專利名稱：改性成骨材料的制作方法
技術領域：
本發明涉及骨修復材料，該材料具有增強的內聚強度和物理強度，用于承受應力的缺損中，或用于產生和保持植入物特定形狀的能力非常重要的部位。在蛋白基顆粒和有機基質之間建立穩定的界面和綴合物的原理也可應用于藥物傳遞物質和裝置上。本發明也涉及成骨潛力增強的成骨骨修復組合物。特別是涉及去礦質骨和可溶性鈣鹽或礦物鹽的組合物，涉及制備這些成骨潛力增強的骨修復組合物的制備方法，并涉及這些組合物的治療用途。
背景技術：
骨缺損的修復或者涉及非吸收性修復結構，或者涉及吸收性修復結構。吸收性結構或材料或者支持相鄰骨和軟組織的向內生長，或者活性誘導新骨的生成。這種新骨的活性生成(稱為骨誘導)只在去礦質骨基質存在下，或在這種基質的蛋白提取物存在下，或在這兩種材料的組合物存在下發生。由于由去礦質骨基質生產的顆粒或粉末的表面積增加，它們具有的每單位重量成骨潛力比大塊或整節去礦質骨大。
我們也探究了損傷的或缺失的骨性組織或骨的其它修復方法。用非吸收性材料(諸如生物相容性金屬、陶瓷或復合金屬-陶瓷材料之類)替代或支承提供一種臨床治療方法。其中某些材料(諸如金屬級鈦等)可以在其表面促進骨輔助誘導，由此產生與骨的穩定連續的界面。Caffessee等人(Joumal of Periodontology，Feb.1987)利用一種“窗口”植入技術，證實非吸收性陶瓷(諸如羥磷灰石等)甚至當置于骨缺損中時，也不能刺激組織。吸收性陶瓷(諸如磷酸三鈣等)置于骨缺損中時，表現出較好地將礦質化組織輸送到吸收移植材料中。與去礦質骨基質不同，磷酸三鈣或羥磷灰石置于非骨性組織時，不能刺激新骨的誘導。將磷酸三鈣或羥磷灰石加入去礦質骨基質中或加入提取的骨誘導蛋白中，實際上抑制這些確定的骨誘導組合物的成骨潛力(參見Yamazaki等人，Experimental Study On the Osteoinduction Ability of CalciumPhosphate Biomaterials with added Bone Morphogenetic ProteinTransactions ofthe Society For Biomaterials第111頁，1986)。
除證明羥磷灰石和磷酸三鈣陶瓷材料不能單獨誘導骨生成外，最近的臨床發現指出，無機顆粒的骨整合高度依賴于那些顆粒保持固定在一定位置中(最好是在骨界面附近)的能力。因此，顆粒的固定為涉及新骨生成的先決條件(參見Donath等人，A Histologic Evaluation ofMandibular Cross Section One Year After Augmentation withHydroxyapatite Particles Oral Surgery，Oral Medicine，Oral Pathology vol63 No.6第651-655頁，1987)。
然而，已得出許多組合物來創造臨床上有用的骨替代材料。Cruz的美國專利3,767,437描述了由膠原與金屬氫氧化物和離子化酸(諸如磷酸等)的部分絡合鹽形成的人造象牙或骨樣結構。關于金屬氫氧化物，該組合物強調在金屬氫氧化物中使用多價金屬陽離子，諸如氫氧化鈣等。磷酸鈣可以將磷酸鈣加入絡合膠原鹽中。Cruz也敘述了加入纖維和離子，以增加硬度和結構強度，但沒有證明這些具體改進或對此提出權利要求。Cruz既沒有提到這些組合物為骨誘導或骨輔助誘導的，或對次提出權利要求，也沒有提到它們在體內地行為。
