專利名稱：對癌癥的易感性診斷及其治療的制作方法
技術領域：
本發明涉及檢測病人是否患有癌癥或是否對癌癥易感的方法，還涉及治療癌癥，尤其是前列腺癌的方法。
前列腺癌在許多國家已成為最重要的疾病。在過去的20年間，其死亡率翻了一倍并且現已為英格蘭和威爾士的男性癌癥死亡的第二個最常見的原因(死亡率統計英格蘭人和威爾士人的死因。OPCS DH2 19，1993，HerMajesty’s Stationery office)。在過去的十年中，前列腺癌的流行增長了28％并且現已占英格蘭和威爾士男性癌癥的總數的12％(癌癥統計英格蘭和威爾士的記錄。OPCS MBI No22，1994，Her Majesty’s Stationery Office)。這種增長以及最近許多公眾死于前列腺癌使得為此種癌癥做些工作的要求更加突出。已建議能更廣泛地普查可以減少前列腺癌的死亡率。
當前前列腺癌普查由直腸檢查和前列腺特異抗原(PSA)水平檢測組成。這些方法由于手指直腸檢查具有相當大的檢查者間的差異(Smith和Catalona(1995)“泌尿科學”(Urology)45，70-74)以及PSA水平可因良性前列腺增生(BPH)，前列腺炎癥和其它疾病而升高而缺少特異性。在超過22,000名男性的前瞻性研究(內科醫師健康研究)中，在366名已生前列腺癌的男性患者表現出以PSA為檢測指標的診斷試驗是比較失敗的。PSA水平是在研究開始時貯存的血清中測定的，而僅有47％的生前列腺癌的男性在隨后的四年中發現有升高的水平(Gann等人(1995)，“美國醫學協會雜志”273，289-294)。
目前的普查方法因而不能令人滿意。
細胞遺傳和等位缺失研究指出一些染色體區域可與前列腺癌有關。Cannon-Albright和Eeles(1995)在“自然，遺傳學分冊”(Nature Genetics)9，336-338(文獻1)中從雜合子缺失(LOH)研究討論了前列腺癌易感基因座的抑癌候選區域，其存在于人染色體的3p，7q，8p，9q，10p，10q，11p，13q，16q，17p，18q和Y區域；而Brothman等人(1990)的“癌癥研究”(Cancer Res.)，50 3795-3803中研究了人前列腺腺癌的細胞遺傳學信息，表明了染色體1，2，5和Y丟失以及7，14，20和22的獲得，并且涉及染色體臂2p，7q和10q的重排是最常見的。Gao等人(1994)，“癌基因”(Oncogene)，9，2999-3003中的研究表明在前列腺腺癌中發現了3p，5q，6p，7p，8p，10q，11p，13q，16q，17p和Xq染色體中至少一個中的陽性突變基因表型；而Massenkeil等(1994)，“抗癌研究”(Anticancer Res.)，14(6B)，2785-2790中表明在各種前列腺癌樣品的8p，17p，18q都發現了LOH，但在十四種有報道的前列腺癌的10q上都沒有發現缺失。Zenklusen等(1994)“癌癥研究”，54，6370-6373提示在7q31.1上有一個可能的抑癌基因。此外，已有其它報道描述了其它染色體缺失或異常。
因此，大多數人類染色體的缺失或異常已由一個或另一個研究小組發現與前列腺癌相關。
一些腫瘤表現出精確的10q23-q25(2，3)區域缺失，提示在此區域有抑癌基因。已建議將編碼Mgc癌蛋白質的負調節蛋白并在10q25上的Mxil視為該抑癌基因的候選基因(4)，近來已描述了Mxil在一些前列腺癌中潛在的功能失效突變。Mxil在一些前列腺癌病例中表現出等位缺失和突變，并且已斷定其可能促使該常見惡性腫瘤的病理性或致瘤性演變(5)。
本發明的目的是提供更好的診斷癌癥和檢測對癌癥特別是前列腺癌的易感性的方法；提供可用于該方法的核酸；以及提供與前列腺癌相關的抑癌基因。
使用基于帶有已充分報道的微衛星CA重復標記的等位型的熒光，本發明人已作出了跨越10q23-q25的詳細的缺失圖，使得可以嚴格地定義可能與腫瘤發展相關的10q缺失區域。此外，本發明人已檢測了前列腺癌中Mxil缺失和突變的頻率以弄清該基因在前列腺癌進展中的意義。
本發明人的資料顯示前列腺癌抑癌基因存在于10q23-q24邊界附近，其在絕大多數(22/23)顯示缺失的腫癌中被刪除。相反，與10q23-q25的其它區域或全部區域的缺失相對應的Mxil特異性缺失僅在1/23腫瘤中有發現，并伴有10q23-q24邊界的標記缺失。
此外，本發明人通過單鏈構象多態性(SSCP)分析或直接DNA測序都沒有在表現出Mxil相關性標記缺失的腫瘤中檢測出任何Mxil突變，并且本申請人的資料顯示Mxil離已鑒定的染色體10區域20厘摩。本發明人發現缺失10q的全部腫瘤已缺失了下文詳述區域。
本發明的第一個方面是提供一種能選擇性地雜交于人類染色體10區域的核酸，而該區域與由標記D10S541和D10S215所定義的DNA相鄰接，條件是該核酸不是任何一種酵母人工染色體(YACs)746-H-8，821-D-2，831-E-5，921-F-8，738-B-12，796-D-5，829-E-1，678-F-1，839-B-1，734-B-4，7B-F12，757-D-8，773-C-2，787-D-7，831-E-9，855-D-2，855-G-4，876-G-11，894-H-5，922-E-6，934-D-3，964-A-8，968-E-6或24G-A10，也不是任何如表3-22所述的已表達序列標志(ESTs)，并且也不是任何一種細菌人工染色體(BACs)或P1衍生的人工染色體(PACs)B2F20，P40F10，P72G8，P74N2，P274D21，B76I10，B79A19，B7901，B93F12，B122L22，P201J8，P201P5，P209K3，P316N14，B46B12，B60C5，B145C22，B150K4，B150N3，B181F15，and 188L22。
人類染色體10上的各種標記物(包括D10S541和D10S215)位點如圖5所示。當提到這些ESTs時，本發明人是指那些公開于所參照的表中的序列，并且更具體是衍生出該序列的特異性cDNA克隆。
“選擇性雜交”是指該核酸帶有足夠的類似于其能在中等或高度嚴格的條件下雜交的染色體10DNA的核苷酸序列。如本領域所周知，核酸雜交的嚴格性依賴于諸如發生雜交的核酸長度，雜交序列的同一程度的因素以及諸如溫度，離子強度和該序列中CG或AT含量的因素。
能選擇性地雜交于該染色體10 DNA的核酸包括那些至少有一部分核酸與該染色體10DNA有＞95％的序列相同，優選地有＞98％的，更優選地有-99％的序列相同的核酸。眾所周知，人類基因通常含有內含子使得諸如衍生于該染色體10DNA中的基因的mRNA或cDNA不能在其全長上與該染色體10DNA完全配對但仍然是能選擇性地雜交于染色體10的該區域的核酸。
常見的導致選擇性雜交的中等或高度嚴格的雜交條件是本領域內周知的，比如，那些描述于“分子克隆，實驗手冊”，第二版(Sambrook等(編)，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，美國)中的方法。
當核酸固定在尼龍膜上并且探針核酸≥500個堿基(對)時，一個常用的雜交溶液的實例是6×SSC(檸檬酸鈉鹽)0.5％十二烷基硫酸鈉(SDS)
100μg/ml變性的，斷裂的鮭魚精DNA該雜交在68℃下進行。該固定有核酸的尼龍膜可于68％下在1×SSC中洗滌，而對于高度嚴格條件是在0.1×SSC中洗滌。
20×SSC可以下述方式制備。將175.3gNaCl和88.2g檸檬酸鈉溶于800mlH2O中。用幾滴10N的NaOH溶液調節其pH至7.0。用H2O將其體積調至1升。分成若干等份。高壓滅菌。
當核酸固定于尼龍膜上并且探針為15-50個堿基的寡核苷酸時，一個常用的雜交溶液的實例是3.0M氯化三甲銨(TMACl)0.01M磷酸鈉(pH6.8)1mM乙二胺四乙酸鈉(EDTA)(pH7.6)0.5％SDS100μg/ml變性的，斷裂的鮭精DNA0.1％脫脂奶粉最佳的雜交溫度通常選為比給定的鏈長的Ti低5℃。Ti是探針和其靶序列間所成的雜交體的不可逆解鏈溫度。Jacobs等(1988)，“核酸研究”，16，4637討論了Ti的測定。對在3M TMACl中的17基體的建議雜交溫度為48-50℃；對19基體的為55-57℃；而對20基體則為58-66℃。
“能選擇性雜交的核酸”還包括那些會用任何周知的擴增系統，如那些在下文中更詳細地描述的，特別是聚合酶鏈式反應(PCR)擴增來源于該染色體10區域的DNA的核酸。PCR擴增的合適條件包括在合適的1×擴增緩沖液中擴增10×擴增緩沖液是500mM KCl；100mMTris·Cl(在室溫下pH8.3)；15mMMgCl2；0.1％明膠。
合適地，該擴增的退火部分介于37℃和60℃(優選地為50℃)間。
標志D10S541和DS10S215定義了染色體10上諸如1993-1994Genethon人類遺傳連鎖圖所示的區域，而該圖是由Gyapay等(1994)，“自然，遺傳學分冊”7，特別版第2期，246-339所描述。
上述的YACs都是公眾可從CEPH大-YAC文庫或ICI YAC文庫(7B-F12和24G-A10)，或從人類基因組圖譜計劃資源中心(Hinxton Hall，Hinxton，Cambridgeshire，CB10 1RQ，UK)獲得。參照CEPH-Genethon Quickmap數據庫(Cohen等(1993)“自然”366，698-701)得到YACs在該遺傳連鎖圖上的位置。上述的已表達序列標志序列見于表3-22，而這些均可購自Genbank，國家生物技術資料中心，國家醫學資料庫，Bldg 38A，國家健康研究所，Rockville Pike，Bethesda，MD20894，USA。如下文中所詳述，特別優選的本發明的核酸是能雜交于對應于克隆IMAGE 264611的cDNA插入片段的基因的核酸。
IMAGE克隆264611是公眾可購自Research Genetics，Inc(2130 MemorialParkway，SW Huntsville，AL 35801，USA)及其它IMAGE來源，如美國典型培養物保藏中心，Rockville，MD 20852，USA，Genome Systems Inc，8629Pennell Drive，St Louis，Missouri，MO 63114，USA，UK-HGMP ResourceContre，Hinxton，Cambridge CB10 1sB。該克隆可如ESTsN29304和N20238(見表9和10)的內封資料所述而獲得。該克隆存在于一改進的Pharmacia pT7T3載體中。名稱pT7T3D-Pac(氨芐青霉素抗性；50μg/ml)宿主DH10B載體類型質粒多接頭序列(修飾的)tttaatacgactcactatagggaatttggccctcgaggccaagaattcccgactacgtagtcggggatccgtcttaattaagcggccgcaagcttattccctttagtgagggttaattttagcttggcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagag該IMAGE264611克隆的插入片段序列如圖6所示。
下述克隆含有相同于IMAGE克隆264611的基因部分的序列，這是由于其重疊形成了大的毗連序列。所有的克隆除非另有說明均可以實物免費獲得。每個克隆的通常為從5′或3′端的一些序列可為用于制備下述探針的EST。
該克隆及其EST列于GenBank和EMBL資料庫。
EST cNDA克隆表號AA009519 IMAGE 365465(5′)3AA009520 IMAGE 365465(3′)4AA017563 IMAGE 361374(3′)5C01084- 6H92038 IMAGE 221326(5′) 7H92039 IMAGE 221326(3′) 8N20238 IMAGE 264611(3′) 9N29304 IMAGE 264611(5′) 10N35389 IMAGE 272092(3′) 11N48030 IMAGE 272092(5′) 12R06763 IMAGE 126556(3′) 13R06814 IMAGE 126556(5′) 14R29457 F1-578D(5′)15T05157 HFBCS42 16T60214 IMAGE 81420(5′)17W23656 IMAGE 30663218W27533 - 19W30684 IMAGE 309597(5′) 20W81026 IMAGE 347316(5′) 21W81062 IMAGE 347316(3′) 22優選地，該核酸能選擇性地雜交于染色體10上與標志D10S541和AFM337×f9相鄰接的區域。有關標志AFM337×f9的資料可自由地獲自Genethon，lrue de L′International，91000 Evry，France。現將AFM337×f9稱作D10S1765。
尤其優選地，該核酸能選擇性地雜交于YACs，746-H-8，821-D-2，831-E-5，921-F-8，796-D-5，829-E-1，839-B-1，734-B-4或24G-A10中的任一種來源于人的DNA；還更加優選地，該核酸能選擇性地雜交于YACs 746-H-8，921-F-8，821-D-2，831-E-5，796-D-5，24G-A-10或734-B-4中任一種人源DNA。要知道的是YAC含有需要能在酵母中增殖和維持的DNA。優選的本發明核酸是那些選擇性地雜交于YAC中的人源DNA而非YAC中諸如酵母DNA的其它DNA。
IMAGE克隆264611的人源cDNA插入片段雜交于至少一種YAC克隆921F8，746H8，821D2，831E5，796D5和24GA10。
IMAGE克隆264611的人源cDNA插入片段雜交于至少一種BAC(細菌人工染色體)克隆B2F20，B46B12，B60C5，B150K4，B150N3，B145C22，B181F15，及B188L22，但不雜交于B76I10，B79A19，B7901，B93F12和B122L22。
公眾可自Research Genetics，2130 Memorial Parkwary，SW Huntsville，AL35801，USA和Genome Systems Inc，8629 Pennell Drive，St Louis，Missouri，MO63114，USA獲得BAC克隆。
IMAGE克隆264611的人源cDNA插入片段雜交于至少一種PAC(源于P1的人工染色體)克隆P40F10和p274D21，但不雜交于P72G8，P74N2，P201J8，P201P5，P209K3和P316N14。
公眾可自Sanger Centre，Wellcome Trust Genome Campus，Hinxon，Cambridge CB101SA，UK獲得該PAC克隆。
雖然本發明的核酸可為RNA或DNA，但DNA是優選的。盡管本發明的核酸可為雙鏈或單鏈的，但單鏈核酸是優選的。
本發明的核酸若為雙鏈的，則可能很大，如100kb。的確，諸如抑癌基因的基因通常是這樣大的。然而，用于診斷，探測或擴增目的的，其優選地為小于10000，更優選地為小于1000，再更優選地為10-100，而進一步優選地為15-30堿基對(若該核酸為雙鏈的)或堿基(若該核酸為單鏈的)。如下文中所更詳細地描述的，適于在PCR中使用的單鏈DNA引物是特別優選的。
本發明特別優選的核酸是那些能雜交于相應于衍生出EST序列N29304和N20238的克隆IMAGE 264611的cDNA插入片段的基因的核酸。N48030和N20238的序列和信息收錄于GenBank和EMBL資料庫中(見表9-12)。該基因的片段和變體，以及可由該基因編碼的mRNA衍生的cNDA也是本發明優選的核酸。“相應于克隆IMAGE 264611的cDNA插入片段的基因“是指那些在部分復制時編碼產生該克隆中的cDNA插入片段的基因。
很明顯，該基因本身及其變體和片段是本發明優選的核酸。“基因”不僅包括內含子和外顯子，也包括與內含子和外顯子相關的和物理上靠近的調節區，尤其是那些5′端至最靠近5′的外顯子的調節區。
基因“片段”包括該基因的長度為至少15個核苷酸(單鏈或雙鏈)的任何部分，而更優選的片段長度為至少20個核苷酸，最優選地為長度為至少50個核苷酸并且可以為至少100個核苷酸或為至少500個核苷酸。優選地，該片段為不超過50kb，而更優選地為不超過100kb。
基因的“變體”特別包括cDNA，無論是部分或全長，或是否是復制于mRNA的任何剪接變體。還特別包括一種與天然基因相比在該基因或其片段或cNDA存在有核苷酸取代(包括倒位)，插入和缺失的核酸。變體和片段都是根據其所期望的目的而選擇的；為探測，擴增或診斷目的一般需要比用于表達治療用途的產品的目的所需的更短的片段，但需要序列同一度更高(例如，至少80％，90％，95％或99％)，而后者一般需要較長的片段，但若需要，可利用遺傳密碼的豐余序列。
尤其優選地，本發明的核酸是能用于擴增一部分相應于克隆IMAGE264611的cDNA插入片段的基因的寡核苷酸引物。
本發明的核酸還優選地包括全部或部分該基因并且可用作雜交探針。
IMAGE 264611的cDNA序列如
圖1所示。
該基因以及從該基因衍生的進一步的cDNA用本領域周知的方法最易于獲得的。例如，進一步的cDNA可用常規方法和IMAGE 264611克隆作為探針或可方便地從表1-19和附圖中所示的序列得到的其它探針分離于前列腺cDNA文庫。該序列可用常規方法方便地檢測。類似地，該基因可用常規方法使用IMAGE264611克隆作為探針或其它可方便地從表1-19和附圖中的序列得到的探針分離于人基因組DNA文庫。
前列腺cDNA文庫可用常規的分子生物學方法獲得或獲自ClontechLaboratories，Inc，1020 East Meadow Circle，Palo Alto，California 94303-4230，USA。
常規的篩選DNA文庫，分離和操作克隆的DNA以及DNA測序的方法見于Sambrook等(1989)，“分子克隆，實驗手冊”，第2版，Sambrook等編，冷泉港出版社，冷泉港，紐約。
預知的由IMAGE克隆264611或表3-22中所示的核苷酸序列編碼的氨基酸序列可用于制備肽，而該肽本身又可用于制作抗體。該抗體可用于篩選cDNA表達文庫或用于分離該基因編碼的多肽。一旦分離出該多肽，則其N-末端序列可用本領域周知的方法獲得。然后，該氨基酸序列可用于設計鑒定cDNA的5′編碼區的寡核苷酸探針。
要知道的是該cDNA的5′末端可用作為本領域周知的技術的RACE(cDNA末端的快速擴增；Schaefer(1995)“生物化學年鑒”(Ahal.Biochem.)，227，255-273)分離。此方法，以及相關的方法，包括用基于現已知的5′序列的一個引物從mRNA反轉錄，而該引物回過來對mRNA轉錄物的5′末端起作用，隨后再通過使用隨機引物從“未知”的5′端引發PCR。基于mRNA的cDNA末端快速擴增法(RACE)也可用于通過分離mRNA，除去5′帽結構而得到5端，然后將該5′端連接到銜接子序列，隨后用一個針對該銜接子的引物以及一個對目標cDNA特異的引物進行PCR。
分離基因和部分基因的方法描述于以參考文獻并入本發明的人類遺傳學常規方法，1996，Dracopoli等(編)，John Wiley和Sons。一個有用的技術是“小載體體”PCR(“vectorette”PCR)。
小載體PCR可用于鑒定新基因，或鑒定部分基因序列是已知的附加序列。該小載體本身是一個帶有錯配的中心區域以及適于連接到限制酶切的合成DNA上的末端的雙鏈部分(描述于“人類遺傳學常用方法”，1995(5.9.15-5.9.21頁)以及Valdes等(1994)美國國家科學院院刊，91，5377-5381以及Allen等“PCR方法和應用”4，71-75)。在將該小載體連接到衍生于合適的DNA來源(通常為諸如YAC克隆的大基因組DNA片段)的限制性片段后，用一衍生于靶DNA的引物以及一個衍生于該小載體的錯配區域的引物進行PCR擴增。此小載體引物是有與此錯配區域的下鏈相同的序列并因此沒有在PCR的第一個循環中退火的互補序列。由于引發僅從靶DNA內的引物發生，所以第一個循環的擴增是非定向的。此產生出在第二個PCR循環中小載體PCR引物退火的互補鏈。在第二個及隨后的PCR循環中，兩個引物均能引導DNA合成，而最終結果僅為擴增了d含目的序列的片段。
此技術可用于以了解一個基因的cDNA序列為基礎來鑒定該基因的內含子序列。在限制性消化帶有目的基因的基因組DNA片段(如YAC克隆)以及隨后的連接到該小載體后，從cDNA序列設計的引物以及該小載體引物一起用于PCR擴增該基因的特異片段。外顯子/內含子邊界可通過比較該片段和cDNAd序列而鑒定。此方法和衍生于cDNA克隆264611的引物用于鑒定內含子序列(見圖8-15)。
類似地，小載體方法可通過使用衍生于該已知的cDNA序列的5′端的引物而鑒定基因的未知的5′端以產生進一步的5′序列數據。
小載體也可在稱為“島拯救”(‘island rescue’)的技術中用于鑒定完全新的基因序列。此法發現富集CpG的“島”存在于哺乳動物基因組中并且該島與基因的5′端相關。某些限制性酶如NotI酶可在CpG島中切割。在NotI消化基因組DNA片段后，帶有NotI-可容性粘性末端的小載體被連接到所得的亞片段上。然后，用該小載體引物和衍生于Alu重復因子(Alu repeatelement)的引物一起用于PCR擴增。該因子常見于人類基因組中，因此有可能有一個或多個毗鄰于目的CpG島并便于PCR產物的產生。作為對照，進行了包括該小載體引物的第二個PCR反應。任何產生于Alu/小載體引導的反應而不存在于僅有Alu的對照反應的片段都應代表部分的CpG島并可用常規方法進行凝膠-純化及分析編碼序列。
