專利名稱：重組人肝細胞生成素的生產(chǎn)方法及其治療嚴重肝病的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程產(chǎn)品的生產(chǎn)方法及用途領(lǐng)域，更具體地說為一種重組人肝細胞生成素(rHPO)的生產(chǎn)方法及產(chǎn)品在臨床上的治療作用。
肝臟是機體具有強大再生能力的臟器，有關(guān)其調(diào)控機理的研究國際上已進行百余年，但目前已知的肝再生相關(guān)生長因子如肝細胞生長因子(HGF)，轉(zhuǎn)化生長因子-α(TGF-α)等，其作用均缺乏肝特異性，難以解釋具有器官特異性的肝再生調(diào)控機理，因此，尋找新型肝再生調(diào)控因子一直是該領(lǐng)域的熱點。1975年，LaBrecque等首先報道大鼠再生肝組織中含有一種具熱穩(wěn)定性的促肝增殖因子。80年代中期，我們在人胎肝組織中也發(fā)現(xiàn)同類因子，并對其生物活性、理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)純化及臨床應用進行了系統(tǒng)研究。由于此類因子應用臨床治療嚴重肝病取得較好療效，因而倍受重視，國內(nèi)外多家實驗室一直致力于此類因子的分子克隆。1995年，我們利用功能篩選法從人胎肝cDNA文庫中分離到人肝細胞生長素cDNA，完成其核苷酸序列測定并通過構(gòu)建真核、原核表達質(zhì)粒，對其生物學活性進行了研究，證實該基因表達產(chǎn)物在體內(nèi)能刺激肝細胞增殖，并于1996年3月申請中國發(fā)明專利，申請?zhí)枮?6103203.0。但至今尚未見國內(nèi)外有關(guān)人肝細胞生成素高效表達及獲取重組人肝細胞生成素的系統(tǒng)工藝報道。近年，國內(nèi)在臨床上應用從乳豬肝、新生小牛肝提取的促肝細胞增殖活性因子治療嚴重肝病，取得滿意療效，但受材料來源、產(chǎn)品純度、種族差異等限制，其應用受到較大限制。重組人肝細胞生成素的生產(chǎn)克服了這些限制，有望為臨床提供有效的治療嚴重肝病的藥物。
本發(fā)明的目的是通過原核表達、純化獲取具有生物活性的重組人肝細胞生成素及用于臨床上治療嚴重肝病。
本發(fā)明其主要內(nèi)容是在獲取人肝細胞生成素cDNA并成功構(gòu)建高效表達菌株的基礎(chǔ)上，建立了一整套工程菌誘導表達、包涵體的分離和裂解、蛋白質(zhì)純化和復性工藝，以獲得重組人肝細胞生成素純品，并對重組人肝細胞生成素的生物學性能進行了描述，表明重組人肝細胞生成素有在臨床上治療嚴重肝病的用途。
本發(fā)明在自行克隆人肝細胞生成素cDNA并成功構(gòu)建高效表達菌株的基礎(chǔ)上；建立并優(yōu)化了一整套工程菌發(fā)酵、包涵體的分離和裂解、蛋白質(zhì)純化和復性工藝，其特征為1)對工程菌低密度發(fā)酵，其最佳誘導表達時間為細胞密度OD600＝0.3-0.4；2)包涵體變性劑是8M尿素或用0.05mol/L NH4AC緩沖液配制的含1％巰基乙醇的7mol/L鹽酸胍；3)采用復性溶液(2mol/L尿素、0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽、1mmol/L還原型谷胱甘肽、100mmol/L Tris-HCl pH8.0)或稀釋復性溶液(100mmol/L尿素、0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽、1mmol/L還原型谷胱甘肽、100mmol/L Tris-HCl pH8.0)進行復性；4)柱層析純化可采用復性蛋白的柱層析純化或包涵體在變性條件下進行柱層析純化，其流程如圖3；其中sp-FF柱上樣后乙酸鈉緩沖液洗脫未結(jié)合相、用300mmol/LNacl階段洗脫rHPO在第一峰；DEAE-Sepharose FF(Pharmacia)陰離子交換柱用50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)緩沖液洗脫未結(jié)合相。