Thiele等人的美國專利4,172,128敘述了降解和再生骨和牙材料和產品的方法。該方法涉及首先將骨和牙質去礦質；通過用氫氧化鈉提取，將去礦質材料轉化為不含粘多糖的膠體溶液；將生理學上惰性的外源粘多糖加入產生的溶液中；使溶液膠凝，然后將所得凝膠再礦質化。Thiele等人指出，該材料為生物相容的和完全吸收性的，由此通過組織學分析確定被人體組織取代，用該方法生產的凝膠材料據報道完全替代在實驗動物中產生損壞的骨部分。專利權所有人沒有指出該材料誘導新骨的任何能力。沒有描述這些材料在體內的最終命運，或它們在非骨性植入部位中刺激新骨生成的能力。專利權所有人沒有描述或定量測定這些材料的強度性質。然而，由于它們描述為凝膠，我們可以假定它們的強度很低。
Urist在美國專利4,294,753中描述了提取和增溶骨形態形成蛋白(BMP)的方法。該蛋白是一種糖蛋白復合體，它誘導骨性部位和非骨性部位軟骨成骨的生成。這種通過提取得自去礦質骨基質的部分純化糖蛋白凍干為粉末形式。Urist描述了體內實驗中，通過直接植入粉末、植入含于擴散室中的粉末或BMP與磷酸鈣共沉淀，實際傳送BMP。盡管Urist描述了或者在骨性組織或者在非骨性組織中植入其中一種形式的BMP后誘導新骨，但Urist沒有提出任何這些傳送形式固有的物理強度性質。然而，凍干粉和磷酸鈣沉淀物的物理強度即使有也很小。此外，最近研究人員(參見上述Yamazasaki等人的論文)指出，磷酸鈣陶瓷(諸如磷酸三鈣和羥磷灰石等)相對于存在的BMP為高濃度存在時，可能實際上抑制BMP的成骨作用。
Jeffries在美國專利4,394,370和4,472,840中描述了由膠原和去礦質骨基質、膠原和提取的骨形態形成蛋白(BMP)組成的骨移植材料。也描述了膠原、去礦質骨基質加上提取的骨形態形成蛋白的組合物。Jeffries描述了由這些組合物制成的無水凍干海綿綴合物，當它植入骨性部位和非骨性部位時，能夠誘導新骨生成。這些海綿的物理強度在該說明書中沒有具體說明，然而其它膠原海綿抗壓強度的報道指出這些材料非常弱，并且容易壓縮(比影響壓縮或拉伸中的顯著物理應變所需的1公斤負荷低得多)。
在轉讓給Collagen Corporation的美國專利4,430,760中，Smestad描述了非承受應力的植入假骨，該假骨由置于膠原管或容器內的去礦質骨基質或牙質組成。正如專利權所有人指出的，該假骨臨床上不能用于承受應力的位置。
在顯然轉讓給Collagen Corporation和Harvard University的美國專利4,440,750中，Glowaki等人描述了與去礦質骨顆粒混合的水性膠原塑性分散體，用于在骨缺損中誘導骨。所述的該移植材料以凝膠狀態存在，其本身具有的物理強度小。因此，它的使用必需限制在整個愈合過程中可以保持足夠形狀和強度的缺損。此外，隨著時間的推移，懸浮于含水膠原溶膠-凝膠中的去礦質骨基質，在重力作用下開始沉淀，由此產生非均相或成層的移植材料。
Seyedin等人在美國專利4,434,094中描述了一種蛋白因子的純化，提出權利要求的這種蛋白因子與Urist的BMP分子不同，負責軟骨形成活性的誘導。
在頒發給Massachuetts Institutes of Technology的美國專利4,485,097中，Bell描述了一種可用于假體制造中的骨等價物，它由成纖維細胞收縮的水合膠原點陣組成，并且含有去礦質骨粉。當該假體結構也為水合膠原凝膠時，其本身的強度小。專利權所有人提到使用合成篩網以支承水合膠原點陣，以進行處理。然而，沒有指出該材料的臨床用途或其總物理強度的測定。
