光固化交聯透明質酸凝膠及其制備方法

專利名稱：光固化交聯透明質酸凝膠及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種生物相容的光固化交聯透明質酸凝膠，它是一種具有特殊物理性能的水凝膠，以及其制備方法和作為生物醫學材料的應用。
背景技術：
透明質酸存在于動物組織內，具有生物相容性和生物降解能力。關于物理性能，它具有諸如吸水性能高等優良性能，還有其水溶液具有高粘性。
水凝膠由下述方法得到化學改性透明質酸；采用某些方法使改性的透明質酸交聯，形成網格結構；以及把含水介質如水加到網絡結構中。水凝膠呈現粘彈性和粘性。
交聯透明質酸表觀上形成了大分子，而與成鍵方式無關。交聯透明質酸的生物降解能力可以通過調節交聯度控制。
有各種交聯方式。例如已知使用疏水鍵合或離子結合的交聯方式，通過引入親核試劑使透明質酸交聯[JP-W-3-502704，(相當美國專利4937270)，本文用語“JP-W”意指未審查的已公開的國際專利申請]，通過使透明質酸酯化借助于疏水鍵合交聯(美國專利4851521)，通過多價離子借助于離子鍵合交聯(歐洲專利0507604A2)。因為與共價鍵比較，它們是通過弱鍵合力交聯的，所以對外界變化的影響敏感，例如pH，離子強度和溫度等。另外，當將它們用作生物醫學材料時，在生物體內的保持能力低，還有也難以控制其在體內的保持能力于適當水平以“保持透明質酸對生物體的生理作用。
此外，還已知通過共價鍵合將透明質酸分子鍵合的交聯方式，借助于二乙烯基砜(divinglsulfone)交聯[JP-B-4-30691(相當于美國專利4582865)，本文用語“JP-B”意指已審查的日本專利出版物]，以及借助環氧化物的交聯[JP-W-61-502729(相當美國專利4,886,787)，JP-A-5-140201，本文用語“JP-A”意指未審查的已公開的日本專利申請]。然而，在這類交聯中所使用的交聯劑或交聯化合物是有毒的。還有，當將二乙烯基砜、環氧化物等引入透明質酸的同時通過交聯構成三維網絡結構，所形成的交聯透明質酸凝膠不溶于諸如水等溶劑。這樣進入網絡結構的未反應的低分子化合物就難于分離和脫除。
另一方面，還已知采用紫外線輻射進行光固化交聯反應使透明質酸交聯[JP-A-6-73102(相當美國專利5462976)，美國人工內臟學會志(ASAIO Journal)，38，M154～M157(1992)]。這種交聯方式的優點是，引入了光反應交聯基的光反應透明質酸衍生物在光固化交聯之前是水溶性的，同時未形成三維網絡結構，所以容易除去未反應的低分子化合物該光反應本身是一種在生成的光固化交聯透明質酸衍生物中不含未反應的低分子化合物的純凈反應(cleanreaction)；所產生的交聯結構由共價鍵形成，因此通過控制交聯度能夠容易地控制光固化交聯透明質酸衍生物的保持能力。
另外，當上述光固化交聯透明質酸衍生物是用來作諸如抗粘連材料的生物醫學材料時，已經研究類似薄膜狀的材料[美國人工內臟學會志，38，M154～M157(1992)]，但是難以預防在組織或器官的細小部位中的粘連。因此，需要一種能夠注入這種細小部位的可注入的光固化交聯透明質酸凝膠。
然而，本發明公開的光固化交聯透明質酸的水凝膠及其制備方法尚屬未知。
傳統交聯透明質酸水凝膠難以除去諸如未反應的低分子化合物等雜質，并且也難以控制水凝膠的物理性能。此外，制備具有目的物理性能水凝膠的條件也難以形成。

發明內容
本發明的第一個目的是，提供一種含有水介質的光固化交聯透明質酸凝膠，該凝膠由下述方法制得對引入光反應交聯基的光反應透明質酸衍生物進行紫外線輻射；使光反應相互交聯基二聚；形成環丁烷環，并借此形成網絡結構；以及提供易于制備上述凝膠的方法。
本發明的第二個目的是提供一種可注入的生物醫學材料，該材料包含一種安全性、生物相容性和生物降解能力均優良的光固化交聯透明質酸凝膠。
作為本發明者充分研究的結果，采用下述各項成功地達到了上述目的1)一種光固化交聯透明質酸凝膠，以頻率10赫茲下動態粘彈性表示，其儲能模量(G′)為50～1500帕，損耗模量(G″)為10～300帕，損失正切δ(G″/G′)為0.1～0.8；以及它是一種按下述方法制備的水凝膠，該方法包括對其中含化學鍵合到透明質酸官能基上的光反應交聯基的光反應透明質酸衍生物進行紫外線輻射，使光反應交聯基相互交聯；2)一種光固化交聯透明質酸凝膠，其交聯度為每摩爾透明質酸二糖成分單元的0.01～0.5％；以及它是一種按下述方法制備的水凝膠，該方法包括對其中含化學鍵合到透明質酸官能基上的光反應交聯基的光反應透明質酸衍生物進行紫外線輻射；3)按照上述1)或2)的光固化交聯透明質酸凝膠，其中所述的光反應交聯基，是一種含有間隔基的肉桂酸衍生物，并且是化學鍵合到透明質酸官能基上，從而提供所述的光反應透明質酸衍生物；使所述光反應透明質酸衍生物的所述光反應相互交聯基通過紫外線輻射二聚，形成環丁烷環，借此形成網絡結構；以及所述的凝膠是一種在所述網絡結構中含有水介質的水凝膠；4)按照上述3)的光固化交聯透明質酸凝膠，其中所述的間隔基是從氨基醇、氨基酸或肽衍生物的基團；5)按照上述3)或4)的光固化交聯透明質酸凝膠，其中所述光反應交聯基用如下通式(1)或(2)表示-NH(CR1R2)nOCOCH＝CH-Ph (1)式中R1和R2彼此獨立代表氫原子或低級烷基；Ph代表苯基；而n代表整數2～18；-A-NH-Ph-CH＝CHCOOR3(2)式中，R3代表低級烷基或芳烷基；A代表-(NHCR4R5CO)m-或-NH(CR4R5)hCO-；R4和R5彼比獨立代表氫原子或低級烷基；Ph代表對亞苯基；m代表整數1～6以及h代表整數1～18；6)按照上述1)～5)中任何一項的光固化交聯透明質酸凝膠，其中引入的所述光反應交聯基的比例為每摩爾二糖單元成分的0.05～10％；7)一種光固化交聯透明質酸凝膠，以頻率10赫茲下的動態粘彈性表示，其儲能模量(G′)為50～1500帕，損耗模量(G″)為10～300帕，損失正切δ(G″/G′)為0.1～0.8；以及它是一種按下述方法制備的水凝膠，該方法包括對其中含化學鍵合到透明質酸官能基上的光反應交聯基的光反應透明質酸衍生物進行紫外線輻射，使光反應相互交聯基交聯，以及然后對交聯產物進行熱處理；8)一種光固化交聯透明質酸凝膠，以頻率10赫茲下的動態粘彈性表示，其儲能模量(G′)為50～1500帕，損耗模量(G″)為10～300帕，損失正切δ(G″/G′)為0.1～0.8；以及它是一種按下述方法制備的水凝膠，該方法包括對其中含化學鍵合到透明質酸官能基上的光反應交聯基的光反應透明質酸衍生物進行熱處理；然后對加熱過的光反應透明質酸衍生物進行紫外線輻射，使光反應相互交聯基交聯；9)一種光固化交聯透明質酸凝膠，以頻率10赫茲下的動態粘彈性表示，其儲能模量(G′)為50～1500帕，損耗模量(G″)為10～300帕，損失正切δ(G″/G′)為0.1～0.8；以及它是一種按下述方法制備的水凝膠，該方法包括對其中含化學鍵合到透明質酸官能基上的光反應交聯基的光反應透明質酸衍生物進行熱處理；然后對加熱過的光反應透明質酸衍生物進行紫外線輻射，使光反應相互交聯基交聯，以及然后再對交聯產物進行熱處理；10)按照上述1)～9)中的任何一項的光固化交聯透明質酸凝膠，其中凝膠的內毒素含量為0.25EU/g(內毒素單位/克)或者更低；11)一種制備光固化交聯透明質酸凝膠的方法，包括對含有0.5～10％重量的光反應透明質酸衍生物的水介質溶液進行紫外線輻射，光反應透明質酸衍生物中，透明質酸的官能基上化學鍵合了光反應交聯基；和通過相互交聯基二聚，形成分子間和/或分子內交聯，得到網絡結構；12)按照上述11)制備光固化交聯透明質酸凝膠的方法，其中，在用紫外線輻射所述光反應透明質酸衍生物的水介質溶液之前和/或之后，對其進行熱處理；13)按照上述12)制備光固化交聯透明質酸凝膠的方法，其中，所述熱處理采用高壓蒸汽在100～125℃下進行5～30分鐘；14)一種生物醫學材料，它包含按照上述1)～10)中任何一項的光固化交聯透明質酸凝膠；15)按照上述14)的生物醫學材料，它具有抗粘連作用；16)一種生物醫學材料器材，它包含交聯透明質酸凝膠，和以可取出的形式裝有所述凝膠的容器；17)按照上述16)的生物醫學材料器材，其中，所述容器是能夠將所述凝膠排出以便注入的容器；18)一種生物醫學材料器材，它包含1)～10)中任何一項敘述的交聯透明質酸凝膠，和以可取出的形式裝有所述凝膠的容器；以及19)按照上述18)的生物醫學材料器材，其中所述容器是能夠將所述凝膠排出以便注入的容器。