由對應于cDNA克隆IMAGE 264611或表3-22中所示的核苷酸序列的基因編碼的多肽的某些序列與張力蛋白(與細胞骨架/胞外基質相互作用相關的蛋白)多肽相似；而且至少在核苷酸序列水平上可見與輔助蛋白(與蛋白質通過包被有網格蛋白的小泡運輸到細胞膜相關的蛋白)的相似性。張力蛋白和輔助蛋白間的序列相似性也已有報道。
本發明優選的核酸包括抑癌基因或其片段或變體。該抑癌基因與諸如前列腺癌，黑素瘤，神經膠質瘤或非何杰金氏淋巴瘤的癌癥的發生或發展相關。合適地，該抑癌基因涉及前列腺癌，特別是前列腺腺癌的發生或發展。
本發明的包括抑癌基因或其片段或衍生物的核酸是可方便地鑒定的；比如，該基因可通過從前列腺和其它腫瘤細胞系中篩選一系列RNA以鑒定降低水平的轉錄物而鑒定。由于其可能具有復雜的功能以及有幾個功能失效突變“襲擊”的位點(比如抑癌基因BRCAl，RB)，所以該轉錄物可能較大。種間交叉保守提示該基因具有基本的細胞“管家”功能，其丟失可導致生長控制的丟失和腫瘤形成。
“抑癌基因”包括其功能或活性的任何丟失或減弱會導致腫癌的基因。
腫瘤中抑癌基因的全部編碼區域的分析表明當該基因較之于非腫瘤組織或沒有以及不易感前列腺癌的個體的基因發生了變化的情況下，該基因為抑制基因，并且與腫瘤，如前列腺癌相關。合適的突變分析方法包括單鏈構象多態性分析(SSCP)(或該技術的變更方法)以及直接的DNA測序。這些都是本領域的熟練技術人員所周知的，比如SSCP見于“人類遺傳學常用方法”，1995，7.4.1.-7.4.6頁。
任何本發明的抑癌基因幾乎無容置疑地含有內含子(如同相應于IMAGE克隆264611的基因的一樣)并幾乎當然地為＞1.5kb，更可能地為＞1.0kb，而最可能地介于1.0kb和500kb之間。IMAGE克隆264611中的cDNA插入片段為大約1.7kbp。本發明的任何抑癌基因幾乎當然地是DNA序列多態性的。因此，片段(如限制性片段或酶擴增產生的片段)和變體(如天然變體，如等位變體)或通過體外操作產生的變體是本發明的部分。合適的這種片段包括用作雜交探針或擴增引物的片段。合適的這種變體包括其中的該基因的編碼意義未變的或其中的編碼序列被修飾以改變該編碼的多肽特性的變體。
雖然本發明的任何抑癌基因幾乎當然地最終編碼一種多肽，其可能編碼一RNA種類，而該RNA種類并不編碼多肽。
更優選地，該核酸包括抑癌基因的核酸產物；或其衍生物或片段或變體。該核酸包括從抑癌基因轉錄的mRNA。
尤其優選地，該核酸是從抑癌基因轉錄的mRNA中產生的cDNA(復制DNA)。從選擇的組織，如從前列腺或前列腺癌組織而來的cDNA文庫是本領域中周知并且可用本領域周知的，如描述于“分子克隆，實驗手冊”(同上)的方法從合適的mRNA中制備。
表3-22中所述的核苷酸序列是部分cDNA的部分序列，而該cDNA衍生于相關的，選擇性雜交的mRNA，并且幾乎當然是轉錄于人染色體10的區域(其毗鄰于標志D10S541和D10S215定義的DNA)存在的基因。圖8-15中所示核苷酸序列包括對應于IMAGE克隆264611的基因中內含子的序列。更特別地，本發明人發現包括表3-22以及圖6和8-15的序列雜交于前述的YAC，BAC和PAC克隆中的至少一種。因此，表3-22以及圖6的核苷酸序列代表至少一個發現于人染色體10區域的基因的mRNA的產物，而該區域毗鄰于標志D10S541和D10S215定義的DNA；更具體地位于YAC克隆定義的亞區域內。尤其優選的實施方案包括能選擇地雜交于與標志D10S541和D10S215所定義的DNA毗鄰的人染色體10區域的核酸以及表3-22B圖6和8-15中任何一個所述的人源序列的核酸，條件是該核酸不是YAC 746-H-8，821-D-2，831-E-5，921-F-8，738-B-12，796-D-5，829-E-1，678-F-1，839-B-1，734-B-4，7B-F12，757-D-8，773-C-2，787-D-7，829-E-1，831-E-9，855-D-2，855-G-4，876-G-11，894-H-5，921-F-8，922-E-6，934-D-3，964-A-8，968-E-6或24G-A10中的任一種，并且不是描述于表3-22的多核苷酸中的任一種，也不是BACs或PACs B2F20，P40F10，P72G8，P74N2，P274D21，B76110，B79A19，B7901，B93F12，B122L22，P201J8，P201P5，P209K3，P316N14，46B12，B60C5，B145C22，B150K4，B150N3，B181F15，和B188L22中的任一種。
顯而易見的是，本領域的熟練技術人員可利用表3-22及圖6和8-15中所給出的序列信息鑒定對應于IMAGE克隆264611的基因。
尤其是，優選該核酸包括衍生出表3-22及圖6和8-15中任何一種序列的基因或其片段或變體。該核酸還優選地包括全長cDNA或至少為mRNA轉錄物的50％長度；更優選地為大于75％長度；更優選地為大于95％長度的cDNA。
可能需要亞克隆該核酸，特別是當全部或部分編碼該蛋白的序列待表達時。
一般地，該DNA以合適的方向和正確的表達閱讀框架插入到諸如質粒的表達載體。若需要，該DNA可連接到由所需的宿主識別的合適的轉錄和翻譯調節控制核苷酸序列，雖然這樣的調控元件一般在表達載體中也可以獲得。然后將該載體通過標準技術引入該宿主。通常，并非所有宿主均都被該載體轉化。因此，需要篩選轉化的宿主細胞。一個篩選技術包括將任何需要的調控元件并入表達載體DNA序列，而該調控元件能在轉化的細胞中編碼可選擇的特征，如抗生素抗性。或者，這種可選擇的特征的基因可存在于另一載體中，而該另一載體用于共轉化該所需的宿主細胞。
然后，將已被本發明的重組DNA轉化的宿主細胞以由本說明書所公開的內容看來是充足的時間和本領域熟練技術人員周知的合適的條件培養以使該多肽表達，然后，回收該多肽。
已知許多表達系統，包括細菌(如E.coli和枯草芽胞桿菌)，酵母(如啤酒糖酵母)，絲狀真菌(如曲霉屬)，植物細胞，動物細胞和昆蟲細胞。
該載體包括諸如ColEl ori的在原核生物中增殖的原核復制子，即使該載體用于在其它非原核細胞型中表達。該載體還可包括諸如能指導基因在被其轉化的諸如E.coli的細菌宿主細胞中表達(轉錄和翻譯)的原核啟動子的合適的啟動子。
啟動子是一種由允許RNA聚合酶結合和轉錄發生的DNA序列形成的表達調控元件。與典型的細菌宿主相容的啟動子序列一般在含有便于插入本發明的DNA節段的限制性位點的質粒載體中提供。
典型的原核載體質粒是獲自Biorad Laboratories，(Richmond，CA，USA)的pUC18，pUC19，pBR322和pBR329以及獲自Pharmacia，Piscataway，NJ，USA的pTrc99A和pKK223-3。
典型的哺乳動物細胞載體質粒是獲自Pharmacia，Prscataway，NJ，USA的pSVL。該載體使用SV40晚期啟動子以驅動該克隆的基因的表達，而最高的表達水平見于諸如COS-1細胞的產生T抗原的細胞。
誘導型哺乳動物表達載體的實例是pMSG，其也可獲自Pharmacia。此載體使用小鼠乳腺瘤病毒的長末端重復的糖皮質素-誘導的啟動子驅動該克隆的基因的表達。
有用的酵母質粒載體是pRS403-406和pRS413-416并且通常可獲自Stratagene Cloning Systems，La Joua，CA92037，USA。質粒pRS403，pRS404，pRS405和pRS406是酵母整合型質粒(YIps)并摻入該酵母可選擇的標志HIS3，TRP1，LEU2和URA3。質粒pRS413-416是酵母著絲粒質粒(YCps)。
已研究了各種方法以通過互補粘端而可操作地將DNA連接到載體上。比如，可將互補的同聚體序列加到待插入載體DNA的DNA節段中。然后，通過該互補同聚體尾部的氫鍵將載體和DNA節段連接形成重組體DNA分子。
含有一個或多個限制性位點的合成接頭提供了一個將DNA節段連接到載體的替代方法。由前述的核酸內切酶消化產生的DNA節段用T4噬菌體DNA聚合酶或E.coli DNA聚合酶I處理，而這些酶可用其3′-5′核酸外切活性除去突出的3′-單鏈末端，而用其聚合活性填補3′凹端。
因此，這些活性的組合產生了平端的DNA節段。然后，將其在能催化平端DNA分子連接的酶(如T40噬菌體DNA連接酶)存在下用摩爾數大大過量的接頭分子溫育。從而，該反應的產物是在其末端帶有多聚接頭序列的DNA節段。然后，用合適的限制酶切割該DNA節段并連接到已用產生相容于該DNA節段的末端的酶切的表達載體上。
含各種限制性內切酶位點的合成接頭是可購于包括InternationalBiotechnologies Inc.，New Haven，CN，USA的許多商家。
本發明的第一方面尤其優選的核酸是選擇于由適于擴增核酸的引物的組合中的那些。合適地，該核酸選擇于那些雜交于表3-22及圖6和8-15中任一所述的核苷酸序列，或其互補序列的引物的組合。
尤其優選地，擴增引物雜交于基因的內含子。若加工的假基因存在，它們是尤其有用的。因此，優選地，該核酸選擇于那些雜交于圖6和8-15所給出的序列，或其互補序列的引物的組合中的。
適用于聚合酶鏈式反應(PCR，Saiki等(1988)，“科學”(Science)239，487-491)的引物是優選的。合適的PCR引物可具有下述特征眾所周知，該寡聚核苷酸5′端的序列無需配對于待擴增的靶序列。
通常，該PCR引物彼此不含任何超過2個堿基的互補結構，尤其是在其3′端，這是由于此特征可促進稱為“引物二聚體”的人工產物的形成。當兩個引物的3′端雜交，其形成“引物模板”復合物，而引物延伸導致稱為“引物二聚體”的短雙螺旋產物。
應避免引物中的內部二級結構。對于對稱PCR來說，通常建議的兩個引物的G+C含量為40-60％，沒有任一堿基有長的延伸。所用常規解鏈溫度計算連同DNA探針雜交研究通常指出指定引物應在特定的溫度下退火或者72℃的延伸溫度將提前解離引物/模板的雜交體。實際上，雜交體在PCR過程比通常由簡單的Tm計算預測的更有效。
最佳的退火溫度可通過經驗決定而且可能高于預測值。Taq DNA聚合酶在37-55℃區間的確有活性，所以在退火步驟中會發生引物延伸并且會穩定化該雜交體。常規(對稱)PCR中該引物的濃度相等，并通常介于0.1-1μM的范圍。
在本發明的方法中可使用任何核酸擴增方法，包括PCR，QB復制酶和連接酶鏈式反應。NASBA(基于核酸序列的擴增，也稱為3SR)也可如Compton(1991)“自然”，350，91-92和“艾滋病”(AIDS)(1993)，第7卷(增刊2)，S108中所述使用或者SDA(鏈置換擴增)可如Walker等(1992)“核酸研究”(Nucl.Acids Res.)20，1691-1696中所述使用。PCR由于其簡單性，是尤其優選的。
若本發明的一對合適的核酸用于PCR，通過凝膠電泳和溴化錠染色檢測該產物是方便的。作為用瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色該DNA而檢測該DNA擴增產物的替代方法，使用標記的能雜交于擴增的DNA的寡核苷酸作為探針是方便的。若該擴增是通過PCR，該寡核苷酸探針雜交于該兩個引物定義的內引物序列。該寡核苷酸探針長度優選地介于10-50個核苷酸之間，更優選地介于15-30核苷酸之間。該探針可通過常用技術用諸如32P，33P和35S的放射性核素標記，或者用熒光染料標記。若其用熒光標記，該擴增的DNA產物可在溶液中檢測(例如見于Balaguer等(1991)“用生物發光吸收劑定量PCR產生的DNA序列”，“生物化學年鑒”，195，105-110和Dilesare等(1993)”一個高靈敏度的基于電化學發光的用于自動定量PCR產物的檢測系統”，“生物技術”(Bio Techniques)，15，152-157。
PCR產物也可用帶有熒光團-猝滅劑對或附著于固相支持物或帶有生物素標記的探針檢測或者用捕獲探針和檢測器探針的組合檢測。
熒光團-猝滅劑對尤其適于PCR反應(如RT-PCR)的定量檢測。用合適的探針的熒光偏振也可用于檢測PCR產物。
進一步優選的核酸是那些作為PCR引物的核酸，而這些引物可參照圖6和8-15所示的序列進行選擇。這些引物用于擴增衍生于相應于cDNA克隆IMAGE 264611的基因的DNA。這些引物包括，但不局限于，圖8-15中以黑體給出的序列(見圖例)。該下游(3′)的引物是黑體所示序列的反向互補序列。
寡核苷酸引物可用本領域周知的方法合成，比如通過固相亞磷酰胺化學合成。
本發明的第二方面是提供能選擇性地雜交于毗鄰于標志D10S541和D10S215所定義的DNA的人染色體10區域，并包括一個可檢測的標記的核酸。
“可檢測的標記”包括任何方便的放射性核素標記，如32P，33P或32S，其可以周知的方法摻入核酸分子；還包括任何能方便地摻入核酸的熒光或化學發光標記。此外，術語“可檢測的標記”還包括那些能通過結合到另一組成成份而檢測的成分(如可通過結合到鏈霉親和素而檢測的生物素)；以及能通過其將無色化合物轉變成有色化合物，或反過來的能力而檢測的成份，如酶(例如，堿性磷酸酶可將無色的鄰硝基苯磷酸轉變成有色的鄰硝基苯酚)。方便地，該核酸探針可在固定檢測中占有一些位點，而該核酸是否雜交到人染色體10的所述區域可通過在固定檢測中參照雜交位點而測定。可檢測的標記也可以是如Tyagi和Kramer(1996)“自然生化技術”(Nature Biotechnology)14，303-308中所述的熒光團-猝滅劑對。
優選地，該核酸包括如表3-22所述的任一已表達序列標志(ESTs)中的人源序列或者圖6所述的cDNA或者如圖8-15所示的內含子序列，其還含有可檢測的標志；或者該核酸包括“酵母人工染色體”(YACs)921-F-8，746-H-8，821-D-2，831-E-5，796-D-5，24G-A-10或734-B-4或BAC克隆B2F20，B46B12，B60C5，B150K4，B150N3，B145C22，B181F15，B188L22，或PAC克隆P40F10，和P274D21中任一種的人源序列。
尤其優選地，核酸是本發明的第一方面的并帶有可檢測的標記的那些核酸。
本發明的第三個方面提供了一個測定患者對癌癥的易感性的方法，包括步驟(i)獲得帶有患者核酸的樣品；以及(ii)將該核酸和能選擇性地雜交于毗鄰由標志D10S541和D10S215定義的DNA的人染色體10區域的核酸接觸。
該方法適于檢測患者對任何癌癥的易感性，但所檢測的癌癥優選地為前列腺癌，黑素瘤，神經膠質瘤或非何杰金氏淋巴瘤。該方法最適于檢測患者對前列腺癌的易感性。相應地，至少對于檢測對前列腺的易感性來說，患者是男性。
人染色體10的部分的存在或不存在可通過本發明的第三，第四，第五方面的方法測定，而在本發明的第三，四，五方面的優選實施方案中，能選擇性地雜交于該人染色體10區域的核酸是適于擴增染色體10的該區域的一部分的核酸。
本發明的第四方面提供了一個診斷患者癌癥的方法，包括步驟(i)獲得含患者核酸的樣品；以及(ii)將該核酸和能選擇性地雜交于毗鄰于標志D10S541和D10S215定義的DNA的人染色體10區域的核酸接觸。
該方法尤其適于區分前列腺瘤和增生。也已發現由于所有缺失10q的腫癌都缺少本文所述的區域，可用本發明的標志和其它標志(包括在其它染色體上的標志)進行有差別的診斷試驗。
本發明的第五方面提供了一個預測患者的尤其是癌癥結果的有關前景的方法，包括步驟(i)獲得含患者核酸的樣品；以及(ii)將該核酸和能選擇性地雜交于毗鄰于標志D10S541和D10S215定義的DNA的人染色體10區域的核酸接觸。
雖然任何含有患者的核酸的樣品均可用于本發明的第三，四和五方面的方法中，該樣品優選地選自前列腺組織，血液，尿或精液。前列腺組織可用常規的外科技術來獲自患者。該前列腺的少量細胞發現于尿液和血液中。雖然，優選含患者核酸的樣品是或直接來源于患者細胞，如前列腺細胞，直接來源于患者的樣品，如培養于培養物中的細胞，也包括在本發明的范圍內。同樣地，雖然產生于患者的核酸可能實際上曾在患者體內，或者可以是由實際上曾經存在于患者體內的核酸復制。該腫瘤組織可取自原發腫瘤或轉移瘤，并尤其是取自該腫瘤的邊緣。
方便地，該能選擇性地雜交于毗鄰于標志D10S541和D10S215定義的DNA的人染色體10區域的核酸還含有一個可檢測的標記。該可檢測的標記包括上述與本發明的第二方面相關的標記。
要知道的是，前述方法可用于在癥狀發生前篩查易感腫瘤的患者。比如，大于60歲的男性比小于35歲的男性有更大的患前列腺癌的危險。類似地，該方法可用于如前列腺癌的腫瘤的病理分類。
方便地，在本發明的第三，四和五方面的方法中，能進行所述選擇性雜交的核酸(用或不用可選擇的標記標記)與患者的核酸在雜交條件下接觸。合適的雜交條件包括所述的與本發明的第一方面相關的那些。
優選地，血液，精液或尿液是該含患者的核酸的樣品源，而該樣品富含產生于前列腺的組織或細胞。可用諸如細胞分選方法(如使用諸如針對前列腺特異性抗原(PSA)的前列腺選擇性抗體的熒光激活細胞分選(FACS))獲得富集的前列腺細胞。該樣品源還包括活檢材料和腫瘤樣品，還包括固定的石蠟封固的樣品以及新鮮或冷凍的組織。
本發明的第三，四或五方面的方法可包括在有關區域的一個或多個相關位點的包括直接測序的DNA測序；PCR擴增的外顯子的直接測序；各種設計的在相關區域的有關位點雜交的寡核苷酸探針的雜交(方便地，在此將固定化的寡核苷酸探針用于本領域眾所周知的所謂的“chip”系統中)；在變性的凝膠電泳前用合適的限制性酶消化，優選地在此前擴增該相關的DNA區域；S1核酸酶序列分析；非變性凝膠電泳，優選地在相關DNA區域擴增之后；常規的RFLP(限制性片段長度多態性分析)檢測；異源雙鏈分析；用寡核苷酸的選擇性DNA擴增；熒光原位雜交分裂間期染色體；特定突變的ARMS-PCR(擴增難控制的突變系統-PCR)；雜交的核酸中的錯配位點的切割(該切割為化學或酶切割)，SSCP單鏈構象多態性或DGGE(不連續或變性的梯度凝膠電泳)；檢測退火的正常/突變體PCR擴增的DNA中的錯配的分析；以及蛋白質截短檢測(外顯子的翻譯和轉錄-若一個突變引入終止密碼子，將導致截短的蛋白產物)。也可使用其它方法，如用裂解I酶檢測由于一級序列變化所致的單鏈DNA的二級結構的變化。該系統可購自GibcoBRL，LifeTechnologies，3Fountain Drive，Inchinnan Business Park，Paisley PA4 9RF，Scotlard。
突變檢測的詳細方法見于“突變檢測的實驗方法”1996，Landegren編，牛津大學以HUGO(人類基因組組織)出版。
優選地，RFLP用于檢測相當大(≥500bp)的缺失或插入片段。Southern印跡可用于本發明的方法中。
PCR擴增較小的區域(最大300bp)以檢測大于3-4bp的插入或缺失可能是優選的。擴增的序列可在測序的凝膠上檢測，并可顯示小的變化(最小的大小為3-4bp)。合適的引物如本文所述設計。
此外，用Southern印跡分析或PCR可檢測限制性酶變體位點。
比如，對于基因組DNA限制性酶消化，凝膠電泳，Southern印跡，以及特異性探針(如描述于本說明書的該區域的YAC，BAC中的任一個，或衍生于其的合適片段)。
比如對PCR擴增DNA，限制性酶切消化，溴化乙錠凝膠檢測，銀染或在該PCR中摻入放射性核素或熒光引物。
其它合適的方法包括研制特異突變事件的等位基因特異的寡核苷酸(ASO)。類似的方法使用于前列腺特異組織的RNA和cDNA。
該方法也包括檢測雜合子丟失(LOH；示一拷貝丟失)以及然后通過在Northern印跡上沒有檢測到mRNA或通過PCR或在RNA/cDNA(示其它無活性的拷貝)探測RNA功能的丟失。與血液相似，不論什么來源的腫瘤細胞上的LOH都可用作診斷工具，如提示腫瘤已發生和需要更迫切的治療。
優選地，本發明的第三，四和五方面中的核酸是能選擇性地雜交于毗鄰于標志D10S541和D10S215的區域的人染色體10區域；更優選地，該核酸包括或者能選擇性地雜交于YAC746-H-8，821-D-2，831-E-5，921-F-8，796-D-5，829-E-1，839-B-1，734-B-4或24G-A10中的任一種的人源DNA更優選地該核酸還包括或能選擇性地雜交于YAC821-D-2，831-E-5，796-D-5，24G-A-10或734-B-4中任一種的人源DNA。
該核酸還優選地包括或能選擇性地雜交于BAC或PAC B2F20，P40F10，P72G8，P74N2，P274D21，B76I10，B79A19，B7901，B93F12，B122L22，P201J8，P201P5，P209K3，P316N14，B46B12，B60C5，B145C22，B150K4，B150N3，B181F15，和B188L22中任一種的人源DNA。
該核酸還優選地為微衛星標志D10S541，D10S215和AFM337×f9(D10S1765)的引物，即5′-AAGCAAGTGAAGTCTTAGAACCACC-3′5′-CCACAAGTAACAGAAAGCCTGTCTC-3′5′-TGGCATCATTCTGGGGA-3′5′-GCTTTACGTTTCTTCACATGGT-3′5′-ACACTTACATAGTGCTTTCTGCG-3′，以及5′-CAGCCTCCCAAAGTTGC-3′.