Reis等人在美國專利4,623,553中描述了一種骨替代材料的生產方法，該材料由膠原和羥磷灰石組成，與適宜的交聯劑(諸如戊二醛或甲醛等)部分交聯。這些試劑的加入順序為，在加入羥磷灰石或磷酸鈣特殊材料之前，將交聯劑加入水性膠原分散體中。混合并凍干產生的分散體。該專利缺乏任何眾所周知的組分，后者為已知成骨誘導物，諸如去礦質骨基質或提取骨蛋白等。
Caplan等人在美國專利4,620,327中描述了用可溶性骨蛋白處理植入物(諸如生物降解性物質、異種骨性植入物、同種移植物和假體裝置之類)，以增強或刺激新軟骨或新骨生成的方法。然后，這些結構可以進行交聯，以固定可溶性骨蛋白或延遲其釋放。盡管詳細描述了這些植入物的成骨活性，但沒有提到它們的物理強度。
現有技術的上述綜述指出，宣稱能夠誘導新骨生成的的假骨材料(骨誘導材料)沒有一個具有高強度特性。此外，在描述具有增強強度的那些材料中，這些材料僅僅由膠原和無機礦質的交聯綴合物構成，它們缺乏刺激新骨誘導的能力。
尤其相關的是，上述參考文獻中沒有一個指出需要將分散微粒或無機相結合到有機載體基質(即膠原)上。如下所述，在與有機生物高分子(諸如膠原等)絡合前，處理去礦質骨基質或顆粒或無機顆粒在決定生物植入物的物理強度特性方面極其重要。此外，使蛋白質或多肽顆粒在無機或天然聚合基質中以穩定方式定向的能力，提供以控制方式釋放藥物、生物活性蛋白和生物活性多肽的能力。
如上所述，多種骨移植材料可利用來修復、替代或再生骨損失或骨病或骨損傷。骨移植物可以為同種移植物，是指得自同一物種供體的加工生物骨材料；或為異質的，是指不來源于生物材料，僅僅由無機或合成聚合材料組成。骨移植材料也可以分為骨誘導或骨輔助誘導的。骨誘導材料能夠在硬組織缺損中和獨特地在非骨性軟組織(或者在肌肉組織中，或者在皮下組織中)部位中誘導新骨生成。骨誘輔助導生物材料不能通過未分化細胞類型的分化，誘導新骨生成，但它的確提供一個架子，促進有活力的骨組織從骨邊緣，沿移植材料的接觸表面遷移。因為骨誘導甚至沒有任何與移植材料相鄰的可利用的有活力骨，也可以產生新骨；骨誘導移植物可能至骨輔助誘導材料更好。骨誘導移植材料的實例包括去礦質骨粉和去礦質骨條或骨皮質或松質骨塊料。
盡管多種骨誘導組合物已用于骨修復和再生中，但本領域總是需要現有技術的改進或增強，這會加速和增強骨修復和再生，使得接受成骨植入物的病人更快地痊愈和增強愈合。
發明概要目前可獲得的或描述的組合物(含有去礦質骨基質顆粒或無機顆粒加上重組結構蛋白或基質蛋白的綴合物)，當經過任何大小的負荷時，表現出的物理穩定性或物理強度差。此外，由于這些材料的結構整體性差，因此進一步加工成其它形狀或大小，以在實際臨床上用來在骨缺損中誘導新骨生成受到限制。本發明的一個主要目的是描述一種具有獨特強度性質和/或成骨性能的生物相容性成骨復合材料的生產方法。盡管本領域中的許多說明書都描述了使用交聯劑以增強蛋白基結合骨誘導材料的物理整體性，但本說明書提供一種生產強度和物理整體性出色的成骨移植材料的嚴謹方法和應用步驟。
此外，本申請中描述的基本概念可以改變，以創造天然生物高分子和無機骨礦質的綴合物，它表現出無機顆粒和有機基質之間出色的粘合力。這些顆粒的空間穩定性對于它們臨床上成功使用而言是重要的。
另一個目的是創造可以以控制和穩定的方式，釋放藥物或其它藥劑的蛋白基結構。這些結合材料的大小穩定性和物理穩定性，在這些材料的藥學釋放性能上起顯著作用。因此，物理強度和藥物傳送能力是相互關聯的。