附圖簡述

圖1表示在光反應透明質酸衍生物溶液中進行光固化交聯的基本原理。
圖2是光固化交聯透明質酸凝膠的DS(取代度)和吸水率關系圖。
實施本發明的最佳方案現將本發明詳細解釋如下。
本發明使用的術語“光固化交聯透明質酸衍生物”，作為一個概念，是用來包括一種用下述方法制備的衍生物，該方法包括對其中含有化學鍵合的光反應交聯基的光反應透明質酸衍生物進行紫外線輻射，以及使光反應相互交聯基二聚，使透明質酸衍生物交聯并借此形成網絡結構。本發明所使用的術語“光固化交聯透明質酸凝膠”，作為一個概念，是用來包括一種水凝膠，在光固化交聯透明質酸(下文有時簡稱為“本發明的凝膠”)的網絡結構(三維網絡結構)中，包含水介質，例如水、緩沖劑、生理鹽水、緩沖生理鹽水、含有作為分散介質的可溶于水的有機溶劑的水溶液。本發明所使用的術語“透明質酸官能基”是用來包括存在透明質酸中的、能夠與光反應交聯基化學鍵合的官能基。官能基的典型實例是羧基和羥基。本發明所使用的術語“低級烷基”或“低級烷氧基”是用來包括含有1～8個碳原子的烷基或烷氧基，優選1～4個碳原子。
在本發明凝膠中，首先以粘彈性表示其物理性能，其次以交聯度表示交聯結構。
對本發明的光反應透明質酸衍生物中的光反應交聯基沒有特別限制，只要所述基團含有能夠通過紫外線輻射二聚形成環丁烷環的1，2-亞乙烯基，并且所述的基團衍生自肉桂酸或其取代衍生物[例如下述肉桂酸衍生物等，其中在肉桂酸苯環上的任何位置的一個或兩個氫被以下基團取代低級烷基(如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基和叔丁基等)、低級烷氧基(如甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基等)、氨基和羥基等]，羧基-低級烷基胸腺嘧啶[例如1-(2-羧乙基)胸腺嘧啶等]，羧基-低級烷基取代的香豆素(例如7-香豆酰氧乙酸等)等等。其中，特別優選引入了從肉桂酸或其衍生物衍生的基團的光反應交聯基。另外，作為光反應交聯基，還優選從鍵合了間隔基的光反應化合物如肉桂酸等衍生的基團。所優選的間隔基包括有兩個或兩個以上官能基的間隔基，這些官能基能夠鍵合到諸如肉桂酸等光反應化合物的官能基以及透明質酸的官能基上。具體地說，所優選的是氨基酸或其衍生物、肽和氨基醇等，更具體地說，最優選的是氨基醇。可以將光反應交聯基引入透明質酸的糖化物成分的任何官能基上，例如N-乙酰基-D-葡糖胺和D-葡糖醛酸，但是特別優選的是把所述的交聯基引入D-葡糖醛酸的羧基上。
就應用肉桂酸作光反應交聯基、氨基醇作間隔基而論，例如，優選具有如下結構的光反應透明質酸衍生物，其肉桂酸的羧基通過酯鍵化學鍵合到氨基醇的羥基上，而氨基醇的氨基通過酰胺鍵化學鍵合到透明質酸的羧基上。就應用氨基肉桂酸作光反應交聯基、氨基酸或肽作間隔基而論，優選具有如下結構的光反應透明質酸，其間隔基的羧基通過酰胺鍵化學鍵合到氨基肉桂酸的氨基上，而所述的氨基酸或肽的氨基通過酰胺鍵化學鍵合到透明質酸的羧基上。
具體地說，對于鍵合了間隔基的光反應交聯基，特別優選的是下述通式(1)或通式(2)表示的那些基團。
-NH(CR1R2)nOCOCH＝CH-Ph(1)在式(1)中，R1和R2彼此獨立代表氫原子或低級烷基(優選含有1～4個碳原子)；Ph代表苯基，它不僅可以是用C6H5表示的基團，而且也可以是包含下述取代苯環的基團，即在苯環任何位置的一個或兩個氫原子被一個或兩個取代基取代，取代基選自含有1～4個碳原子的低級烷基或烷氧基、氨基和羥基等；n代表整數2～18，優選2～12。
通式(1)所表示的光反應交聯基是化學鍵合到，例如通過酰胺鍵化學鍵合到透明質酸的羧基上，形成光反應透明質酸衍生物。
-A-NH-Ph-CH＝CHCOOR3(2)在式(2)中，R3代表低級烷基，優選含1～4個碳原子的烷基(例如甲基、乙基等)或含有7～20個碳原子的芳烷基，優選芐基或苯乙基；A代表-(NHCR4R5CO)m-或NH(CR4R5)hCO-；R4和R5彼此獨立代表氫原子或低級烷基(優選含有1～4個碳原子)；Ph代表對亞苯基，它不僅可以是由-C6H4-表示的基團，也可以是包含下述取代苯環的基團，即苯環上鄰位或間位的氫原子被含1～4個碳原子的低級烷基或烷氧基、氨基、羥基等取代；m代表整數1～6，優選為1～3；h代表整數1～18，優選為1～12。
對用于本發明的透明質酸沒有特殊限制；然而，通常使用重均分子量為10,000～5,000,000的透明質酸作原料。可以按照用途選擇不同分子量。優選重均分子量為500,000～3,000,000，更優選800,000～2,500,000。在如下合成方法中，優選使用透明質酸的水溶性鹽，例如堿金屬鹽(如鈉鹽、鉀鹽等)，堿土金屬鹽(如鈣鹽等)等，但是也能使用其他鹽或游離酸，只要它們溶于所使用的反應溶劑，且不干憂反應。下文使用的術語“透明質酸”往往包括它的鹽。
用于本發明的光反應透明質酸衍生物的制備方法，包括將透明質酸溶解于，例如，水或水溶液中，后者含有可與水溶混的有機溶劑[例如二噁烷、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、乙酰胺、醇(例如甲醇、乙醇)、吡啶等]；然后在水溶性碳化二亞胺[例如1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺氫氯化物(下文縮寫為“EDC·HCl”、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺甲碘化物、1-環己基-3-(2-嗎啉代乙基)碳二亞胺氫氯化物]和縮合輔助劑(例如，N-羥基琥珀酰亞胺，N-羥基苯并三唑等)存在下，通過，例碳二亞胺法，引入光反應交聯基。
反應后能夠以普通方法提純所得產物，例如乙醇沉淀或透析(dialysis)。在提純和干燥之后，可以采用分光光度計測定產物在約269納米下的吸光度，從而得到所得光反應透明質酸衍生物的取代度(下文縮寫為“DS”，DS是每個透明質酸的二糖成分單元所引入的光反應交聯基的比率)。
無菌的和基本無內毒素(例如內毒素含量為0.25EU/g或更低)的光反應透明質酸衍生物和光固化交聯透明質酸凝膠可以通過使用無菌或基本無內毒素的試劑、水和容器等、并注意制備工作環境的無菌處理得到。
將光反應交聯基引入透明質酸所使用的具體化合物包括下列通式(1-1)或(2-1)所表示的化合物H2N(CR1R2)nOCOCH＝CH-Ph(1-1)式中R1、R2、Ph和n與上述限定相同。
