專利名稱：脂環二胺作為免疫調節劑的用途的制作方法
本申請涉及脂環二胺的新用途。
FR-A-1387971描述了新的脂環二胺及其制備方法。
以下通式代表的脂環二胺及其與無機或有機酸的加成鹽具有影響脂類代謝的特性R-NH-K-Q-K-NH-R(I)其中Q代表相應于下式II-V的二價基團
K代表亞甲基，或當Q由式(II)代表時K為一連接鍵，R為選自以下VI-XVII的基團VI 芐基VII 由鹵原子或一個、兩個或三個三鹵甲基取代的芐基VIII 取代的三鹵甲基芐基IX 2，3-二氫化茚基X烷基XI 環烷基XII 環烷基烷基XIII 鏈烯基XIV 環烯基烷基XV 雙環烷基XVI 雙環烯基烷基XII 雙環烷基烷基。
經長期研究后，申請人發現如上定義的產物具有顯著的調節免疫的新穎特性。
實際上上述產物特別能夠在與內源或外源性病態相關的功能紊亂中恢復細胞因子和/或其受體的基因表達。這些特性將在下文試驗部分予以證實。
它們還能夠刺激人體防卸必需的炎性分子的產生，如趨化因子(MIP1α，β和Rantes，其抗病毒特性已由例如Cochi等在《科學》(Science)，270，1811-1518，1995描述)。
式I二胺似作為TH1型細胞因子的刺激劑起作用，已知在艾茲病中這些細胞因子首先被擾亂(如IL2，IL12)；這些化合物通過這種機制可限制由HIV和其他疾病誘導的凋亡作用。
因而本發明的主題是如上所定義的式I化合物在制備免疫調節藥物中的用途，物別是能夠在與外源或內源性病態相關的功能紊亂中調節細胞因子和/或其受體的基因表達的藥物，和在刺激產生細胞因子中的應用。
所述病態可與一種病毒侵入相關，如I型或II型艾滋病、皰疹、肝炎、乳頭瘤，或與寄生蟲的侵入相關，如利什曼病、瘧疾或biharziose。這種病態也可能是醫源的，例如由于免疫抑制劑如環孢菌等的作用或由皮質激素的作用或由腫瘤(特別是血液腫癌如骨髓瘤或組織腫瘤)引起。
相關病態尤其是一種自體免疫疾病，如類風濕性多關節炎、紅斑狼瘡或自體免疫性糖尿病。
對于上述式I化合物的更詳細的定義以及它們的制備方法和已知的應用，可特別參見FR-A-1387971及其法國的和國外的等同物，特別是法國藥物特殊專利號3559M。也有大量關于這些化合物的文獻，特別是關于反式1-4雙[2-氯芐基氨基甲基]-環己烷，又名AY 9944。
特別是，關于該物質的藥理和毒理數據已在文獻中大量記載。
本發明特別談及上述一種化合物在制備用于治療下述疾病的藥物中的用途--病毒性疾病，
--寄生蟲病，--腫瘤，--自體免疫疾病。
對于這些應用，特別使用這樣的式I化合物，其中Q代表環己烷-1，4-二基，即Q為前述式II；特別是這樣的式I化合物，其中R為芐基，或被鹵素如氟、溴特別是氯取代的或被一、二或三個三鹵甲基取代的芐基，或例如被一、二或三個鹵原子或C1-C5烷基或烷氧基取代的三鹵甲基芐基，尤其是化合物AY 9944，即下式化合物的二鹽酸鹽
以下試驗部分證明的在與外源或內源性病態相關的功能紊亂中使細胞因子和/或其受體基因恢復表達的特性，指明了上述式I衍生物及其鹽作為用于校正外源或內源病態相關的功能紊亂中細胞因子和/或其受體基因表達的藥物的用途。
本發明的藥物例如用于上述提及的病態的治療，無論是治療性還是預防性的。
特別用于治療自體免疫疾病。
常用劑量根據所治療主體和疾病而變化，例如對需此治療的人，每日口服10mg到2g AY9944化合物。
作為藥物，上述式I化合物及其鹽可摻入在用于消化道或胃腸外的藥物組合物中。這些藥物組合物例如可為固態或液態，呈現今用于人類醫學的藥物形式，例如簡單片劑或糖衣片劑、膠囊、粒劑、焦糖劑、栓劑、注射劑；按常規方法制備它們。活性成分可與常規用于藥物組合物的賦形劑一起摻入組合物中，如滑石、阿拉伯膠、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、可可脂，含水或不含水載體、動物或植物脂肪、石蠟衍生物、二元醇、各種潤濕劑、分散劑或乳化劑、防腐劑。