尤其優選地，該核酸能選擇性地雜交于相當于克隆IMAGE 264611的cDNA插入片段的基因。
因此，本發明提供了能選擇性地雜交于人染色體10的該區域的核酸在診斷癌癥或診斷對癌癥的易感性中的用途。
本發明也提供了一個測定人染色體10的該區域的存在與否，或其中的突變的方法。
優選地，該能選擇性地雜交的核酸是DNA，并且其還優選地為單鏈。
尤其優選地，該能選擇性地雜交的核酸具有少于10000個堿基對(若其為雙鏈)或堿基(若其為單鏈)；更優選地，該核酸具有少于1000個堿基對(若其為雙鏈)或堿基(若其為單鏈)；還更優選地，該核酸具有10-100個堿基對(若其為雙鏈)或堿基(若其為單鏈)；而甚至更優選地，該核酸具有15-30個堿基對(若其為雙鏈)或堿基(若其為單鏈)。
優選地，該能選擇性地雜交的核酸包括抑癌基因或其片段或變體，或者與其選擇性雜交的核酸。
優選地，該能選擇性地雜交的核酸是適于作為核酸擴增的引物。合適的引物包括描述于有關本發明的第一方面中的那些。
在一個優選的實施方案中，反轉錄酶PCR用于檢測患者血樣中的微轉移酶。獲得血樣并從其中的成核細胞中制備RNA。此用于使用檢測前列腺抑癌基因mRNA的存在與否，或其中的突變的寡核苷酸引物的PCR擴增中。此是一個能檢測混合于超過1百萬個正常細胞中一個細胞的較敏感的方法并且可能檢測在循環系統中混合于正常血液細胞中的不表達這些基因的轉移細胞中前列腺抑癌基因mRNA產物。這些存在于毗鄰于由標志D10S541和D10S215定義的DNA的染色體10區域的基因的基因產物是有用的用于檢測循環中的前列腺細胞的標志。
要知道，其也可能通過直接尋找血樣中的細胞的DNA中的突變，或通過利用蛋白質截短試驗或通過利用微衛星標志檢測微轉移酶；而在此情況下，可疑的腫瘤細胞應從血液中純化。
還優選地，該能選擇性地雜交的核酸是，或是能雜交于，表3-22或圖6和8-15中所述的人源序列；方便地，該核酸選自由雜交于源自表3-22或圖6和8-15中所述的序列的DNA的引物的組合。
本發明的方法包括檢測毗鄰于標志D10S541和D10S215定義的DNA的染色體10區域中的突變；特別是抑癌基因中的突變。
本發明的方法可利用突變所致的限制性酶切位點的不同。非變性的凝膠可用于檢測用合適的限制性酶消化所致的片段的不同長度。該DNA通常在消化前擴增，比如，用PCR法或其改進方法。否則需要在第一處得到10-100倍的DNA，并且盡管如此，該檢測只有在限制性酶很少切割DNA時才會成功。
DNA擴增可通過已有的PCR法(公布于Saiki等(1988)“科學”239，487-491)或其進展或替換方法如連接酶連式反應，QB復制酶和基于核酸序列的擴增或其它已知的擴增方法(其中的一些描述于本說明書)來實現。
“合適的限制性酶”是識別和切割野生型序列而不識別和切割突變型序列(或者，反之亦然)的酶。能被限制性酶識別和切割(或不是，視情況而定)的序列可作為突變的結果或者其可利用PCR反應中的錯配的寡核苷酸而引入到正常或突變的等位基因中。方便的是，該酶僅偶爾切割DNA，換句話說，其識別一個很少出現的序列。
在另一方法中，使用了一對PCR引物，其配對(即雜交于)于野生型基因型或突變型基因型但不是同時都能配對。然后，是否產生擴增的DNA會指示野生型或突變型基因型(以及由此的表型)。然而，此法部分地依賴于可能由于技術錯誤的陰性結果(即沒有擴增的DNA)。因此，可靠性較差和/或者需要附加的對照實驗。
優選的方法使用了類似的PCR引物，但除了雜交于僅僅一種野生型或突變型序列外，它們還引入了否則在野生型或突變型序列中均不存在的限制性位點。
本發明提供的核酸可用于許多目的。它們可用在Southern雜交到基因組DNA和RNA酶保護法中檢測以上已討論的點突變。該探針可用于檢測PCR擴增產物。它們還可用于用其它技術檢測與抑癌基因或mRNA的錯配序列。錯配序列可用酶(如S1核酸酶或解離酶)，化和物(如羥胺或四氧化鋨以及哌啶)，或錯配的雜交體較之于完全配對的雜交體的電泳遷移率的變化來檢測。這些技術是本領域內已知的。一般地，該探針互補于抑癌基因編碼序列，雖然也考慮了某些內含子的探針。整套核酸探針可用于組成一個檢測野生型抑癌基因的丟失或突變的試劑盒。該試劑盒允許雜交于整個抑癌基因。該探針可以是彼此重疊或毗鄰。
若核糖探針用于檢測與mRNA的錯配序列，其互補于人野生型抑癌基因的mRNA。因此，該核糖探針是反義探針，其不編碼由抑癌基因編碼的蛋白質，這是由于其是具有相反于有義鏈的極性。該核糖探針通常被標記，比如用本領域周知的任何方法進行放射性標記。若其用于檢測與DNA的錯配序列，其可有極性，有義或無義。類似地，DNA探針也可用于檢測錯配序列。
核酸探針也可以是互補于該抑癌基因的突變的等位基因。這些可用于在雜交而非錯配的基礎上檢測其它患者類似的突變。如上述，抑癌基因探針也用于對基因組DNA的Southern雜交以檢測諸如缺失和插入的整個體染色體變化。該探針還可用于選擇腫瘤和正常組織的抑癌基因的cDNA克隆。此外，該探針可用于檢測組織中的抑癌基因mRNA以測定表達是否變化，如由于野生型抑癌基因的丟失而減弱。
按照本發明的診斷和預后方法可檢測野生型基因的丟失。該丟失可以是因為插入，缺失或點突變事件所致。只要有單個等位基因突變，就可表明早期的瘤形成狀態。然而，若等位基因都突變，則可表明是惡性狀態或惡性狀態的可能性增大。因此這種突變的發現提供了診斷和預后信息。沒缺失的抑癌基因等位基因(如位于有基因缺失的染色體的姐妹染色體上)可用于篩查其它突變，如插入，小缺失，和點突變。相信發現于腫瘤組織的大部分突變是引起抑癌基因產物的表達的極大變化的那些。然而，導致非功能性的基因產物的突變還會引起惡性狀態或惡性腫瘤的可能性增加。突變(如點突變，缺失，插入等)可能發生在調節區，如在該基因的啟動子中，引起mRNA表達的丟失或減弱。點突變也會破壞合適的RNA加工，引起抑癌基因產物的表達失敗。
本發明還包括下列方法抑癌基因的體外轉錄和翻譯以鑒定截短的基因產物，或者變化的特性如底物結合；組織切片的免疫組織化學以鑒定其中蛋白表達已減弱/丟失，或其分布已在細胞或其表面發生了改變的細胞；以及在如上述檢測該區域的突變前用隨機引物RT-PCR。
本發明的第六方面提供了裝置(或可稱為試劑盒)以檢測毗鄰于標志D10S541和D10S215定義的DNA的人染色體10區域的存在與否，或其中的突變，該裝置包括能選擇性地雜交于毗鄰于標志D10S541和D10S215定義的DNA的人染色體10區域的核酸以及核苷三磷酸或脫氧核苷三磷酸或其衍生物。優選的能選擇性地雜交于毗鄰于標志D10S541和D10S215定義的DNA的人染色體10區域的核酸相同于在本發明的第三，四和五方面優選的那些。
“突變”包括插入，置換和缺失。
“核苷三磷酸或脫氧核苷三磷酸或其衍生物”包括任何天然的核苷三磷酸或脫氧核苷三磷酸如ATP，GTP，CTP和UTP，dATP，dGTP，dCTP，TTP以及非天然的衍生物如包括硫代磷酸鍵的那些(如αS衍生物)。
方便地，該核苷三磷酸或脫氧核苷三磷酸是放射性標記的或其衍生物，如用32P，33P或35S，或熒光標記或用化學發光化合物或用地高辛配基標記。
方便地，脫氧核苷酸是以適于稀釋以使用于PCR的濃度。
因此，本發明包括一套構件，其包括能選擇性地雜交于人染色體10的該區域的核酸以及檢測該區域存在與否，或其中的突變的裝置。
本發明的第七方面提供了一個檢測毗鄰于標態D10S541和D10S215定義的DNA的人染色體10區域的存在與否，或其中的突變的裝置，該裝置包括一種能選擇性地雜交于毗鄰于標志D10S541和D10S215定義的DNA的人染色體10區域的核酸以及一種核酸修飾酶。優選的能選擇性地雜交于毗鄰于標志D10S541和D10S215定義的人染色體10區域的核酸是相同于本發明的第三，四和五方面優選的那些。
“突變”包括插入，置換(包括顛換)和缺失。
“核酸修飾酶”包括任何能修飾RNA或DNA分子的酶。
優選的酶選自DNA聚合酶，DNA連接酶，多聚核苷酸激酶或限制性核酸內切酶。尤其優選的酶是熱穩定的DNA聚合酶如TaqDNA聚合酶。也可使用識別二級結構如錯配序列的核酸酶如切割酶I。
本發明的第八方面提供了一種能被本發明的抑癌基因或其片段或變體編碼的多肽。該多肽優選地具有抑癌活性，尤其是在前列腺中，或與天然多肽的特異抗體發生交叉反應。
本發明的第九方面包括一種能特異結合于本發明的第八方面的多肽的分子。合適地，該分子是包括對該多肽特異的互補性決定區域的抗體樣分子。
結合于許多這些抗原的單克隆抗體是已經周知的，但在任何情況用當今有關于單抗技術的技術可制備大部分抗原的抗體。該抗原結合部分可為抗體的一部分(如Fab片段)或合成的抗體片段(如單鏈Fv片段[ScFv])。選擇的抗原的合適單抗可通過周知的技術制備，如公開于“單抗技術手冊”，HZola(CRC出版社，1988)和“單克隆雜交瘤抗體技術和應用”，JGRHurrell(CRC出版社，1982)。
嵌合抗體報道于Neuberger等(1988，第8屆國際生物技術研究會，第2部分，792-799)。
合適地制備的非人類抗體可用周知的方式“人源化”，比如通過將鼠抗體CDR區域插入到人抗體的構架中。
本發明的再一方面提供了(a)檢測患者對癌癥的易感性的方法，包括步驟(i)獲得含患者蛋白質的樣品；以及(ii)測定如本發明的第八方面的多肽在該樣品中的相對量和大小或者測定如本發明的第八方面的多肽是否有截短或喪失功能；(b)診斷患者癌癥的方法，包括步驟(i)獲得含患者蛋白質的樣品；以及(ii)測定如本發明的第八方面的多肽在該樣品中的相對含量或大小；以及(c)預測尤其是癌癥后果的有關前景的方法，包括步驟(i)獲得含患者蛋白質的樣品；以及(ii)按本發明的第七方面測定該多肽樣品中的有關含量。
通常，較之于正常細胞，癌癥細胞中的蛋白質是截短的或者蛋白產物的量是減少的。
“衍生于患者”包括直接或間接產生于患者的樣本，比如，該蛋白質可以是通過體外轉錄和翻譯而產生于分離的DNA。該樣品可以是任何合適的樣品并包括活檢材料，腫瘤樣品(如，那些用固定的石蠟封固載片以及新鮮或冷凍的組織)以及脫落于腫瘤樣品的細胞。
這些方法適于測定患者對任何癌癥，特別是前列腺癌，黑素瘤，神經交質瘤或非何杰金氏淋巴瘤的易感性。相應地，至少對前列腺癌的易感性檢測，該患者是男性的。前列腺癌尤其是合適的。
方便地，該多肽用本發明的第九方面定義的分子檢測。優選地，該分子是包括對該多肽特異的互補性決定區的抗體樣分子。合適地，該分子，如單抗，包括一個可檢測的標記。合適的可檢測標記包括放射性標記如125I和131I以及其它諸如診斷造影中使用的放射性核素，以及任何方便的熒光或化學發光標記，其易于摻入到諸如抗體的分子。此外，術語“可檢測標記”還包括能通過結合于另一成分而檢測的成分(如通過結合于鏈霉親和素而檢測的生物素)；以及利用其轉變無色化合物成有色化合物(或者，反之亦然)的能力而檢測的成分，如酶(例如，堿性磷酸酶可將無色的鄰硝基苯磷酸轉變成有色的鄰硝基苯酚)。
方便地，產生出該多肽的不同外顯子編碼的多肽的抗體。這些可用于諸如組織切片，以及在蛋白截短試驗中檢測截短的蛋白質，并且也可用于檢測蛋白質水平的變化。
本發明的再一方面提供了使用能選擇性地雜交于毗鄰于標志D10S541和D10S215定義的DNA的人染色體10區域的核酸制備診斷癌癥，尤其是前列腺癌的試劑；以及制備治療癌癥的藥劑。
本發明還有一個方面是提供治療癌癥的方法，包括步驟對患者給藥能選擇性地雜交于毗鄰于標志D10S541和D10S215定義的DNA的人染色體10區域的核酸，該核酸在進入或不進入患者體內時能編碼抑癌分子。腫瘤抑制可通過用含有多聚核苷酸的表達載體轉染(優選地為前列腺)腫瘤細胞系以及比較該轉染細胞系和異種移植模型(如裸鼠)中親代細胞系的致瘤性而鑒定。
優選地，該方法用于治療前列腺癌。更優選地，該核酸是抑癌基因，其在上下文中是治療基因。優選地為野生型抑癌基因。再更優選地該核酸包括一個合適的釋放系統。
雖然腺病毒衍生的載體適于修復在靜息或緩慢分裂的組織細胞中的基因缺陷，逆轉錄病毒衍生的載體特異性地以迅速分裂細胞(如腫瘤細胞)為靶并因而適于在體內治療癌癥。
產生的治療性蛋白質的量以及生產的持續時間都是基因治療中的重要問題。結果，當重復治療由于免疫原性的原因而不合乎需要時，使用能細胞基因整合的病毒載體(如逆轉錄病毒載體)比非整合的替代物(如腺病毒衍生的載體)更有利。
當該治療基因維持在染色體外，最高水平的表達可使用病毒啟動子實現，如Rous肉瘤病毒長末端重復序列(Ragot等(1993)，“自然”361，647-650；Hyde等(1993)自然362，250-255)以及腺病毒的主要晚期啟動子。后者已被成功地使用以驅動囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)基因在肺上皮中的表達(Rosenfeld等(1992)“細胞”68，143-155)。由于這些啟動子在各種組織中起作用，其可能不適于指導細胞-型-特異的表達，除非釋放方法適于提供該特異性。然而，體細胞增強子序列可用于在染色體外調節中給出細胞-型-特異的表達。
若該基因-載體結構的回收是不可能的，可能需要將自殺基因加入到該系統中以迅速地中止有毒反應。單純皰疹病毒胸苷激酶基因在導入細胞時，使它們對藥物9-(1，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤(GCV)敏感，從而有選擇迅速殺死該細胞的余地。
在基因治療中使用種特異性的親嗜性病毒可以提供一個比使用兼嗜性病毒作為載體更安全的替代方法。在此方法中，將親嗜性病毒受體，非人類的一種同系物以這樣的一種方式修飾使得能被病毒識別。然后，通過構建一個分子(其前端對靶細胞具有特異性而尾部是被改變的受體)將該修飾的受體釋放到細胞。在該受體釋放到其靶后，可注射帶有治療基因的遺傳工程的親嗜性病毒并且其僅整合到靶細胞。
可使病毒衍生的基因轉移載體適于僅識別特異性的細胞，所以其可能定向到癌癥細胞，如前列腺癌細胞。類似地，可能用諸如針對PSA基因的前列腺特異性啟動子對癌癥細胞，尤其是前列腺細胞定向表達該治療基因。
本發明再一方面提供一個治療癌癥的方法，包括步驟對患者給藥按本發明的第九方面的分子，該分子還包括一種細胞毒性成分。該細胞毒性可為直接細胞毒性(如蓖麻毒蛋白，合適的藥物或合適的放射性核素)或間接細胞毒性(如能將相對無毒性的前藥物轉變成相對毒性的藥物的酶；如見于WO88/07378和WO91/11201)。
合適地，按本發明的第九方面的分子是一種抗體，優選地為單抗，或其片段。
本發明的前述化合物或其制劑可通過非經腸道(如皮下或肌內)注射給藥，但優選地給藥到腫瘤中。該治療可包括單劑量或一段時間內的多劑量。
雖然可能單獨給藥本發明的組合物，優選地其作為藥物制劑，和一種或多種可接受的載體一起給藥。該載體必需是“可接受的”(在與本發明的化合物相容的意義上)并對其受體無害。一般地，該載體是無菌和無熱原的水或鹽水。
本發明的再一方面提供了用按本發明第九方面的分子制備癌癥治療藥劑。
尤其優選地，對于本發明的診斷方法及用途說來，這些方法中所用的任何核酸是能選擇性地雜交于相當于克隆IMAGE264611的cDNA插入片段的基因的核酸。
尤其優選地，用于本發明的使用抑癌基因的治療方法的基因是相當于克隆IMAGE264611的cDNA插入片段基因或其合適的變體，比如，截短型或無內含子型，如cDNA。尤其優選地，能由含有腫瘤基因的能選擇性地雜交于人染色體10區的核酸編碼的多肽為能由相當于克隆IMAGE264611的cDNA插入片段的基因編碼的多肽。
所用的縮寫SSCP，單鏈構象多態性；PCR，聚合酶鏈式反應；YAC，酵母人工染色體；CEPH，人多態性研究中心(Centre d’Etude duPolymorphisme Humain)。
附圖及某些表的簡要說明圖1示a前列腺癌10q23-q25上的微衛星標志上的等位基因丟失的實例。每個峰下面的上方框示等位基因片段的長度；下方框是相對峰高。主峰左側的“肩”峰是由于PCR過程的聚合酶滑動所致的。b.微衛星不穩定性。被認為是由于DNA錯配修復錯誤(10)所致的不穩定性見于1/37腫瘤中的21/24基因座。在每一峰下給出了片段長度。這里所示的例子反映了207bp的等位基因缺失以及213bp的等位基因擴展。
圖2示10q23-q25處的等位基因丟失。腫瘤序號與圖4中的那些一致。標志號數(斜體)是D10S號數(7)。標作‘AFM’的標志也計為D號數；標志全名為AFMa051tb9，AFMa124wd9，AFMa064za5，AFMa301ex1和AFMa273yel。腫瘤8，16，24，30和31也表示標志D10S189和/或D10S570在染色體10的P臂上的等位基因丟失，提示染色體全部丟失。較小的號數以厘摩給出了標志間的大約的遺傳距離。標志AFMa124wd9和D10S583(距離約為9厘摩)間有一清楚定義的缺失的共有區。通過對比，僅腫瘤1和11顯示出Mxil周圍的標志的特異性丟失并且在此兩種情況下都伴有AFMa124wd9-D10S583區的等位基因丟失。
圖3示Mxil在前列腺癌中的丟失通過基于熒光的分型檢測在腫瘤1和11的Mxil基因的3′非翻譯區中的(AAAAC)n多態性處的等位基因丟失，表明鄰近微衛星標志的特異性丟失。每個峰下面的打框的數字給出了等位基因片段長度(上)和相對峰高(下)。腫瘤1顯示明顯的Mxil丟失(峰高降低58％)而腫瘤11顯示沒有明顯的Mxil丟失，盡管顯示了鄰近的微衛星標志AFMa273yel的丟失。
表2顯示前列腺癌的10q23-q25丟失的檢測結果。
圖4(a)是示YAC克隆和標志D10S541和AFM337位點的最小區域的物理圖譜，而圖4(b)是示BAC和PAC克隆位點的更詳細圖譜。
圖5示進一步更加詳細的LOH資料。
表3-22描述了序列分析的衍生于相當于IMAGE克隆264611的cDNA插入片段的基因的已表達的序列標志的插入片段。
圖6(序列11)示一個尤其優選的核酸分子的cDNA的完整序列。顯示了內含子的潛在位點(二核苷酸上的“SS”表示剪接位點)。該3′非翻譯序列是以小寫字體表示。
圖7(序列12)示圖6的核苷酸序列的一個閱讀框中的翻譯。
圖8-15(序列13-20)示源自相當于IMAGE克隆264611的基因的外顯子序列和側翼內含子序列。編碼序列是用大寫表示而內含子序列用小寫表示。PCR擴增引物以黑體表示。雖然外顯子連續排序，可能有更多的上游或下游外顯子而每個給定的“外顯子”可再分成較小的外顯子。R＝嘌呤。
實施例1將前列腺抑癌基因定位到10q23-q24邊界材料和方法DNA制備 腫瘤和靜脈血樣獲自進行了經尿道前列腺切除術的男性患者。從正常組織顯微解剖腫瘤組織，而腫瘤和血液DNA如前述制備(6)。
PCR.PCR在含有30ng模板DNA，1×PCR緩沖液(BoehringerMannheim)，20pmol引物，20μMdNTP(Boehringer Mannheim)和1單位Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)的50ul反應液中于GeneAmp9600熱循環儀(Perkin-Elmer Cetus)上進行。為擴增微衛星CA重復標志(7)，將其中一個引物用熒光標記(JOE，FAM，HEX或TAMRA；應用生物系統)標記。微衛星反應混合液進行30個循環(@94℃，30秒，@55℃，30秒；以及@72℃，30秒)，在此前95℃下，3分鐘熱起動。退火溫度低至50℃以擴增Mxil螺旋-環-螺旋和亮氨酸拉鏈外顯子(5)，而增至60℃以擴增3′外顯子；擴增3′外顯子的引物序列是5′-GAGATTGAAGTGGATGTTGAAAG-3′(序列7)(A)和5′-AAATACAGGTCCTCTGACCC-3′(序列8)(B)并給出319或324bp的產物。為便于(CAAAA)n多態性的基于熒光的分型，引物A用FAM標記。等位基因分型、微衛星等位基因大小和雜合子丟失可按使用說明書通過在有2500-ROX大小標準物(應用生物系統)存在下的6％變性的聚丙烯酰胺凝膠上的PCR產物的大小分離而測定以及在使用Gene Scan軟件的373A DNA測序儀上檢測。同時分型多達10個通過大小或熒光標記可辨別的標志。所得的數據用Gene typer軟件(應用生物系統)分析。
還可能通過用溴化乙錠染色并用UV光源顯色PCR產物，或將該產物轉移至尼龍或硝酸纖維素膜上并用衍生于標志DNA序列放射性探針(如在初始PCR擴增中使用放射性標記的寡核苷酸作為引物)雜交而檢測LOH和等位基因丟失。在此情況下，通過將該濾膜暴露于X射線膠片檢測PCR產物，而等位基因丟失則可通過肉眼或替代地通過光密度檢測。SSCP.在Mxil內含子擴增后，將10μl PCR產物與10μl甲酰胺混合并加熱至90℃3分鐘。將該變性產物在6％非變性的聚丙烯酰胺凝膠上于25w電泳4-6小時，同時用電扇幫助冷卻以維持溫度低于25℃(8)。將DNA轉移至尼龍膜(HybondN+；Amersham)并在68℃用兩個PCR引物的混合液雜交(該引物已通過末端轉移酶(Gibco-BRL)用32P-dCTP標記)。在2×SSC/0.1％SDS中洗滌5-10分鐘后，將濾膜于-70℃下暴露于X-射線膠片1-24小時。DNA測序在通過Centricon-100柱(Amicon)純化后，PCR擴增的Mxil外顯子用PRISM循環測序試劑盒(應用生物系統)以及在使用373A匯集和分析軟件(應用生物系統)的373A DNA測序儀按使用說明書測序。將源自獨立的PCR反應的每一外顯子測序兩次(從每一端一次)。用測序Navigator軟件(應用生物系統)對比和肉眼比較序列電泳圖。結果分類了總共37個不同的和組織病理學級別和階段(表2)的前列腺癌的在橫跨10q23-q25(7)的24 CA重復序列標志的雜合子丟失。在DNA抽提前從正常組織顯微解剖腫瘤組織并把腫瘤微衛星分布圖與淋巴細胞DNA的比較測定等位基因丟失。研究了8個良性增生組織樣品。本發明人認為若觀察到一個可重現的信號較之于正常組織降低超過20％則可表示腫瘤DNA樣品有等位基因丟失，雖然降低程度實際上經常要大得多且在某些情況將近100％。等位基因丟失的實例如圖1所示。總共23個腫瘤(62％)顯示出10q23-q25上一個或多個標志的等位基因丟失。其中，8個顯示出全部分型信息標志處的丟失，而在這8個中還有5個顯示出P臂標記上的等位基因丟失，提示整個染色體的不存在，可能通過不分離。該等位基因的丟失數據總結于圖2。在良性增生組織樣品中沒有發現丟失。一個腫瘤顯示出在大部分基因座(21/24；見圖1)處的微衛星不穩定性，推測應有一個缺損DNA錯配的校正系統(10)。10q丟失與腫瘤階段和級別沒有明顯的相關性，提示10q丟失可發生在腫瘤進展的任何時候。
