假單胞菌屬外毒素－髓磷脂堿性蛋白嵌合蛋白的制作方法

專利名稱：假單胞菌屬外毒素－髓磷脂堿性蛋白嵌合蛋白的制作方法
技術領域：
本發明涉及可用于自身免疫病，特別是多發性硬化的定向免疫治療的抗原-毒素嵌合蛋白。
治療自身免疫病的主要目的之一是開發選擇性的免疫抑制劑。在不了解有關具體抗原的性質的前提下，目前為止治療只能是通過細胞毒性劑非特異性致死迅速分裂的細胞，以及用抗炎劑抑制炎癥介體的作用。
最近，由于我們對免疫反應的了解加深，遺傳工程的發展和改進了自身免疫病的模型，業已開發出了用于治療免疫反應疾病的特異性及選擇性治療劑。
業已了解作過全面研究的動物模型實驗自身免疫腦脊髓炎(EAE)是由髓磷脂堿性蛋白(MBP)或其免疫原性決定簇引起的，在很多哺乳運動種中，當在適當條件下注射時均是如此。MBP是中樞神經系統(CNS)髓磷脂蛋白的一種主要成分。已提出MBP能刺激T細胞群，使其向中樞神經系統遷移并引發會導致血管周圍成套損傷和多發性硬化的脫髓鞘特征的反應。將MBP-特異-T輔助細胞注射到鼠類動物體內也可以誘發上述模式。
已采用過多種方式來抑制EAE模式。已報導對MBP-1a配合物特異的單克隆抗體能抑制H-2S小鼠的EAE(1-2)。
治療多發性硬化(MS)的其它方法包括施用合成的T-細胞受體肽(3)、MBP的改性肽(4)、共聚物-1-合成的氨基酸無規共聚物(US專利3,849,550)和各種干擾素(5)。
治療自身免疫病的一種不同方法涉及一種用基因融合技術制成的嵌合細胞毒性分子的使用。這些分子利用了諸如假單胞菌屬(Pseudomonas)外毒素(PE)的毒素部分，同時克服了其非特異性細胞結合的特性。通過毒素部分與識別因子的融合賦予這種截短或修飾過的毒素分子特異性，所述識因子可將該嵌合蛋白引導到表達特異受體的特定靶細胞處。
通過融合編碼IL2、IL4、IL6、TGFα、抗Tac和CD4的cDNA和PE已構建出有效的嵌合細胞毒素(6-11)。
已證實所述嵌合蛋白之一IL2-PE40針對并可選擇性地消除能表達IL2受體的活化T細胞。在很多免疫反應疾病模型中(其中活化的T細胞起著關鍵作用)，已證實IL2-PE40是IL2受體定向治療的有效的、選擇性的免疫抑制劑(12-19)。
使用高度純化的制劑(40)，已證實IL2-PE40(a)延緩并轉移在大鼠中由佐劑誘發的關節炎(21)，(b)明顯延長血管化心臟同種異體移植小鼠的存活時間(22)，(c)降低大鼠實驗自身免疫眼色素層視網膜炎(EAU)的發病率和發病程度(23)，(d)抑制小鼠中T細胞淋巴瘤的生長(24)，(e)明顯減輕大鼠正位角膜移植的臨床排斥等級和累積排斥速率(25)，和(f)防止在大鼠和小鼠中出現EAE的特有特征(26)。
盡管已證實諸如IL2-PE40的細胞因子-毒素嵌合蛋白是一種有效的選擇性免疫抑制劑，但其作用并不局限于特異抗原激活的細胞，而是涉及一切IL2受體陽性細胞(12)。
與目前正采用或推薦的很多治療EAE或MS患者的方法形成對照的是，仍然需要僅針對病原細胞并保持其它免疫反應完全有效的特異性方法。
Steinberg I.等(Third International Conference On Neuro-immunology，Jerusalem，Israel(1991)，Third InternationalSymposium on Immunotoxins Jerusalem(1992))披露了與編碼截短了的或突變的全長PE基因的cDNA融合的編碼一種MBP致腦炎部分的寡核苷酸。該DNA在大腸桿菌(E.coli)中表達，而所得到的嵌合蛋白能有效殺傷αMBP T細胞，但對非靶細胞無影響。
本發明的目的之一是提供一種可用于治療自身免疫疾病的嵌合蛋白。
本發明的另一個目的是提供一種治療諸如多發性硬化的自身免疫病的方法。
本發明涉及嵌合分子的構建、鑒定和純化，該嵌合分子包括一種與毒素部分連接的髓磷脂堿性蛋白部分，這種嵌合分子是能定向并專門殺傷αMBP特異T細胞以及MS患者的外周血細胞的新型制劑。
根據本發明的一個方面，提供了一種嵌合蛋白，它包括一個與髓磷脂堿性蛋白(MBP)部分連接的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素(PE)部分，該MBP部分選自(a)MBP；(b)豚鼠髓磷脂堿性蛋白或其抗原性部分的氨基酸69-88；(c)人髓磷脂堿性蛋白或其抗原性部分的氨基酸84-102；(d)人髓磷脂堿性蛋白或其抗原性部分的氨基酸143-168；和(e)在(a)、(b)、(c)或(d)的氨基酸序列中有一個或幾個氨基酸缺失、添加、取代或突變了的氨基酸序列，該修飾過的序列仍保持與未修飾過的氨基酸序列至少有75％的同源性。
對假單胞菌屬外毒素進行分析后發現，它包括幾個獨特的功能域，被稱作功能域I(a和b)、II和III。理想的是，該假單胞菌屬毒素部分包括完整長度的外毒素或該外毒素的突變的或截短了的衍生物。該外毒素可衍生自外毒素的功能域II和III。另外，該假單胞菌屬毒素部分可以由在諸如位置57、246、247和249中的一個或幾個上發生了突變的外毒素而形成。這種突變PE被稱為PE664Glu。