H-A-NH-Ph-CH＝CHCOOR3(2-1)式中A，-Ph-，和R3與上述限定相同。
化合物(1-1)和(2-1)優選以鹽的形式應用，例如，酸加成鹽如氫氯化物、氫溴化物、氫氟化物等，特別優選氫氯化物。
具體地說，化合物(1-1)的氫氯化物(1-2)能按照如下反應路線合成第一反應第二反應(1-2)式中R6代表能夠用酸裂開的氨基保護基，例如叔-丁氧基羰基等；X代表鹵原子，例如氯原子等。
這里，具體地說，本發明按下述方法合成化合物(1-2)。
將有機溶劑(如氯仿等)加到化合物(3)中，然后，在冰冷卻下向其中加入有機堿(如三乙基胺等)。順次向其中加入化合物(4)和堿性催化劑(如4-二甲基-氨基吡啶等)。在室溫下攪拌該混合物后，向反應混合物中加入有機溶劑(如醋酸乙酯等)，然后依次用下述洗滌該混合物，包括幾份弱酸水溶液、水、幾份弱堿水溶液、水和飽和氯化鈉水溶液等。所分離出的有機溶液層置于無水硫酸鈉等上方干燥。過濾除去干燥劑等。在減壓下干燥濾液得到化合物(5)。
在冰冷卻下，將1～5M的氯化氫有機溶劑(如二噁烷等)的溶液加入化合物(5)，隨后攪拌。加有機溶劑(如二乙醚等)于其中，過濾收集所沉淀的結晶。用有機溶劑洗滌該結晶，然后在減壓下干燥，得到化合物(1-2)。
具體地說，能夠按下述反應路線合成化合物(2-1)的氫氯化物(2-2)第一反應第二反應式中R3和R6如上述所限定。
另外，具體地說，按下述方法合成化合物(2-2)。
將有機溶劑(如氯仿等)加到化合物(6)中，再在有機堿(如三乙胺等)存在下加入活化劑(如二甲基-硫膦基氯化物等)，同時用冰冷卻，借此使化合物(6)的羧基活化。化合物(6)活化后，在有機堿(如三乙基胺等)存在下將化合物(7)加入其中，同時冰冷卻，隨后在室溫下攪拌。向反應混合物加入有機溶劑(如醋酸乙酯等)，依次用下述洗滌所得混合物，包括幾份弱酸水溶液、水、幾份弱堿水溶液、水、飽和氯化鈉水溶液等。所分離出的有機溶劑層置于無水硫酸鈉等上方，干燥。過濾除去干燥劑等，在減壓下干燥濾液，得到化合物(8)。
在冰冷卻下，將A1～5M氯化氫有機溶劑(如二噁烷等)的溶液加到化合物(8)中，隨后攪拌。向其中加入有機溶劑(如二乙醚等)，過濾收集沉淀的結晶，用有機溶劑洗滌，在減壓下干燥，得到化合物(2～2)。
加到光反應交聯基中的間隔基的存在對改善光反應透明質酸衍生物的光反應性起很大作用，這種改善取決于間隔基的自由度和疏水鍵合性能。間隔基引起的光反應性敏感性的改善，使得在低引入比例的光反應交聯基存在下就能夠實現光固化交聯，迄今光固化交聯還難以在這種條件下進行。
按照傳統工藝，當對上述光反應透明質酸衍生物進行光輻射交聯時，首先將光反應透明質酸衍生物的水溶液置于一個容器等上，干燥成薄膜或類似形狀，然后用紫外線輻射，得到光固化交聯透明質酸薄膜。薄膜不僅易傳輸紫外線，而且，在薄膜成形期間，因為光反應交聯基的疏水性，當薄膜脫水或蒸發水時，使其彼此取向靠近。已經證實，所形成的這種狀況有利于光反應。例如在光反應交聯基是肉桂酸殘基的情況下，當肉桂酸殘基彼此之間的距離為4時，通過特定波長的紫外線輻射，分子能二聚，即交聯，但是在其他分子間距離下不能。所以，認為能使光反應交聯基彼此靠近的薄膜形成是實現光反應的重要步驟。另外，反式肉桂酸在上述條件下通過紫外線輻射能二聚，而其他幾何異構體(即順式肉桂酸)對于二聚而言是不活潑的。當對傳統光反應透明質酸衍生物水溶液用紫外線輻射時，認為交聯難以進行，因為水分子似乎妨礙光反應交聯基彼此靠近，并且比起二聚來主要進行反式成為順式的異構化作用。
本發明者發現，形成光固化交聯透明質酸凝膠的步驟包括制備高濃度光反應透明質酸衍生物的水溶液，以便光反應交聯基彼此更頻繁地靠近；使溶液層成為紫外線易于透射的形狀，隨后對其進行紫外線輻射。
按照本發明，當對光反應透明質酸進行紫外線輻射時，通過適當選擇光反應條件，如光反應溶液濃度、紫外線輻射時間等，或者DS，能夠得到具有諸如粘彈性等目的物理性能的光固化交聯透明質酸凝膠。
優選待光輻射的在水介質中的光反應透明質酸衍生物溶液的濃度(下文往往稱為“光反應濃度”)為約0.5～10％重量。用分子量約1,000,000的光反應透明質酸衍生物時，更優選濃度為1～4％重量。在較低濃度下，如下文所述，異構化作用發生優于二聚作用。相反，在較高濃度下，難以得到均勻凝膠。
當對低于所述規定濃度的較稀水溶液進行紫外線輻射時，如上所述，傾向于優先產生異構體。當繼續用紫外線輻射時，透明質酸糖化物鏈本身因受紫外線的作用而分解，結果分子量降低。從這些觀點出發，重要的是創造一種光固化交聯反應有效進行而對透明質酸的糖化物鏈無有害影響的反應環境。所以必需制備上述規定濃度的水溶液。圖1表示在水介質中進行光固化交聯的基本原理，其中，(a)表示在稀溶液中紫外線輻射光反應透明質酸衍生物的變化。水分子妨礙光反應交聯基彼此進行易于交聯的分子排列，主要結果是異構化作用。(b)表示在規定濃度的溶液中，進行紫外線輻射，光反應透明質酸衍生物的變化。與在稀溶液中比較，疏水光反應交聯基受水分子干擾較少，似乎通過疏水鍵合力彼此吸引，取得了易于交聯的分子排列。這樣光反應交聯基通過輻射而二聚，同時包含水介質，借此實現交聯。為了改善在規定濃度的溶液中交聯作用的光反應性，特別優選使用引入了含有上述間隔基的具有高柔韌性的光反應交聯基的光反應透明質酸衍生物。
上述光反應濃度取決于引入到透明質酸中的光反應交聯基的取代度(DS)。DS能夠以每個透明質酸的二糖成分單元引入的光反應交聯基的比率(％)為基礎計算。例如每個二糖成分單元有一個光反應交聯基的光反應透明質酸衍生物的DS是100％，或者每200個糖化物成分單元含有一個，則DS是1％。在相同光輻射條件下DS越低，交聯比越小。
在本發明中，為了在上述規定的光反應濃度下實現交聯，在透明質酸分子量等于或大于500,000的情況下，光反應透明質酸衍生物的DS可以約為0.05～10％，優選約為0.3～5％，更優選約為0.5～3％，然而可以依起始透明質酸的分子量變化。
作為待光輻射的光反應透明質酸衍生物溶液的溶劑，水介質包括水、緩沖劑、生理鹽水、緩沖生理鹽水等。對于生物醫學材料應用，特別優選緩沖劑、生理鹽水、緩沖生理鹽水[例如磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)等]。當應用含水介質而不是水時，能用介質種類和溶質濃度精細控制本發明所制凝膠的物理性能，取決于用途進行適當選擇。
光反應透明質酸衍生物溶液通常由下述的方法制得光反應透明質酸衍生物只要從合成反應系統分離并提純出來，就溶于水介質中。作為光反應透明質酸衍生物溶液，在某些情況下，光反應透明質酸衍生物可以照合成反應系統中的原來樣子使用，或者以其濃縮狀態使用。
當光反應透明質酸衍生物的DS固定時，形成環丁烷環的比例，即交聯比，往往隨著上述光反應濃度的范圍的變化而變化，因此所制凝膠的物理性能也變化。隨著光反應濃度的增加，交聯比似乎也增加，正如測定光固化交聯透明質酸凝膠的粘彈性所證實的那樣，凝膠的彈性也增加。隨著交聯比的增加，網絡結構變得較致密。在光固化交聯透明質酸凝膠中的環丁烷環的比例可稱為交聯度，交聯度是DS和交聯比的乘積，并以每個透明質酸二糖成分單元的二聚體摩爾比率(％)表示。優選交聯度的范圍為每摩爾透明質酸二糖成分單元0.01～0.5％。