用350mmol/L NaCl階段洗脫，rHPO在第一峰；5)柱層析純化可采用包涵體在變性條件下進行柱層析純化，其流程如圖4；其中AcA44凝腔過濾柱層析上樣后用2mol/L鹽酸胍洗脫，rHPO在第二峰中；MONO Q離子交換層析上樣后用0.05mol/L NaCl(0.05mol/L NH4Ac配制)將rHPO洗脫下來，rHPO在主峰中；通過該方法獲得人肝細胞生成素純品，純度達99％，其N-端氨基酸序列(圖2)測定與依據(jù)核苷酸序列推導的氨基酸序列(圖1)一致；人肝細胞生成素等電點為7.2，分子量為15280道爾頓；在體外能促進原代培養(yǎng)肝細胞及肝癌細胞的增殖，在體內(nèi)能促進CCL4致?lián)p肝細胞DNA合成，并能顯著提高CCL4誘導肝功能衰竭大鼠存活率，因而提示重組人肝細胞生成素能應用臨床治療嚴重肝病。
結(jié)合
本發(fā)明的具體實施方法如下圖1為依據(jù)核苷酸序列推導的rHPO氨基酸序列圖2為測定的人rHPO N-端氨基酸序列圖3為本發(fā)明的工藝流程4為本發(fā)明實施例二的工藝流程圖5為工程菌誘導表達水平的SDS-PAGE檢測結(jié)果圖6為rHPO純化產(chǎn)物SDS-PAGE結(jié)果圖中從左至右分別為蛋白標準、全菌裂解液、純化HPO實施例一一、本實施例的技術(shù)要點1.細菌發(fā)酵為低密度高表達2.包涵體變性劑為尿素3.包涵體復性后再進行柱層析純化(兩步法)4.包涵體變性條件下進行柱層析純化(一步法)二、實施例實驗操作步驟(圖3)1.工程菌種重組pBV-rHPO-1/JM109本室構(gòu)建。從4℃保存的工程菌平皿中挑取單菌落接種于5ml LB培養(yǎng)液試管中(含氨芐青霉素100ug/ml)，30℃、200轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)12小時后，按5％比例接種于搖瓶中(含氨芐青霉素100ug/ml)30℃、200轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)12小時后可作為種子液。
2.發(fā)酵 以2％濃度將種子液接種于500ml LB培養(yǎng)液中(含氨芐青霉素100ug/ml，pH7.2)，30℃、200轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)3-5小時。待其菌密度達到OD600＝0.3-0.4時，迅速升高溫度至42℃誘導表達5小時。離心收集細菌、電泳鑒定目的蛋白表達含量。濕菌收獲量約5g/L。5升發(fā)酵罐發(fā)酵條件為通氣量2L/min，溶解氧50％(DO調(diào)節(jié))，攪拌速度300-600轉(zhuǎn)/分，每次LB培養(yǎng)液(含氨芐青霉素100ug/ml，pH7.2)投料量4升。種子液濃度2％，生長溫度30℃，待其菌密度達到OD600＝0.3-0.4時，升高溫度至42℃誘導表達5小時。離心收集細菌、電泳鑒定目的蛋白表達含量(圖5)。濕菌收獲量約5g/L。
3.細菌細胞裂解4℃ 3,000rpm離心30分鐘，棄去上清。稱量細菌濕重量，按10g菌/100ml的濃度加裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA，1mg/ml)溶菌酶，0℃作用30分鐘。然后冰浴超聲30-45秒，間歇2分鐘，共超聲三次。超聲完畢，4℃ 8,000rpm離心30分鐘，棄去上清，收集包涵體。以100mmol/L Tris-HClpH8.0洗滌一次。
4.包涵體洗滌和純化(1)以0.5％ Triton X-100(100mmol/L Tris-HCl pH8.0配制)重懸沉淀(20g/100ml)，室溫攪拌40分鐘。10,000rpm，離心30分鐘，棄去上清。沉淀用100mmol/L Tris-HCl pH8.0洗滌一次，稱重；(2)以2mol/L NaCl(100mmol/L Tri-HCl pH8.0配制)重懸步驟(1)沉淀(20g/100ml)，室溫攪拌120分鐘，10,000rpm，離心30分鐘，棄去上清。沉淀用100mmol/L Tris-HCl pH8.0洗滌一次，稱重；(3)以4mol/L尿素(100mmol/L Tris-HCl pH8.0配制)重懸步驟(2)沉淀(20g/100ml)，室溫攪拌40分鐘。10,000rpm，離心30分鐘，棄去上清。沉淀用100mmol/L Tris-HClpH8.0洗滌一次，稱重。