在另一種實施方案中，本發明涉及一種嵌合蛋白，該蛋白包括與選擇性地突變或截短了的假單胞菌屬外毒素部分連接的完整長度的髓磷脂堿性蛋白。
在本發明的每一種實施方案中，所述髓磷脂堿性蛋白部分和毒素部分可以直接或間接地連接。如果這兩部分是間接連接，則優選由一個接頭序列連接。在本文中“接頭序列”一詞涉及任何包括1-5個氨基酸和可能重復1-3次的氨基酸序列，即該接頭可包括由一個重復3次的五肽組成的多達15個氨基酸殘基。理想的是，該接頭序列是一個包括gly-gly-gly-gly-ser的五肽。
本發明的另一方面涉及含有編碼一種本發明分子的DNA序列的質粒，以及能表達該分子的表達載體。合適的質粒包括一個可操縱地與一個編碼本發明分子的DNA序列連接的啟動子。任何原核啟動子均可使用，如PL和Tac等，但優選使用噬菌體T7啟動子。在本文中，“可操縱地連接”一詞是指啟動子序列和待在該啟動子的控制下表達的序列彼此之間的空間位置，使得該啟動子能誘導表達。因此，可以用間隔序列將所述啟動子和待表達的序列隔開。任何適當的表達載體均可使用，但優選使用大腸桿菌作載體。
本發明還包括所述嵌合蛋白的鹽。“鹽”一詞包括羧基鹽以及該蛋白分子的氨基的酸加成鹽。可以用本領域公知的方法產生羧基鹽，包括諸如鈉、鈣、銨、鐵或鋅鹽之類的無機鹽，和與諸如三乙醇胺、精氨酸、賴氨酸、哌啶和普魯卡因之類的有機堿形成的鹽。例如，酸加成鹽包括與諸如鹽酸、硫酸之類的無機酸形成的鹽或與諸如乙酸或草酸之類的有機酸形成的鹽。
本發明還涉及含有至少一種上述嵌合蛋白和一種可以藥用的惰性載體的藥用組合物。理想的是，該組合物還包括一種諸如氯化銨和莫能菌素之類的菌性營養劑(lysosomotrophic agent)。
可以用本領域已知的施用蛋白的方法施用本發明的蛋白，例如，口服、靜脈內、關節內、皮下、肌內、腹膜內、鼻內、鞘內、真皮內、經皮服施用、吸入或包括經腸途徑的任何其它途徑施用。
本發明的嵌合蛋白可以用本領域技術人員所熟知的方法制備，例如，化學合成法或生物技術(遺傳學)方法。如果用后一種方法，要把一個編碼該嵌合蛋白的DNA構建體插入質粒中。合適的載體是經過選擇并用上述質粒轉化過的。然后刺激所述載體，以產生所需的嵌合蛋白。
通過結合附圖對優選實施方案所作的以下詳細說明可以更好地理解本發明。其中


圖1是構建表達質粒pIS-1，pIS-2和pIS-3的示意圖，這些質粒分別編碼BPP1-PE664Glu，BPP2-PE664Glu和MBP-PE664Glu，其中，B表示BamHI；H表示Hind III；N表示NdeI；而E表示EcoRI；圖2表示構建表達質粒pHL15的示意圖，其中B表示Bam HI；N表示NdeI；E表示EcoRI；圖3A表示考馬斯藍染色的凝膠，顯示含有BPP-PE嵌合蛋白的細菌細胞級分的SDS-PAGE分析結果；圖3B表示含有BPP-PE嵌合蛋白的細菌細胞級分的SDS-PAGE分析和與抗PE抗體的免疫印跡；圖4表示BPP-PE嵌合蛋白對αMBP T細胞-D9的胞毒活性。以下列各種濃度添加BPP-PE嵌合蛋白；1-4＝分別為250；500；1000；1500ng(總蛋白濃度)不溶性組分-鹽酸胍處理過的BPP-PE嵌合蛋白；4*＝有αPE抗血清的BPP-PE嵌合蛋白(總蛋白濃度為1500ng)；5-7＝分別為50；100；500ng高度純化的IL2-PE40。
測定摻入細胞蛋白的[3H]-亮氨酸。結果以未經BPP-PE嵌合蛋白處理的對照細胞的百分比形式表達；圖5表示BPP-PE嵌合蛋白對αMBP-T細胞系Zla的胞毒活性。結果以圖4中述的圖例形式表示；圖6表示BPP-PE嵌合蛋白對αMBP-T細胞系kla的胞毒活性。結果以圖4中所述的圖例形式表示；圖7表示MBP-FE664Glu嵌合蛋白對Z85細胞的胞毒活性。結果以圖4中所述的圖例形式表示；圖8表示BPP-PE嵌合蛋白對非靶T細胞系-A2b的胞毒活性。以下列各種濃度添加BPP-PE嵌合蛋白1-5＝分別為250；500；1000；1500；2000ng(總蛋白濃度)的不溶性級分-鹽酸胍處理過的BPP-PE嵌合蛋白；6-8＝分別為50；100；500ng高度純化的IL2-PE40。
測定摻入細胞蛋白中的[3H]-亮氨酸。結果以未經BPP-PE嵌合蛋白處理的對照細胞的百分比形式表示；圖9表示BPP-PE嵌合蛋白對PPD-非靶細胞的胞毒活性。結果以圖4中所述的圖例形式表示；圖10表示BPP2-PE66和BPP1-PE40嵌合蛋白向PAS靶細胞里的內化。將BPP2-PE664Glu或BPP1’-PE40(不溶性級分-鹽酸胍處理過的總蛋白濃度為15ug)加入細胞中，保持5小時。洗滌并裂解細胞，用抗PE抗血清對其樣品作免疫印跡分析。
1泳道分別為BPP2-PE664G1u/BPP1’-PE40(總蛋白濃度為3ug)2泳道與BPP-PE嵌合蛋白中的任一種一起溫育的裂解細胞的不溶性級分；3泳道與BPP-PEs一起溫育的裂解細胞的可溶性級分；4、5泳道分別為洗滌步驟1和4的樣品。