另外還發現當將如上定義的式I免疫調節化合物與具有抗病毒性質的化合物(如DDI、DDC、抗蛋白酶，3TC和優選的AZT)結合時，如在下文試驗部分所示，發現各自的效應得到加強。
因而本申請還涉及一種組合，特征在于它包括如果上定義的化合物，特別是反式1，4-雙[2-氯芐基氨基甲基]-環己烷，和一種具有抗病毒特性的化合物。
抗病毒化合物優先選自DDI、DDC、抗蛋白酶、3TC和AZT。
圖1顯示終濃度為3×10-6M的AY 9944(AY)對來自艾滋病人的外周血培養物中存在的單核細胞數目(T4＝400/mm3)的作用。橫坐標為以天表示的培養時間，縱坐標為每孔的細胞數目。
圖2顯示濃度為3×10-6M的AY 9944(AY)對來自艾滋病人的外周血培養物中存活細胞百分率的作用(T4＝400/mm3)。橫坐標為以天表示的培養時間，縱坐標為細胞死亡的百分率。
圖3顯示濃度為3×10-6M的AY 9944隨著培養時間對培養基中的RT活性的作用。
圖4顯示濃度為3×10-6M的AY 9944對從健康主體(對照Tém)或不同的艾滋病人(1-5)分離的外周血淋巴細胞群中表達IL-2受體的細胞百分率的作用。
圖5顯示幾種受試物質在3×10-6M濃度下對表達CD4的外周血淋巴細胞的百分率的作用。對照為未處理的艾滋病人外周血淋巴細胞(T4約為400/mm3)。
圖6表示試驗物質對逆轉錄酶活性的影響，對得自艾滋病人單核細胞的細胞提取物測定。
圖7表示試驗物質在3×10-6M劑量下抗HIV-1IIIB病毒的細胞致病作用的效果，在得自健康主體的淋巴細胞中測定。
圖8、9、10和11代表試驗物質在3×10-6M劑量下分別對細胞因子IFN-γ、MIP1α、MIP1β、Rantes合成的作用。
下列實施例說明本發明。試驗部分在Ficoll梯度上分離來自艾滋病人的單核細胞，37℃下用植物凝集素(PHA)活化一夜。然后洗滌，在40UI/ml白介素-2(重組的，Roussel-Uclaf)存在下、在有或無試驗濃度(即3×10-6M)的AY 9944存在下，以8×105/ml的比例在補有10％脫補體胎牛血清的RPMI培養基中培養。在用一種或多種試驗物質和更新培養基處理或不處理下，每3天對細胞存活進行計數和檢測(臺盼藍試驗)。
利用與熒光素偶聯的抗輔助T淋巴細胞特征性CD4膜抗原的單克隆抗體，借助于細胞篩分儀(“FACS”Beckton-Dickinson)定期進行細胞分類。實施例1對細胞增殖和存活百分率的作用圖1顯示，來自艾滋病供者的血中存在的單核細胞數目(T4400/mm3)略有增加，感染細胞中10天后降低(病毒的細胞致病作用和凋亡進程)，而相反在用3×10-6M的試驗分子(AYAY 9944)處理的感染培養物中觀察到大量的增殖。因此，例如對于AY 9944，培養15天后細胞數目比未處理培養物中的高5-7倍。
另外，在圖2中可以看到，例如用AY 9944處理的培養物中，培養中死亡細胞的百分率在感染后保持在10％左右，而在感染但未處理的培養物(對照)中，死亡百分率在感染后15天達到約70％。另外，因為已知細胞死于艾滋病病毒所致的凋亡，因而可從中得出結論AY 9944具有抗細胞凋亡作用。這種抗凋亡效果從下述對細胞因子的作用結果得到證實。
因此，培養基中式(I)化合物的存在保護單核細胞對抗病毒的細胞致病作用，使細胞在凝集素(PHA)存在下能大量增殖。實施例2對培養基中逆轉錄酶(RT)活性的作用按Barré-Sinousi等(科學，1983，220868)描述的方法測定逆轉錄酶(RT)活性。在不同的培養時間在感染細胞的培養基中測定了RT活性。