5.包涵體裂解采用8mol/L尿素裂解已純化的包涵體。8mol/L尿素(100mmol/L Tris-HClpH8.0配制)，0.5-1％巰基乙醇重懸純化的包涵體(20-30g/100ml)，室溫攪拌過夜。10,000rpm離心30分鐘，上清即為包涵體裂解溶液，溶液應為清亮透明、淡黃色。沉淀可用8mol/L尿素再萃取一次。
6.包涵體復性(1)2mol/L尿素復性步驟5，包涵體裂解液，用100mmol/L Tris，pH8.0，將尿素由8mol/L稀釋至2mol/L，同時調(diào)節(jié)總蛋白量不超過500ug/ml。并在此復性體系中加入終濃度0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽和終濃度1mmol/L還原型谷胱甘肽。4℃復性8-10小時。復性后溶液應清亮透明無沉淀。用100mmol/L Tris-HClpH8.0緩沖液(含氧化還原體系)多次透析除去尿素，每次尿素濃度降低25％。
(2)稀釋復性方法 將變性蛋白液逐滴加入復性溶液中(100mol/L尿素、0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽、1mmol/L還原型谷胱甘肽、100mmol/L Tris-HClpH8.0)。總蛋白量不超過1mg/mg充分復性后，離心去除沉淀，經(jīng)Millipore濃縮儀(分子量截留5000)濃縮，再經(jīng)100mmol/L Tris-HCl pH8.0緩)中液充分透析，去除殘留尿素。
7.復性蛋白的柱層析純化(1)強陽離子交換層析結(jié)合分子篩層析法 選用丙磺基-瓊脂糖強陽離子快流速交換柱(SP-FF Pharmacia)。用pH5.5 50mmol/L乙酸鈉緩沖液平衡SP-FF柱(2.620cm)。包涵體復性液在乙酸鈉緩沖液中充分透析后上樣。每次上樣10ml(1mg/ml)。乙酸鈉緩沖液洗脫未結(jié)合相。用300mmol/L NaCl階段洗脫，280nm檢測洗脫蛋白峰，SDS-PAGE鑒定各峰蛋白分布情況，rHPO在第一峰。將以上第一峰樣品用50mmol/L Tris-HCl pH8.0充分透析除去NaCl后上樣于50mmol/L Tris-HCl pH8.0平衡的Sephacryl S-100快速柱(802.6cm)，280nm檢測洗脫蛋白峰，SDS-PAGE鑒定各峰蛋白分布情況。rhHPO在主峰中。
(2)陰離子交換層析結(jié)合分子篩層析法 選用DEAE-Sepharose FF(Pharmacia)陰離子交換柱。柱先用50mmol/L Tris-HCl pH8.0流洗平衡。包涵體復性液直接上樣，上樣濃度1mg/ml，體積15ml。50mmol/L Tris-HClpH8.0緩沖液洗脫未結(jié)合相。用350mmol/L NaCl階段洗脫，280nm檢測洗脫蛋白峰，SDS-PAGE鑒定各峰蛋白分布情況，rHPO-I在第一峰。
將以上第一峰樣品用50mmol/L Tris-HCl pH8.0充分透析除去NaCl后上樣于50mmol/L Tris-HCl pH8.0平衡的Sephacryl S-100快速柱(802.6cm)，280nm檢測洗脫蛋白峰，SDS-PAGE鑒定各峰蛋白分布情況。rHPO在最后主峰中。
(3)包涵體裂解液在變性狀態(tài)下的分子篩層析法Sephacryl S-100快速柱(802.6cm)。8mol/L尿素變性包涵體樣品直接上樣于經(jīng)8mol/L尿素(100mM Tris-HCl pH8.0)平衡后的柱。280nm檢測洗脫蛋白峰，SDS-PAGE鑒定各峰蛋白分布情況，r HPO在最后峰。
實施例二.