視黃醇結合蛋白4基因(RBP4)和細胞色素P450IIC基因族(CYP2C)定位于缺失圖譜，隨后鑒定帶有這兩個基因座及毗鄰于微衛星標志D10S185和D10S571的YAC(11)。該圖譜清楚地揭示了毗鄰于RBP4和CYP2C(細胞遺傳學上分別定位于10q23-24和10q24.1的缺失的共有區(12，13)(圖2)。除了腫瘤37外，此區域在本發明人研究的顯示10q丟失的全部腫瘤中都丟失，其未提供該區域標志的資料。腫瘤1，3，6，13，14和15定義了距離約為9厘摩的標志AFMa124wd9和D10S583間缺失的最小區域。
Eagle等最近已鑒定了在少數前列腺癌中于10q25處的Mxil基因突變，引起對mxil可作為抑癌基因起作用的推測(1，5)。本發明人在證實了Mxil存在于已被證明重疊于帶有微衛星標志D10S597的CEPH大-YAC 936-h-5和966-h-9后，能將Mxil置于缺失圖譜(14)。僅有兩個腫瘤，1和11，顯示出緊接著側翼Mxil的標志的特異性丟失，而在這兩種情況下，均伴有AFMa124wd9-D10S583區域的等位基因丟失(圖2)。
為試圖進一步明確Mxil丟失在腫瘤進展中的意義，本發明人通過PCR擴增每個外顯子，隨后再SSCP分析篩查了腫瘤1和11，以及那些顯示出整個區域丟失的腫瘤的Mxil突變(8)。PCR擴增編碼螺旋-環-螺旋和亮氨酸拉鏈區的外顯子的引物獲自Eagle等(5)。為擴增終末3′外顯子，使用了衍生于該外顯子的緊接的5′端和3′非翻譯序列中的引物(4，5)。這三對引物給出了66％的該Mxil編碼序列的區域。Mxil基因的5′端基因組結構還未被測定，所以本發明人不能分析外顯子5′-螺旋-環-螺旋區域。SSCP分析沒有檢測到在所涉及的三分之二的Mxil編碼序列內的任何突變。
除了SSCP分析外，本發明人直接測序了前面證明可能在前列腺腫瘤中發生突變的編碼該螺旋-環-螺旋和亮氨酸拉鏈區的外顯子(5)。也沒有檢測到任何突變。雖然通過這兩種方法都不能檢測任何腫瘤的Mxil突變，但本發明人通過SSCP的確檢測到3′非翻譯區中的共同的多態性，而隨后的序列分析表明其源自(AAAAC)n串聯重復序列的長度變化(給出兩個等位基因，(AAAAC)4和(AAAAC)5)。8個顯示出整個10q23-q25區丟失或Mxil附近的CA重復標志處的等位基因丟失(第1，8，11，16，17，21，23和30號)是該多態性的雜種，從而使有可能檢測這些腫瘤的實際的Mxil丟失。6個顯示出附近標志丟失的腫瘤(1，8，16，17，23和30)也顯示出如通過熒光法分型測定的Mxil丟失(圖3)。其中，5個顯示出整個10q24-q25區丟失(圖2)。因此，從總共23個顯示出10q23-q25丟失的腫瘤中，本發明人僅能鑒定一個腫瘤(第1號)顯示出Mxil的特異性缺失(相對于其它10q23-q25區或整個區域的丟失)，并且這伴隨著AFMa124wd9-D10S583的缺失。
本發明人也能用此多態性通過循環測序法檢測在腫瘤中污染有正常組織對突變檢測效果的影響。把在這些顯示出Mxil丟失的腫瘤(腫瘤1，8，16，17，23和30)中的外顯子5′(包括立即的3′非翻譯的DNA)測序。對于顯示出最大程度的缺失等位基因丟失的腫瘤8來說，清楚地鑒定了保留的等位基因。其余的腫瘤給出了極不明確的緊接(AAAAC)n重復序列的序列數據，源于這兩個等位基因的復合的終末產物(未顯示)。因此有可能已通過循環測序法檢測保留的Mxil拷貝中源自小的缺失或插入事件的任何功能失效突變。討論這里所提供的數據顯示了前列腺癌抑癌基因存在于10q23-q24邊界，而更具體地介于橫跨約9厘摩的標志AFMa124wd9和D10S583間。此區在23個顯示有10q丟失的腫瘤的22個中缺失，而第23個是沒有有關標志的信息。10q丟失可能是一些前列腺癌發生的早期事件；早期和晚期腫瘤中能檢測到丟失。或者，10q丟失可能在已發生的腫瘤的進展中而不是在其發生中更重要，條件是在良性增生組織樣品中沒檢測到丟失。然而，目前并不清楚良性前列腺增生和癌癥發生的關系，并且該損傷可能不是惡性腫瘤的前兆。
雖然已顯示出Mxil在前列腺癌中突變，但每種腫瘤僅有小部分的細胞被發現帶有Mxil突變(5)。作者提出了兩種可能的解釋。第一種是所研究的腫瘤可能含有顯著量的非癌組織。第二種是突變的Mxil等位基因僅存在于少數癌細胞中。例如本發明人不能檢測含＜30％的污染的正常組織并且顯示出10q丟失程度介于25-79％(由微衛星等位基因丟失檢測-見表2)的顯微解剖的腫瘤中Mxil突變，后者似乎更有可能。這也提示保留的Mxil等位基因的突變發生在缺失的等位基因丟失后。沒有突變檢出，或僅在小部分的腫瘤細胞中檢出連同該等位基因丟失數據的聯合證據提示在10q23-q24處的抑癌基因突變比Mxil在前列腺癌進展的突變更顯著。
10q24-q25的丟失或重排并不僅限于前列腺腺癌；其還發現于黑素瘤，神經膠質瘤和非何杰金氏淋巴瘤(15-21)中，提示抑癌基因存在于相關的n個腫瘤類型的此位點。實施例2含抑癌基因的DNA的鑒定圖4和5給出了更詳細的AFM124和D10S583間的圖譜(該標志在原稿中定義最小區域)，使本發明人可將該最小區域進一步限定到D10S541和D10S215之間的區域；更具體地介于的D10S541和AFM337xf9之間的長度小于1厘摩(cM)。該物理圖譜數據總結如下表1最小區域酵母人工染色體(YAC)序列標志位點(STS)測定
<p>除了7B-F12和24G-A10外的全部這些YAC均是公眾可獲自CEPH大-YAC庫的。7B-F12和24G-A10是公眾可獲自ICI YAC庫。而此二庫均是公眾可獲自人類基因組圖譜計劃中心(Hanan Genome MappingProject Resource Cowtre)，Hihxton Hall，Hinxton，Cambridgeshire，CB10 IRQ，UK。大-YAC克隆的大小獲自CEPH數據庫。ICI YAC克隆由本發明人測定大小。+＝規定給YAC的STS。
已更詳細地作出了YAC 821-D-2，831-E-5，796-D-5，24G-A-10和734-B-4的圖譜從而給出了該區域的大量限制性圖譜(見圖4)。此重疊群并不包含全部限制性位點。YAC 821-D-2和831-E-5看來是相同的并橫跨最小區域(D10S541-AFM337×f9)。它們因此包括全部或部分的該抑癌基因。
EST(已表達的序列標志)是用下列步驟產生和分配給基因組區域的。1.從目的組織構建cDNA文庫。2.隨機地篩選每一克隆并進行單鏈測序(single sequencing pass)以給出大約200-300bp的DNA序列(一個EST)。3.從每一EST設計引物以擴增內片段(一個已表達的序列標志的位點或eSTS)。4.通過PCR擴增單染色體細胞雜交體DNA(一組衍生于人/嚙齒類細胞雜交體的DNA樣，每個帶有單個人染色體)將EST裝入染色體。5.再通過PCR擴增重疊YAC克隆庫并最終通過指定到每個YAC的PCR定位EST。
由IMAGE克隆264611的cDNA插入片段編碼的多肽與蛋白質張力蛋白及輔助蛋白(一種與蛋白質通過披網格蛋白小泡而運輸到細胞膜有關的蛋白)具有相似性。該相當于克隆IMAGE 264611的cDNA插入片段的基因是抑癌基因。
通過篩選一系列源自前列腺和其它腫瘤細胞系的RNA以鑒定改變的，通常是減弱的轉錄水平從而鑒定前列腺抑癌基因或基因。該轉錄體由于可能具有復雜的功能和幾個功能失效突變“襲擊”位點(cf BRCAl，RB)而很可能是大的。種間保守是一個良好的暗示，即該基因是有基本的細胞“管家”功能，而其丟失則會導致生長控制失去和腫瘤形成。前列腺抑癌基因cDNA鑒定如下。
一個YAC克隆的部分是用作探針以在放射性標記后直接篩選前列腺cDNA文庫。約占該最小區域75％的400kb Mlul片段(標記于圖4的限制性圖譜上)用作探針該片段可從消化后的脈沖場凝膠中干凈地分離。或者，將整個24G-A10 YAC用作探針。使用了常規的克隆/濾膜雜交法。也可使用合適的BAC或PAC克隆。
腫瘤中的整個編碼區的突變分析表明該基因是前列腺抑癌基因。這是通過分別分析每個外顯子的突變而進行的。使用的突變分析方法是SSCP法(或其變化方法)和直接的DNA測序。
定位于此區域的基因可通過用獲自含于該YAC，BAC和PAC中的人核酸序列的探針篩選cDNA文庫或者通過外顯子截留法或通過測序該包含于YAC，BAC和PAC中的人核酸序列(自動測序技術執行這一程序)，使用區分編碼序列的電腦程序(如GRAIL II)而鑒定。結果通過前列腺組織的前列腺RNA和cDNA文庫的RT-PCR來鑒定。
發現該前列腺抑癌基因表達于正常的前列腺組織，突變分析該整個編碼區域表明在前列腺癌中該基因的表達較之于正常前列腺可能發生改變，該基因產物可在蛋白質水平上被截短，該mRNA產物可被截短，或者較之于正常的具有改變的剪接，從而導致異常蛋白質，所得的由該改變的基因編碼的蛋白可能在組織中具有異常特性或分布。實施例3核酸的診斷應用用分裂間期熒光原位雜交(FISH)分裂間期的細胞以檢測丟失從而檢測染色體10的特定區域(即位于10q23-q24邊界的含抑癌基因區域)的染色體缺失。源于活檢樣品的細胞分散到整個載玻片并將細胞膜透化。這使得原位雜交試劑可進入含分裂間期染色體的細胞內。該區域缺失的特異的BAC或PAC或其它適合的探針在用熒光染料標記探針后雜交于該染色體。含缺失區域的染色體沒顯示信號；而源于其中的一條染色體10已在此區域有缺失的細胞的染色體僅顯示出一個而非兩個信號。因此，提供能檢測源自患者的活檢材料中的10q缺失的方法。這些可用于指示介于良性和惡性之間的腫瘤級別的階段，也可指示應進行更積極的治療方案。
用作探針的合適YAC克隆包括821-D-2，831-E-5，796-D-5，24G-A-10和734-B-4。
任何衍生于目的區域(見物理圖譜)的BAC或PAC克隆均可使用并包括60L5和46B12。
尤其有用的是使用能選擇性地雜交于相當于克隆IMAGE 264611 cDNA插入片段的基因的核酸。該基因本身，或其一合適大小的片段尤其適于作為探針。
理想地，該探針介于10kb-1Mb，優選地介于60-200kb之間。
FISH由Bentz等人[(1994)，“白血病”(Leukemia)8(9)1447-1452]描述。
該BAC或PAC克隆(如BAC克隆60C5)用于分離于前列腺組織的核。從冰凍組織中分離核的方法如下。從冰凍組織中抽提核(采用Xiao等(1995)，“美國病理學雜志”(Am.J.Patho1.147，896-904)。(1)切2×5×5mm的冰凍組織塊--取自整個未除冰的樣品。室溫下1-3分鐘解凍。(2)用對置的手術刀刃在35mm塑料平皿中細切組織。(3)加入溶于0.9％NaCl的水溶液(pH1.5)的1ml 0.5％胃蛋白酶到該皿中。轉移到15ml離心管中。(4)37℃下水浴溫育15-30分鐘或直至大部分腫瘤塊已消失。(注意所用的時間應是解離該腫瘤塊所需要的最少時間)。每5分鐘渦旋。(5)加入14ml PBS并以15,000rpm離心5分鐘收集核。(6)吸取0.5ml上清液，丟去其余部分。在殘留上清液中重懸核沉淀塊。(7)加一滴(10μl)懸浮液到未涂布的載玻片上。在干燥前通過相顯微鏡檢測該懸浮液以測定該細胞密度是否合適-若核過分擁擠，用PBS稀釋該懸浮液；若核稀薄，在同一位置加入另一滴懸浮液。(8)風干該載玻片。(9)浸于10％緩沖的福爾馬林中10分鐘。(10)風干。(11)在電熱板上于55℃烘干2小時。此時的載玻片可如下貯存(通過乙醇系列脫水(75％，85％，95％分別2分鐘；風干；用干燥劑將載片貯存于-20℃下；于-70℃下在PBS中貯存殘留的核懸浮液(其可融化2次，而對隨后的雜交質量沒有任何影響)。(12)雜交前，該DNA需要變性。用在蓋玻片下的70％甲酰胺/2×SSC pH7.0將載玻片置于73℃的電熱板上2.5分鐘。(13)在冰預冷的70％，95％和100％的乙醇系列中，每個3分鐘，脫水，并風干。雜交每個雜交通常占一個載玻片的一半。探針標記。BAC或PAC克隆(如BAC克隆60C5)用作診斷探針。該完整的克隆用于產生一個標記的探針。一個市售的識別染色體10的著絲粒的序列(如腫瘤D1021α-衛星)的克隆用作檢測染色體10的對照。該將兩個探針不同地標記以致它們可區分開。該探針通過缺口翻譯使用市購的試劑盒(即Bionick kit，Life Technologies)用生物素或地高辛配基標記。在一Eppendorf管中，混合20ng標記的探針+4μgCot1DNA+2體積的乙醇。在真空離心蒸發濃縮器中干燥該混合物25-30分鐘。重懸于11μ1雜交混合液(2×SSC，50％甲酰胺，10％硫酸葡聚糖，1％Tween20，pH7.0)。(若2或3個探針同時雜交，那么該12μl雜交混合液應平分(即2個探針，每個6μl雜交混合液)；它們不應混合直止預退火階段后)。
在85℃下變性該探針5分鐘。立即置于冰上幾秒鐘。迅速自旋以使所有液體沉于管底。在37℃下預退火30分鐘(此后若需要，可混合2個或多個探針)。將預退火探針置于載玻片的一半上并用22×22mm蓋玻片蓋住。用橡膠液密封蓋玻片周圍。雜交后洗滌(現在的步驟應在黑暗中即在封閉的coplin罐中進行)在50％甲酰胺，2×SSC，pH7.0中，于42℃下3×5分鐘2×SSC，pH7.0，42℃下3×5分鐘4×SSC，0.05％Tween20，pH7.0(＝SSCCT)，于室溫下1×3分鐘。探針檢測步驟1-用SSCTM預溫育。將100μl SSCTM(＝SSCT+5％Marvel＝10mlSSCT+0.5gMarvel，使用前離心下來以除去固相物)置于22×50mm蓋玻片下的載玻片上。置于37℃下的濕盒中10分鐘。在SSCT中洗滌3分鐘。(注意全部檢測反應劑在SSCTM中稀釋)。對每一檢測步驟，將100μl檢測反應劑置于22×50mm蓋玻片下并置于37℃下的濕盒中25-30分鐘。每個步驟后都于室溫下在SSCT中洗滌3×3分鐘-在這些步驟中應輕輕搖動該Coplin罐-除了在最后的步驟后在SSCT中洗滌1×5分鐘和在PBS中洗滌2×5分鐘。然后，在乙醇系列(70％，95％，100％，每個兩分鐘)中脫水該載玻片并風干。然后，將其裝入含DAPI 4，6-二氨基-2-苯基吲哚作為復染的細胞熒光劑(UKC ChemLab，Canterbury CT2 7NH，UK)中固定(見下文)雙探針檢測(雙色)步驟2-鼠抗-地高辛配基異硫氰酸熒光素(FITC)，以及親和素-Texas紅。步驟3-兔抗鼠FITC，以及抗親和素生物素。步驟4-抗兔FITC，親和素-Texas紅。復染DAPI(0.15μg/ml＝5μl，30μl/ml貯備液+995μ1甘油(細胞熒光劑)。結果對正常的前列腺細胞，該60C5探針產生2個信號(斑點)/細胞。每個細胞兩個斑點還見于染色體10著絲粒標志D10Z1。若前列腺細胞僅有一個，或沒有產生于與60C5探針的雜交斑點，提示該探針所覆蓋的區域的缺失，那么該細胞是癌癥細胞。而且，若用60C5顯色的斑點數少于用染色體10著絲粒標記觀察的斑點數，那么缺失發生于60C5覆蓋的區域，而該細胞是癌癥細胞。
使用基因組克隆，分裂間期FISH法可用于該區域。優選地，該基因組DNA為約60-200kb。一般地，正常組織顯示兩個斑點，而腫瘤組織顯示一個或無斑點，或替換地，斑點少于任何細胞中的染色體10拷貝數。著絲粒重復序列用于證實細胞中染色體10的存在。然而，甚至正常組織也會有一些細胞僅顯示單一信號(斑點)。對固態組織，效率一般介于85到95％間，即85-95％的核顯示兩個信號。效率基于探針和實驗條件，但可通過經驗作出最佳選擇。受侵染的組織顯示出顯著大的百分數的僅有單一信號的細胞。污染的正常細胞的在樣品中的存在將會阻止此百分數達到100％。因此，需要在這些檢測前解剖除去這些細胞區域。
因此，總之，該方法和結果是(i)取患者組織樣，切除/純化侵染的組織區，以及抽提核，(ii)用可檢測標記標記該探針。(iii)在雜交條件將該所制備的樣品和探針接觸。(iv)洗滌除去未雜交的過量探針。(v)顯色已雜交的探針。通過顯微微觀察雜交到單個基因座的探針為一個信號(斑點)。(vi)在未侵染的組織中，發現大部分細胞顯示出每個細胞兩個信號。少數細胞由于無效雜交而顯示出少于兩個斑點。(vii)在侵染的組織中，發現非常大數目的細胞顯示出源自特異性探針的單個或無信號。要知道，污染的正常細胞會影響顯示有兩個信號的細胞的比例。
固體腫瘤，成神經細胞瘤的預后信息已通過其他研究人員用非相關的探針但類似于FISH法獲得(Taylor等(1994)，“英國腫瘤雜志”(Br.J.Cancer)69，445-451)。實施例4；多肽檢測將針對抑癌基因產物的單抗用125I標記。制備前列腺組織樣并通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質。將該蛋白電印跡到硝酸纖維素膜上并和單抗一起溫育。
檢測到抑癌基因產物的存在。該產物缺失提示對前列腺癌增加的易感性。實施例5治療應用用合適反轉錄載體將該抑癌基因轉入易感前列腺癌的患者。實施例6用IMAGE克隆264611(及其衍生的引物或探針)診斷前列腺癌通過原位雜交，Northern分析(還檢測變化的mRNA種類分布)或定量RT-PCR用克隆264611(以及衍生于其的引物或探針)檢測變化的mRNA水平。至于表達檢測方法(除原位雜交外)，優選地使用相當純的腫瘤組織。在原位雜交中使用固定的組織。提示前列腺癌的陽性結果是較之于非癌前列腺組織的變化表達水平或者較之于正常前列腺組織的變化的轉錄體表達模式。適于檢測的樣品還包括新鮮的前列腺組織，通過針吸活組織檢查從前列腺或轉移中取出的組織。
衍生于IMAGE克隆264611的cDNA插入片段的PCR引物用于RT-PCR，然后再進行突變檢測或蛋白截短檢測。提示前列腺癌的結果是檢測到編碼突變，或截短的蛋白質產物。
因此，此實施例的方法用于檢測前列腺腺癌的存在。
衍生于相當于IMAGE 264611的基因的內含子序列的引物(例如，如圖29-34所示的那些)用于擴增該基因外顯子，然后再通過各種方法(測序，SSCP或任何類型的錯配檢測)檢測突變或者用于蛋白質截短檢測。合適的樣品包括新鮮的前列腺癌組織，回收于血液，尿液或精液中的前列腺細胞，以及回收于石蠟塊的DNA。
其它用于本實施例的檢測突變的方法包括DGGE，直接測序，錯-配切割，雜合子分析和化學切割。實施例7雜合子丟失(LOH)作為診斷/預后工具使用標志D10S541，D10S1765(AFM337×f9)和D10S215的LOH研究用于測定D10S541-D10S215區間的丟失。
由串聯CA重復序列組成的這些標志位于單一DNA序列側翼并通常稱為微衛星。CA重復序列的數目顯示出等位基因(不同染色體上的同系物)間的變化。運可用于區分在一給定組織中的帶有這些標記的兩個同源染色體區域。通過比較活檢的前列腺DNA(如源自尿液或精液)微衛星分布和抽提于血液或面頰細胞(如通過漱口藥)中的DNA的，可檢測到前列腺組織中的D10S541-D10S215區間的一個同系物丟失。
此法尤其適用于區分前列腺的瘤形成(一個同系物丟失)和增生(未丟失)。
此方法的步驟更詳細地描述于實施例1和圖1a和圖例中的實施例。
PCR引物序列是D10S541 5′-AAGCAAGTGAAGTCTTAGAACCACC-3′(序列1)5′-CCACAAGTAACAGAAAGCCTGTCTC-3′(序列2)D10S215 5′-TGGCATCATTCTGGGGA-3′(序列3)5′-GCTTTACGTTTCTTCACATGGT-3′ (序列4)D10S1765 5′-ACACTTACATAGTGCTTTCTGCG-3 ′ (序列5)5′-CAGCCTCCCAAAGTTGC-3′(序列6)通過類似方法可檢測該基因的雙缺失。實施例8；抑癌基因突變本發明的優選核酸的核酸分析，比較一個源自腫瘤的樣品和一個源自血樣的樣品，揭示了下述突變血液GAGGCCCTAG ATTTCTATGG GGAAGT-AAGG ACCAGAGACA AAA (序列9)腫瘤GAGGCCCTAG ATTTCTATGG GGAAGTTAAGG ACCAGAGACA AAA (序列10)在外顯子4中有一個T插如片段(腫瘤24)。此突變引起移碼，從而導致插入后摻入不合適的氨基酸到蛋白質產物中并最終由于遇到讀框外的終止子而致提前截短。
此突變可通過PCR擴增外顯子4(用外顯子4的圖中所示的內含子引物)以及隨后的用常規方法測序該PCR產物而檢測表2
