47670個DNA序列，從中選出4189個重鏈可變區DNA作逐個堿基比較，結果證明VH-8E5屬Gamma重鏈，包括可變區，D區，J區和恒定區起始段共375bp，與資料庫中的許多VHDNA序列高度同源，但沒有一個完全相同。本發明的輕鏈可變區基因的分離是使用相同的雜交瘤細胞系8E5并采用相同的RT-PCR方法，該基因被命名為VK-8E5，不同的是為擴增輕鏈可變區基因所設計的引物對為VK-5’引物5’GAAGCACGCGTAGATATCG(T)TGA(C)TC(G)ACCCAG(A)TCTCCAVK-3’引物5’GAAGATGGATCCAGCGGCCGCAGCATCAGC本發明的VK-8E5經序列分析表明，其具有SEQIDNO.2所述的核苷酸序列，全長為366bp，其中在SEQIDNO.2的序列的第70-120位核苷酸、第166-186位核苷酸和第283-309位核苷酸為三個互補決定區。將此基因序列與Kabatdatabase資料庫中的DNA序列比較，發現與資料庫中的許多VKDNA序列高度同源，但沒有一個完全相同。實施例2VH和VKcDNA的重組根據實施例1的DNA序列分析結果，選出框架結構正確的VH和VKcDNA克隆提取質粒DNA，用pVUII和HindIII切下VH片段，用EcoRV和BamH1切下VK片段，瓊脂糖電泳純化后分兩步插入經同樣內切酶消化和脫磷酸的表達載體pOPE51-215，構建成重組表達載體pOPE51-8E5，用于表達抗人纖維蛋白單鏈小抗體scFv。重組表達載體pOPE51-8E5的結構示意圖如圖3所示。實施例3單鏈抗體scFv-8E5的表達和純化用實施例2得到的pOPE51-gE5質粒DNA轉化大腸桿菌JM109，轉化子在LB培養液中擴增，分別用濃度為20μM和100μM的IPTG誘導表達3小時后收集菌體。20μMIPTG誘導組的菌體在破壁緩沖液(50μMTris-HCl，1mMEDTA和20％蔗糖，pH8.0)中冰浴1小時，30000g離心40分鐘，收集上清液中的可溶性蛋白，經透析后用IMAC柱純化(Dubel等人，CellBiophy.1992，2169-79)。IMAC柱上的鎳離子能與表達產物末端的組氨酸結合，通過親和層析一步純化。100μMIPTG誘導組的菌體需超聲破碎，30000g離心30分鐘，收集沉淀，用6M鹽酸胍溶解包涵體，30000g離心1小時，收集表達產物即單鏈抗體scFv-8E5用于分析。將收集的純化產物樣品與對照樣品(未誘導的轉化子的總蛋白、壁膜間蛋白以及包涵體蛋白)經透析和濃縮后用12％聚丙烯酰胺還原膠作電泳，考馬斯亮蘭染色后用激光掃描儀分析電泳區帶的蛋白含量。同樣的SDS-PAGE膠經電轉移把蛋白帶轉移到醋酸纖維薄膜上，用于Western雜交。基于表達產物末端的c-myc短肽，用抗c-myc單克隆抗體9E10為一抗，辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠血清為二抗，與底物二氨基聯苯反應后顯色。SDS-PAGE電泳和Western印跡分析的結果如圖4所示，由圖4可以看出，轉化子經用20μMIPTG誘導表達，細菌壁膜間的可溶性蛋白在SDS-PAGE膠上顯示出約30KDa表達帶，其蛋白含量占壁膜間蛋白的7.3％，純化后成為SDS-PAGE膠上的主帶。Western印跡結果證明這個30KDa條帶為表達產物，即所表達的單鏈抗體scFv-8E5的分子量約為30KDa。100μMIPTG誘導表達后產量明顯增高，激光掃描結果證明30KDa帶占細菌總蛋白的28.9％，但多數形成不溶解的包涵體。經過離心回收的包涵體中含有表達產物54％。實施例4單鏈抗體的的抗原識別特異性分析用改進的酶聯免疫反應(ELISA)觀察實施例3制備的純化scFv-gE5的抗原識別特異性。為了制備抗原，用纖維蛋白原包被96孔板(美國Nune公司)，37℃烤干后用15％小牛血清DMEM培養液(Gibco)活化，形成均勻的纖維蛋白薄層，經0.2％明膠封閉和洗凈后加入不同稀釋度的scFv待測樣品。用抗c-myc單克隆抗體9E10為一級抗體，辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠血清為二級抗體，二氨基聯苯胺為底物，進行ELISA測試。用酶標儀(Bio-Rad)檢測492nm的顏色反應強度。能與抗原結合的scFv將被固定在孔中，通過ELISA進行顯色反應。ELISA檢測以8E5全抗體為陽性對照，4次檢測結果的平均OD數為1.435。陰性對照組用無關抗體，4次檢測的平均OD數為0.011。2批表達產物不同濃度的重復檢測結果證明所分離的VH和VK基因重組后的表達產物scFv-8E5有特異性抗原結合能力，結果見下表1。