干燥了的光固化交聯透明質酸凝膠(下文簡稱“干凝膠”)的吸水率受交聯度的影響，因此吸水率就成了交聯度的一種度量。以下式表示吸水率吸水率(％)＝所吸收的水的重量/干凝膠的重量×100隨著交聯度即交聯比的增加，網絡結構變得較致密，所吸收的水減少，因此干凝膠的吸水率下降。當干凝膠吸水率是將其在作為含水介質的生理鹽水(0.9％氯化鈉水溶液)中浸漬24小時之后進行測定時，本發明的干凝膠吸水率通常約為20(×100％)～150(×100％)，優選30(×100％)～120(×100％)，更優選40(×100％)～100(×100％)。
本發明的凝膠可以是含有0.5～10％重量光固化交聯透明質酸衍生物的凝膠，按透明質酸含量計。特別是，優選從重均分子量為約1,000,000的光反應透明質酸衍生物制備的光固化交聯透明質酸凝膠中透明質酸含量為1～4％重量。
能夠以動態粘彈特性表示凝膠的粘彈性方面的物理性能，例如儲能模量(G′)、損耗模量(G″)和損失正切δ(tanδG″/G′)等。儲能模量高；損耗模量低，表示彈性高，意味著是硬凝膠。相反，損耗模量高，儲能模量低，意味著凝膠具有高彈性。
本發明凝膠的物理性能，以頻率10赫茲下動態粘彈性表示，其儲能模量(G′)為50～1500帕，優選為100～500帕；損耗模量(G″)為10～300帕，優選為50～150帕；損失正切δ(tanδ；G″/G′)為0.1～0.8，優選為0.2～0.5。
在光輻射即紫外線輻射中，紫外線種類沒有特別的限制。通常采用下述光源進行幾秒鐘至幾分鐘光輻射或紫外線輻射，所采用的光源提供含有光反應必須波長的光，即200～600納米，優選200～450納米(例如高壓汞燈、金屬鹵化物燈等)，同時采用遮擋紫外線的濾波器等[如派熱克斯玻璃(商品名)等]遮擋二聚不需要的短波。對輻射方式沒有特別限制，可按其用途適當選擇各種方式。例如將光反應透明質酸衍生物溶液裝入作為盛本發明凝膠市售最終產品的容器中，然后按下述進行輻射；將所述溶液置于一對用透射紫外線的板材制的帶式運輸器之間，然后在運動中輻射；或者，將光反應透明質酸溶液送入并使其通過透射紫外線的材料制造的管的內部，并在送料的同時用紫外線輻射。
在制備本發明凝膠的過程中，即使光反應透明質酸衍生物水溶液，在用紫外線輻射之前和/或之后，用100～125℃高壓蒸汽熱處理5～30分鐘(壓熱器處理)，也能得到具有上述規格粘彈性的凝膠。這種熱處理相當于醫用器具或醫藥所需要的消毒過程。
對于待紫外線輻射的光反應透明質酸衍生物溶液的狀況，容納該光反應溶液進行光反應的容器材料和形狀、以及受紫外線照射的部分的材料和形狀沒有特別限制，只要紫外線能夠透過就行。例如它們可以是層狀、管狀、注射器狀或小瓶狀等。考慮到交聯反應均勻性，其形狀應利于紫外線能均勻充分地透過。使紫外線輻射薄溶液層特別適于得到均勻交聯的凝膠。光反應容器的形狀應能裝光反應透明質酸衍生物溶液和所制得的光反應系統中的本發明的凝膠，該容器并不一定總需要是密閉容器。例如容器可以是簡單的板形。
在應用本發明凝膠作生物醫學材料如抗粘連材料之處，優選保存本發明凝膠的容器的形狀，應能夠直至應用均能消毒保存所制得的本發明的凝膠，并且能從該容器適當地取出凝膠供應用。這種保存用的容器也可以用作光反應容器。直至應用時凝膠均能消毒保存的、并且凝膠易于被施加到給藥體或部位(當凝膠用于抗粘連材料時，物體或部位是應防結連的損傷部位)的容器實例包括諸如注射器、管等容器。另外，易于取出和施加凝膠的容器的實例還包括諸如小瓶等容器。
當光反應透明質酸衍生物裝到容器中、所裝的光反應透明質酸衍生物被紫外線輻射進行上述光反應時，容器的材料必須選擇透射紫外線并且不發生紫外線降解的材料。此外，在本發明凝膠是用來作為生物醫學材料施加到人體的情況下，可以優選對光反應之后的凝膠采用，例如，高壓蒸氣(壓熱器處理)，進行消毒。當裝到容器中的光固化交聯凝膠采用壓熱器消毒進行消毒時，可以優選容器材料是玻璃、塑料以及抗熱性達到某種程度的其他材料。對裝入所述容器的凝膠量沒有特別限制，然而，例如從操作，經濟和其他方面考慮，其量約為0.5～500毫升。
上述光輻射得到的水凝膠可以脫水，例如采用干燥等方法，然后通過加入需要量的水介質溶脹，提供具有本發明的上述物理性能的凝膠。在這種情況下，優選，采用對透明質酸糖化物鏈及交聯結構沒有有害影響的方法，進行干燥。
光固化交聯透明質酸凝膠也有可能以上述干燥固體凝膠的形式貯存或運輸，在應用之前用適當的水介質將其溶脹，緊接著以再溶脹的狀態應用。
本發明凝膠作為生物醫學材料具有很大用途。透明質酸所固有的高生物相容性和通過交聯新增加的適于作生物醫用材料使用的特性相結合，如在生物體內的持續時間延長(保持能力改進)以及改善的物理化學性能如粘彈性等，使本發明的凝膠非常適于在醫用領域中應用。
因為本發明凝膠所包含的大部分是無害無毒水介質，所以對生物體沒有毒性，并且具有高安全性。
更具體地說，本發明凝膠單次量大鼠腹膜內投藥100毫升/千克[相當于每千克2000毫克透明質酸]，沒有發生起因于凝膠的致死和嚴重異常。
此外，為研究自動過敏性進行了抗原性試驗，實驗中對豚鼠腹膜內用20毫克或2毫克本發明的凝膠致敏，然后再腹膜內給藥40毫克該凝膠。結果，沒有引起過敏性反應。
當用本發明的凝膠用作生物醫學材料如抗粘連材料時，認為凝膠彈性增加，改善了組織間的阻隔效應和在體內的保持能力，而粘性增加改善了對組織的粘著性以及對受傷部位的可注射性。所以，對于這些應用理想的是，優選凝膠具有彈性和粘性的優良平衡。如果凝膠的G′超過1500，或者損失正切δ小于0.1，則成為高彈性凝膠，所謂硬而脆的凝膠，難以注到受傷部位。另一方面，如果凝膠G′小于50，或者損失正切δ超過0.8，那朱成為其行為象溶液的高粘性凝膠，不能提供理想硬度，并且還失去了抗粘連作用所需要的阻隔效應。因此，認為本發明的凝膠具有作為抗粘連材料的最適合的物理化學性能。
器官粘連，例如往往發生在手術之后，從臨床觀點看是不希望發生的，據此需要開發有效的抗粘連材料。抗粘連材料的理想特性是，該材料(1)在易發生粘連的器官之間具有阻隔作用；(2)在傷口部位具有覆蓋性能；(3)不延緩傷口的愈合；(4)在傷口愈合期間保持在體內，并優選在愈合之后在體內分解并被吸收；(5)無害、無毒、生物相容等。
通過光固化交聯得到的、具有優良生物相容性和安全性的本發明光固化交聯透明質酸凝膠，達到了上述全部要求。特別重要的阻隔效應由交聯凝膠的物理化學性能得到，而體內保持能力由形成的光固化交聯網絡結構得到。
凝膠的無定形性，例如，使凝膠能經注射嘴或針注射，即將凝膠裝到注射器中，注射到微細損傷部位(例如創傷部位等)。就此而論，本發明凝膠的特征在于，具有比透明質酸溶液高得多的彈性，而且具有的硬度柔軟得使其可通過注射器的針頭。該凝膠也能通過較小直徑的管子(注射嘴)注射到損傷部位，還期待著將其施用于腹腔鏡顯微手術等。
簡言之，包含上述本發明凝膠的抗粘連材料的特征如下(1)具有優良抗粘連作用；(2)是一種具有能注射到損傷部位的物理性能的水凝膠；(3)當注射或施用時，具有對組織的高粘著性，也具有對組織的優良附著性，借此在必要的抗粘連期間內保持在損傷部位；(4)無需除去，可以從施用目的部位如腹腔等被吸收、引起代射和排泄；以及(5)具有安全性，在任何單次量毒性試驗、多次量毒性試驗和抗原性試驗的動物實驗中均沒有發現安全向題。
當用本發明凝膠作抗粘連材料時，應用領域舉例說明如下(1)產科和婦科領域與骨盆內手術同時發生的粘連的抗粘連，這些手術包括不孕癥治療、子宮手術、管的手術、卵巢手術、子宮內膜異位治療手術、剖腹產術、骨盆內粘連切離術等。
(2)胃腸手術領域在腹部手術等之后與腸粘連同時發生的粘連的抗粘連。
(3)矯形外科手術與下述手術同時發生的粘連的抗粘連，包括跟腱手術、屈肌和腱的手術、關節成形術、椎板切除術等。