圖3所示結果清楚地表明在用AY 9944處理的培養物中，介質中的RT活性保持極低水平，而在未處理培養物的上清液中卻升高了1000％以上。這種驚人的效果令人想到，此類化合物急劇減低病毒量。另外，將在以下看到這不是對RT酶的直接抑制，而是通過其他機制對病毒產量的抑制。實施例3對白介素2(IL-2)受體表達的作用白細胞介素2是在免疫系統的調節中起基本作用的一種細胞因子，特別是對輔助T淋巴細胞增殖的調節，人們已知輔助T淋巴細胞在艾滋病中尤其受影響。圖4顯示對AY 9944處理的培養物中IL-2受體表達的特別顯著的刺激。有趣的是注意到，在對來自5位不同病人的外周血淋巴細胞進行的這項研究中，在每例中都觀察到IL-2受體大量增加，包括第4號病人，其中受體表達水平以前沒有顯著的降低。在這后一例中，與對照(正常人外周血淋巴細胞)相比，IL-2受體超量表達。對于第1、2和5號病人，受體表達的百分率從15-18％(對照為40％)達到30-45％，即該受體表達程度得到了真正的正常化。最后可注意到受試物質對健康人外周血的淋巴細胞(對照)沒有明顯影響。
這一效應是很重要的，IL-2被視為在免疫中起主要作用的細胞因子之一，其生產的失調可能是HIV感染后觀察到的疾病的關鍵所在。IL-2受體率的下降實際上與CD4計數以及與病毒量相關。另外最近的試驗證明早熟表達的病毒蛋白Tat抑制IL-2信使的表達(Chirmule等，1995，病毒學雜志(J.Virol.)69492)。實施例4對表達CD4的細胞百分率的作用人們已知表達CD4標志的T4淋巴細胞的數目下降是艾滋病感染最顯著的特征之一，以致“CD4”計數成為跟蹤艾滋病發展的最有用的參數之一。圖5顯示表達CD4的細胞百分率顯著的回升(利用抗CD4的熒光抗體用FACS檢測)。在此系列試驗中，證明AY 9944(AY)最有效，使CD4+細胞百分率升高約30％(在對照中，病人外周血淋巴細胞，未處理)至約70％(在兩種上述化合物存在下培養的外周血淋巴細胞中)。
綜上所述，在AY 9944處理后，觀察到了對細胞增殖和對細胞生存率的積極作用、病毒量的下降、對白介素2信使和白介素2的受體Tac的表達刺激、以及最后提高CD4+淋巴細胞的百分率、重建正常的CD4/CD8比例。值得注意的是，當受試物質以10-7M或10-8M的濃度使用時，得到了相似的結果。實施例5轉錄水平的作用研究了AY 9944對IL12(由抗原呈遞細胞分泌)的信使RMA表達的影響，IL12是一種在T淋巴細胞增值中同樣起重要作用的白細胞介素。裂解106個細胞，按常規技術提取DNA，在商業逆轉錄酶的作用下獲得相應的RNA，然后利用相應于所研究RNA的引物進物PCR擴增。結果顯示AY 9944可提高編碼IL12的信使RNA的表達。用下式的不同引物實施PCR技術TL 12-P35(+)5′CAT GCT-TTC AGA ATT CGG GC 3′TL 12-P35(-)5′GTT AGC TCA GAT GCT TTC ATG 3′TL 12-P40(+)5′CCC TGA CAC CTG GAG TAC TC 3′TL 12-P40(-)5′GGC TAT ACC ATG AAG CCT AG 3′這相應于IL12的兩個亞單位(P401-4道；P355-8道)。對3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的mRNA進行了對比研究(9-12道)。