一、本實施例的技術(shù)要點1.細菌發(fā)酵為低密度高表達2.包涵體變性劑為鹽酸胍3.包涵體在變性條件下進行柱層析純化，目的蛋白復性后再進行第二步柱層析純化二.本實施例實驗操作步驟(圖4)1.細菌發(fā)酵 與實施例1相同2.細菌細胞裂解 與實施例1相同3.包涵體洗滌和純化 與實施例1相同4.包涵體裂解 洗滌后的包涵體用0.05mol/L NH4Ac緩沖液配制的含1％巰基乙醇的7mol/L鹽酸胍裂解，8,000rpm離心10分鐘，回收裂解上清，將此上清用于下述純化。
5.AcA44凝膠過濾柱層析 用2mol/L鹽酸胍(0.05mol/L NH4Ac配制)平衡的AcA44凝膠過濾柱(1.6×80cm)。將步驟4裂解上清 上此凝膠柱，每次上樣量為3ml。然后用2mol/L鹽酸胍洗脫，280nm檢測洗脫蛋白峰。SDS-PAGE檢查各峰中的蛋白，rHPD在第二峰中。
6.rHPO的復性 將步驟5得到的rHPO樣品，用2mol/L鹽酸胍調(diào)至蛋白濃度低于500ug/ml，然后用0.05mol/L NH4Ac作10倍稀釋，并向稀釋后的樣品溶液中加還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽，使其終濃度分別為1mmol/L和0.2mmol/L。稀釋后的樣品置4℃的層析柜中過夜。此日，將此稀釋樣品對0.05mol/L NH4Ac充分透析。然后將透析后的樣品離心，上清即為復性后的rHPO樣品。
7.MONO Q離子交換層析 將復性后的rHPO樣品流經(jīng)0.05mol/L NH4Ac平衡的Q Sepharose Fast Flow陰離子交換柱(1.6×10cm)，用同樣的緩沖液洗脫未結(jié)合蛋白。再用0.05mol/L NaCl(0.05mol/L NH4Ac配制)將rHPO洗脫下來。經(jīng)SDS-PAGE鑒定rHPO在主峰中。rHPO純化產(chǎn)物SDS-PAGE結(jié)果見圖6。測定的人肝細胞生成素N- 端氨基酸序列見圖2。等電點為7.2，分子量為15280道爾頓。實施例三一、本實施例的技術(shù)要點1.rHPO促原代培養(yǎng)肝細胞及HTC肝癌細胞DNA合成2.rHPO體內(nèi)促肝細胞DNA合成二、本實施例實驗操作步驟1.體內(nèi)促肝細胞增殖活性測定 以原代肝細胞及HTC肝癌細胞為體外生物活性檢測靶細胞。肝細胞的分離采用Seglaen的方法。Wistar大鼠禁食過夜，自由飲水。早900-1100行手術(shù)分離肝細胞。用0.4％戊巴比妥腹腔給藥麻醉，75％酒精浸泡全身，通過肝門靜脈用無鈣PBS罐流5分鐘，改用事先預熱37℃的0.06％膠原酶液，以10ml/min的速度罐流，同時將肝與周圍組織分離，移至平皿繼續(xù)罐流，剝離肝包膜，輕輕抖落肝實質(zhì)部分，去除血管、脂肪后，過200目銅網(wǎng)及紗布過濾細胞，用PBS沖洗三次。調(diào)整細胞濃度6×106/ml，取100ul接種96孔培養(yǎng)板，以含5％胎牛血清的1640培培養(yǎng)液于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)12h，加入純化的rHPO(濃度4-10ug/ml)。同時以胰島素、人胎肝肝臟刺激物為陽性對照，JM109轉(zhuǎn)染PBV220空質(zhì)粒全菌裂解液(4-10ug/ml)為對照。連續(xù)培養(yǎng)24h每孔加入1.85×104Bq3H-TdR。3h后胰蛋白酶消化，收集細胞并進行液閃計數(shù)。刺激活性以刺激指數(shù)表示。刺激指數(shù)＝實驗組cpm/至白組cpm。
取HTC細胞懸液(4×105/ml)100ul，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，以含5％小牛血清的1640培養(yǎng)液在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)6h后，加入待測樣品(每樣四孔)，繼續(xù)培養(yǎng)20h，每孔加1.85×104Bq3H-TdR，3h后，收集細胞于濾紙，并進行液閃計數(shù)，活性以cpm值表示。結(jié)果表明提純rHPO在體外能促進原代培養(yǎng)大鼠肝細胞及HTC肝癌細胞DNA合成。