本發明凝膠作為生物醫學材料應用于醫學領域，除了上述的抗粘連材料之外，還有如下所述。
(1)眼科手術輔藥。例如在諸如眼內晶狀體植入、全角膜移植術等手術中，將凝膠注入前房；或者在視網膜脫離等中，用凝膠保持眼內壓；或者用凝膠補充玻璃體。
(2)關節功能改善劑。例如將凝膠注入關節腔，其目的是減輕疼痛、改善關節可動范圍、在諸如膝關節變形性關節炎、肩關節關節周炎等關節炎治療中使生病滑液等正常化。
(4)成形外科領域缺損修復術。
(5)褥瘡或燒傷敷料。
(6)緩釋藥品材料或制劑。
關于用本發明凝膠作抗粘連材料，不能規定對損傷部位施加的凝膠量，因為該量依施加部位的類型(如器官的種類等)、尺寸或狀況和施加目的而變化。通常約為0.5～500毫升/部位，優選約為1～100毫升/部位，更優選約為2～50毫升/部位。
本發明光固化交聯透明質酸凝膠具有三維網絡結構。將藥品加到網絡中能夠提供一種緩釋(sustained release)藥品的有用制劑。能夠通過把干凝膠浸入含藥品的溶液中將藥品加到凝膠中。另外，因為光固化交聯凝膠在交聯后不需提純，可以先將藥品加到待輻射的光反應透明質酸衍生物的溶液中。上述任何方法均可以應用。
另外，能夠將藥品通過化學鍵(共價鍵、離子鍵等)化學鍵合到光反應透明質酸衍生物上，然后可以進行光反應交聯。例如當藥品以共價鍵引入時，借助酰胺鍵或酯鍵可以使藥品和光反應透明質酸衍生物的羧基或羥基結合在一起，然后進行紫外線輻射。另外，當通過離子鍵引入藥品時，能借助離子鍵鍵合到透明質酸的羧基上的陽離子藥品可以與光反應透明質酸混合，然后進行紫外線輻射。此外，含有鍵合藥品的光反應交聯基的光反應透明質酸衍生物也可以進行交聯光反應。
實例現參照制備實例、實例和試驗實例較詳細地敘述本發明，但是不言而喻，并不認為本發明僅限于此。
制備實例1光反應透明質酸衍生物(DS 0.53％)的制備在1.5升水中溶解10克(25毫摩爾二糖單元)透明質酸鈉[Seikagaku公司的產品，重均分子量(Mw)為950,000]，然后將750毫升1，4-二噁烷加到該溶液中。每隔5分鐘，向所得溶液順序加入50毫升含有288毫克(2.5毫摩爾)N-羥基琥珀酰亞胺的二噁烷溶液，50毫升含有1240毫克(1.25毫摩爾)EDC·HCl的水溶液和50毫升含有355毫克(1.25毫摩爾)HCl·H2N(CH2)6OCOCH＝CHPh的水溶液，同時用冰冷卻。在室溫下攪拌該混合物8小時之后，加入10克氯化鈉的水溶液，隨后攪拌1小時。將所得溶液倒入5升乙醇中。離心過濾(4000轉/分鐘×15分鐘)收集如此形成的目的沉淀物，順序用3份80％乙醇和1份乙醇洗滌，然后干燥，得到9.73克光反應透明質酸衍生物白色固體(DS為0.53％，內毒素含量為0.8pg/mg)。
該制備實例和以下制備實例及實例中的內毒素含量采用ToxicolorSystem LS-20儀、DIA儀和Et-1儀測定。所有儀器均購自Seikagaku公司(商標名，下同)光固化交聯透明質酸凝膠的內毒素含量的測定方法，包括先將實例中敘述的光固化交聯透明質酸凝膠用酶(如軟骨素酶(chondroitinase)ABC，Seikagaku公司等產品)消化溶解，然后用上述方法進行測定。
關于內毒素含量，一個內毒素單位(EU)相當于345pg內毒素。
制備實例2光反應透明質酸衍生物(DS 0.75％)的制備本衍生物按與制備實例1相同的方法進行制備，使用10克(25毫摩爾二糖單元)透明質酸鈉(Seikagaku公司產品，Mw為950,000)、65毫升0.05M的N-羥基琥珀酰亞胺(3.25毫摩爾)二噁烷溶液、65毫升0.025M的EDC·HCl(1.625毫摩爾)水溶液，和65毫升0.025M HCl·H2N(CH2)6OCOCH＝CHPh(1.625毫摩爾)水溶液。得到9.74克光反應透明質酸衍生物白色固體(DS為0.75％，內毒素含量為2.5pg/mg)。
制備實例3光反應透明質酸衍生物(DS 0.90％)的制備本衍生物按與制備實例1相同的方法進行制備，使用2.0克(5.0毫摩爾二糖單元)透明質酸鈉(Seikagaku公司產品，Mw為950,000)、3毫升含有69毫克(0.6毫摩爾)N-羥基琥珀酰亞胺的水溶液、3毫升含有58毫克(0.3毫摩爾)EDC·HCl的水溶液，以及3毫升含有85毫克(0.3毫摩爾)HCl·H2N(CH2)6OCOCH＝CHPh的水溶液。得到2.1克光反應透明質酸衍生物白色固體(DS為0.90％，內毒素含量為2.4pg/mg)。
制備實例4光反應透明質酸衍生物(DS 1.06％)的制備本衍生物按與制備實例1相同的方法進行制備，使用10克(25毫摩爾二糖單元)透明質酸鈉(Seikagaku公司產品，Mw為950,000)、100毫升0.05M的N-羥基琥珀酰亞胺(5.0毫摩爾)二噁烷溶液、100毫升0.025M的EDC·HCl(2.5毫摩爾)水溶液，和100毫升0.025M HCl·H2N(CH2)6OCOCH＝CHPh(2.5毫摩爾)水溶液。得到9.64克光反應透明質酸衍生物白色固體(DS為1.06％，內毒素含量為3.2pg/mg)。
制備實例5光反應透明質酸衍生物(DS 1.26％)的制備本衍生物按與制備實例1相同的方法進行制備，使用5克(12.5毫摩爾二糖單元)透明質酸鈉(Seikagaku公司產品，Mw為950,000)、50毫升的288毫克(2.5毫摩爾)N-羥基琥珀酰亞胺的二噁烷溶液、50毫升的240毫克(1.25毫摩爾)EDC·HCl的水溶液，以及50毫升的355毫克(1.25毫摩爾)HCl·H2N(CH2)6OCOCH＝CHPh的水溶液。得到4.9克光反應透明質酸衍生物白色固體(DS為1.26％，內毒素含量為1.0pg/mg)。
制備實例6光反應透明質酸衍生物(DS 1.29％)的制備本衍生物按與制備實例1相同的方法進行制備，使用10克(25毫摩爾二糖單元)透明質酸鈉(Seikagaku公司產品，Mw為950,000)、50毫升0.1M的N-羥基琥珀酰亞胺(5.0毫摩爾)二噁烷溶液、50毫升0.05M的EDC·HCl(2.5毫摩爾)水溶液，和50毫升0.05M HCl·H2N(CH2)6OCOCH＝CHPh(2.5毫摩爾)水溶液。得到10.0克光反應透明質酸衍生物白色固體(DS為1.29％，內毒素含量為2.5pg/mg)。
制備實例7光反應透明質酸衍生物(DS 1.55％)的制備本衍生物按與制備實例1相同的方法進行制備，使用10克(25毫摩爾二糖單元)透明質酸鈉(Seikagaku公司產品，Mw為950,000)、150毫升0.05M的N-羥基琥珀酰亞胺(7.5毫摩爾)二噁烷溶液、150毫升0.025M的EDC·HCl(3.75毫摩爾)水溶液，和150毫升0.025M HCl·H2N(CH2)6OCOCH＝CHPh(3.75毫摩爾)水溶液。得到9.92克光反應透明質酸衍生物白色固體(DS為1.55％，內毒素含量為1.2pg/mg)。
制備實例8光反應透明質酸衍生物(DS 1.93％)的制備在600毫升水中溶解4.0克(10.0毫摩爾二糖單元)透明質酸鈉(Seikagaku公司產品，Mw為950,000)，再加入300毫升1.4二噁烷于該溶液中。每間隔5分鐘向所得溶液中順序加入10毫升含有230毫克(2.0毫摩爾)N-羥基琥珀酰亞胺的水溶液，10毫升含有192毫克(1.0毫摩爾)EDC·HCl的水溶液以及10毫升含有284毫克(1.0毫摩爾)HCl·H2N(CH2)6OCOCH＝CHPh的水溶液，同時用冰冷卻。在室溫下攪拌所得混合物24小時之后，將2.0克氯化鈉的水溶液加入其中，隨后攪拌。將所制得的溶液倒入3.0升乙醇中。離心分離(4000轉/分鐘×15分鐘)收集如此形成的目的沉淀物，順序用80％乙醇洗滌3次，用乙醇洗滌1次，干燥，得到4.1克光反應透明質酸衍生物白色固體(DS為1.93％，內毒素含量為2.1pg/mg)。