因此，看來試驗物質的作用機制中有轉錄水平的，這樣就恢復了被HIV-1類逆轉錄病毒所抑制的某些基因的表達。從而觀察到對病原體引起的基因組水平早熟紊亂的上游作用。實施例6細胞分化水平的作用還進行了另外的試驗以研究AY 9944對單核細胞分化狀態的影響。在AY 9944存在下培養6天后，得自艾滋病人外周血的單核細胞群中活化巨噬細胞的百分率顯示凈增長。實施例7對體外測定的逆轉錄酶(細胞提取物)的作用還證明了AY 9944處理的培養物上清中顯示的RT活性的降低(見圖3)不是由于化合物的直接抑制。圖6顯示受試物質在所用濃度范圍內(10-6-10-5M)對于細胞提取物都沒有顯著地抑制RT活性。
用AY 9944獲得的結果顯示在左起的第3、4柱，向右的其他柱代表其他受試物。
總之，式(I)化合物未顯示為逆轉錄酶的抑制劑。這與其活性的新穎特點符，所述化合物與現用的AZT類藥物沒有共同的作用點。實施例8體外保護陽離子兩親性分子處理的淋巴細胞對抗HIV感染使用了用強毒株(HIV-IIIB)體外繼發感染的來自健康個體外周血的淋巴細胞，以檢查受試物對抗大病毒量的作用。圖7表明，此時用化合物(3×10-6受試物)在感染前預處理一周，AY 9944保護這些細胞對抗病毒的細胞致病作用。實施例9-12在Ficoll梯度上分離來自艾滋病人的單核細胞，37℃下用植物凝集素(PHA)活化一夜。然后洗滌，在40UI/ml白介素-2(重組的，Roussel-Uclaf)存在下、在有或無試驗濃度(即3×10-6M)的AY 9944存在下，以8×105/ml的比例在補有10％脫補體胎牛血清的RPMI培養基中培養。在用一種或多種試驗物質和更新培養基處理或不處理下，每3天對細胞存活進行計數和檢測(臺盼藍試驗)。
第10天分別測定培養基中產生的IFN-γ，MIP1α、MIP1β、Rantes的量。結果報告在圖8、9、10、11中。左邊的兩柱相應于一個病人(F7)，另外兩柱相應于另一病人(F130)。對于每位病人，左側柱(-)代表無AY 9944時的產量，而右側柱(+)代表有AY 9944時的產量。
在每一例中都觀察到這些細胞因子的合成在AY 944存在下大大增強，其產量在四周的培養中保持高水平。實施例13AY 9944和抗病毒化合物的協同作用用病毒株HIV-HTLV IIIB感染H9人細胞系。
每3天將這些淋巴細胞以3×105細胞/ml重懸在加有10％胎牛血清的RPMI培養基中。
在此培養基中加入AY 9944、AZT或AY 9944和AZT的混合物。
培養30天后，用P24試驗檢查病毒的存在，用氚標胸腺嘧啶的摻入檢查細胞增殖，用臺盼藍排斥試驗檢查細胞存活率，以及這些細胞表達的CD4分子的百分率。
結果報告在下表中，-v表示“無病毒”，+v表示“有病毒”。
觀察到在3×10-8M的AY 9944和1μg/ml AZT的劑量下有強協同作用，而單用AY 9944即使在3×10-6M劑量下作用也較弱(P24＝70)，1μg/ml的AZT根本沒有作用(P24＞1000)。
還觀察到AY 9944對被病毒抑制的細胞增殖有恢復作用。
還觀察到細胞死亡率的降低(從僅用1μg/ml AZT的58％到加入濃度僅為3×10-8M的AY 9944時的11％)。
最后觀察到在向AZT(1μg/ml)中加入3×10-8的AY 9944時CD4表型的恢復，從26％到正常值83％。
結果列在下表中，它表示AZT和AY 9944對HIV增殖、淋巴細胞的病毒裂解和CD4抗原表達的聯合作用。這些結果是在用分離株(HIV-1IIIB)感染的IH9細胞培養4周后獲得的。將這些淋巴細胞每3天進行一次傳代，以3×10-5/ml的濃度接種。