兩個因素與這些新組合物的觀察性能有關。首先，蛋白顆粒表面活化和部分交聯，形成一個反應性界面，使得這些顆粒以穩定的方式結合到有機基質、即重組膠原上。對增強物理性能而言，該步驟是重要的。第二，無機顆粒可以通過首先建立鈣結合蛋白或多肽與顆粒的結合界面，結合到有機或蛋白基聚合物上，并在其中穩定化。然后，通過化學交聯法或活化法，將改性顆粒結合到基質蛋白質上。同第一種情況一樣，該方法顯著增強這些綴合物的物理性能。
總之，本申請的主要目的為(1)表面活化和/或部分交聯蛋白基或蛋白涂布顆粒，以增強它們與有機基質(包括血清、血漿、天然產生的蛋白質以及骨基質)的結合和反應性的方法。
(2)公開一種方法和組合物，該組合物植入動物和人體時誘導骨，并且具有現有技術中沒有描述的早期承受應力的性能。
(3)公開一種方法和組合物，將含有無機礦物元素的無機顆粒結合到周圍有機基質上，使得產生穩定的承受應力的綴合物。這一綴合物中的無機顆粒不易轉移或從基質中逐出，當將顆粒簡單地加入基質中而不進行適當地表面處理時，會發生這種情況。
(4)應用其中上述方法之一，使含藥物的蛋白基顆粒在有機基質或聚合物基質中穩定化，以延遲或控制藥物從綴合材料中的釋放。
(5)一種方法和包含生物相容性可植入海綿的組合物，它含有填料組分，其重量比在干燥和濕潤條件下，都足以增強復合海綿的彈性，甚至在濕潤條件下，也允許維持海綿的形狀、大小和形式。
本發明也涉及產生骨移植材料或成骨潛力增加組合物的去礦質骨表面修飾方法。本發明成骨潛力增加的成骨骨修復組合物可以用作治療骨缺損或牙周缺損的植入物。本文提供的改進的成骨組合物包含去礦質骨和至少一種加入的鈣鹽或礦物鹽。相對于其它骨修復組合物，通過本文描述方法生產的本發明成骨骨移植材料表現出增加的成骨活性。
本發明的總目的是提供包含去礦質骨和至少一種鈣鹽或礦物鹽的改進的成骨骨移植材料，其中所述鈣鹽或礦物鹽吸附在去礦質骨團塊上或其中，或散布在去礦質骨團塊表面上或其中。
本發明的一個目的是提供活性增強的成骨骨移植材料，它包含凍干去礦質骨粉和至少一種鈣鹽或礦物鹽，其中所述鈣鹽或礦物鹽吸附在去礦質骨團塊上或其中，或散布在去礦質骨團塊表面上或其中。
本發明的另一目的是提供活性增強的成骨骨移植材料，它包含凍干去礦質骨粉和至少一種鈣鹽或礦物鹽以及至少一種藥物、抗生素、營養物、生長因子或血蛋白。
本發明的另一目的是提供生產這些改進成骨組合物的方法。
本發明的另一目的是提供這些改進成骨組合物在骨缺損或牙周缺損的修復或替代中的治療用途。
本發明的再一目的是提供包含大約60-95％去礦質骨的成骨組合物，它表現出增強的成骨潛力和其它獨特的性能。
本發明的再一目的是提供能夠誘導礦質化骨樣結構生成的組合物，它包含一種載體和堿性磷酸酶。
本發明還有一個目的是提供在骨性部位和非骨性部位中能夠增強有活力新骨誘導的組合物，它包含一種成骨載體和堿性磷酸酶。
本發明的其它目的和優點在以下說明中變得明顯。
本發明優選實施方案的詳細描述當含有蛋白質或氨基酸組分的顆粒(諸如蛋白微膠囊、重建膠原細碎顆粒或在破膜試劑中提取的去礦質骨基質之類)在低濃度戊二醛溶液中部分交聯時，這些顆粒的表面變為高度反應性，因此提供的顆粒和有機聚合物基質之間的結合程度增加，顆粒可以分散在其中。這些結構當脫水為固體物質時，表現出在分散于基質組分中的簡單顆粒組合物中沒有發現的內聚強度性質。如果在加入顆粒并且隨后脫水之前，將戊二醛直接加入基質中，那么得出的粘合強度水平非常低。如果整個脫水結合基質進行交聯，那么情況也是如此。增加蛋白基顆粒/生物高分子基質綴合物強度和內聚的重要因素，似乎只是顆粒在與生物高分子有機基質絡合前顆粒的部分交聯或表面活化。或者或另外，關鍵性地控制顆粒組分實際重量百分比(作為總結合植入物的重量百分比)，可以增強海綿構型的物理性能以及植入物或藥物傳送裝置的形狀和間隙維持功能。