圖11表示BPP1’-PE40對PAS細胞(αMBP T細胞)的胞毒活性。在增殖期的第1天以各種濃度將純化的BPP1’-PE40(-□-)加入PAS細胞中。結果以圖4所述形式表示；圖12表示NH4Cl對BPP1’-PE40對αMBP T細胞的胞毒活性的影響。以500ng的恒定量添加BPP1’-PE40。在有遂步加大濃度的NH4Cl的條件下測定BPP1’-PE40對蛋白合成的抑制作用(-O-)。還測定了單獨用NH4Cl在不同濃度下的作用(-□-)。結果以圖4所述形式表示；圖13表示BPP1’-PE40對獲自MS患者的PBL的影響。以各種濃度將BPP1’-PE40添加到從以下MS患者體內分離得到的PBL細胞中MSM13(-■-)，MSM14(-△-)，MSM16(-●-)和MSM18(-□-)，按圖4所述的方法測定蛋白合成的抑制作用；圖14a-d是編碼人嵌合蛋白的質粒的示意圖；和圖15a-c表示表達下列人BPP-PE嵌合蛋白的大腸桿菌細胞級分的SDS-PAGE圖a)BPP84-102-PE664Glu；b)BPP143-168-PE664Glu；c)BPP84-102-PE40。A.構建BPP-PE/MBP-PE嵌合基團構建5種肽-毒素嵌合蛋白。3種含有編碼豚鼠髓磷脂堿性蛋白19個氨基酸(氨基酸69-88)的BPP序列(29)。合成3種各自含有該豚鼠序列的寡核苷酸(Oligo1、1’和2，表I)，并各自與編碼截短形式的PE(PE40)或突變了的完整長度PE序列(PE664Glu)的DNA片段的5’末端融合。對于BPP1-PE664Glu和BPP1’-PE40而言，所述BPP編碼序列前面有一個編碼Met-Val兩個氨基酸的序列，而對于BPP2-PE664Glu而言，，所述BPP編碼序列前面有一個編碼Met-Ala的序列。
將該BPP/MBP編碼序列直接與突變的PE序列觸合(嵌合蛋白BPP2-PE664Glu)或通過一個5個氨基酸(gly-gly-gly-gly-ser)的接頭連接，該接頭插在BPP序列和PE664Glu(表I，Olio 1嵌合蛋白BPP1-PE664Glu)或PE40(表I，Oligo 1’，嵌合蛋白BPP1’-PE40)之間。
在第4種質粒pIS-3中，將一個大鼠MBP序列(30)直接連接在PE664Glu序列上(圖1)，而在第5種質粒pBM-8466中，將編碼人MBP的氨基酸84-102的序列直接同PE664Glu序列連接。質粒及其內容的概述(構建體(質粒名稱))1.BPP1-PE664Glu(pIS-1)-69-88豚鼠MBP和突變PE，有接頭2.BPP1’-PE40(pHL15)-69-88豚鼠MBP和截短了的PE，有接頭3.BPP2-PE664G1u(pIS-2)-69-88豚鼠MBP和突變了的PE，無接頭4.MBP-PE664Glu(pIS3)-大鼠MBP和突變PE，無接頭5.BPP84-PE664Glu(pSM-8466)-84-102人MBP和突變PE，無接頭。
表I用于合成BPP-PE嵌合蛋白的寡聚物(Oligo’s)Oligo 15′TATGGTAGGCTCCCTGCCCCAGAAGTCGCAGAGGTCTCAAGATGAAAACCCA GTAGTCCACTTCGGTGGCGGAGGATCAGA 3′Oligo 1′5′TATGGTAGGCTCCCTGCCCCAGAAGTCGCAGAGGTCTCAAGATGAAAACCCA GTAGTCCACTTCGGTGGCGGAGGATCACA 3′Oligo 25′TATGGCTGGCTCCCTGCCCCAGAAGTCGCAGAGGTCTCAAGATGAAAACCCAGTAGTCCACTTCGA 3′Oligo 35′TATGGATGAAAATCCAGTAGTTCATTTTTTTAAAAATATTGTAACCCCACGTACCCCACCCGA 3′pMBP-1質粒中編碼大鼠MBP的cDNA的PCR引物IS1有義5′AGC TCATATGGCATCACAGGGGAGACC 3′IS2反義5′AGCTAAGCTTCGCGTCTTGCTATGGGAGATC 3′A.1質粒pIS-1、pIS-2和pSM-8466按圖1和2所示的方法構建了在噬菌體T7控制下表達所述嵌合蛋白的質粒。用被NdeI和Hind III裂解過的pHL 823構建分別編碼BPP1-PE664Glu、BPP2-PE664G1u和BBP84-PE664Glu的質粒pIS-1、pIS-2和pSM-8466。將最大的載體片段(4.4Kb)連接到3個不同的合成寡核苷酸(Oligo1，2或3，表I和圖1)中的每一個上。檢測所得質粒的大小，并在BL21(λDE3)細胞中檢測所編碼的嵌合蛋白的表達，見G部分。
A.2編碼BPP1’-PE40的質粒pHL15用由NdeI裂解過的pHL906(29b)構建質粒pHL15。將最大的載體片段(4kb)連接到合成的寡核苷酸(Oligo1’，表I和圖2)上。按上述方法檢測質粒pHL15。