如表中結果所示，具有抗病毒作用(P24＝0)的10μg/ml AZT也對H9免疫細胞系具有抑制作用，因為使用AZT時細胞增殖被降至28000cpm。向該濃度的AZT中加入AY(表中第6行)使細胞增殖升至47000cpm。這表明，對于具抗增殖效果的藥物(AZT 10μg/ml)的作用，AY 9944對細胞增殖有恢復作用。
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實施例14制備了具有如下配方的片劑反式1-4雙[2-氯芐基氨基甲基]-環己烷二鹽酸鹽10mg足量賦形劑至最終片劑達100mg(賦形劑具體為乳糖、淀粉、滑石、硬脂酸鎂)。實施例15制備了具有如下配方的可分割片劑反式1-4雙[2-氯芐基氨基甲基]-環己烷二鹽酸鹽15mg足量賦形劑至最終片劑達100mg(賦形劑具體為乳糖、淀粉、滑石、硬脂酸鎂)。實施例16制備了具有如下配方的可分割片劑反式1-4雙[2-氯芐基氨基甲基]-環己烷二鹽酸鹽15mgAZT 100mg足量賦形劑至最終片劑達250mg(賦形劑具體為乳糖、淀粉、滑石、硬脂酸鎂)。
權利要求
1.通式(I)化合物和其與無機或有機酸的加成鹽在制備免疫調節藥物中的用途R-NH-K-Q-K-NH-R(I)其中Q代表相應于下式II-V的二價基團
K代表亞甲基，或當Q由式(II)代表時K為一連接鍵，R為選自以下VI-XVII的基團VI 芐基VII 由鹵原子或一個、兩個或三個三鹵甲基取代的芐基VIII 取代的三鹵甲基芐基IX 2，3-二氫化茚基X烷基XI 環烷基XII 環烷基烷基XIII 鏈烯基XIV 環烯基烷基XV 環烷基XVI 環烯基烷基XII 雙環烷基烷基。
2.根據權利要求1的用途，其特征在于所述免疫調節劑在與外源或內源性病態相關的功能紊亂中校正細胞因子和/或其受體基因的表達。
3.根據權利要求2的用途，其特征在于所述病態與病毒侵入相關。
4.根據權利要求2的用途，其特征在于所述病態與寄生蟲侵入相關，如利什曼病、瘧疾或biharziose。
5.根據權利要求2的用途，其特征在于所述病態與醫源侵犯相關，例如由免疫抑制劑如環孢菌素的作用或由皮質激素的作用所引起。
6.根據權利要求2的用途，其特征在于所述病態與腫瘤侵犯相關，例如血液腫瘤如骨髓瘤，或組織腫瘤。
7.根據權利要求2的用途，其特征在于所述病態與自體免疫病的侵犯相關。
8.根據權利要求3的用途，其特征在于所述病態與I型或II型HIV的病毒侵入相關。
9.根據權利要求1-8之一的用途，其特征在于化合物為其中Q代表環己烷-1，4-二基，K代表亞甲基，R代表芐基或由鹵原子或一個、兩個或三個三鹵甲基取代的芐基或取代的三鹵甲基芐基的式(I)化合物。
10.根據權利要求1-8之一的用途，其特征在于式(I)化合物為反式1-4雙[α-氯芐基氨基甲基]-環己烷二鹽酸鹽。
11.一種如權利要求1、9和10之一所定義的化合物和一種具抗病毒特性的化合物的組合。
12.根據權利要求11的組合，其特征在于所述抗病毒化合物選自DDI、DDC、抗蛋白酶、3TC和AZT。
全文摘要
本發明公開了式(Ⅰ)R－NH－K－Q－K－NH－R化合物和其與有機或無機酸加成鹽的用途,式中Q為式(Ⅱ)到(Ⅴ)的二價基團;K為亞甲基,或當Q為式(Ⅱ)基團時,K為連接鍵;R為選自芐基、由鹵原子或三鹵甲基取代的芐基、2,3－二氫化茚基、烷基、環烷基、環烷基烷基、鏈烯基、環烯基烷基、雙環烷基、雙環烷基烷基、雙環烷基烷基。還描述了用于校正細胞因子和/或其受體基因的表達以治療與外源或內源病態相關的功能紊亂的藥物的制備。
文檔編號A61K31/132GK1193910SQ9619653
公開日1998年9月23日 申請日期1996年8月2日 優先權日1995年8月3日
發明者J－C·馬奇勒, A·阿果爾, J－C·朗杜里奧, D·查古芮 申請人:新疫苗公司