如果生物活性顆粒(諸如去礦質骨基質或含藥物顆粒之類)要絡合，那么表面活化和部分交聯的條件是重要的。例如，用大約0.25％(重量)的戊二醛交聯去礦質骨顆粒，破壞顆粒的大部分骨誘導能力。在較高交聯水平下，顆粒通過攝取磷酸鈣礦質化，但不會誘導新骨。因此，使用低于0.25％(重量)、最好低于0.1％(重量)的戊二醛在本發明中是重要的條件。
基質的性質影響綴合生物材料的最終強度性能，后者在承受應力的臨床應用中是重要的。例如，重建膠原提供表現出獨特和意外的強度性能的一種基質。然而，重建膠原的方法可以直接影響增加的粘合強度的大小。這在下面的實施例中進行說明。
除戊二醛外的試劑可以用來增強生物相容性基質中蛋白基顆粒表面結合。例如，蛋白顆粒上可利用的游離羧基可以通過在二胺存在下與水溶性碳化二亞胺反應，轉化為胺基團。然后，這些其他可利用的胺基團可以在顆粒交聯反應中，與戊二醛反應。或者，去礦質骨基質顆粒可以浸入四環素溶液中，后者增強結合有機生物高分子基質。此外，骨顆粒或部分去礦質骨顆粒可以在四環素溶液中去礦質。
具有無機組分的顆粒可以加入這些承受應力的成骨組合物中，條件是這些顆粒構成不高于顆粒總重量的20％。這些無機組分顆粒通過具有鈣結合官能團或羥磷灰石結合官能團的官能分子，結合到生物高分子有機基質上。在一個實施方案中，所有顆粒性質上可以是無機的，并以該方式結合到基質上。這里的優點是增加強度以及限制顆粒本身從基質損失。
顆粒和基質組分之間增強的結合，在藥物傳送方面也可以是有利的。在交聯和表面活化前，在顆粒中分散藥物、蛋白質或多肽的方法提供含有藥物、溶解度減小的顆粒的用途，即在生物相容性基質中起藥物貯器的作用。該基質的性質可以調節從綴合材料中釋放藥物的速率。
生物高分子基質可以以多種方式改性。例如，基質的親水性性質或疏水性性質可以通過加入糖類或脂類加以改變。將酸性磷脂加入該基質中，增強鈣結合到基質上的能力。其它大分子可以加入該基質中，以得到特殊的生物學反應。無論以可溶性形式還是作為蛋白基顆粒的部分加入氫氧化鈣，都發現增強基質的pH，使得在這一環境中體內骨膠原合成增加。也可以加入肝素。
此外，可以將交聯劑加入基質中，或經過完全綴合，進一步延遲基質的降解并降低其溶解度。也可以通過使堿性磷酸酶的作用穩定化，控制基質的降解程度及其炎性反應。
最后，這些組合物明顯的優點是它們鑄成表面細節配準好的一定形狀的能力。由于這些組合物的結構，其均勻性比同種組織中發現的均勻性大得多。此外，一個重要發現是，這些綴合物結構能夠用常規方法研磨或磨細，而整個基質并沒有完全破壞或沒有形成嚴重的表面缺損。這一發現是重要的，因為現在的診斷技術提供精確的骨缺損三維圖象，而通過CAD/CAM技術最后磨制移植材料。沒有其它加工的真正成骨移植材料可以研磨成插入骨缺損中精確的具體形狀。
本發明也涉及成骨潛力增強的骨移植材料。這些本文提供的成骨潛力增強的組合物基于本發明人的觀察，即通過將至少一種鈣鹽或礦物鹽加入去礦質骨中，顯著地增強去礦質骨的骨誘導能力。此外，本說明書的組合物和方法大大提高了由去礦質骨生成骨和礦質的速度。