2.rHPO體內(nèi)促肝細胞DNA合成 采用大鼠1/3肝部分切除模型進行。按Higgins和Anderson介紹的方法建立鼠1/3肝葉切除模型。Wistar大白鼠行1/3肝葉切除術(shù)，術(shù)后立即腹腔注射rHPO(0.1mg/mI)1ml，同時設(shè)生理鹽水及荷空質(zhì)粒受體菌裂解液(0.1mg/ml)對照組；20h后按100u ci/kg體重腹腔注射3H-TdR，2h后，處死大鼠于肝固定部位取肝組織，按Morley(6)介紹的方法進行DNA提取及3H-TdR摻入計數(shù)，結(jié)果以cpm/ug DMA計算.結(jié)果表明rHPO在體內(nèi)能促進肝細胞增殖。實例四一、本實施例的技術(shù)要點rHPO抗肝損傷活性二、本實施例實驗操作步驟1.體外CCl4肝損傷模型的建立 按Seglaen介紹的原位灌注法分離Balb/c小鼠肝細胞。分離的細胞用含10％小牛血清，10-9mol/L胰島素及含青霉素，鏈霉素的1640培養(yǎng)液懸浮，按每孔100ul(細胞數(shù)3×104)接種于96孔細胞培養(yǎng)板，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)10小時后，換含5mM CCl4，10％小牛血清及不同濃度rHPO的1640培養(yǎng)液，分別于換液后不同時間進行LDH釋放實驗及細胞存活狀態(tài)觀察。
2.LDH釋放實驗 于換液后不同時間收集細胞培養(yǎng)上清，按Cytox96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay操作指南進行測定。
LDH釋放率＝實際釋放數(shù)-自然釋放數(shù)/最大釋放數(shù)-自然釋放數(shù)3.細胞存活狀況 采用MTS法評價肝細胞存活狀況。每組4孔，共三次實驗，用酶聯(lián)檢測儀檢測各孔490nm OD值。
4.體內(nèi)肝損傷模型的建立首先進行預實驗，依據(jù)病死率、病理改變等確定4ml/kg(1體積CCl4∶1體積豆油)為最佳致死劑量，2ml/kg為最佳致傷劑量。取40只小鼠分別一次性每只腹腔注射CCl4(4ml/kg)，4h后隨機分組，每組20只，治療組每12小時腹腔注射rHPO 40ug，同時設(shè)生理鹽水對照組，每日記錄動物死亡情況，存活超過96h計為存活動物。共進行3批實驗，以觀察rHPO對CCl4中毒肝衰竭動物的救治作用。
取18只小鼠，按2ml/Kg腹腔注射CCl4，4小時后隨機分為3組，1組靜脈注射rHPO 10ug；2組靜脈注射rHPO 40ug； 3組靜脈注射生理鹽水；每12小時注射一次，中毒后48小時，進行DNA增殖測定，同時取外周血清測定ALT、LDH水平；取肝組織進行病理學檢查。
5.DNA增殖測定 以5-氟尿嘧啶標記法進行肝細胞增殖檢測。主要過程最后一次注射rHPO后12小時，按1.0ml/Kg腹腔注射標記液，2小時后活殺動物，于肝固定部位取肝組織于甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟切片，二甲苯脫蠟，系列酒精脫水后，切片以PBS液洗滌三次，抗5-氟尿嘧啶單克隆抗體室溫孵育60分鐘，PBS洗滌二次，切片以過氧化物酶標記的鼠抗兔IgG室溫孵育30分鐘，洗滌三次后，顯色10min，脫水、透明、封片，顯微鏡下隨機挑出5個視野，計數(shù)陽性細胞。
6.病理學檢查 于肝右葉固定部位取肝組織置10％甲醛溶液，常規(guī)石蠟切片，病理檢查。
7.結(jié)果 為觀察rHPO在體外是否對CCl4損傷肝細胞有保護作用，我們在原代培養(yǎng)肝細胞體系中加入5mMol/L CCl4模擬體內(nèi)肝損傷情況，并選擇LDH釋放及肝細胞存活狀況為指標進行了觀察。如所示，rHPO對正常肝細胞LDH釋放無明顯影響，但具有明顯抑制CCl4誘導損傷的肝細胞LDH的釋放，這種作用在各個時間點均存在且具有劑量效應正相關(guān)。為較客觀評價CCl4致?lián)p后培養(yǎng)肝細胞的存活狀況，以MTS法檢測之。在含5Mol/L CCl4條件下，培養(yǎng)24h后細胞存活數(shù)明顯下降，但rHPO組存活數(shù)均高于對照組(p＜0.05)。
以4ml/Kg劑量CCl4，成功誘導小鼠發(fā)生肝功能衰竭，生理鹽水組存活率為10％，rHPO治療組為30％，兩組差別顯著(p＜0.01)；以2ml/Kg劑量CCl4誘導小鼠發(fā)生實驗性肝炎，并以rHPO(10ug、40ug)和生理鹽水進行治療，損傷后48h，兩組動物外周血ALT、LDH水平均明顯升高，但rHPO治療組水平較對照組降低，其中40ug組LDH水平降低34％，ALT水平降低38.3％；光鏡下病理學檢查顯示未治療組肝細胞廣泛腫脹、變性，中央靜脈周圍可見多處壞死，10ug治療組與未治療組比較無明顯差別，但40ug治療組變性及壞死均較未治療組明顯減輕；免疫組化檢測CCl4誘導肝損傷后肝細胞DNA合成狀況。表明rHPO-I具有促進DNA合成的作用，其中10ug組標記細胞較對照增加1.7倍，40ug組增加4.7倍。表明rHPO具有阻止肝細胞壞死，促進肝細胞再生的作用。