A.3編碼MBP-PE664GIu的質粒pIS-3將-個相當于完整大鼠MBP的400bp-PCR片段與用NdeI和HindIII裂解過的pHL823的較大片段(4.4Kb)融合，構建質粒pIS-3。所述PCR片段用IS1和IS2引物(表I)合成，而質粒pMBP-1由L.Hood(California Inst.of Tech，USA)惠贈。用NdeI和Hind III裂解所述PCR產物，并與用相同的酶裂解過的pHL823連接。質粒pMBP-1含有編碼大鼠MBP的完整長度的cDNA。
通過DNA序列分析證實了所構建嵌合基因的序列(資料未發表)。
B.蛋白表達用熱激方法(32)將編碼所述融合基因的質粒轉化入大腸桿菌BL-21 DE3菌株中。在氨芐青霉素(100(g/ml)的瓊脂板上生長并篩選轉化的大腸桿菌菌落。讓篩選出的菌落在含有氨芐青霉素(50(g/ml)的SLB培養基上進一步生長，直到OD650達到0.5。然后用異丙基-(-D-半乳糖苷(IPTG)(終濃度1mM)進行90分鐘的誘導。
將一團表達過的細胞懸浮于TE緩沖液(50mM Tris，pH8.0，1mMEDTA)中，聲波處理(100w，6次，每次沖擊30秒)，并以10,000xg離心15分鐘。除去上清液(可溶性級分)，并留待分析。在4vol(v/w)的提取緩沖液(7M Gu-HCl，0.1M Tris pH8.0，1mM EDTA，1mM DTT)中使細胞沉淀變性，并用聲波處理(100W，沖擊6次，每次30秒)。在4℃下攪拌該懸浮液1小時。通過在12,000g下離心15分鐘澄清該懸浮液，并棄除沉淀。然后用磷酸緩沖鹽水(PBS)將澄清的上清液稀釋4倍，并用PBS透析。透析過的材料以12,000g離心10分鐘。
所得到的上清液(鹽酸胍處理過的不溶性級分)被用作大部分實驗的嵌合蛋白來源。
C.BPP-PE嵌合蛋白的鑒定和亞細胞定位通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)鑒定新表達的嵌合蛋白。這些蛋白以接近42.9Kd和68.3-68.9Kd的表觀分子量遷移，分別相當于預測的BPP1’-PE40、BPP1-PE664Glu/BPP2-PE664Glu/BPP84-PE664Glu的分子量(圖3A)。MBP-PE664Glu的分子量為80Kd。免疫印跡顯示，該嵌合蛋白能與多克隆抗-PE抗血清反應(圖3B)。
如下面的表II所顯示的，上述細胞的提取物具有ADP-核糖基化活性(31)。為了查明所表達的嵌合蛋白的亞細胞定位，進行亞細胞分級。用富含延伸因子2的麥胚提取物測定每種亞級分的ADP核糖基化活性。按照其酶促活性，3種不同的嵌合蛋白(BPP1-PE664Glu，BPP2-PE664Glu和BPP1’-PE40)是以類似方式表達并分布在不同亞級分中。
發現其總活性的大約60-70％與可溶性級分相關，而僅有30-40％的活性與不溶性級分相關。不過，發現不溶性級分是最富含所述蛋白的級分，其活性值(比活性)比計算出的可溶性級分的活性高7-16倍(表II)。因此，從不溶性級分中純化BPP-PE嵌合蛋白(見下文)。應當指出的是，在外周質級分或培養基中僅存在基礎水平的BPP-PE蛋白。
表II
D.BPP-PE嵌合蛋白的胞毒活性用MBP-特異的致腦炎的T細胞系檢測不同BPP-PE嵌合蛋白的胞毒活性。在培養物中維持所述細胞系(MBP-特異性T細胞系Z85、D9、PAS、Kla和對照細胞系A2b、PPD，可由本發明人提供)，做法是改性特異抗原刺激3天，并再進行為期5-7天的增殖期。MBP特異性致腦炎MBP-1細胞系(3×105細胞/ml)的刺激是在有15μg/ml豚鼠MBP的條件下，用15×106細胞/ml同系照射的胸腺細胞作為抗原呈遞細胞(APC)，在補充了1％同系大鼠血清、2mM-L谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉、5×10-5M β-巰基乙醇、100μg/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI-1640中進行的。通過經Ficoll paque梯度(Pharmacia)離心將活化的淋巴母細胞同胸腺細胞和碎片分離。所述母細胞存在于界面中。然后在不含抗原和大鼠血清的同一種培養基中繁殖該母細胞，該培養基中富含10％加熱失活的胎牛血清(FCS)和10％ConA激活的脾細胞上清液(含有TGCF的條件培養基)或25個單位/ml的人rlL2。
用稀釋在含有0.2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS中的不同嵌合蛋白的不溶性級分進行試驗。在增殖階段的第3天(d3)，以不同濃度將其加入96孔板的MBP-T細胞(2-4×104細胞/孔)中，做3次重復。在37℃下在含有5％CO2的空氣中將這些細胞培養18-24小時，添加2μci〔3H〕-亮氨酸或1μci〔3H〕-胸苷，再培養12-16小時。收集細胞，并測定摻入的放射性。當用HUT102對照細胞做試驗時，僅添加放射性材料培養4小時，然后收集細胞。由未用任何嵌合蛋白處理過的對照細胞計算出蛋白合成抑制的百分比。