對本發明重要是一種方法和產生的組合物，通過吸收可溶性或飽和鈣鹽或礦物鹽溶液，提高去礦質骨的礦質含量的，藉此通過骨誘導產生提高骨生成的速率和可能性以及由給定質量或體積的去礦質骨基質誘導的骨量的出色結果。本文提供的成骨潛力增加的成骨骨移植材料由去礦質骨和至少一種可溶性鈣鹽或礦物鹽組成。可以使用的去礦質骨類型的實例包括(但不限于)去礦質骨基質或部分去礦質骨基質、或去礦質或部分去礦質凍干骨粉同種移植物(DFDBA)或基質(DFDBM)。例如，通過骨中殘留鈣的重量百分比測定的去礦質程度的范圍可以為去礦質后，大約10-0％(重量)(低于大約0.1％(重量))、優選低于大約3％(重量)至0％(重量)、最優選低于大約1％(重量)至0％(重量)的鈣殘留在骨中。優選去礦質后，低于大約3％(重量)的鈣殘留在骨中，最優選去礦質后，低于大約1％(重量)的鈣殘留。多種大小和形狀的去礦質骨基質(由細粉至粗粉，至片屑、條狀、環狀、火柴棒狀、楔形、小骨節、大骨節)都可以用于本發明。在推薦實施方案中，DFDBA用于組合物。
鹽可以為鈣鹽或其它礦物鹽。可以使用的其它礦物鹽例如包括(但不限于)鹽(諸如氫氧化鈉、氯化鈉之類)和鎂鹽(諸如氯化鎂或氫氧化鎂之類)或其它生物相容性鹽。可以用于本文所述方法和組合物中的鈣鹽實例包括(但不限于)乙酸鈣、檸檬酸鈣、氯化鈣、甲酸鈣、甘油磷酸鈣、乳酸鈣、月桂酸鈣、油酸鈣、氧化鈣、棕櫚酸鈣、水楊酸鈣、硬脂酸鈣、琥珀酸鈣和硫酸鈣。在推薦實施方案中使用氫氧化鈣。用于本文公開的方法和組合物中的鹽溶液的pH可以為中性或堿性。在推薦實施方案中，pH最好為堿性。可溶性或飽和鈣鹽或礦物鹽溶液可以用于本文所述方法中。
例如，可以使用的可溶性鹽溶液的濃度可以為大約100-0.001％(重量)的鹽，或可以為大約10-0.01％(重量)的鹽。例如，關于氫氧化鈣，建議可以使用的溶液濃度為大約3-0.001％(重量)的鹽。
本發明涉及成骨潛力增加的骨移植組合物。例如，加入的鈣鹽或礦物鹽與去礦質骨的重量比(鹽重量除以去礦質骨預處理重量)可以為大約0.0001-20％或大約為0.0010-10％。在優選實施方案中，該組合物包含氫氧化鈣與DFDBA，其重量比為大約0.001-10％。
本發明也涉及生產成骨潛力增加的成骨骨移植組合物的方法，包括將去礦質骨暴露于至少一種可溶性或飽和鈣鹽或礦物鹽溶液中，其時間足以使溶液中的離子吸附到骨基質中或骨基質上，或散布在去礦質骨塊表面或散布在其中。在推薦實施方案中，通過將飽和氫氧化鈣溶液吸附到去礦質骨材料結構上或結構中，或散布在去礦質骨塊上或骨塊中，將鈣吸附在去礦質骨、最好為DFDBA上或其中。飽和溶液的pH可以為堿性。其它方法可以用來制備本發明成骨潛力增加的組合物。例如這類方法可以包括(但不限于)通過電流或等離子體放電，將鈣鹽或礦物鹽沉積到去礦質骨上。
此外，本發明計劃包括成骨潛力增加的本發明組合物的功能相同的組合物。
在另一實施方案中，包含去礦質骨(已經暴露于至少一種可溶性鈣鹽或其它礦物鹽)的去礦質骨組合物可以還包含尚未暴露于鈣鹽或其它礦物鹽的去礦質骨。此外，如果將一個或多個大骨節使用本文描述的方法中，那么所用的一個或多個完整骨節不需要完全去礦質。或者，可以只將一個或多個骨節暴露的外表面去礦質，然后用鈣鹽或其它礦物鹽處理。
該組合物可以用常規方法，在周圍溫度或較高溫度條件下脫水，或可以在很寬的條件下，在市售干燥器中凍干。該組合物可以粉末形式或為去礦質骨條、骨屑、骨節、assays或比去礦質骨粉大并且與其不同的其它大小和幾何形狀的形式。包含去礦質骨和加入的可溶性鈣鹽或礦物鹽的組合物，可以通過本文描述的方法用交聯劑部分活化。在本發明再一實施方案中，鈣鹽或礦物鹽改性的去礦質骨可以與尚未改性的去礦質骨混合，或者或另外，與通過本文所述方法用交聯劑部分活化的去礦質骨混合。這些不同類型粉末中每種的重量比范圍可以為大約總摻混料的5-95％。此外，所有三種類型的去礦質骨基質顆粒都可以以多種比例混合，以產生粉末摻混混合物。