表1重組單鏈抗體scFv的抗原結合特異性</tables>序列表SEQIDNO.1序列長度375bp鏈型單鏈分子型cDNA特征第85-99位核苷酸、第142-192位核苷酸和第289-321位核苷酸為三個互補決定區來源人CAGCTGCAGCAG12QLQQ____VH-5′引物________TCTGGAGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGC60SGAELVKPGASVKMSCCDR1AAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAACTATTGGATGCACTGGGTGAAG108KASGYTFTNYWMHWVKCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATCGGAACGATTGATCCTGCA156QRPGQGLEWIGTIDPACDR2GATAGTTATACTAGTTACAATCAAAACTTCAAGGACAAGGCCACATTG204DSYTSYNQNFKDKATLACTGTAGACAAACCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTG252TVDKPSSTAYMQLSSLACATTTGGGGACTCTGCGGTCTATTTTTGTGCAAGAGAGGGGGTCTAC300TFGDSAVYFCAREGVYCDR3TATAGATACTACTTTGACTACTGGGGCCACGGCACCACTCTCACAGTC348YRYYFDYWGHGTTLTV_________VH-3′引物________TCCTCAGCCAAAACGACACCCAAGCTT375SSAKTTPKLSEQIDNO.2序列長度366bp鏈型單鏈分子型cDNA特征第70-120位核苷酸、第166-186位核苷酸和第283-309位核苷酸為三個互補決定區來源人_______VK-5′引物_______________GATATCGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGGCTATG39DIVLTQSPSSLAMCDR1TCAGTAGGACAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTT87SVGQKVTMSCKSSQSLTTAAATAGTAGCAATCAAAAGAACTATTTGGCCTGGTACCAGCAGAAA135LNSSNQKNYLAWYQQKCDR2CCAGGACAGTCTCCTAAACTTCTGGTATACTTTGCATCCACTAGGGAA183PGQSPKLLVYFASTRETCTGGGGTCCCTGATCGCTTCATAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTC231SGVPDRFIGSGSGTDFACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGATTACTTC279TLTISSVQAEDLADYFCDR3TGTCAGCAACATTATAGCACTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACAAAG327CQQHYSTPLTFGAGTK________VK-3′引物_____________CTGGAGCTGAAACGGGCTGATGCTGCGGCCGCTGGATCC366LELKRADAAAAGS權利要求1.一種抗人纖維蛋白單克隆抗體重鏈可變區基因，其與輕鏈可變區基因重組后可表達特異性識別和結合人纖維蛋白的抗體，所述的基因具有SEQIDNO.1的序列，其特征在于在SEQIDNO.1的DNA序列的第85-99位核苷酸、第142-192位核苷酸和第289-321位核苷酸為三個特異性結合人纖維蛋白所需的互補決定區。2.一種由權利要求1所述的抗人纖維蛋白單克隆抗體重鏈可變區基因編碼的多肽產物。3.一種抗人纖維蛋白單克隆抗體輕鏈可變區基因，其與重鏈可變區基因重組后可表達特異性識別和結合人纖維蛋白的抗體，所述的基因具有SEQIDNO.2的序列，其特征在于在SEQIDNO.2的DNA序列的第70-120位核苷酸、第166-186位核苷酸和第283-309位核苷酸為三個特異性結合人纖維蛋白所需的互補決定區。4.一種由權利要求3所述的抗人纖維蛋白單克隆抗體輕鏈可變區基因編碼的多肽產物。5.一種表達載體，其含有權利要求1所述的抗人纖維蛋白單克隆抗體重鏈可變區基因以及權利要求3所述的抗人纖維蛋白單克隆抗體輕鏈可變區基因。6.如權利要求5所述的表達載體，其為pOPE51-8E5。7.如權利要求5或6所述的表達載體的表達產物。8.如權利要求1所述的抗人纖維蛋白單克隆抗體重鏈可變區基因和權利要求3所述的抗人纖維蛋白單克隆抗體輕鏈可變區基因在制備血栓定位診斷試劑和溶血栓藥物中的應用。全文摘要本發明公開了抗人纖維蛋白單克隆抗體重鏈可變區基因和輕鏈可變區基因,由所述基因編碼的多肽,含有所述基因的載體及所述的基因在制備血栓定位診斷試劑和溶血栓藥物中的應用。文檔編號A61P7/02GK1195701SQ9710375公開日1998年10月14日申請日期1997年4月8日優先權日1997年4月8日發明者宋增璇申請人:中國醫學科學院血液學研究所