a期是基于手指直腸檢查和骨掃描(9)。b世界衛生組織分級1.高分化 2.中分化 3.低分化 4.各種分化的混合c+＝10q丟失-＝未檢測到10q丟失。IS＝不穩定性。括號內的數字給出了如熒光法分型所測定的顯示等位基因丟失的微衛星標志的信號減弱的平均程度。基因座AA009519 510bp mRNA EST 1996年7月29日定義ze82b09.r1 Soares胎兒心臟NbHH19W人cDNA克隆365465 5′類似于SWTENS_CHICK Q04205張力蛋白.[1]；登記號AA009519 NIDg1470718關鍵詞EST.來源人。生物體人類真核生物；線粒體真核生物；后生動物；脊索動物門；脊椎動物門；真獸亞綱；靈長類動物；狹鼻類；原始人類；人。文獻1(堿基1-510)作者Hillier，L.，Clark，N.，Dubuque，T.，E1liston，K.，Hawkins，M.，Holman，M.，Hultman，M.，Kucaba，T.，Le，M.，Lennon，G.，Marra，M.，Parsons，J.，Rifkin，L.，Rohlfing，T.，Soares，M.，Tan，F.，Trevaskis，E.，Waterston，R.，Williamson，A.，Wohldmann，P.和Wilson，R.題目The WashU-Merck EST Project雜志未出版(1995)說明聯系WilsonRK WashU-Merck EST Project Washington University School ofMedicine 4444 Forest Park Parkway，Box 8501，St.Louis，MO63108電話314 286 1800傳真314 286 1810Emailest@watson.wustl.edu此克隆通過LLNL而不付使用費獲得；進一步的資料可與IMAGE Consortium聯系(info@image.llnl.gov)。序列引物mob.REGA+ET高質量的序列終止子331.特征Location/Qualifiers來源1..510/生物體＝“人類”/注＝“器官心臟；載體帶有一個修飾多接頭的pT7T3D(pharmacia)，位點1NotI；位點2EcoRI；第一條鏈cDNA是用NotI-寡聚(dT)引物[5′TGTTACCAATCTGAAGTGGGAGCGGCCGCATCTTTTTTTTTTTTTTTTTT3′]，以大小選定雙鏈cDNA并連接到EcoRI銜接頭(Pharmacia)，用NotI消化并克隆入修飾的pT7T3載體(Pharmacia)的NotI和EcoRI位點。文庫完成一系列規一化到Cot＝5。文庫是由M.Fatima Bonaldo構建的。此文庫構建于相同于胎兒肺文庫(Soares胎兒肺NbHL19W”)的胎兒。/克隆＝“365465”/克隆文庫＝“Soares胎兒心臟NbHH19W”/性別＝“未知”/發展時期＝“19周”/實驗宿主＝“DH10B(氨芐青霉素抗性)”mRNA<1..>510堿基數162a 92c 108g 143t 5個其它起源(ORIGN)AA009519長度510 1996年9月10日1903類型N編號3385..1ATGTAGTAAGGTTTTTGGATTCAAAGCATAAAAACCATTACAAGATATAC 51 AATCTTTGTG CTGAAAGACA TTATGACACCGCCAAATTTA ATTGCAGAGT 101 TGCACAATAT CCTTTTGAAGACCATAACCC ACCACAGCTA GAACTTATCA 151AACCCTTTTGTGAAGATCTT GACCAATGGC TAAGTGAAGA TGACAATCAT 201GTTGCAGCAATTCACTGTAA AGCTGGAAAG GGACGAACTGGTGTAATGAT 251 ATGTGCATAT TTATTACATC GGGGCAAATTTTTAAAGGCA CAAGAGGGCC 301 CTAGATTTCT ATGGGGAAGTAAGGACCAGA GACAAAAAGG GAGTAACTAT 351 TTCCCAGTCAGAAGGCGCTA TGTGTATTATTATTAGCTAC CTGTTAAAGA 401ATCATCTGGATTATAGACCA GTGGCACTGT TGTTTCCCAAGATGATGNTT 451TGAAACTATT NCCAATGTTC AGTGGCNGGACCTTGCAATC CNCAGTTTGT 501 GGGTCCTGCN表3基因座AA009520 414bp mRNA EST 1996年7月29日定義ze82b09.s1 Soares胎兒心臟NbHH19W人cDNA克隆365465 3′登記號AA009520NID g1470719關鍵詞EST來源人。生物體人類真核生物；線粒體真核生物；后生動物；脊索動物門；脊椎動物門；真獸亞綱；靈長類動物；狹鼻類；原始人類；人。文獻1(堿基1-414) 作者Hillier，L.，Clark，N.，Dubuque，T.，Elliston，K.，Hawkins，M.，Holman，M.，Hultman，M.，Kucaba，T.，Le，M.，Lennon，G.，Marra，M.，Parsons，J.，Rifkin，L.，Rohlfing，T.，Soares，M.，Tan，F.，Trevaskis，E.，Waterston，R.，Williamson，A.，Wohldmann，P.和Wilson，R.題目The WashU-Merck EST Project雜志未出版(1995)注明聯系Wilson RK WashU-Merck EST Project WashingtonUniversity School of Medicine 4444 Forest Park Parkway，Box 8501，St.Louis，MO 63108電話314 286 1800傳真314 286 1810Emailest@watson.wustl.edu此克隆通過LLNL不付使用費獲得；進一步的資料可與IMAGE Consortium聯系(info@image.llnl.gov)。序列引物mob.REGA+ET高質量的序列終止子317.特征Location/Qualifiers來源1..414/生物體＝“人類”/注＝“器官心臟；載體帶有一個修飾的多接頭的pT7T3D(Pharmacia)，位點1NotI；位點2EcoRI；第一條鏈cDNA是用NotI-寡聚(dT)引物[5′TGTTACCAATCTGAAGTGGGAGCGGCCGCATCTTTTTTTTTTTTTTTTTT3′]，以大小選擇雙鏈的cDNA并連接到EcoRI銜接頭(Pharmacia)，用NotI消化并克隆入修飾的pT7T3載體(Pharmacia)的NotI和EcoRI位點。文庫完成一系列規一化到Cot＝5。文庫是由M.FatimaBonaldo構建的。此文庫構建于相同于胎兒肺文庫(Soares胎兒肺NbHL19W”)的胎兒。/克隆＝“365465”/克隆文庫＝“Soares胎兒心臟NbHH19W”/性別＝“未知”/發展時期＝“19周”/實驗宿主＝“DH10B(氨芐青霉素抗性”)mRNA互補序列(Complement)(<1..>414)堿基數104a 71c 72g 165t2個其它起源AA009520長度414 1996年9月10日1905類型N編號5376..1 CAGTTTATTC AAGTTTATTT TCATGGTGTT TTATCCCTCTTGATAAAAAA 51 AAATTCAGACTTTTGTAATTTGTGTATGCTGATCTTCATC AAAAGGTTCA 101TTCTCTGGAT CAGAGTCAGTGGTGTCAGAA TATCTATAAT GATCAGGTTC 151ATTGTCACTAACATCTGGTG TTACAGAAGT TGAACTGCTA GCCTCTGGAT201 TTGACGGCTC CTCTACTGTT TTTGTGAAGT ACAGCTTCACCTTAAAATTT 251GGAGAAAAGT ATCGGTTGGCTTTGTCTTTA TTTGCTTTGT CAAGATCATT 301 TTTTGTTAAAGTAAGTACTA GATATTCCTT GTCATTATCT GCACGCTCTA 351TACTGCAAAT GCTATCGATTTCTTGATCACATAGACTTTCCATTTTCNAC 401 TTTTTCNGAG GTTT表4基因座AA017563 241bp mRNA EST 1996年8月2日定義ze39e04.s1 Soares N2b4HR人cDNA克隆361374 3′登記號AA017563NIDg1479716關鍵詞EST.來源人。生物體人類真核生物；線粒體真核生物；后生動物；脊索動物門；脊椎動物門；真獸亞綱；靈長類動物；狹鼻類；原始人類；人。文獻1(堿基1-241)作者Hillier，L.，Clark，N.，Dubuque，T.，Elliston，K.，Hawkins，M.，Holman，M.，Hultman，M.，Kucaba，T.，Le，M.，Lennon，G.，Marra，M.，Parsons，J.，Rifkin，L.，Rohlfing，T.，Soares，M.，Tan，F.，Trevaskis，E.，Waterston，R.，Williamson，A.，Wohldmann，P.和Wilson，R.題目TheWashU-Merck EST Project雜志未出版(1995)說明聯系WilsonRK WashU-Merck EST Project Washington University School ofMedicine 4444 Forest Park Parkway，Box 8501，St.Louis，MO63108電話314 286 1800傳真314 286 1810Emailest@watson.Wustl.edu此克隆通過LLNL不付使用費獲得；進一步的資料可與IMAGE Consortium聯系(info@image.llnl.gov)。可能的反相克隆polyT未發現 序列引物-40M13fwd.獲自Amersham高質量的序列終止子166.特征Location/Qualifiers來源1..241/生物體＝“人類”/注＝“器官眼睛；載體帶有一個修飾多接頭的pT7T3D(pharmacia)，位點1NotI；位點2EcoRI；第一條鏈cDNA是用Not I-寡聚(dT)引物[5′TGTTACCAATCTGAAGTGGGAGCGGCCGCGTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3′]，以大小選擇雙鏈cDNA并連接到EcoRI銜接頭(Pharmacia)，用NotI消化并克隆入修飾的pT7T3載體(Pharmacia)的NotI和EcoRI位點。視網膜獲自55歲白人而總細胞poly(A)+RNA在離體后6小時抽提。視網膜RNA由Toronto大學的Roderick R.McInnes醫學博士惠贈。文庫是由Bento Soares和M.Fatima Bonaldo構建的。/克隆＝“361374”/克隆文庫＝“Soares視網膜N2b4HR”/性別＝“男性”/組織型＝“ ”/發展時期＝“55歲”/實驗宿主＝“DH10B(氨芐青霉素抗性”)mRNA互補序列(<1..>241)堿基數31a 84c 82g 37t 7個其它起源AA017563 長度241 1996年9月10日1912類型N編號7697..1 GCGGCCGCGG NGGNTGCAGC TCCANGNAGG GGGTCTGAGTCGCCTGTCAC 51 CATTTNCAGG GCTGGGAACG CCGGAGAGTTGGTCTCTCCC CTTCTACTGC 101 CTCCAACACG GCGGCNGCGGCGGCGGCACA TCCAGGGACC CGGGCCGGTT 151 TTAAACCTCCCGTCCGCCGC CGCCGCACCC CCCAGTGGCC CGGGCTCCGG 201AGNCCGCCTG GCGGAGGCAA GCCGTTCGGA GGGATTATTC G表5基因座C01084 84bp DNA EST 1996年7月11日定義HUMGS0007741，人基因特征，3′-定向的cDNA序列。登記號C01084NIDg1433314關鍵詞基因特征；GS；EST(已表達的序列標志)；BodyMqp；基因表達來源一個或多個成人組織。生物體人類真核生物；線粒體真核生物；后生動物；脊索動物門；脊椎動物門；真獸亞綱；靈長類動物；狹鼻類；原始人類；人。文獻1(堿基1-84)作者Okabo，K.題目直接提交雜志交(1995，12，28)到DDBJ/EMBL/Genbank數據庫。Kousaku Okubo，Osaka University，Institute for Molecular and Cellular Bio1-3，Yamada-oka，Suita，Osaka Pref.565，Japan(E-mailkousaku@imcb.osaka-u.ac.jp，電話06-877-5111(ex.3315)，傳真06-877-1922)文獻2(堿基1-84)作者Okubo，K.題目BodyMap；人基因表達數據庫雜志未出版(1995)說明自1993年，本發明人沒有過多地提交相同的cDNA將序列到DDBJ。至于在此文庫以及其它3′-定向文庫中的此序列克隆的豐富資料，見http//www.imcb.osaka-u.ac.jp/bodymap′。在那里也發現了由此GS序列代表的克隆序列。特征Location/Qualifiers來源1..84/生物體＝“人類”堿基數38a 12c 11g 22t 1個其它起源C01084長度84 1996年9月10日1912類型N編號58761 GATCAGCATA CACAAATNACAAAAGTCTGA ATTTTTTTTT ATCAAGAGGG 51 ATAAAACACCATGAAAATAA ACTTGAATAA ACTG表6基因座H92038 427bp mRNA EST 1995年11月29日定義ys82e12.r1人cDNA克隆221326 5′。登記號H92038 NID g1087616關鍵詞EST.來源人克隆＝221326引物＝M13RP1文庫＝Soares視網膜N2b4HR載體＝帶有一個修飾的多接頭的pT7T3D(Pharmacia)宿主＝DH10B(氨芐青霉素抗性)位點1＝NotI；位點2＝EcoRI；第一條鏈cDNA是用NotI-寡聚(dT)引物[5TGTTACCAATCTGAAGTGGGAGCGGCCGCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTT3′]。以大小選擇雙鏈cDNA并連接到EcoRI銜接頭(Pharmacia)，用NotI消化并克隆入修飾的pT7T3載體(Pharmacia)的NotI和EcoRI位點。視網膜獲自55歲的男性白人而總細胞poly(A)+RNA在離體后6小時抽提。該視網膜RNA由Toronto大學的Roderick R.McInnesM.D.Ph.D惠贈。文庫由Bento Soares和M.Fating Bonaldo構建。生物體人真核生物；后生動物；Eumetazoa；Bilateria；體腔動物；后口動物；脊索動物門；脊椎動物門；有頜類；硬骨魚類；Sarcopterygii；Choanata；四足動物；羊膜動物；哺乳綱；Theria；真獸亞綱；Archonta；靈長類動物；狹鼻類；原始人類；人。文獻1(堿基1-427) 作者Hillier，L.，Clark，N.，Dubuque，T.，Elliston，K.，Hawkins，M.，Holman，M.，Hultman，M.，Kucaba，T.，Le，M.，Lennon，G.，Marra，M.，Parsons，J.，Rifkin，L.，Rohlfing，T.，Soares，M.，Tan，F.，Trevaskis，E.，Waterston，R.，Williamson，A.，Wohldmann，P.和Wilson，R.題目The WashU-Merck EST Project雜志未出版(1995)說明聯系人Wilson RK WashU-Merck EST Project Washington University School of Medicine 4444 ForestPark Parkway，Box 8501，St.Louis，MO63108電話314 286 1800傳真314 286 1810Emailest@watson.wustl.edu高質量的序列終止子330來源IMAGE Consortian，LLNL此克隆通過LLNL不付使用費獲得；進一步的資料可與IMAGE Consortium聯系(info@image.llnl.gov)。特征Location/Qualifiers來源1..427/生物體＝“人類”/克隆＝“221326”mRNA<1..>427堿基數103a 75c 116g 129t 4個其它起源H92038長度427 1996年9月10日1903類型N編號61681GGAAGTNGGTNATGGTCTTC AAAAGGATAT TGTGCAACTC TGCAATTAAA 51TTTGGCGGTGTCATAATGTCTTTCAGCACA AAGATTGTATATCTTGTAAT 101 GGTTTTTATG CTTTGAATCC AAAAACCTTACTACATCATC AATATTGTTC 151 CTGTATACGC CTTCAAGTCTTTCTGCAGGA AATCCCATAG CAATAATGTT 201 TGGATAAATATAGGTCAAGT CTAAGTCGAA TCCATCCTCT TGATATCTCC251TTTTGTTTCT GGCTAACGAT CTCTTTGGAT GGATGGCTGTCATGTCTGGG 301 GAGCCTGTGN TGGNAAGGAA AAAGGGAGGGAGAGAGATGG GCAGAAGCTG 351 GCTCGGTGGG CGGGGGCTTTCTTCTGGCAG GGATGGGAAA TGGGCTCTGG 401GGACTGGGCG GTACTGGATG GCCCCTC表7基因座H92039 117bp mRNA EST 29-11-1995定義ys82e12.s1人cDNA克隆221326 3′。登記號H92039NID g1087617關鍵詞EST.來源人克隆＝221326引物＝Promega-21m13文庫＝Soares視網膜N2b4HR載體＝帶有一個修飾的多接頭的pT7T3D(Pharmacia)宿主＝DH10B(氨芐青霉素抗性)位點1＝NotI；位點2＝EcoRI；第一條鏈cDNA是用NotI-寡聚(dT)引物[5′TGTTACCACTGAAGTGGGAGCGGCCGCAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTT3′]。以大小選擇雙鏈cDNA并連接到EcoRI銜接頭(Pharmacia)，用NotI消化并克隆入修飾的pT7T3載體(Pharmacia)的NotI和EcoRI位點。視網膜獲自55歲的男性白人而總細胞poly(A)+RNA在離體后6小時時抽提。該視網膜RNA由Toronto大學的Roderick R.McInnes醫學博士惠贈。文庫由Bento Soares和M.Fatima Bonaldo構建。生物體人類真核生物；后生動物；Eumetazoa；Bilateria；體腔動物；后口動物；脊索動物門；脊椎動物門；有頜類；硬骨魚類；Sarcopterygii；Choanata；四足動物；羊膜動物；哺乳綱；Theria；真獸亞綱；Archonta；靈長類動物；狹鼻類；原始人類；人。文獻1(堿基1-117) 作者Hillier，L.，Clark，N.，Dubuque，T.，Elliston，K.，Hawkins，M.，Holman，M.，Hultman，M.，Kucaba，T.，Le，M.，Lennon，G.，Marra，M.，Parsons，J.，Rifkin，L.，Rohlfing，T.，Soares，M.，Tan，F.，Trevaskis，E.，Waterston，R.，Williamson，A.，Wohldmann，P.和Wilson，R.題目The WashU-Merck EST Project雜志未出版(1995)注明聯系Wilson RK WashU-Merck EST Project Washington University School of Medicine 4444 ForestPark Parkway，Box 8501，St.Louis，MO63108電話314 286 1800傳真314 286 1810Emailest@watson.wustl.edu高質量的序列終止子104來源IMAGE Consortiam，LLNL此克隆通過LLNL不付使用費獲得；進一步的資料可與IMAGE Lonsortium聯系(info@image.llnl.gov)。可能的反向克隆polyT未發現。特征Location/Qualifiers來源1..117/生物體＝“人類”/克隆＝“221326”mRNA<1..>117堿基數16a 44c 37g 19t 1個其它起源H92039長度117 1996.9.10.1912類型N編號5577..1TCCAGGGCTGGGAACGCCGG AGAGTTGGTC TCTCCCCTTCTACTGCCTCN 51 AACACGGCGGCGGCGGCGGC GGCACATCCAGGGACCCGGG CCGGTTTTAA 101 ACCTCCCGTC CGCCGCC表8基因座N20238 322bp mRNAEST1995年12月18日定義yx44f06.s1人cDNA克隆264611 3′。登記號N20238 NID g1125193關鍵詞EST.來源人克隆＝264611 引物＝M13-40正向文庫＝Soares黑素細胞2NbHM載體＝帶有一個修飾的多接頭的pT7T3D(Pharmacia)宿主＝DH10B(氨芐青霉素抗性)限制位點1＝NotI；限制位點2＝EcoRI；第一條鏈cDNA是用NotI-寡聚(dT)引物[5′TGTTACCAATCTGAAGTGGGAGCGGCCGCAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT3′]。