制備實例9光反應透明質酸衍生物(DS 2.87％)的制備本衍生物按與制備實例1相同的方法進行制備，使用10克(25毫摩爾二糖單元)透明質酸鈉(Seikagaku公司產品，Mw為950,000)、50毫升含有864毫克(7.5毫摩爾)N-羥基琥珀酰亞胺的二噁烷溶液、50毫升含有718毫克(3.75毫摩爾)EDC·HCl的水溶液、以及50毫升含有1.06克(3.75毫摩爾)HCl·H2N(CH2)6OCOCH＝CHPh的水溶液。得到10克光反應透明質酸衍生物白色固體(DS為2.87％，內毒素含量為2.8pg/mg)。
制備實例10光反應透明質酸衍生物(DS 2.28％)的制備本衍生物按與制備實例1相同的方法進行制備，使用50克(125毫摩爾二糖單元)透明質酸鈉(Seikagaku公司產品，Mw為950,000)、250毫升含有3.45克(30毫摩爾)N-羥基琥珀酰亞胺水溶液、250毫升含有2.88克(15毫摩爾)EDC·HCl的水溶液、以及250毫升含有15毫摩爾HCl·H2N(CH2)6OCOCH＝CHPh的水溶液。得到49克光反應透明質酸衍生物白色固體(DS為2.28％，內毒素含量為3.2pg/mg)。
實例1本實例涉及用下述制備方法得到的光固化交聯透明質酸凝膠，該方法包括在水溶液中使制備實例6中制得的光反應透明質酸衍生物進行光固化交聯，隨后用1.5mM磷酸鹽緩沖生理鹽水(pH7.4)置換介質。
將制備實例6制得的光反應透明質酸衍生物(DS為1.29％)的1.4％重量水溶液置于一對派熱克斯耐熱玻璃板之間，每板厚度為2.5毫米，其間隔為1.0毫米，每側均用紫外線(3千瓦金屬鹵化物燈)輻射4分鐘(總計8分鐘)，然后在45℃下干燥。將1.5mM磷酸鹽緩沖生理鹽水(pH7.4)加到所制得的干燥凝膠之中，調節濃度至2％重量。然后將干燥凝膠溶脹1天，得到光固化交聯透明質酸凝膠(內毒素含量為0.11EU/g)。
實例2本實例涉及用下述制備方法得到的光固化交聯透明質酸凝膠，該方法包括對1.4％重量的在制備實例1，4和7中制得的光反應透明質酸衍生物的在1.5mM磷酸鹽緩沖生理鹽水(pH7.4)中的溶液進行光固化交聯。
將在1.5mM磷酸鹽緩沖生理鹽水(pH7.4)中的制備實例1、4和7制得的光反應透明質酸衍生物(DS分別為0.53％、1.06％和1.55％)的1.4％重量的溶液分別置于一對派熱克斯耐熱玻璃板之間，每塊玻璃板的厚度為2.5毫米，其間隔為1.0毫米，每側用紫外線(3千瓦金屬鹵化物燈)輻射4分鐘(總計8分鐘)，得到光固化交聯透明質酸凝膠。
在DS分別為0.53％、1.06％和1.55％的凝膠中，內毒素含量分別為0.03、0.12、和0.05EU/g。
實例3本實例涉及用下述制備方法得到的光固化交聯透明質酸凝膠，該方法包括對2.0％重量的在制備實例1～9中制得的光反應透明質酸衍生物的在1.5mM磷酸鹽緩沖生理鹽水(pH7.4)中的溶液進行光固化交聯。
將在1.5mM磷酸鹽緩沖生理鹽水(pH7.4)中的制備實例1～9中制得的光反應透明質酸衍生物(DS分別為0.53％、0.75％、0.90％、1.06％、1.26％、1.29％、1.55％、1.93％和2.87％)的2.0％重量的溶液分別置于一對派熱克斯耐熱玻璃板之間，每板厚度為2.5毫米，其間隔為1.0毫米，每側均用紫外線(3千瓦金屬鹵化物燈)輻射4分鐘(總計8分鐘)，得到光固化交聯透明質酸凝膠。
實例4本實例涉及用下述制備方法得到的光固化交聯透明質酸凝膠；該方法包括對3.2％重量的在制備實例1、4和7中制得的光反應透明質酸衍生物的在1.5mM磷酸鹽緩沖生理鹽水(pH7.4)中的溶液進行光固化交聯。
將在1.5mM磷酸鹽緩沖生理鹽水(pH7.4)中的制備實例1，4和7中制得的光反應透明質酸衍生物(DS分別為0.53％、1.06％、1.55％)的3.2％重量的溶液分別置于一對派熱克斯耐熱玻璃板之間，每板厚度為2.5mm，其間隔為1.0毫米，每側均用紫外線(3千瓦金屬鹵化物燈)輻射4分鐘(總計8分鐘)，得到光固化交聯透明質酸凝膠。
實例5本實例涉及按下述方法得到的光固化交聯透明質酸凝膠，該方法包括對實例3中的DS分別為1.55％和2.87％的光固化交聯透明質酸凝膠進行熱處理。
將實例3中從DS分別為1.55％和2.87％的光反應透明質酸衍生物制得的光固化交聯透明質酸凝膠分別裝于10毫升安瓿中，在121℃壓熱器中進行8分鐘熱處理。
物理性能測定測定下述材料的動態粘彈性[儲能模量G′，損耗模量G″、損失正切δ，tanδ(G″/G′)]、動態粘度(η)和吸水率；這些材料是，制備實例1，4，5和7中制得的制備濃度(溶液濃度以透明質酸濃度表示)分別為1.4％重量、2.0％重量或3.2％重量的光反應透明質酸衍生物的溶液，實例2～4制備的制備濃度分別為1.4％重量、2.0％重量或3.2％重量的光固化交聯透明質酸凝膠，以及在實例5中制備的熱處理了的光固化交聯透明質酸凝膠。按如上所述，還測定了所制備的透明質酸溶液的物理性能，其制備濃度與上述光固化交聯透明質酸凝膠的制備濃度相同。采用Carri-Med公司制造的CSL-50型流變儀在下述條件下測定動態粘彈性和動態粘度。
測定方法振動試驗法，應力控制測定溫度37℃測定外形尺寸(geometry)4厘米間隙800微米頻率10赫茲吸水率按照如下所述的使用歐洲專利0205674 A1中公開的蘭色葡聚糖(Blue Dextran)(下文縮寫為“B.D”)通過紫外線吸光度法進行測定。使用生理鹽水(0.9％氯化鈉水溶液)作為水介質。
當干凝膠置于B.D.溶液中時，凝膠僅吸收水，因為具有高分子量的B.D.不能進入凝膠。所以，未吸收的剩余B.D.溶液濃度，與初始濃度比起來，隨著水被吸收而增加。這種濃度差異得自吸光度(610納米)，然后按下述方程計算吸水率吸水率(×100％)＝(1-y1/y2)/A×1000式中y1是初始濃度為每克0.1％重量B.D.溶液中干凝膠A毫克時的吸光度，y2是在B.D溶液中溶漲24小時之后的吸光度。
另外，還對在實例3中從DS為0.53％、0.75％、0.90％、1.26％、1.55％和1.93％的光反應透明質酸衍生物制備的光固化交聯透明質酸凝膠干樣品進行了吸水率測定。
關于動態粘彈性等的某些測定結果示于表1。DS與吸水率的關系示于圖2。在表1中，分析樣品的實測濃度是通過按照咔唑-硫酸反應法測定凝膠的透明質酸成分含量得到的。
表1濃度 濃度頻率 10Hz實例序號DS(制備)(實測)熱處理G′ G″ tanδ η(％)(％) (％) (Pa)(Pa)(Pa·s)2 0.531.4 1.22 - 66 41 0.630.71.061.4 1.37 - 146 65 0.451.01.551.4 1.24 - 149 64 0.431.0透明質酸1.4 1.38 - 46 44 0.970.73 0.532.0 1.96 - 146 78 0.531.21.062.0 1.81 - 339 109 0.321.71.262.0 1.70 - 273 96 0.351.51.552.0 2.04 - 342 105 0.311.72.872.0 1.62 - 427 103 0.241.7透明質酸2.0 2.00 - 241 102 0.421.64 0.533.2 2.63 - 550 216 0.393.41.063.2 2.77 - 818 223 0.273.51.553.2 2.78 - 1002248 0.253.9透明質酸3.2 3.35 - 560 304 0.544.85 1.552.0 2.04 121℃，8分鐘 173 86 0.501.42.782.0 1.62 121℃，8分鐘 310 101 0.321.6透明質酸3.2 3.02 121℃，8分鐘 407 281 0.694.5