如圖4-6所示，特異性的αMBP T細胞系(分別為D9、Z85和Kla)對上述BPP-PE嵌合蛋白的胞毒活性敏感，在試驗過的最高濃度下，表現出對蛋白合成有60-70％的抑制作用。蛋白合成的抑制作用取決于濃度。
與其它兩種嵌合蛋白(BPP2-PE664Glu和BPP1’-PE40)不同的是，嵌合蛋白BPP1-PE664Glu對D9靶細胞無細胞毒性(圖4)。當試驗BPP-PE嵌合蛋白的細胞毒性作用對DNA合成的影響時，觀察到了類似的結果(結果未發表)，表明該嵌合蛋白能不可逆地抑制蛋白的合成，由此導致細胞死亡。由于表達細胞的不溶性級分被用于這些實驗中的大部分，我們將僅能表達該嵌合蛋白的毒性部分(PE40)的細胞不溶性級分用作對照，以檢測與該不溶性級分制劑相關的非特異性活性。
PE40的不溶性級分對靶細胞(圖4)或非靶細胞均無細胞毒性作用。MBP-PE664Glu的不溶性級分對Z85細胞有細胞毒性。在試驗過的最高濃度(2,000ng)下，觀察到蛋白合成的抑制作用為58％(圖7)。
在用一種抗原誘發的T細胞系的激活過程中，出現了白介素2受體分子(IL2R)的從頭表達，因此，我們試驗了IL2-PE嵌合蛋白對作為正對照的不同抗原特異性T細胞系的胞毒活性。在試驗過的不同αMBPT細胞系中，高度純化的IL2-PE664Glu可導致蛋白合成40-75％的抑制作用(圖4-6)。
E.BPP/MBP-PE嵌合蛋白活性的特異性在證實了BPP-PE嵌合蛋白對αMBP T細胞系的細胞毒性作用后，我們評估了對該嵌事蛋白的反應的特異性。如圖4所示，過量的多克隆αPE可完全抑制BPP-PE嵌合蛋白對αMBP T細胞系D9的細胞毒性作用，從而證實了其作用的特異性。
還試驗了BPP-PE蛋白對非靶細胞系A2b或PPD的作用。對分支桿菌抗原特異的A2b細胞系能與大鼠軟骨交叉反應，并參與介異佐劑關節炎。PPD細胞系對結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的純化的蛋白衍生物有特異性。以與αMBP T細胞相同的條件在培養物中維持上述兩種T細胞。
如圖8和9所示，A2b或PPD對照細胞系不受BPP-PE嵌合蛋白作用的影響，證實其作用是一種高度特異的反應。還在其它非靶細胞-HUT 102細胞上試驗了BPP-PE嵌合蛋白的活性，HUT102細胞是一種人HTLV-IT細胞白血病細胞系，它能表達高親和和低親和形式的IL2R。在補充了10％FCS的RPMI 1640中維持該細胞。HUT102是由T.A.Waldmann(National Cancer Institutes)惠贈的。未發現BPP-PE嵌合蛋白的細胞毒性作用。
F.嵌合蛋白向靶細胞中的內化作為證實BPP-PE嵌合蛋白向靶細胞中內化的另一種方法，我們在培養之后通過免疫印跡分析尋找該蛋白在細胞內的存在。
通過培養嵌合蛋白BPP2-PE664Glu和BPP1’-PE40(不溶性級分的總蛋白濃度約為5μg，用鹽酸胍處理過)和αMBP T細胞(PAS細胞)或A2b非靶細胞5小時來分析嵌合蛋白向靶細胞中的內化。在培養結束時，用HanRs平衡鈉鹽溶液(HBSS)緩沖液洗滌細胞4次，保留取自每一洗滌步驟的樣品。然后用裂解緩沖液(20mM Tris-HCl，pH7.4，150mM NaCl，1mM EDTA、1％NP40、1％脫氧膽酸、0.1％SDS、1mM PMSF)裂解細胞，并在室溫下培養15分鐘。以9000g離心細胞裂解液10分鐘，并保存裂解細胞的沉淀部分(溶于Tris-HCl pH 7.4，1mMEDTA，TE緩沖液)和上清液部分用于分析。將來自生長培養基、洗滌步驟和裂解細胞的樣品用于SDS PAGE分析。將電泳過的樣品從凝膠轉移到硝酸纖維素上，并用αPE抗血清作免疫印跡分析。當在A2b細胞上分析內化作用時，樣品的免疫印跡分析是通過狹線印跡法進行的。
在標準分析條件之后，可以檢測到靶細胞裂解液中的BPP2-PE664Glu和BPP1’-PE40(圖10)。由于來自最后一個洗滌步驟(在裂解細胞之前，洗滌IV，圖10)的樣品未表現出任何免疫反應性材料，這些嵌合蛋白是細胞相關性的。在相同分析條件下，在A2b非靶細胞內檢測不到內化的嵌合蛋白(圖10)。正如所預料的，此情形中只能在生長培養基中和第一次洗滌的樣品中檢測到嵌合蛋白。
G.BPP-PE嵌合蛋白的生產和純化在原核系統中表達MBP/BPP-PE嵌合蛋白。其在大腸桿菌中的表達，與所觀察到的很多外源真核蛋白的表達一樣，會導致不溶性包含體的形成，該包含體含有非天然、非活性構象的重組蛋白。獲取這種融合蛋白的其它方法有別于并取決于其組分的性質。