以大小選擇雙鏈cDNA并連接到EcoRI銜接頭(Pharmacia)，用NotI消化并克隆入修飾的pT7T3載體(Pharmacia)的NotI和EcoRI位點。文庫由Bento Soares和M.Fatima Bonaldo構建。源于正常包皮黑素細胞(FS374)的RNA由Anthony P.Albino博士惠贈。生物體人類真核生物；后生動物；Eumetazoa；Bilateria；體腔動物；后口動物；脊索動物門；脊椎動物門；有頜類；硬骨魚類；Sarcopterygii；Choanta；四足動物；羊膜動物；哺乳綱；Theria；真獸亞綱；Archonta；靈長類；狹鼻類；原始人類；人。文獻1(堿基1-322)作者Hillier，L.，Clark，N.，Dubuque，T.，Elliston，K.，Hawkins，M.，Holman，M.，Hultman，M.，Kucaba，T.，Le，M.，Lennon，G.，Marra，M.，Parsons，J.，Rifkin，L.，Rohlfing，T.，Soares，M.，Tan，F.，Trevaskis，E.，Waterston，R.，Williamson，A.，Wohldmann，P.和Wilson，R.題目The WashU-Merck EST Project雜志未出版(1995)注明聯系Wilson RK WashU-Merck EST Project Washington University School of Medicine 4444 ForestPark Parkway，Box 8501，St.Louis，MO 63108電話314 286 1800傳真314 286 1810Emailest@watson.wustl.edu高質量的序列終止子209來源IMAGE Consortiam，LLNL此克隆通過LLNL不付使用費獲得；進一步的資料可與IMAGE Consortium聯系(info@image.llnl.gov)。特征Location/Qualifiers來源1..322/生物體＝“人類”/克隆＝“264611”mRNA<1..>322堿基數49a 112c 98g 57t 6個其它起源N20238長度322 1996年9月10日1907類型N編號72491GGTCTGAGTCGCCTGTCACC ATTTCCAGGGCTGGGAACGCNGGAGAGTTG 51 GTCTCTCCCC TTCTACTGCC TCCAACACGGCGGCGGCGGC GGCGGCACAT 101 CCAGGGACCC GGGCCGGTTTTAAACCTCCC GTCCGCCGCC GCCGCACCCC 151 CCGTGGCCCGGGCTCCGGAG GCCGCCGGCG GAGNAAGCCG TTTCGGAGGA 201TTATTCGTCT TCTCCCCATT CCGCTGCCGC CCGCTGCCAGGCTCTTGGTG 251 CTTGAAGAAG AAGCAGGCCA GTTGNCTGAAACCATTCNAG AAGCCGCNGA 301 AGCAGCCATT ACNCGGCTGC GG表9基因座N29304 427bp mRNA EST 04-1-1995定義yx44506.r1人cDNA克隆264611 5′。登記號N29304NID g1147540關鍵詞EST.來源人克隆＝264611引物＝T7文庫＝Soares黑素細胞2NbHM載體＝帶有一個修飾的多接頭的pT7T3D(Pharmacin)宿主＝DH10B(氨芐青霉素抗性)位點1＝NotI；位點2＝EcoRI；第一條鏈cDNA是用NotI-寡聚(dT)引物[5′TGTTACCAATCTGAAGTGGGAGCGGCCGCAGTCTTTTTTTTTTTTTTTTTT3′]。以大小選擇雙鏈cDNA連接到EcoRI銜接頭(Pharmacia)，用NotI消化并克隆入修飾的pT7T3載體(Pharmacia)的NotI和EcoRI位點。文庫由Bento Soares和M.Fatima Bonaldo構建。源自包皮黑素細胞(FS374)的RNA由Anthony P.Albino博士惠贈。生物體人類真核生物；后生動物；Eumetazoa；Bilateria；體腔動物；后口動物；脊索動物門；脊椎動物門；有頜類；硬骨魚類；Sarcopterygii；Choanata；四足動物；羊膜動物；哺乳綱；Theria；真獸亞綱；Archonta；靈長類動物；狹鼻類；原始人類；人。文獻1(堿基1-427)作者Hillierl，L.，Clark，N.，Dubuque，T.，Elliston，K.，Hawkins，M.，Holman，M.，Hultman，M.，Kucaba，T.，Le，M.，Lennon，G.，Marra，M.，Parsons，J.，Rifkin，L.，Rohlfing，T.，Soares，M.，Tan，F.，Trevaskis，E.，Waterston，R.，Williamson，A.，Wohldmann，P.和Wilson，R.題目The WashU-Merck EST Project雜志未出版(1995)注明聯系Wilson RK WashU-Merck EST Project Washington University School of Medicine 4444 ForestPark Parkway，Box 8501，St.Louis，MO 63108電話314 286 1800傳真314286 1810Emailest@watson.wustl.edu高質量的序列終止子370來源IMAGE Consortiam，LLNL此克隆通過LLNL不付使用費獲得；進一步的資料可與IMAGE Consortium聯系(info@image llnl.gov)。特征Location/Qualifiers來源1..427/生物體＝“人類”/克隆＝“264611”mRNA<1..>427堿基數116a 90c 79g 140t 2個其它起源N29304長度427 1996年9月10日1904類型N編號95081TAAGTACTAGATATTCCTTGTCATTATCTGCACGCTCTATACTGCAAATG 51 CTATCGATTT CTTGATCACA TAGACTTCCATTTTCTACTT TTTCTGAGGT 101 TTCCTCTGGT CCTGGTATGAAGAATGTATTTACCCAAAAGTGAAACATTT 151 TGTCCTTTTTTAGCATCTTG TTCTGTTTGT GGAAGAACTC TACTTTGATA201TCACCACACA CAGGTAACGG CTGAGGGAAC TCAAAGTACATGAACTTGTC 251 TTCCCGTCGT GTGGGTCCTG AATTGGAGGAATATATCTTC ACCTTTAGCT 301 GGCAGACCAC AAACTGNAGGATTGCAAGTT CCGCCACTGA ACATTGGAAT 351 AGTTTCAAACATCATCTTGT GAAACAACAG TGCCACTGGT CTATAANCCA401GATGATTCTT TAACAGGGTA GCTATAA表10基因座N35389 427bp mRNA EST 1996年1月18日定義yy23e03.s1人cDNA克隆272092 3′。登記號N35389 NID g1156531關鍵詞EST.來源人克隆＝272093引物＝M13-40正向文庫＝Soares黑素細胞2NbHM載體＝帶有一個修飾的多接頭的pT7T3D(Pharmacia)宿主＝DH10B(氨芐青霉素抗性)限制位點1＝NotI；限制位點2＝EcoRI；第一條鏈cDNA是用NotI-寡聚(dT)引物[5′TGTTACCAATCTGAAGTGGGAGCGGCCGCATCTTTTTTTTTTTTTTTTTT3′]。以大小選擇雙鏈cDNA并連接到EcoRI銜接頭(Pharmacia)，用NotI消化并克隆入修飾的pT7T3載體(Pharmacia)的NotI和EcoRI位點。文庫由Bento Soares和M.Fating Bonaldo構建。源自正常包皮黑素細胞(FS374)的RNA由Anthony P.Albino博士惠贈。生物體人類真核生物；后生動物；Eumetazoa；Bilateria；體腔動物；后口動物；脊索動物門；脊椎動物門；有頜類；硬骨魚類；Sarcopterygii；Choanata；四足動物；羊膜動物；哺乳綱；Theria；真獸亞綱；Archonta；靈長類動物；狹鼻類；原始人類；人。文獻1(堿基1-437)作者Hillier，L.，Clark，N.，Dubuque，T.，Elliston，K.，Hawkins，M.，Holman，M.，Hultman，M.，Kucaba，T.，，Le，M.，Lennon，G.，Marra，M.，Parsons，J.，Rifkin，L.，Rohlfing，T.，Soares，M.，Tan，F.，Trevaskis，E.，Waterston，R.，Williamson，A.，Wohldmann，P.和Wilson，R.題目The WashU-Merck EST Project雜志未出版(1995)注明聯系人Wilson RK WashU-Merck EST Project Washington University School of Medicine 4444 ForestPark Parkway，Box 8501，St.Louis，MO 63108電話314 286 1800傳真314286 1810Emailest@watson.wustl.edu高質量的序列終止子331來源IMAGE Consortiam，LLNL此克隆通過LLNL不付使用費獲得；進一步的資料可與IMAGE Consortium聯系(info@image.llnl.gov)。特征Location/Qualifiers來源1..437/生物體＝“人類”/克隆＝“272092”mRNA<1..>427堿基數108a 79c 78g 166t 6個其它起源N35389長度437 1996年9月10日1904類型N編號98031CAGTTTATTCAAGTTTATTTTCATGGTGTTTTATCCCTCT TGATAAAAAA 51AAATTCAGAC TTTTGTAATT TGTGTATGCTGATCTTCATCAAAAGGTTCA 101 TTCTCTGGAT CAGAGTCAGT GGTGTCAGAATATCTATAATGATCAGGTTC 151 ATTGTCACTA ACATCTGGTGTTACAGAAGTTGAACTGCTA GCCTCTGGAT 201 TTGACGGCTCCTCTACTGTT TTNGTGAAGT ACAGCTTCAC CTTAAAATTT251GGAGAAAAGT ATCGGTTGGCTTTGTCTTTATTTGCNTTGTCAAGATCATT 301 TTCTGTTAAA GTAAGTACTA TGATATTCCTTGTCATTATCTGCACGCTCT 351 ATACTGCAAA TGCTATCGATTTCTTGATCA CATAGACTTC CATTTTCTAC 401 TTTTTCNGAGGTTTCCCCCN GGTCCNGGGT AATGAAN表11基因座N48030 372bp mRNA EST 1996定義yy23e03.r1人cDNA克隆272092 5′。類似于SW TENS CHICK Q04205張力蛋白。[1]；登記號N48030 NID g1189196關鍵詞EST.來源人克隆＝272092引物＝T7文庫＝Soares黑素細胞2NbHM載體＝帶有一個修飾的多接頭的pT7T3D(Pharmacia)宿主＝DH10B(氨芐青霉素抗性)位點1＝NotI；位點2＝EcoRI；第一條鏈cDNA是用NotI-寡聚(dT)引物[5′TGTTACCAATCTGAAGTGGGAGCGGCCGCATCTTTTTTTTTTTTTTTTTT3′]。以大小選擇雙鏈的cDNA連接到EcoRI銜接頭(Pharmacia)，用NotI消化并克隆入修飾的pT7T3載體(Pharmacia)的NotI和EcoRI位點。文庫由Bento Soares和M.Fating Bonaldo構建。源于包皮黑色素細胞(FS374)的RNA由Anthony P.Albino博士惠贈。生物體人類真核生物；后生動物；Eumetazoa；Bilateria；體腔動物；后口動物；脊索動物門；脊椎動物門；有頜類；硬骨魚類；Sarcopterygii；Choanata；四足動物；羊膜動物；哺乳綱；Theria；真獸亞綱；Archonta；靈長類動物；狹鼻類；原始人類；人。文獻1(堿基1-372)作者Hillier，L.，Clark，N.，Dubuque，T.，Elliston，K.，Hawkins，M.，Holman，M.，Hultman，M.，Kucaba，T.，Le，M.，Lennon，G.，Marra，M.，Parsons，J.，Rifkin，L.，Rohlfing，T.，Soares，M.，Tan，F.，Trevaskis，E.，Waterston，R.，Williamson，A.，Wohldmann，P.和Wilson，R.題目The WashU-Merek EST Project雜志未出版(1995)注明聯系人Wilson RK WashU-Merck EST ProjectWashington University School of Medicine 4444 Forest Park Parkway，Box 8501，St.Louis，MO 63108電話314 286 1800傳真314 286 1810Emailest@watson.wustl.edu高質量的序列終止子240來源IMAGEConsortiam，LLNL此克隆通過LLNL不用使用費獲得；進一步的資料可與IMAGE Consortium聯系(info@image.llnl.gov)。特征Location/Qualifiers來源1..372/生物體＝“人類”/克隆＝“272092”mRNA<1..>427堿基數122a67c 76g 101t 6個其它起源N48030長度372 1996.9.10.1906類型N編號60711 TTTTTGGATT CAAAGCATAA AAACCATTACAAGATATTTT ATCTTCTNNG 51 CTGAAAGACA TTATGACACCGCCAAATTTA ATTGCAGAGT TGCACAATAT 101 CCTTTTGAAGACCATAACCCACCACAGCTA GAACTTATCAAACCCTTTTG 151TGAAGATCTT GACCAATGGC TAAGTGAAGA TGACAATCATGTTGCAGCAA 201 TTCACTGTAA AGCTGGAAAG GGACGAACTGGTGTAATGAT ATGTGCATAT 251 TTATTACATCGGGGCAAATTTTTAAAGGCACAAGAGGCCC NAAGATTTCT 301 ATGGGGAAGTAAGGGCCCGAGA CNAAAAGGGNGTAACTAT TCCCAGTCAG351 AGGGCGCTAT GTGTNTTATT AT表12基因座R06763 474bp mRNA EST 1995年4月3日定義yf11e03.s1人cDNA克隆126556 3′。登記號R06763NID g757383關鍵詞EST.來源人克隆＝126556文庫＝Soares胎兒肝脾1NFLS載體＝帶有一個修飾的多接頭的pT7T3D(pharmacia)宿主＝DH10B(氨芐青霉素抗性)引物＝SP6限制位點1＝Not I；限制位點2＝EcoRI；第一條鏈cDNA是用PacI-寡聚(dT)引物[5′AACTGGAAGAATTAATTAAAG ATCTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3′]。以大小選擇雙鏈的cDNA并連接到EcoRI銜接頭(Pharmacia)，用PacI消化并克隆入修飾的pT7T3載體(Pharmacia)的PacI和EcoRI位點。文庫通過一系列歸一化。文庫由Bento Soares和M.FatingBonaldo構建。生物體人類真核生物；后生動物；脊索動物門；脊椎動物門；有頜類；哺乳綱；真獸亞綱；靈長類動物；狹鼻類；原始人類；人。文獻1(堿基1-474)作者Hillier，L.，Clark，N.，Dubuque，T.，Elliston，K.，Hawkins，M.，Holman，M.，Hultman，M.，Kucaba，T.，Le，M.，Lennon，G.，Marra，M.，Parsons，J.，Rifkin，L.，Rohlfing，T.，Soares，M.，Tan，F.，Trevaskis，E.，Waterston，R.，Williamson，A.，Wohldmann，P.t和Wilson，R.題目The WashU-Merek EST Project雜志未出版(1995)注明聯系Wilson RK WashU-Merck EST Project Washington UniversitySchool of Medicine 4444 Forest Park Parkway，Box 8501，St.Louis，MO 63108電話314 286 1800傳真314 286 1810Emailest@watson.Wustl.edu高質量的序列終止子108來源IMAGE Consortiam，LLNL此克隆通過LLNL不用使用費獲得；進一步的資料可與IMAGE Consortium聯系(info@image.llnl.gov)。特征Location/Qualifiers來源1..474/生物體＝“人類”/克隆＝“126556”堿基數108a 81c 89g 190t 6個其它起源R06763長度474 1996年9月10日1904類型N編號67891AGCCGCTTTA ATTAAAGATC TTTTTTTTTT TTTTTTTTTC AGTTTATTCA51 AGTTTATTTT CATGGTGTTTTATCCCTCTTGATAAAAAAAAATTCAGACT101 TTTGTAATTT GTGTATGCTG ATCTTCATCAAAAGGGTTCA TTCTCTGGAT 151 CAGAGTCAGTGGGTGTCAGA ATATCTATAA TGATCAGGTTCATTGTCACT201AACATCTGGN GTTACAGAAG TTGAACTGCT AGCCTCTGGGATTTGACGGC251 TCCNCTACTGTTTTTGTGAA GTACAGCTTCACCTTAAAAT TTGGNGAAAA 301GTATCGGTTG GCTTTGTCTTTATTTGCTTT GTCAAGATCA TTTTTTGTTA 351 AAGTAAGGACTAGGATATTC CCTGTCATTATCTGCACGCT CTATACTGCA 401AATGCTATCG ATTTCTTGATCACATAGGGC TTCCNTTTTCTACTTTTTCT 451 GAGGGTTNCCCTGGTCCGGG NTTG表13基因座R06814 429bp mRNA EST 03-4-1995定義yf11e03.r1人cDNA克隆126556 5′。登記號R06814 NID g757434關鍵詞EST.來源人克隆＝126556文庫＝Soares胎兒肝脾1NFLS載體＝帶有一個修飾的多接頭的pT7T3D(Pharmacia)宿主＝DH10B(氨芐青霉素抗性)限制位點1＝NotI；限制位點2＝EcoRI肝和脾肝源自妊娠20周的男性胎兒；第一條鏈cDNA是用PacI-寡聚(dT)引物[5′AACTGGAAGAATTAATTAAAGATCTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3′]。將選定的大小的雙鏈的cDNA連接到EcoRI銜接頭(Pharmacia)，用PacI消化并克隆入修飾的pT7T3載體(Pharmacia)的PacI和EcoRI位點。文庫通過一系列歸一化。文庫由Bento Soares和M.Fating Bonaldo構建。生物體人類真核生物；后生動物；脊索動物門；脊椎動物門；有頜類；哺乳綱；真獸亞綱；靈長類動物；狹鼻類；原始人類；人。文獻1(堿基1-429)作者Hillier，L.，Clark，N.，Dubuque，T.，Elliston，K.，Hawkins，M.，Holman，M.，Hultman，M.，Kucaba，T.，Le，M.，Lennon，G.，Marra，M.，Parsons，J.，Rifkin，L.，Rohlfing，T.，Soares，M.，Tan，F.，Trevaskis，E.，Waterston，R.，Williamson，A.，Wohldmann，P.t和Wilson，R.題目The WashU-Merck EST Project雜志未出版(1995)的評論聯系人Wilson RK WashU-Merck EST Project Washington University School ofMedicine 4444 Forest Park Parkway，Box 8501，St.Louis，MO 63108電話314 286 1800傳真314 286 1810Emailest@watson.wustl.edu高質量的序列終止子307來源IMAGE Consortiam，LLNL此克隆通過LLNL不付使用費獲得；進一步的資料可與IMAGE Consortium聯系(info@image.llnl.gov)。