實例6本實例涉及按下述方法制備的光固化交聯透明質酸凝膠，該方法包括對2.0％重量的在制備實例10中制得的光反應透明質酸衍生物的在1.5mM磷酸鹽緩沖生理鹽水(pH7.4)中的溶液，在不同條件下進行紫外線輻射，并進行熱處理。
將制備實例10中制備的DS為2.28％的光反應透明質酸衍生物溶解于1.5mM磷酸鹽緩沖生理鹽水(pH7.4)中，成為2.0％重量的溶液。按照下述三種方法對所制得的溶劑進行紫外線輻射。在紫外線輻射之前和/或之后，在下述條件下，對溶液(或凝膠)進行熱處理。測定所得凝膠的交聯比、交聯度和粘彈特性。
紫外線輻射(UV輻射)條件(1)與實例2～4相同的方法。將光反應透明質酸衍生物的水溶液置于一對派熱克斯耐熱玻璃板之間，每板厚度為2.5毫米，其間隔為1.0毫米，用3千瓦金屬鹵化物燈的紫外線從每側輻射4分鐘(共計8分鐘)。
(2)將該溶液置于一對聚乙烯薄膜之間，用400瓦高壓汞燈的紫外線從一側輻射3秒鐘。
(3)將該溶液在送入并通過直徑5毫米石英管的同時用400瓦高壓汞燈輻射。
熱處理條件(壓熱器處理法)A.在UV輻射之后，121℃，8分鐘B.在UV輻射之前，121℃，8分鐘C.在UV輻射之前，121℃，8分鐘；然后，在UV輻射之后，100℃，10分鐘D.在UV輻射之后，121℃，15分鐘測試結果示于下表2。
其中交聯比用如下方程計算。
交聯比(％)＝二聚的肉桂酸摩爾數×2/引入的肉桂酸摩爾數×100更具體地說，將肉桂酸或其二聚物從光固化交聯透明質酸凝膠中化學裂解并提取出來。利用肉桂酸和其二聚體之間的分子量差異，通過凝膠滲透色譜法(GPC)將提取物分離成肉桂酸和其二聚體，定量測定每個組分，得到各自的摩爾數。然后按上述方程計算交聯比。
交聯度從下述方程計算。
交聯度(％)＝DS×交聯比/100正如從上述方程所見，當交聯比是以引入的肉桂酸為基礎計算的數值時，交聯度(交聯比和DS的乘積)能以每個透明質酸的二糖單元成分的二聚體的摩爾比(％)表示。
表2光輻熱處頻率10 赫茲DS射條件理條件交聯比交聯度G′G″tanδη(％) (％)％) (帕) (帕) (帕秒)2.28(1)A 4.1 9.4×10-2161680.42 1.12.28(2)A 1.9 4.4×10-2122560.46 0.92.28(3)B 2.5 5.6×10-2146700.48 1.32.28(3)C 2.5 5.6×10-2144840.59 1.32.28(2)D 1.9 4.4×10-2108840.78 1.
試驗實例1在大鼠子宮角模型中的抗粘連作用本試驗實例涉及下述材料在大鼠子宮角粘連模型中的抗粘連作用，這些材料是，實例1、3、5和6制得的凝膠，以及為比較用的，如實例1和3那樣制備的紫外線輻射前的光反應透明質酸衍生物溶液(下文稱為未交聯透明質酸凝膠)、市售的抗粘連材料TC7[Interceed(商品名)，Johnson&Johnson公司生產]，以及在1.5mM磷酸鹽緩沖生理鹽水中的3.2％重量透明質酸溶液。
1.試驗動物購置七周CrjSD(SPF)雌大鼠，試驗前喂養一周。每組五只2.試驗方法2-1大鼠子宮角粘連模型的準備方法在戊巴比妥鈉麻醉下，對大鼠腹進行備皮。劃約4厘米長中線切口。
(a)用眼科手術環鋸將右腹壁切至肌層，并用鑷子剝離肌層。
(b)暴露子宮角，從卵巢下約1厘米向子宮頸以2～3毫米間距劃4個橫切口。每次切開隨時用電灼術止血。
(c)將從子宮角上橫切口端約3～4毫米的部位以及從腹壁損傷端3～4毫米部位合攏，用8/0單股縫線將上述(a)和(b)中造成的外傷縫合。
2-2給藥試驗組在腹壁損傷部位和子宮角切口部位間注入或嵌入下述材料，它們是均為1毫升的上述光固化交聯透明質酸凝膠、未交聯透明質酸凝膠和透明質酸溶液，以及面積為1.5×1.5厘米2的市售TC7。更具體地說，上述凝膠按如下方式給藥。將精確計量的各1毫升上述凝膠裝入1毫升注射器[Terumo注射器，用于結核菌素(tukerculin)(商品名)，經r-射線消毒，管內徑約4毫米，端部內徑約1毫米]，經注射器端部注入腹壁損傷部位和子宮角切口部位之間。
對照組在用于實驗組的同一動物左側腹壁和子宮角進行相同操作，但是沒有嵌入抗粘連材料。
3.評判
3.評判植藥后七天，將大鼠在乙醚麻醉下經頸動脈驅血殺死。解剖之后，按如下記分系統，評判經受粘連部位的粘連程度。
0無粘連1稍粘連但易分開2中等粘連但可分開3嚴重粘連且不可分開4.結果試驗結果示于下表3。在表3中，紫外線輻射條件和熱處理條件與實例6所述相同。
表3光輻 熱處抗粘連效果實例序號DS射條件理條件試驗組對照組(％)1 1.29(1) - 0，0，0，0，02，2，2，2，2- 1.29未輻射 - 2，2，2，2，22，2，2，2，23 1.06(1) - 1，1，0，0，02，2，2，2，23 1.26(1) - 2，0，0，0，02，2，2，2，2- 1.26未輻射 - 2，2，2，2，02，2，2，2，23 1.55(1) - 0，0，0，0，02，2，2，2，25 1.55(1) A 0，0，0，0，02，2，2，2，23 2.87(1) - 0，0，0，0，02，2，2，2，25 2.87(1) A 0，0，0，0，02，2，2，2，26 2.28(2) A 1，0，0，0，02，2，2，2，26 2.28(3) D 1，0，1，0，02，2，2，2，2比較例TC7-- - 2，2，2，2，22，2，2，2，23.2％透明質酸溶液 A 2，2，2，2，22，2，2，2，2
正如從表3的結果所見，市售抗粘連薄膜TC7在本粘連模型中不完全有效，而按照本發明的光固化交聯透明質酸凝膠在本模型中具有充分有效的抗粘連作用。
具有與光交聯凝膠相似的粘彈性和粘度的未交聯凝膠或3.2％透明質酸溶液沒有抗粘連效果，據此，可以認為本發明光固化交聯透明質酸凝膠的抗粘連作用歸因于光固化交聯。
試驗實例2本試驗實例涉及在與試驗實例1相同的大鼠子宮角粘連模型中本發明凝膠的抗粘連作用，只是沒有對腹壁損傷部位和子宮角切口部位進行止血。
本發明凝膠的抗粘連作用采用與試驗實例1相同的方法進行試驗和評價，不同之處在于，本實例沒有對腹壁和子宮角切口止血，所采用的是0.5毫升濃度為2％、DS為2.5％的光固化交聯透明質酸凝膠，并且在紫外線輻射之前對其在105℃下進行了10分鐘熱處理，在紫外線輻射之后對其在121℃下進行了8分鐘熱處理(n＝10)。
作為對照試驗，采用與試驗實例1相同的方法對實驗組所使用的同一動物進行了試驗，但沒有嵌入抗粘連材料。
所得結果示于表4。
表4動物號對照組實驗組12 022 032 042 052 062 072 082 292 010 2 0
0.5毫升劑量的光固化交聯透明質酸凝膠對未接受止血的模型具有顯著抗粘連作用。換句話說，表4結果證明，光固化交聯透明質酸凝膠優于市售TC7，后者不能施加到未進行止血的損傷部位。