總之，本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)rHPO的方法，包括工程菌誘導表達、包涵體的分離和裂解、蛋白質(zhì)純化和復性等系列工藝，并提供了生產(chǎn)產(chǎn)物的理化性質(zhì)、生物活性檢測方法。
本發(fā)明的純化產(chǎn)物可做為一種抗原，用于免疫動物以制備相應抗體，也可作為一種試劑，用于固體組織、液體標本的檢測；該產(chǎn)品還可望應用臨床治療嚴重肝病(如急性肝功能衰竭)。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)重組人肝細胞生成素(rHPO，原名肝增殖素)的生產(chǎn)方法及其治療嚴重肝病的用途，包括工程菌發(fā)酵、包涵體的分離裂解、蛋白質(zhì)純化和復性工藝及表達產(chǎn)物的生物活性；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征為對工程菌低密度發(fā)酵，其最佳誘導表達時間為細胞密度OD600＝0.3-0.4時。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征為包涵體變性劑可以是用0.1MTris，pH8.0緩沖液配制的8M尿素或用0.05mol/L NH4AC緩沖液配制的含1％巰基乙醇的7mol/L鹽酸胍。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征為采用復性溶液，其組份可以為2mol/L尿素、0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽、1mmol/L還原型谷胱甘肽、100mmol/L Tris-HCl pH8.0或稀釋復性溶液，其組份可以為100mmol/L尿素、0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽、1mol/L還原型谷胱甘肽、100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征為柱層析純化可采用復性蛋白的柱層析純化，其流程如圖3，其中SP-FF陽離子交換柱上樣后乙酸鈉緩沖液洗脫未結(jié)合相，用300mmol/L NaCl階段洗脫，rHPO在第一峰；DEAE-Sepharose FF(Pharmacia)陰離子交換柱用50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)緩沖液洗脫未結(jié)合相，用350mmol/L NaCl階段洗脫，rHPO在第一峰。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征為柱層析純化可采用包涵體在變性條件下進行柱層析純化，其流程如圖4；其中AcA44凝膠過濾柱層析上樣后用2mol/L鹽酸胍洗脫，rHPO在第二峰中；MONO Q離子交換層析上樣后用0.05mol/LNaCl(0.05mol/L NH4Ac配制)將rHPO洗脫下來，rHPO在主峰中。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，生產(chǎn)的rHPO具有以下生物學特性具有附圖1氨基酸序列；等電點為7.2，分子量為15280道爾頓；在體外能促進原代培養(yǎng)肝細胞及肝癌細胞的增殖，在體內(nèi)能促進1/3肝部分切除后及CCl4致?lián)p后大鼠肝細胞DNA合成，并能顯著提高CCCL4誘導肝功能衰竭大鼠存活率。
全文摘要
本發(fā)明為重組人肝細胞生成素(rHPO)的生產(chǎn)方法及其治療嚴重肝病的用途;屬生物產(chǎn)品生產(chǎn)方法及用途領(lǐng)域。在獲取hHPOcDNA并成功構(gòu)建高效表達菌株的基礎(chǔ)上,建立了一整套工程菌誘導表達、包涵體的分離和裂解、蛋白質(zhì)純化和復性工藝,以獲得重組人肝細胞生成素純品;其生物特征為等電點7.2,分子量15280道爾頓;在體外能促進原代培養(yǎng)肝細胞及肝癌細胞的增殖,在體內(nèi)能促進1/3肝部分切除后及CCl
文檔編號A61K38/16GK1194308SQ9710193
公開日1998年9月30日 申請日期1997年3月21日 優(yōu)先權(quán)日1997年3月21日
發(fā)明者賀福初, 楊曉明, 何浩, 王清明, 魏漢東, 李志紅, 陳惠鵬, 吳祖澤 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所