可溶性鈣溶液或礦物溶液吸附到去礦質骨基質塊上或骨基質塊中，或散布在去礦質骨塊表面上或骨塊中，與未處理的去礦質骨基質相比，使得骨誘導的速率和傾向顯著增加。通過礦物生成的放射照片分析和通過本文描述的組合物和方法處理的誘導骨的組織學分析評價，與等量非富鈣去礦質骨相比，可溶性鈣/去礦質骨復合體也顯著增加誘導的鈣化活力骨的大小。例如，本文公開的組合物和方法可以將動物模式中去礦質骨誘導的預見性提高至大約75％水平，在動物模式中最好為大約90-100％水平的骨誘導和礦質化。
本發明也涉及成骨組合物，它包含大約60-95％(重量)、最好為大約60-90％(重量)的去礦質骨。可以用于這些組合物的去礦質骨類型的實例包括(但不限于)去礦質骨基質或部分去礦質骨基質、去礦質或不夠去礦質凍干骨粉或顆粒。可以構成成骨組合物其余大約40-5％(重量)或其余大約40-10％(重量)的材料實例，包括(但不限于)膠原、明膠、生長因子、骨形態形成蛋白(BMP)、血蛋白(諸如血纖維蛋白、白蛋白等)或其它生物相容性賦形劑(諸如甲基纖維素或羥甲基纖維素等)。最好使用重建膠原。包含大約60-95％(重量)、最好為60-90％(重量)本文所述去礦質骨的成骨組合物可以用本領域技術人員已知的標準方法，制造成脫水形式的海綿、粉末、顆粒、膜、羊毛狀物、或纖維。可以通過凍干或在周圍條件或其它控制條件下控制脫水，制造海綿。如果該組合物以海綿形式生產，那么可以用常規方法，將海綿研磨成顆粒、粉末或羊毛狀物。如果該組合物為海綿形式，那么其特征最好為密度為大約0.1克/立方厘米(cc)或大于0.1克/立方厘米(cc)。例如，海綿的密度范圍可以為大約0.1-0.5克/cc，其密度最好為0.11-0.35克/立方厘米。為了制造具有90％(重量)或90％(重量)以上去礦質骨的海綿，可以用酸性材料或堿性材料形成該組合物余下的部分。如果待使用材料在酸性范圍內，那么pH最好為大約5，最優選為大約4.5或低于4.5。如果待使用材料在堿性范圍內，那么pH最好為大約9或更高。當該材料為水溶液或干燥粉末或凍干粉形式時，去礦質骨可以與該材料混合。凍干粉最好為酸性鹽或堿性鹽形式。例如，膠原或明膠可以為用來形成組合物余下部分的材料。可以使用任何膠原，最好為哺乳動物膠原，包括(但不限于)人膠原或牛膠原。
本發明的另一實施方案涉及一些組合物，它們能夠誘導礦質化骨樣結構或骨樣結構的形成。這類組合物包含一種載體和堿性磷酸酶。可以使用的載體實例包括(但不限于)膠原、去礦質骨、明膠、提取抗體的去礦質骨或用破膜試劑提取的(以除去大多數或所有非膠原蛋白質)去礦質骨基質。
可以使用的膠原實例包括(但不限于)重建膠原、部分去礦質膠原、酶提取膠原或用蛋白酶(諸如facin或胃蛋白酶等)處理的膠原。膠原的pH可以為中性、酸性或堿性。去礦質骨可以為粉末或顆粒形式。例如堿性磷酸酶比載體的范圍可以為10-5000單位/毫克載體，最好為大約100-1000單位/毫克載體。可以用于這些組合物的堿性磷酸酶實例包括任何哺乳動物堿性磷酸酶，諸如(但不限于)牛堿性磷酸酶或人堿性磷酸酶等。本領域技術人員會理解，用于這些組合物中的堿性磷酸酶的實際重量隨堿性磷酸酶的比活而變化。這些組合物可以用常規工藝，制成海綿、粉末、顆粒、羊毛狀物或纖維或膜形式。本發明也計劃包括包含載體和堿性磷酸酶、能夠誘導骨樣結構的功能相同的組合物。
這些材料可以通過標準外科操作，在塑料重建手術、牙周骨移植物和牙髓操作中作為移植植入物用于治療。本發明成骨潛力增加的成骨植入物既適于人使用，也適于獸醫使用。