試驗實例3光固化交聯透明質酸凝膠在大鼠類腸粘連模型中的抗粘連效果1.試驗材料光固化交聯透明質酸凝膠，濃度為2％，DS為2.5％；在紫外線輻射前在105℃下進行10分鐘熱處理，并且在紫外線輻射后在121℃進行8分鐘熱處理。
2.試驗動物購置七周SD雌大鼠，在試驗前喂養一周。
3.粘連模型的準備方法對從回腸至結腸的漿液膜成直線地進行剝離，剝離長度為20厘米，寬度為3～4毫米，不進行止血。
4.給藥和分組從1毫升注射器注射規定量(0.5毫升、1.0毫升或2毫升)凝膠，施加到損傷部位。敷用之后，將腸管移入腹腔，然后封閉腹部。未敷用凝膠的粘連模型作為對照組。敷用0.5毫升、1.0毫升和2.0毫升凝膠的模型分別作為0.5毫升、1.0毫升和2.0毫升組。每組10只大鼠。
5.評判和結果植藥后七天，將大鼠在乙醚麻醉下經頸動脈驅血殺死。解剖后，按與試驗實例1相同的記分系統評判粘連程度。所得結果示于下表5。
表5試驗組動物序號對照組0.5毫升1.0毫升2.0毫升1 2 0 0 02 2 0 0 03 2 1 0 04 2 0 0 05 2 0 0 06 2 0 0 17 2 0 0 08 1-2 0 0 09 1-2 1-2 0 010 1-2 0 0 0與對照組相比，三個試驗組全部具有顯著抗粘連作用。表5結果說明本發明凝膠不僅對抗粘連有效，而且，在考慮到有力的腸蠕動的情況下，在對組織的粘著性以及與組織的生物相容性方面，它均顯示優越性能。
另外，在上述試驗實例1和2動物試驗中，植藥后七天解剖時，肉眼觀察得知大部分植入的光固化交聯透明質酸凝膠消失。如此，顯示了本發明凝膠的生物降解能力。
如上所述并證明，光固化交聯透明質酸凝膠易于通過用紫外線輻射高濃度光反應透明質酸衍生物水溶液制備。本發明的光固化交聯透明質酸凝膠在保持透明質酸固有優良性能的同時，如無毒、非抗原性、生物相容性、生物降解能力等，還具有如下物理性能，如適當的粘彈性、組織親合力和生物降解能力等。所以，預期它將作為高度安全的醫學材料用于各種領域，例如作為抗粘連材料、作為緩解藥品的載體等。另外，該凝膠能夠借助注射器、管等注射到機體受傷細微部位，所以預期會應用于顯微外科等。
權利要求
1.一種光固化交聯透明質酸凝膠，以頻率10赫茲下動態粘彈性表示，其儲能模量(G′)為50～1500帕，損耗模量(G″)為10～300帕，損失正切δ(G″/G′)來0.1～0.8；以及它是一種按下述方法制備的水凝膠，該方法包括對其中含化學鍵合到透明質酸官能基上的光反應交聯基的光反應透明質酸衍生物進行紫外線輻射，使光反應相互交聯基交聯。
2.一種光固化交聯透明質酸凝膠，其交聯度為每摩爾的透明質酸二糖成分單元0.01～0.5％，以及它是一種按下述方法制備的水凝膠，該方法包括對其中含化學鍵合到透明質酸官能基上的光反應交聯基的光反應透明質酸衍生物進行紫外線輻射。
3.按照權利要求1或2的光固化交聯透明質酸凝膠，其中所述的光反應交聯基，是一種含有間隔基的肉桂酸衍生物，并且是化學鍵合到透明質酸官能基上，從而提供所述的光反應透明質酸衍生物；使所述光反應透明質酸衍生物的所述光反應相互交聯基通過紫外線輻射二聚，形成環丁烷環，借此形成網絡結構；以及所述的凝膠是一種在所述網絡結構中含有水介質的水凝膠。
4.按照權利要求3的光固化交聯透明質酸凝膠，其中所述的間隔基是從氨基醇、氨基酸或肽衍生的基團。
5.按照權利要求3或4的光固化交聯透明質酸凝膠，其中所述光反應交聯基用如下通式(1)或(2)表示-NH(CR1R2)nOCOCH＝CH-Ph (1)式中，R1和R2彼此獨立代表氫原子或低級烷基；Ph代表苯基；而n代表整數2～18；-A-NH-Ph-CH＝CHCOOR3(2)式中，R3代表低級烷基或芳烷基；A代表-(NHCR4R5CO)m-或-NH(CR4R5)hCO-；R4和R5彼此獨立代表氫原子或低級烷基；Ph代表對亞苯基；m代表整數1～6；以及h代表整數1～18。
6.按照權利要求1～5中任何一項的光固化交聯透明質酸凝膠，其中引入的所述光反應交聯基的比例為每摩爾二糖單元成分0.05～10％。
7.一種光固化交聯透明質酸凝膠，以頻率10赫茲下的動態粘彈性表示，其儲能模量(G′)為50～1500帕，損耗模量(G″)為10～300帕，損失正切δ(G″/G′)為0.1～0.8；以及它是一種按下述方法制備的水凝膠，該方法包括對其中含化學鍵合到透明質酸官能基上的光反應交聯基的光反應透明質酸衍生物進行紫外線輻射，使光反應相互交聯基交聯，然后對交聯產物進行熱處理。
8.一種光固化交聯透明質酸凝膠，以頻率10赫茲下的動態粘彈性表示，其儲能模量(G′)為50～1500帕，損耗模量(G″)為10～300帕，損失正切δ(G″/G′)為0.1～0.8；以及它是一種按下述方法制備的水凝膠，該方法包括對其中含化學鍵合到透明質酸官能基上的光反應交聯基的光反應透明質酸衍生物進行熱處理，然后對加熱過的光反應透明質酸衍生物進行紫外線輻射，使光反應相互交聯基交聯。
9.一種光固化交聯透明質酸凝膠，以頻率10赫茲下的動態粘彈性表示，其儲能模量(G′)為50～1500帕，損耗模量(G″)為10～300帕，損失正切δ(G″/G′)為0.1～0.8；以及它是一種按下述方法制備的水凝膠，該方法包括對其中含化學鍵合到透明質酸官能基上的光反應交聯基的光反應透明質酸衍生物進行熱處理，然后對加熱過的光反應透明質酸衍生物進行紫外線輻射，使光反應相互交聯基交聯，然后再對交聯產物進行熱處理。
10.按照權利要求1～9中的任何一項的光固化交聯透明質酸凝膠，其中凝膠的內毒素含量為0.25EU/g(內毒素單位/克)或者更低。
11.一種制備光固化交聯透明質酸凝膠的方法，包括對含有0.5～10％重量的光反應透明質酸衍生物的水介質溶液進行紫外線輻射，其中透明質酸的官能基上化學鍵合了光反應交聯基；和通過光反應相互交聯基二聚，形成分子間和/或分子內交聯，得到網絡結構。
12.按照權利要求11制備光固化交聯透明質酸凝膠的方法，其中，在用紫外線輻射所述光反應透明質酸衍生物的水介質溶液之前和/或之后，對其進行熱處理。
13.按照權利要求12制備光固化交聯透明質酸凝膠的方法，其中，所述熱處理采用高壓蒸汽在100～125℃下進行5～30分鐘。
14.一種生物醫學材料，它包含按照權利要求1～10中任何一項的光固化交聯透明質酸凝膠。
15.按照權利要求14的生物醫學材料，它具有抗粘連作用。
16.一種生物醫學材料器材，它包含交聯透明質酸凝膠，和以可取出的形式裝有所述凝膠的容器。
17.按照權利要求16的生物醫學材料器材，其中，所述容器是能夠將所述凝膠排出以便注射的容器。
18.一種生物醫學材料器材，它包含權利要求1～10中任何一項敘述的光固化交聯透明質酸凝膠，和以可取出的形式裝有所述凝膠的容器。
19.按照權利要求18的生物醫學材料器材，其中所述容器是能夠將所述凝膠排出以便注射的容器。
全文摘要
一種光固化交聯透明質酸凝膠,以頻率10赫茲下動態粘彈性表示,其儲能模量(G′)為50～1500帕,損耗模量(G″)為10～300帕,以及損失正切δ(G″/G′)為0.1～0.8;它是一種按下述方法制備的水凝膠,該方法包括:對有光反應交聯基化學鍵合到透明質酸官能基上的光反應透明質酸衍生物進行紫外線輻射,使光反應相互交聯基交聯;以及制備該凝膠的方法和其作為生物醫學材料的應用。
文檔編號A61K47/48GK1207744SQ96199650
公開日1999年2月10日 申請日期1996年11月14日 優先權日1995年11月15日
發明者脅道典, 宮本建司 申請人:生化學株式會社