在大腸桿菌BL21菌株(λDE3)的細胞中表達所述嵌合蛋白。在37℃下，在SLB/Amp(50(g/ml)(1L的SLB-5g NaCl，16g色氨酸、10g酵母提取物)培養基中生長細菌細胞，直到OD600達到1.5-2.0。用IPTG誘導(1mM，90分鐘，37℃)，導致所述嵌合蛋白表達。以2700rpm的速度離心培養物15分鐘。在-70℃下冷凍細胞沉淀。使冷凍的大腸桿菌細胞解凍，并懸浮在裂解緩沖液(50mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA，0.2mg/ml溶菌酶)(10ml/g細胞)中。
對細胞懸浮液進行脈沖聲波處理3×30秒。在4℃下以35,000×g離心裂解的細胞30分鐘，以獲得不溶性級分，即所述包含體。將該包含體懸浮在變性緩沖液(6M GuHCl，100mM Tris-HCl pH8.6，1mMEDTA，10mm DTT，50mM NaCl)(1ml/g細胞)中。離心收集所述混合物(35,000g，15分鐘)。用重折疊緩沖液(100mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA，0.25M粗氨酸， 5mM DTT，0.25M NaCl)將上清液稀釋100倍，并在4℃下攪拌48小時。
通過在4℃，35,000g下離心30分鐘澄清所述稀釋過的提取物。將重折疊溶液的每一克蛋白吸附到0.7-0.8ml預處理過的(用BSA)羥基磷灰石上。未與吸附劑結合的部分添加0.25M NaCl和100mM精氨酸，并用攪拌室(Nucleopore，膜截斷分子量30,000，Sigma)濃縮，直到最終體積為1-2ml。然后將濃縮過的級分上Sephacryl S-200 HR柱(1×120cm)，該柱用50mM磷酸鉀緩沖液， pH7.0，和0.25M NaCl預校正過。
收集1ml的級分，在280nm測光吸收，并在SDS-PAGE上檢測。收集峰值級分，并用PBS透析，稱之為純化的BPP1’-PE40。以等分試樣的形式在-20℃下保存高度純化的BPP1’-PE40。
在所有的純化步驟之后都對樣品進行SDS-PAGE電泳、蛋白測定、Western印跡分析和ADP-核糖基化活性分析。
根據總活性(通過ADP-核糖基化活性測定)得出原材料的產率為4.5％(表III)。根據嵌合蛋白的比活性，其純化程度為20.8倍(表III)。
表IIIBPP-PE40的純化
檢驗所述高度純化的嵌合蛋白的非特異活性。其做法是將提高的單一劑量嵌合蛋白注射給小鼠(SJL品系)。對動物至少作2周的觀察，不過，毒性劑量的PE可在24-48小時內導致死亡。在50μg的劑量下沒有小鼠死亡，在100μg的劑量2/3的小鼠死亡。
在上述純化方法中，在羥基磷灰石步驟之后使用離子交換柱(取代攪拌室)可以提高最終產物的純度。用TE緩沖液(TE緩沖液10mMTris HCl pH8.0，1mM EDTA)稀釋(1∶5)未與羥基磷灰石支持物結合的級分，加到Q-Sepharose(將5ml濕柱介質混入BPP1-PE40稀溶液的約20mg蛋白)中，并在4℃下攪拌30分鐘。然后將該材料裝柱，并用TE緩沖液洗滌。洗脫是用溶于TE緩沖液中的1MNaCl進行的。將通過該步驟濃縮的蛋白樣品加到Sephacryl柱上。
H.純化BPP1’-PE40的胞毒活性在增殖期的第1天(d1)，將用量逐漸加大的純化BPP1’-PE40嵌合蛋白加入PAS細胞中。如圖11所示，高度純化的BPP1’-PE40以取決于劑量的形式導致蛋白合成的抑制。
1.用溶菌性營養劑增強細胞毒性已知NH4Cl是一種溶菌性營養劑，它可以提高溶酶體的pH，從而中和其酶的活性。諸如NH4Cl、能霉素之類的不同溶菌性營養劑可導致所述免疫毒素細胞毒性的增強。
我們檢驗了NH4Cl對BPP1’-PE40對靶細胞的細胞毒性的影響。如圖12所示，5mM NH4Cl可明顯提高BPP1’-PE40對PAS細胞的細胞毒性作用。而在無NH4Cl的條件下，500ng BPP1’-PE40僅能對蛋白合成產生4％的抑制作用，加入NH4Cl可將對蛋白合成的抑制作用提高到98％(5mM NH4Cl本身可使蛋白合成減少26％)。
J.BPP-PE對獲自MS患者的PBL的細胞毒性從MS患者或對照健康供體采集外周質。將20ml外周血加入Ficoll-isopaque(1.077)中，以分離淋巴細胞。用PHA(5(g/ml)對淋巴細胞進行72小時的活化，或在24小時內趁鮮使用。將激活的淋巴細胞轉入補充了10％FCS和10單位/ml rlL2的RPMI 1640中。轉移細胞后立刻進行細胞毒性分析(2×104細胞/孔)。在補充了20％加熱失活的FCS和10單位/ml rlL2的與用于所述T細胞系的相同培養基中維持新鮮淋巴細胞(105細胞/孔)。
用于蛋白抑制試驗而接種的細胞是1)沒有任何預激活階段的新鮮細胞。用對照新鮮血樣進行校準實驗，以確保在試驗階段該細胞的良好有效性。試驗諸如接種細胞的密度、添加特異生長因子/細胞因子等的參數；2)PHA激活2-3天后的細胞。在平行實驗中，以類似方式檢驗采自健康個體的對照血樣，檢驗所用嵌合蛋白的特異性。