特征Location/Qualifiers來源1..429/生物體＝“人類”/克隆＝“126556”堿基數114a 73c 65g 176t 1個其它起源R06814長度429 1996年9月10日1916類型N編號8891TGTTCTGTAA GTTACTTTTA CCGTTAAACT TCTTAATGTTGCTTATTGTT 51 TGTCTTACAT TTTTAGGTTG GATTTTTCTTAAGTCACATG TCTAATAAAA 101 AAAACCCTTA AATACCTCATTTATTCGTCT TCGTTAGTGA ATGCATTGTT 151 GTACATATTAGATTTTTCTC TTTAGATAAC TCAGCTTCCC CTATTAAGTG 201CCACATGTAT TACAAAATTT TATTTATGTT TTATTGTTTA ATAAACTCTT251 GAGAACTAGA TACATTTTAA TCATTTGTAA TACTTACATTTTCTAAAACA 301 CTTCATTTTT CCCGGGGTTCTTCAACAAAGGGGATGGCAT GTAGGTACAA 351 GGGATAGCTT TACCNGTGTTAGGAAGGTTG TTTTCACACC TTTACATCAA 401 CTGCATAGTCCCGTTTTTGT TGGGGCCCA表14基因座R29457 224bpmRNA EST 1996年4月25日定義F1-578D22周人胎兒肝臟cDNA文庫，人cDNA克隆F1-578D 5′。登記號R29457NID g1511865關鍵詞EST來源人。生物體人類真核生物；線粒體真核生物；后生動物；脊索動物門；脊椎動物門；真獸亞綱；靈長類動物；狹鼻類；原始人類；人。文獻1(堿基1-224)作者Choi，S.S.，Yun，J.W.，Choi，E.k.，Cho，Y.G.，Sung，Y.C.和Shin，H.-S。題目單向(Single-pass)cDNA測序構建人胎兒肝臟基因表達分布圖雜志未出版(1995)說明聯系人Hee-Sup Shin Developmental Genetics Pohang Institute of Science & TechnologySan31.Hyojadong Pohang，Emailshinhs@vision.postech.ac.kr序列引物T3引物。特征Location/Qualifiers來源1..224/生物體＝“人類”/注＝“載體pBluescript II SK(-)；位點1EcoRI；位點2XhoI；該cDNA文庫由寡聚-dT引導并直接克隆到5′ExoRI-xhoI3′位點間而構建”。/克隆＝“F1-578D”/克隆文庫＝“22周齡人胎兒肝臟cDNA文庫”/實驗宿主/；XL1-blue MRF mRNA<1..>224堿基數45a 78c 67g 34t起源R29457長度224 1996年9月10日1911類型N編號1046..1GGGCTCCGGAGCCGCCGGCGGAGGCAGCCG TTCGGAGGATTATTCGTCTT 51 CTCCCCATTC CGCTGCCGCCGCTGCCAGGCCTCTGCTGCTGAGGAGAAGC 101 AGGCCCAGTC GCTGCAACCATCCAGCAGCCGCCGCAGCAG CCATTACCCG151 GCTGCGGTCCAGAGCCAAGA CGCAGAGAGG GCATCAGCTACCGCCAAGTC201 AGAGCATTTC CATCTCAGAA GAAG表15基因座T05157 266bp mRNA EST 1993年6月30日定義EST03045人cDNA克隆HFBC342登記號T05157NID g316309關鍵詞EST來源人克隆＝HFBCS42文庫＝胎兒腦，戰略(編號#936206)載體＝λZAP-II引物＝MB-21妊娠17-18周，女性；oligo-dT+隨機引導的cDNA合成；λZAP-II載體，1.0kb平均插入大小。生物體人類真核生物；Animalia；脊索動物門；脊椎動物門；哺乳動物；Theria；真獸亞綱；靈長類動物；Haplorhini；狹鼻類；原始人類。文獻1(堿基1-266)作者Adams，醫學博士.，Kerlavage，A.R.，Fields，C.and Venter，J.C.題目3400個已表達的序列標志源自人腦的轉錄體的多樣性雜志自然，遺傳分冊4，256-267(1993)注明聯系Adams，MD The Institute for Genomic Research 932 Clopper Road，Gaithersburg，MD 20878電話3018699056傳真3018699423Emailmdadams@tigr.org.特征Location/Qualifiers來源1..266/生物體＝“人類”/克隆＝“HFBCS42”堿基數95a44c 57g69t 1個其它起源T05157長度266 1996年9月10日，1906類型N編號43981 TGGAGGGAAGACAAGTTCAT GTACTTTGAGTTCCCTCAGCCGTTACCTGT 51GTGTGGTGATATCAAAGTAG AGTTCTTCCA CAAACAGAACAAGATGCTAA101 AAAAGGACAA AATGTTTCAC TTTTGGGTAAATACATTCTTCATACCAGGA 151CCAGAGGAAACCTCAGAAAAAGTAGAAAATGGAAGTCTATGTGATCAAGN 201AATCGATAGCATTTGCAGTA TAGAGCGTGCAGATAATGACAAGGAATATC251 TAGTACTTAC TTTAAC表16基因座T60214 396bp mRNA EST 09-02-1995定義yc22c07.r1人cDNA克隆81420 5′。登記號T60214 NID g662051關鍵詞EST來源人克隆＝81420文庫＝stratagene肺(#937210)載體＝pBluescript SK-宿主＝SOLR細胞(卡拉霉素抗性)引物＝M13RP1限制性位點1＝EcoRI，限制性位點2＝XhoI正常肺組織獲自72歲男性。單向克隆。引物寡聚dT。平均插入大小1.0kb；Uni-ZAR XR載體；5′銜接頭序列5′-GAATTCGGCACGAG-3′；3′銜接頭序列5′-CTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′。生物體人類真核生物；后生動物；脊索動物門；脊椎動物門；有頜類；哺乳綱；真獸亞綱；靈長類動物；狹鼻類；原始人類；人。文獻1(堿基(1-396)作者Hillier，L.，Clark，N.，Dubuque，T.，Elliston，K.，Hawkins，M.，Holman，M.，Hultman，M.，Kucaba，T.，Le，M.，Lennon，G.，Marra，M.，Parsons，J.，Rifkin，L.，Rohlfing，T.，Soares，M.，Tan，F.，Trevaskis，E.，Waterston，R.，Williamson，A.，Wohldmann，P.和Wilson，R.題目TheWashU-Merck EST Project雜志未出版(1995)注明聯系人Wilson RKWashU-Merck EST Project Washington University School of Medicine4444 Forest Park Parkway，Box 8501，St.Louis，MO 63108電話314 286 1800傳真314 286 1810Emailest@watson.wustl.edu高質量的序列終止子242來源IMAGE Consortium，LLNL此克隆通過LLNL不付使用費獲得；進一步的資料可與IMAGE Consortium聯系(info@image.llnl.gov)。Location/Qualifiers來源1..396/生物體＝“人類”/克隆＝“81420”堿基計數119a 75c 74g 126t 2個其它起源T60214長度396 1996年9月10日，1907類型N編號51341 TCAAATCCAG AGGCTAGCAGTTCAACTTCT GTAACACCAG ATGTTAGTGA 51 CAATGAACCTGATCATTATA GATATTCTGA CACCACTGAC TCTGATCCAG 101AGAATGAACC TTTTGATGAAGATCAGCATACACAAATTACAAAAGTCTGA 151 ATTTTTTTTT ATCAAGAGGG ATAAAACACCATGAAAATAA ACTTGAATAA 201 ACTGAAAATG GGACCTTTTTTTTTTTTAAT GGGCAATAGG GACATTGTGT 251 CAGGATTACCAGTTATAGGG GACAATTCTC TTTTCCCTGG ACCCAATCTT 301GTTTTTACC CTATACATCC ACCGGGGGTT TTTTGACACT TGTTTGTCCC351 AGTTGGAAAA AGGGTTGTNT TGGCCGTNGT CCAGGATTATACCCTT表17基因座W23656 451bp mRAN EST 06-05-1996定義zb46c05.r1Soares胎兒肺NbHL19W人cDNA克隆306632 5′。登記號W23656NIDg1300471關鍵詞EST.來源人。生物體人類真核生物；線粒體真核生物；后生動物；脊索動物門；脊椎動物門；真獸亞綱；靈長類動物；狹鼻類；原始人類；人。文獻1(堿基1-451)作者Hillier，L.，Clark，N.，Dubuque，T.，Elliston，K.，Hawkins，M.，Holman，M.，Hultman，M.，Kucaba，T.，Le，M.，Lennon，G.，Marra，M.，Parsons，J.，Rifkin，L.，Rohlfing，T.，Soares， M.，Tan，F.，Trevaskis，E.，Waterston，R.，Williamson，A.，Wohldmann，P.t和Wilson，R.題目TheWashU-Merck EST Project雜志未出版(1995)注明聯系Wilson RKWashU-Merck EST Project Washington University School of Medicine4444 Forest Park Parkway，Box 8501，St.Louis，MO 63108電話314 2861800傳真314 286 1810Emailest@watson.wustl.edu此克隆通過LLNL不付使用費獲得；進一步的資料可與IMAGE Consortium聯系(info@image.llnl.gov)。序列引物mob.REGA+ET高質量的序列終止子240.特征Location/Qualifiers來源1..451/生物體＝“人類”/注＝“器官肺；載體帶有一個修飾多接頭的pT7T3D(Pharmacia)，位點1NotI；位點2EcoRI；第一條鏈cDNA是用NotI-寡聚(dT)引物[5′TGTTACCAATCTGAAGTGGGAGCGGCCGCAATTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′]，以大小選擇雙鏈的cDNA并連接到EcoRI銜接頭(Pharmacia)，用NotI消化并克隆入修飾的pT7T3載體(Pharmacia)的NotI和EcoRI位點。文庫完成一系列規一化到Cot＝5。文庫是由M.Fatima Bonaldo構建的。此文庫構建于相同于胎兒心臟文庫(Soares胎兒心臟NbHH19W”)的胎兒。/克隆＝“306632”/克隆文庫＝“Soares胎兒肺NbHL19W”/發展時期＝“19周”/實驗宿主＝“DH10B(氨芐青霉素抗性”)mRNA<1..>451堿基數148a 76c 82g 141t 4個其它起源W23656長度451 1996年9月10日1910類型N編號6961..1 CAACTTCTGTAACACCAGAT GTTAGTGACA ATGAACCTGA TCATTATAGA 51TATTCTGACA CCACTGACTC TGATCCAGAG AATGAACCTTTTGATGAAGA 101 TCAGCATACA CAAATTACAAAAGTCTGAAT TTTTTTTTAT CAAGAGGGAT 151AAAACACCATGAAAATAAAC TTGAATAAACTGAAAATGGACCTTTTTTTT201 TTTAATGGCA ATAGGACAT GTGTCAGATT ACCAGTTATAGGAACAATTC 251 TCTTTTCCTG ACCAATCTTG NTTTACCCNATACATTCCCA GGGGTTTGGA 301CACTTGGTGG TCCAGNTTGAAAAAAGGTTG TGTAGCTGTG NCATGGTATA 351 TACCTTTTTGTGGCCAAAAG GGACATTTAA AATTCAATTA GGATTAATAA 401AGATGGGCAC TTTCCCGTTTATTCCAGTT TTATAAAAAGTGGGGACAGA 451 C表18基因座W27533 902bp mRAN EST 1996年5約8日定義32b2人視網膜cDNA隨機引導的亞文庫人cDNA。登記號W27533NID g1307337關鍵詞EST.來源人。生物體人類真核生物；線粒體真核生物；后生動物；脊索動物門；脊椎動物門；真獸亞綱；靈長類動物；狹鼻類；原始人類；人。文獻1(堿基1-902)作者Macke，J.，Smallwood，P.和Nathans J。題目成人視網膜cDNA Project雜志未出版(1995)注明聯系人Dr.Jeremy NathansDr.Jeremy Nathans，Dept.of Molecular Biology and Genetics Johns HopkinsSchool of Medicine 725 North Wolfe Street，Baltimore，MD 21205電話410 955 4678傳真410 614 0827Emailjeremy_nathans@qmail.bs.jhu.edu該文庫的克隆不能獲得。PCR引物正向CTTTTGAGCAAGTTCAGCCTGGTTAAG反向GAGGTGGCTTATGAGTATTTCTTCCAGGGTAA序列引物GGGTAAAAAGCAAAAGAATT.特征Location/Qualifiers來源1..902/生物體＝“人類”/注＝“器官眼睛；載體λgt10；位點1EcoRI；位點2EcoRI；用于測序的文庫是衍生于人視網膜cDNA文庫的亞文庫。分離出眼網膜cDNA文庫DNA的插入片段，隨機引導，PCR擴增，以大小篩選，并克隆入λgt10。排列各個噬斑并用作PCR擴增的模板，并將這些PCR產物測序”。/克隆文庫＝“人視網膜cDNA隨機引導的亞文庫”/性別＝“混合(男和女性)”/組織類型＝“視網膜”/發育時期＝“成人”/實驗宿主＝“E.coli菌株K802”mRNA<1..>902堿基數124a 110c 117g 131t 402個其它起源W27533，長度9021996，9，10，1905類型N，編號224..1GNGNNNTTNC TACTCANGAT CATTTGGNGGT TAAAGTAAG TACTAGATAN51 TCCTTGTCAT TATCTGCACG CTCTATACTG CAAATGCTAT CGATTTCTTG101ATCACATAGA CTTCCATTTT CTACTTTTNCTGAGGTTNCCTCTGGTCCTG 151 GTATGAAGAA TGTATTTACC CAAAAGTGAAACATTGGGTC CTTTTTTAGC 201 ATCTGGTNCT GTGNGTGGAAGAACTCTACT TGGATATCAC CACACACAGG 251 TAACGGCTGAGGGAACTCAA AGTACATGAA CTTGTCTTCC CGNCGNGTGG 301GTCCTGAATT GGAGGAATAT NTCTTCACCT NNAGCTGGCA GACCACAAAC351 TGAGGATTGC AAGTNCCGCC ACTGAACATG GGAATAGGNTCAAACATCAN401 CTTGGGAAAC AACAGGGNCA CTGGTCTTTTANCCAGNTGA TCNNNACAGG 451 GGGTATNATA NACANANGGGCCCNNNNNGG AATGGGNCNC CNNGGGGTTN 501 NNCCCNNNNCCCANNNNNNC ANNGGGNTNC CGGNGGGNNN NNNNNNNNNN 551NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN601 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 651 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 701 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 751 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 801NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN851 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNN N NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 901 CC表19
基因座W30684 601bp mRAN EST 09-05-1996定義zb77b11，r1Soares衰老的成纖維細胞NbHSF人cDNA克隆309597 5′登記號W30684NID g1311870關鍵詞EST.來源人。生物體人類真核生物；線粒體真核生物；后生動物；脊索動物門；脊椎動物門；真獸亞綱；靈長類動物；狹鼻類；原始人類；人。文獻1(堿基1-601)作者Hillier，L.，Clark，N.，Dubuque，T.，Elliston，K.，Hawkins，M.，Holman，M.，Hultman，M.，Kucaba，T.，Le，M.，Lennon，G.，Marra，M.，Parsons，J.，Rifkin，L.，Rohlfing，T.，Soares，M.，Tan，F.，Trevaskis，E.，Waterston，R.，Williamson，A.，Wohldmann，P.和Wilson，R.題目TheWashU-Merck EST Project雜志未出版(1995)注明聯系人Wilson RKWashU-Merck EST Project Washington University School of Medicine 4444Forest Park Parkway，Box 8501，St.Louis，MO 63108電話314 286 1800傳真314 286 1810Emailest@watson.wustl.edu此克隆通過LLNL不付使用費獲得；進一步的資料可與IMAGE Consortium聯系(info@image.llnl.gov)。序列引物mob.REGA+ET高質量的序列終止子463.特征Location/Qualifiers來源1..601/生物體＝“人類”/注＝載體帶有一個修飾多接頭的pT7T3D(Pharmacia)，載體類型噬菌粒；位點1NotI；位點2Eco RI；TGTTACCAATCTGAAGTGGGAGCGGCCGCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3′]，以大小選擇雙鏈cDNA并連接到EcoRI銜接頭(Pharmacia)，用NotI消化并克隆入修飾的pT7T3載體(Pharmacia)的NotI和EcoRI位點。文庫完成一系列規一化到Cot＝5。文庫是由M.FatimaBonaldo構建的。/克隆＝“309597”/克隆文庫＝“Soares衰老成纖維細胞NbHSF”/實驗宿主＝“DH10B(氨芐青霉素抗性”)mRNA<1..>601堿基數176a 105c 122g 197t 1個其它起源W30684長度601 1996年9月10日1913類型N編號2320..1 GCAAGAGGGA TAAAACACCATGAAAATAAA CTTGAATAAA CTGAAAATGG 51 ACCCTTTTTTTTTTAATGGC AATAGGACAT TGTGTCAGAT TACCAGTTAT 101AGGAACAATTCTCTTTTCCTGACCAATCTTGTTTTACCCTATACATCCAC 151 AGGGTTTTGA CACTTGTTGT CCAGTTGAAAAAAGGTTGTGTAGCTGTGTC 201 ATGTATATAC CTTTTTGTGTCAAAAGGACA TTTAAAATTC AATTAGGATT 251 AATAAAGATGGCACTTTCCC GTTTTATTCC AGTTTTATAA AAAGTGGAGA 301CAGACTGATGTGTATACGTA GGAATTTTTT CCTTTTGTGTTCTGTCACCA 351 ACTGAAGTGG CTAAAGAGCT TTGTGATATACTGGTTCACATCCTACCCCT 401 TTGCACTTGTGGCAACAGAT AAGTTTGCAG TTGGGCTAAG AGAGGTTTCC 451GAAGGGTTTT GCTACATTCT AATGCATGTATTCGGGGTTAGGGGAATGGA 501 GGGGAATGCT CAGAAAGGAA ATAATTTTAATGCTGGACTC TGGACCATAT 551 ACCATCTCCA GCTANTTACACACACCTTTC CTTAGCATGC CACAGTTATT601 A表20基因座W81026 453bp mRAN EST 1996年6月26日定義zd84a07.r1Soares胎兒心臟NbHH19W人cDNA克隆347316登記號W81026NIDg1392060關鍵詞EST.