對MS患者所做的研究主要是在疾病復發時進行。該研究涉及到18個MS患者。用不同純化階段的BPP1’-PE40(隨著純化方法的進程進行)檢驗獲自11個患者的新鮮細胞(未作任何預激活)。來自6個患者(54％)的外周血細胞對由BPP1’-PE40介導的細胞毒性敏感，可抑制蛋白合成的20-92％。圖13證實了BPP1’-PE40對少數MS患者的作用，一個患者對該嵌合蛋白十分敏感(MSM-18)，一個未表現出任何反應(MSM-16)，而其它兩個患者表現出對由BPP1’-PE40介導的細胞毒性低至中度敏感性(MSM-13，14)。
在用PHA激活3天后檢驗自12個患者體內采集的樣品(部分患者的樣品同時做新鮮細胞和激活后的細胞檢驗)。12個樣品中的6個(50％)表現出對所述嵌合蛋白的敏感性。
取自對照供體的細胞對該嵌合蛋白無反應或反應很弱。還對取自患有另一種不相關的神經疾病的患者的細胞進行了試驗，并發現其對BPP1’-PE40的細胞毒性作用無反應。
K.用BPP1’-PE40抑制EAE免疫和處理方法用小鼠脊髓勻漿物(0.1mg/小鼠)對8-10周齡的18只雌性SJL小鼠的爪墊接種免疫，所述勻漿物溶解在PBS，pH7.4中，并以1∶1的比例用CFA(5mg/ml結核分枝桿菌)乳化，總體積為100μl/小鼠。另外，靜脈注射百日咳毒素(200ng/200μl/小鼠)。在48小時后靜脈注射另一劑百日咳毒素(200ng/200μl/小鼠)以加強免疫。
做這樣的處理每12小時腹膜內注射溶于0.5ml PBS pH7.4中的5ug/小鼠(基于2.5μl/g動物)BPP1’-PE40，或僅注射0.5ml PBS。在免疫8天后開始處理，并持續處理10天。在處理期間和至少1個月之后每天對EAE嚴重度進行評級。分級范圍可分為以下1-6級1＝中度尾部虛弱；2＝尾部麻痹，3＝尾部麻痹和后腿麻痹，4＝后腿麻痹或中度前肢虛弱，5＝四肢麻痹，6＝死亡。
結果BPP1’-PE40處理的小鼠一點也不會發生EAE(平均重度＝0)，而且無一因此病而死亡。相反，在PBS對照組中，9只小鼠中有6只出現EAE，疾病高峰在第14天。這6只感病小鼠表現出不同的重度，和發病期間，在第14天時的平均重度為3。另外，對照組的6只小鼠中有1只因該病而死亡。
再對處理組做4周的隨訪，未出現延遲的發病跡象或該病延遲復發。
L.人嵌合蛋白根據人MBP致病序列構建幾種其它的嵌合蛋白。該嵌合蛋白上的靶序列是以人MBP的肽84-102和143-168為基礎(表IVb)。在一臺DNA合成儀上合成所述短肽序列，并用常規方法純化。用于構建物的Oligo示于表IVa中。
表IVa用于構建人BPP-PE嵌合蛋白的Oligo序列Oligo 1(143-906)5′TATGTTTAAAGGGGTAGATGCTCAAGGGACCCTTTCTAAAAT-TTTTAAATTGGGAGGTAGAGATCA 3′Oligo 2(143-906)5′TATGATCTCTACCTCCCAATTTAAAAATTTTAGAAAGGGTCCCTT-GAGCATCTACCCCTTTAAACA 3′Oligo 3(84-906)5′TATGGATGAAAATCCAGTAGTTCATTTTTTTAAAAATATTGTAA-CCCCACGTACCCCACCCCA 3′Oligo 4(84-906)5′TATGGGGTGGGGTACGTGGGGTTACAATATTTTTAAAAAAATG-AACTACTGGATTTTCATCCA 3′Oligo 5(84-823)5′TATGGATGAAAATCCAGTAGTTCATTTTTTTAAAAATATTGTAAC-CCCACGTACCCCACCCGA 3′Oligo 6(84-823)5′AGCTTCGGGTGGGGTACGTGGGGTTACAATATTTTTAAAAAAAT-GAACTACTGGATTTTCATCCA 3′Oligo 7(143-823)5′TATGTTTAAAGGGGTAGATGCTCAAGGGACCCTTTCTAAAAT-TTTTAAATTGGGAGGTAGAGATGA 3′Oligo 8(143-823)5′AGCTTCATCTCTACCTCCCAATTTAAAAATTTTAGAAAGGGTGC-CTTGAGCATCTACCCCTTTAAACA 3′