來源人。生物體人類真核生物；線粒體真核生物；后生動物；脊索動物門；脊椎動物門；真獸亞綱；靈長類動物；狹鼻類；原始人類；人。文獻1(堿基1-453)作者Hillier，L.，Clark，N.，Dubuque，T.，Elliston，K.，Hawkins，M.，Holman，M.，Hultman，M.，Kucaba，T.，Le，M.，Lennon，G.，Marra，M.，Parsons，J.，Rifkin，L.，Rohlfing，T.，Soares，M.，Tan，F.，Trevaskis，E.，Waterston，R.，Williamson，A.，Wohldmann，P.和Wilson，R.題目TheWashU-Merck EST Project雜志未出版(1995)說明聯系Wilson RKWashU-Merck EST Project Washington University School of Medicine4444 Forest Park Parkway，Box 8501，St.Louis，MO 63108 Tel314 286 1800Fax314 286 1810Emailest@watson.wustl.edu此克隆通過LLNL不付使用費獲得；進一步的資料可與IMAGE Consortium聯系(info@image.llnl.gov)。序列引物mob.REGA+ET高質量的序列終止子392.特征Location/Qualifiers來源1..453/生物體＝“人類”/注＝“器官心臟；載體帶有一個修飾多接頭的pT7T3D(pharmacia)，位點1NotI；位點2EcoRI；第一條鏈cDNA是用NotI-寡聚(dT)引物[5′TGTTACCAATCTGAAGTGGGAGCGGCCGCATCTTTTTTTTTTTTTTTTTT3′]，以大小選擇雙鏈cDNA連接到EcoRI銜接頭(Pharmacia)，用NotI消化并克隆入修飾的pT7T3載體(Pharmacia)的NotI和EcoRI位點。文庫完成一系列規一化到Cot＝5。文庫是由M.Fatima Bonaldo構建的。此文庫與胎兒肺文庫(Soares胎兒肺NbHL19W”)相同從胎兒構建。/克隆＝“347316”/克隆文庫＝“Soares胎兒心臟NbHH19W”/性別＝“未知”/發展時期＝“19周”/實驗宿主＝“DH10B(氨芐青霉素抗性”)mRNA<1..>453堿基數190a 77c 79g 106t 1個其它起源W81026長度4531996.9.10.1903類型N編號2953..1 ATACCAGGAC CAGAGGAAACCTCAGAAAAA GTAGAAAATGGAAGTCTATG 51 TGATCAAGAAATCGATAGCA TTTGCAGTATAGAGCGTGCA GATAATGACA 101AGGAATATCT AGTACTTACT TTAACAAAAA ATGATCTTGACAAAGCAAAT 151 AAAGACAAAGCCAACCGATACTTTTCTCCAAATTTTAAGG TGAAGCTGTA 201CTTCACAAAA ACAGTAGAGGAGCCGTCAAA TCCAGAGGCT AGCAGTTCAA 251CTTCTGTAAC ACCAGATGTTACGTGACAATGAACCTGATCATTATAGATA 301 TTCTGACACC ACTGACTCTG ATCCAGAGAATGAACCTTTT GATGAAGATC 351 AGCATACACA AATTACAAAAGTCTGAATTT TTTTTTATCA AGAGGGATAA 401 AACACCATGGAAAATAAACT TGGAATAAAC TGAAAAANAA AAAAAAAAAA 451GAT表21基因座W81062 429bp mRAN EST 1996年6月26日定義zd84a07.r1Soares胎兒心臟NbHH19W人cDNA克隆3473163′登記號W81062 NIDg1392114關鍵詞EST.來源人。生物體人類真核生物；線粒體真核生物；后生動物；脊索動物門；脊椎動物門；真獸亞綱；靈長類動物；狹鼻類；原始人類；人。文獻1(堿基1-429)作者Hillier，L.，Clark，N，Dubuque，T.，Elliston，K.，Hawkins，M.，Holman，Hultman，M.，Kucaba，T，Le，M.，Lennon，G.，Marra，M.，Parsons，J.，Rifkin，L.，Rohlfing，T.，Soares，M.，Tan，F.，Trevaskis，E.，Waterston，R.，Williamson，A.，Wohldmann，P.和Wilson，R.題目TheWashU-Merck EST Project雜志未出版(1995)注明聯系Wilson RKWashU-Merck EST Project Washington University School of Medicine4444 Forest Park Parkway，Box 8501，St.Louis，MO 63108電話314 286 1800傳真314 286 1810Emailest@watson wustl.edu此克隆通過LLNL不付使用費獲得；進一步的資料可與IMAGE Consortium聯系(info@image.llnl.gov)。序列引物mob.REGA+ET高質量的序列終止子324.特征Location/Qualifiers來源1..429/生物體＝“人類”/注＝“器官心臟；載體帶有一個修飾多接頭的pT7T3D(Pharmacia)，位點1NotI；位點2EcoRI；第一條鏈cDNA是用NotI-寡聚(dT)引物[5′TGTTACCAATCTGAAGTGGGAGCGGCCGCATCTTTTTTTTTTTTTTTTTT3′]，以大小選擇雙鏈的cDNA并連接到EcoRI銜接頭(Pharmacia)，用NotI消化并克隆入修飾的pT7T3載體(Pharmacia)的NotI和EcoRI位點。文庫完成一系列規一化到Cot＝5。文庫是由M.Fatima Bonaldo構建的。此文庫與胎兒肺文庫(Soares胎兒肺NbHL19W”)相同從胎兒構建。/克隆＝“347316”/克隆文庫＝“Soares胎兒心臟NbHH19W”/性別＝“未知”/發展時期＝“19周”/實驗宿主＝“DH10B(氨芐青霉素抗性”)mRNA互補序列(Complement)(<1..>429)堿基數105a 83c 77g 161t 3個其它起源W81062長度429 1996年9月10日1905類型N編號7359..1CAGTTTATTC AAGTTTATTT TCATGGTGTTTTATCCCTCTTGATAAAAAA 51 AAATTCAGACTTTTGTAATT TGTGTATGCTGATCTTCATC AAAAGGTTCA 101 TTCTCTGGATCAGAGTCAGTGGTGTCAGAA TATCTATAAT GATCAGGTTC 151 ATTGTCACTAACATCTGGTG TTACAGAAGT TGAACTGCTA GCCTCTGGAT201 TTGACGGCTC CTCTACTGTT TTTGTGAAGT ACAGCTTCACCTTAAAATTT 251 GGAGAAAAGT ATCGGTTGGCTTTGTCTTTATTTGCTTTGT CAAGATCATT301 TTTTGTTAAAGTAAGTACTAAGATATTCCT TGTCATTATC TGCACGCTCT 351AATACTGCAAATGGCTATCCGATTTCCTGG ATCCACCATA GGNCTTCCNA401TTTCCAACTT TTCCCTGNGG TTCCCCCGG表22文獻1.Cannon-Albright，L.，和Eeles，R.(1995)“前列腺癌的發展”“自然，遺傳學分冊”(Nature，Genet.)，9.336-338。2.Lunbgren，R.，Mandahl，N.，Heim，S.，Limon，J.，Henikson，H.，和Mitelman，F.(1992)“57例原發性前列腺腺癌的細胞遺傳學分析”，Genes Chrom.Cancer，4，16-24。3.Arps，S.，Rodewald，A.，Schmalenberger，B.，Carl，P.，Bressel，M.，和Kastendieck，H.(1993)“32例前列腺癌的細胞遺傳學研究”“癌癥遺傳學與細胞遺傳學”(Cancer 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權利要求
1.一種能選擇性地雜交于毗鄰于標志D10S541和D10S215定義的DNA的人染色體10的區域的核酸，條件是該核酸不是任一種酵母人工染色體(YAC)746-H-8，821-D-2，831-E-5，921-F-8，738-B-12，796-D-5，829-E-1，678-F-1，839-B-1，734-B-4，7B-F12，757-D-8，773-C-2，787-D-7，831-E-9，855-D-2，855-G-4，876-G-11，894-H-5，922-E-6，934-D-3，964-A-8，968-E-6或24G-A10和不是表3-22中所述的任一種已表達的序列標志(EST)，以及不是任一種細菌人工染色體(BAC)或P1-衍生的人工染色體(PAC)B2F20，P40F10，P72G8，P74N2，P274D21，B76I10，B79A19，B7901，B93F12，B122L22，P201J8，P201P5，P209K3，P316N14，B46B12，B60C5，B145C22，B150K4，B150N3，B181F15和B188L22。
2.權利要求1的能選擇性地雜交于毗鄰于由標志D10S541和D10S1765定義的DNA的人染色體10區域的核酸。
3.權利要求1或2的能選擇性雜交于酵母人工染色體(YAC)746-H-8，821-D-2，831-E-5，921-F-8，796-D-5，829-E-1，839-B-1，734-B-4，或24G-A10中的任一種，或BAC或PAC B2F20，P40F10，P72G8，P74N2，P274D21，B76I10，B79A19，B7901，B93F12，B122L22，P201J8，P201P5，P209K3，P316N14，B46B12，B60C5，B145C22，B150K4，B150N3，B181F15，和B188L22中任一種人源DNA的核酸。
4.權利要求3的核酸，其中的YAC是任一921-F-8，746-H-8，821-D-2，831-E-5，796-D-5，24G-A-10和734-B-4中的任一種，或BAC是B2F20，B46B12，B60C5，B150K4，B150N3，B145C22，B181F15和B188L22中的任一種，或者該PAC是P40F10和P274D21。
5.按任一前述權利要求的核酸，其包括相當于IMAGE克隆264611的cDNA插入片段的基因或其片段或變體。
6.權利要求1的核酸，其能選擇性地雜交于權利要求5所定義的基因。
7.按任一前述權利要求的核酸，其中的核酸是DNA。
8.按任一前述權利要求的核酸，其中的核酸是單鏈的。
9.按任一前述權利要求的核酸，其中的核酸若為雙鏈的，則有少于10000個堿基，對或者若為單鏈的，則有少于10000個堿基。
10.按任一前述權利要求的核酸，其中的核酸若為雙鏈的，則有少于1000個堿基對，或者若為單鏈的，則有少于1000個堿基。
11.按任一前述權利要求的核酸，其中的核酸若為雙鏈的，則有10-100個堿基對，或者若為單鏈的，則有10-100個堿基。
12.按任一前述權利要求的核酸，其中的核酸若為雙鏈的，則有13-30個堿基對，或者若為單鏈的，則有15-30個堿基。
13.權利要求1的核酸，其包括抑癌基因或其片段或變體。
14.一種能選擇性地雜交于毗鄰于標志D10S541和D10S215定義的DNA的人染色體10區域的核酸，其包括抑癌基因產物或其衍生物或片段或變體。
15.權利要求13的核酸，包括相當于克隆IMAGE 264611的cDNA插入片段的基因或其片段或變體。
16.權利要求13或14的核酸，其能選擇性地雜交權利要求15中定義的基因。
17.權利要求13的核酸，其中的核酸是cDNA。
18.一種能選擇性地雜交于毗鄰于標志D10S541和D10S215定義的DNA的人染色體10區域的核酸，其進一步包括可檢測的標記。
19.權利要求18的核酸，該核酸包括如表3-22所述的任一已表達的序列標志(EST)中人源序列或圖8-15中的內含子序列。
20.權利要求18的核酸，其包括相當于克隆IMAGE 264611的cDNA插入片段的基因或其片段或變體。
21.權利要求18的核酸，其能選擇性地雜交于權利要求20中定義的基因。
22.權利要求1的核酸，其能選擇性地雜交于表3-22中所述的任一已表達的序列標志(EST)中的人源序列，或圖8-15的內含子序列。
23.權利要求22的核酸，包括衍生出已表達的序列標志(EST)的基因或含該內含子序列的基因或其片段或變體。
24.權利要求1的核酸，其選擇于由適于擴增DNA并雜交于權利要求19所述的已表達的序列標志(EST)或內含子序列的引物的組合。
25.一種檢測病人對癌癥的易感性的方法，包括步驟(i)獲得含有來源于病人的核酸的樣品；以及(ii)將該核酸和能選擇性地雜交于毗鄰于標志D10S541和D10S215定義的DNA的人染色體10區域的核酸接觸。
26.一種診斷病人癌癥的方法，包括步驟(i)獲得含有來源于病人的核酸的樣品；以及(ii)將該核酸和能選擇性地雜交于毗鄰于標志D10S541和D10S215定義的DNA的人染色體10區域的核酸接觸。
27.一種預測病人的尤其是癌癥結果的相關前景的方法，包括步驟(i)獲得含有來源于病人的核酸的樣品；以及(ii)將該核酸和能選擇性地雜交于毗鄰于標志D10S541和D10S215定義的DNA的人染色體10區域的核酸接觸。
28.權利要求25，26或28的方法，其中的癌癥是前列腺癌。
29.權利要求25-28中任一項的方法，其中的樣品選自前列腺組織，血液，精液或尿液。
30.權利要求25-29中任一項的方法，其中的能選擇性地雜交于毗鄰于標志D10S541和D10S215定義的DNA的人染色體10區域的核酸進一步包括一個可檢測的標記。
31.權利要求25-30中任一項的方法，其中的核酸能選擇性地雜交于毗鄰于標志D10S541和AFM337×f9定義的DNA的人染色體10區域。
32.權利要求31的方法，其中的核酸能選擇性地雜交于酵母人工染色體(YAC)746-H-8，821-D-2，831-E-5，921-F-8，796-D-5，829-E-1，839-B-1，734-B-4 or 24G-A10中任一種，或者是BACs或PAC B2F20，P40F10，P72G8，P74N2，P274D21，B76I10，B79A19，B7901，B93F12，B122L22，P201J8，P201P5，P209K3，P316N14，B46B12，B60C5，B145C22，B150K4，B150N3，B181F15，和B188L22中任一種的人源DNA。
33.權利要求32的方法，其中的YAC是921-F-8，746-H-8，821-D-2，831-E-5，796-D-5，24G-A-10 or 734-B-4中的任一種，或者是BAC或PAC B2F20，P40F20，P40F10，P72G8，P74N2，P274D21，B76I10，B79A19，B7901，B93F12，B122L22，P201J8，P201P5，P209K3，P316N14，B46B12，B60C5，B145C22，B150K4，B150N3，B181F15，和B188L22中的任一種。
34.權利要求31的方法，其中的核酸包括相當于IMAGE克隆264611的cDNA插入片段的基因或其片段或變體。
35.權利要求31的方法，其中的核酸能選擇性地雜交于權利要求34中定義的基因。
36.權利要求31的方法，其中的核酸是DNA。
37.權利要求31的方法，其中的核酸是單鏈的。
38.權利要求31的方法，其中的核酸若為雙鏈的，則有少于10000個堿基對，若為單鏈的，則有少于10000個堿基。
39.權利要求31的方法，其中的核酸若為雙鏈的，則有少于1000個堿基對，若為單鏈的，則有少于1000個堿基。
40.權利要求31的方法，其中的核酸若為雙鏈的，則有10-100個堿基對，若為單鏈的，則有10-100個堿基。
41.權利要求31的方法，其中的核酸若為雙鏈的，則有15-30個堿基對，若為單鏈的，則有15-30個堿基。
42.權利要求31的方法，其中的核酸包括抑癌基因或其片段或變體。
43.權利要求31的方法，其中的核酸是或能夠雜交于表3-22中所述的已表達的序列標志(EST)中的任一人源序列或圖8-15中所述內含子序列。
44.權利要求43的方法，其中的核酸選擇于由適于擴增權利要求19中定義的已表達的序列標志(EST)或內含子序列的引物的組合。
45一種檢測毗鄰于由標志D10S541和D10S215定義的DNA的人染色體10區域的存在與否，或其中的突變的系統，其包括能選擇性地雜交于毗鄰于由標志D10S541和D10S215定義的DNA的人染色體10區域的核酸和核苷三磷酸或脫氧核苷三磷酸或其衍生物。
46.權利要求45的系統，其中的核苷三磷酸或脫氧核苷三磷酸被可檢測地標記，優選地為放射性標記。
47.一種檢測毗鄰于由標志D10S541和D10S215定義的DNA的人染色體10區域的存在于否，或其中的突變的系統，其包括能選擇性地雜交于毗鄰于由標志D10S541和D10S215定義的DNA的人染色體10區域的核酸和核酸修飾酶。
48.權利要求47的系統，其中的核酸修飾酶選自DNA聚合酶，DNA連接酶，多核苷酸激酶，限制性核酸內切酶或核酸酶的組合。
49.一種能被權利要求13-17中任一項的核酸編碼的多肽。
50.一種能來源于權利要求49的多肽的分子。
51.一種檢測病人對癌癥的易感性的方法，包括步驟(i)獲得含來源于病人的核酸的樣品；以及(ii)測定權利要求49的多肽在該樣品中的相對量，或者測定是否有權利要求49的多肽的截短或喪失功能。
52.一種診斷病人癌癥的方法，包括步驟(i)獲得含來源于病人的核酸的樣品；以及(ii)測定權利要求49的多肽在該樣品的相對量，或者測定是否有權利要求49的多肽的截短或喪失功能。
53.一種預測病人的尤其是癌癥結果的有關前景的方法，包括步驟(i)獲得含來源于病人的核酸的樣品；以及(ii)測定權利要求49的多肽在該樣品的相對量，或者測定是否有權利要求49的多肽的截短或喪失功能。
54.權利要求51-53中任一項的方法，其中的癌癥是前列腺癌。
55.權利要求51-53中任一項的方法，其中的多肽是用權利要求50的分子檢測。
56.權利要求51-53中任一項的方法，其中的樣品選自前列腺組織，血液，尿液或精液。
57.權利要求55的方法，其中的分子包括可檢測的標記。
58.能選擇性地雜交于毗鄰于由標志D10S541和D10S215定義的DNA的人染色體10區域的核酸在制備診斷癌癥的試劑或在制備治療癌癥藥劑中的用途。
59.一種治療癌癥的方法，包括步驟對病人給藥能選擇性地雜交于毗鄰于由標志D10S541和D10S215定義的DNA的人染色體10區域的核酸。
60.權利要求59的方法，其中的核酸是抑癌基因或其片段或變體。
61.權利要求59或60的方法，其中的核酸包括病毒載體。
62.權利要求59的方法，其中的癌癥是前列腺癌。
63.一種治療癌癥的方法，包括對病人給藥權利要求50的分子的步驟，而該分子進一步包括細胞毒性成分。
64.權利要求50的且進一步含有細胞毒性成分的分子在制備治療癌癥的藥物中的用途。
65.一種檢測組織樣品中的雜合子丟失的方法，包括步驟(i)獲得含來源于該組織的核酸的樣品；以及(ii)比較該核酸和參照(純合的)組織的微衛星分布，而該微衛星參照D10S541-D10S215間隔而選擇。
全文摘要
一種測定患者對癌癥的易感性的方法,包括步驟:(i)獲得含來源于患者的核酸的樣品;以及(ii)將該核酸與能選擇性地雜交于毗鄰于標志D10S541和D10S215定義的DNA的人染色體10的區域的核酸接觸。一種能選擇性地雜交于毗鄰于標志D10S541和D10S215定義的DNA的人染色體10區域的核酸,只要該核酸不是本說明書定義的YAC,BAC,PAC或EST中的任何一個。優選地,該核酸是前列腺抑癌基因。
文檔編號A61K38/00GK1203633SQ9619881
公開日1998年12月30日 申請日期1996年10月22日 優先權日1995年10月23日
發明者奈杰爾·K·斯珀爾, 伊恩·C·格雷 申請人:帝國癌癥研究技術有限公司