表IVb所述人BPP’s的氨基酸序列84-1025′Asn Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val ThrPro Arg Thr Pro Pro 3′143-1685′Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu Ser Lys Ile PheLys Leu Gly Gly Arg Asp 3′用基因融合技術構建新的嵌合蛋白。在圖14a-d中示意性地示出了編碼所述新的嵌合蛋白的質粒。將靶序列克隆在完整長度的修飾PE(PE664Glu)的5’末端(圖14a，b)或PE-cDNA的截短了的形式(PE-40)上(圖14c，d)。將以上兩種形式的PE-cDNA用于構建IL2-毒素嵌合蛋白，并發現其對人和鼠類新激活的T細胞有不同的活性。將Oligo’s 1-2用于構建BPP143-168-PE40；將Oligo’s 3-4用于構建BPP84-102-PE40；將Oligo’s 5-6用于構建BPP84-102-PE664Glu；和將Oligo’s 7-8用于構建BPP143-168-PE664Glu。
在大腸桿菌表達系統中表達新的嵌合細胞毒素，與前文所述MBP-PE的生產相似。在表達之后通過SDS-PAGE分析細胞提取物(圖15a-c)，用抗PE抗體進行Western印跡分析，并測定表達蛋白的ADP-核糖基化活性。所有新的嵌合蛋白均能高度表達，并主要集中在表達細胞的不溶性級分。
用上述人嵌合蛋白對諸如獲自MS患者的外周血的靶細胞進行試驗。對兩個MS患者的細胞(已作過試驗，MSM16，18)試驗BPP84 -102-PE664Glu，并發現其有細胞毒性(表V)。對基于人序列的新的嵌合蛋白有反應的一個患者(MSM16)以前對由BPP1-PE40(基于豚鼠的序列)介導的細胞毒性無反應。獲自另一個SM患者的細胞對BPP84-102-PE664Glu無反應。表VBPP84-102-PE664Glu對獲自MS患者的PBL的影響患者蛋白合成抑制，％(在500ng下)MSM-16 52MSM-18 56MSM-22 ＜5參考文獻1)Aharoni，R.，Teitelbaum，D.，Arnon，R.& Puri，J.(1991)通過抗原-la復合體的抗體對實驗變應性腦脊髓炎進行免疫調節。Nature351147-150。
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本領域技術人員應當理解，本發明并不局限于以上說明，本發明的范圍僅由以下權利要求限定。
權利要求
1.一種含有與髓磷脂堿性蛋白(MBP)部分連接的銅綠假單胞菌外毒素(PE)部分的嵌合蛋白，所述MBP部分選自(a)MBP；(b)豚鼠髓磷脂堿性蛋白或其抗原性部分的氨基酸69-88；(c)人髓磷脂堿性蛋白或其抗原性部分的氨基酸84-102；(d)人髓磷脂堿性蛋白或其抗原性部分的氨基酸143-168；和(e)在(a)、(b)、(c)或(d)的氨基酸序列中有一個或幾個氨基酸缺失、添加、取代或突變了的氨基酸序列，該修飾過的序列仍保持與所述氨基酸序列至少有75％的同源性。
2.如權利要求1的蛋白，其中，所述PE部分包括在氨基酸位置57、246、247和249中的一個或幾個上發生突變的PE。
3.如權利要求1的蛋白，其中，所述PE部分包括所述外毒素的功能域II和III。
4.如權利要求1的蛋白，其中，所述MBP部分與所述PE部分是直接連接的。
5.如權利要求1的蛋白，其中，所述MBP部分和所述PE部分通過一個重復1-3次的五肽連接。
6.如權利要求5的蛋白，其中，所述五肽包括氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser。
7.一種編碼權利要求1-6中任一項所述蛋白的DNA序列。
8.一種質粒，含有一個可操縱地與權利要求7的DNA序列連接的啟動子。
9.一種能表達權利要求1-6中任一項所述蛋白的表達載體，它包括權利要求8的質粒。
10.一種藥用組合物，含有權利要求1-6中任一項所定義的嵌合蛋白和一種惰性載體。
11.如權利要求10的藥用組合物，還包括一種溶菌性營養劑。
12.一種治療自身免疫病的方法，包括給患有這種病的患者施用權利要求10的藥用組合物。
13.一種治療自身免疫病的方法，包括給患有這種病的患者施用權利要求11的藥用組合物。
14.如權利要求12的方法，其中，所述疾病是多發性硬化。
15.如權利要求13的方法，其中，所述疾病是多發性硬化。
全文摘要
披露了一種含有與髓磷脂堿性蛋白(MBP)部分連接的銅綠假單胞菌外毒素(PE)部分的嵌合蛋白。所述MBP部分選自:(a)MBP;(b)豚鼠髓磷脂堿性蛋白或其抗原性部分的氨基酸69—88;(c)人髓磷脂堿性蛋白或其抗原性部分的氨基酸84—102;(d)人髓磷脂堿性蛋白或其抗原性部分的氨基酸143—168;和(e)在(a)、(b)、(c)或(d)的氨基酸序列中有一個或幾個氨基酸缺失、添加、取代或突變了的氨基酸序列,修飾過的序列(e)仍保持分別與氨基酸序列(a)、(b)、(c)或(d)至少有75%的同源性。該嵌合蛋白可用于治療自身免疫病,尤其是多發性硬化。
文檔編號A61K38/00GK1207132SQ96199470
公開日1999年2月3日 申請日期1996年11月17日 優先權日1995年11月17日
發明者H·洛伯博姆高斯基, I·斯坦伯格, E·伯勞德, I·瑪利亞諾夫斯基, S·雅可尼 申請人:耶路撒冷希伯來語大學依蘇姆研究開發公司