所有的書、論文或本文參考的專利通過引用結合到本文中。以下實施例是說明本發明，決不是限制本發明的范圍。
實施例1將10克去礦質骨基質在A-10磨機中碾磨成75-400微米大小一致的顆粒。將去礦質骨基質顆粒過篩，除去大于400微米的顆粒。控制戊二醛的濃度對維持去礦質骨基質顆粒足夠的骨誘導活性的是重要的。例如，低至1.0-1.5％(重量)的戊二醛交聯溶液可以將去礦質骨基質的殘留骨誘導活性降至10％或10％以下。然而，醛濃度為0.08％(重量)或0.2％(重量)的戊二醛的交聯將去礦質骨基質的殘留骨誘導活性只降低30-35％，由背景留下未交聯去礦質骨基質顆粒65-70％的骨誘導活性。因此，用于該步驟中的戊二醛濃度的控制對于維持加工的去礦質骨基質顆粒的生物學活性是重要的。
用來部分交聯和表面活化去礦質骨基質顆粒的戊二醛范圍為0.002-0.25％(重量)的戊二醛。推薦的范圍為0.005-0.9％(重量)的戊二醛。去礦質骨基質的部分交聯延遲基質的非炎性方式吸收，增加血漿蛋白在去礦質骨基質表面上的粘附，并且促進去礦質骨基質粘附于骨缺損骨性表面的有機膠原基質上。
在該實施例中，將去礦質骨顆粒浸入0.05％(重量)的戊二醛水溶液中，該溶液用磷酸鹽緩沖液緩沖為pH7.0-7.6。通過加入NaCl，使其最終濃度為大約0.9％(重量)，將戊二醛溶液制成等滲的。或者，戊二醛溶液可以在酸性或堿性范圍內緩沖。戊二醛溶液可以是未緩沖的，只由無菌蒸餾去離子水或無菌等滲鹽水組成。
將去礦質骨基質(DBM)顆粒浸入含有0.05％(重量)戊二醛的中性磷酸鹽緩沖的等滲鹽水溶液中12小時，于4℃下進行恒定的攪拌。保溫時期結束時，由交聯溶液過濾顆粒，用磷酸鹽緩沖的等滲鹽水洗滌1次。制備的DBM顆粒在無菌條件下干燥，然后用適當的方法消毒，諸如環氧乙烷、γ輻射或電子束消毒等。
這些活化顆粒可以直接置于骨缺損中，或者與后面實施例中所述的有機生物高分子復合。
實施例2用破膜試劑提取去礦質骨基質顆粒，以除去所有生物活性成分或免疫學成分。以該方式處理的同種顆粒或異種顆粒制造出色的藥物、多肽或蛋白質復合體的傳送顆粒。在酸性溶液或堿性溶液中溶脹后，將提取的去礦質骨基質顆粒浸入待結合的試劑中，然后釋放顆粒。然后將顆粒干燥，并以實施例1所述的控制方式進行交聯。下面的具體說明描述該方法的使用。
將10克顆粒大小潛在75-400微米(最好為150-400微米)的去礦質骨基質浸入用50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)緩沖的鹽酸鈲中。將顆粒在4℃下在該提取介質中保持10-15小時，同時輕輕攪拌。可選地將蛋白酶抑制劑(諸如0.5 mM苯基甲磺酰基氟、0.1M6-氨基己酸等)加入提取介質中。
在提取時期結束時，通過真空過濾或以800-1000rpm離心，從提取溶液中取出提取的去礦質骨基質顆粒。提取的去礦質骨基質顆粒(EDBMP)用中性無菌磷酸鹽緩沖的鹽水洗滌10-20次。然后顆粒對更換幾次的中性磷酸鹽緩沖的鹽水透析，以除去任何殘留量的破膜試劑。
適宜的生物活性多肽或蛋白質可以吸收到EDMB顆粒上。在該實施例中，以該方式使用甲狀腺降鈣素。將1克份數的EDBM顆粒浸入100ppm甲狀腺降鈣素的無菌生理鹽水溶液中。將顆粒在該溶液中保持24-72小時，同時進行周期性的輕輕攪拌。
復合體EDBM-甲狀腺降鈣素顆粒通過真空過濾分離并沖洗1次，以除去過量的多肽。將EDBM-甲狀腺降鈣素顆粒浸入實施例1所述的低濃度戊二醛交聯溶液中。將顆粒干燥，按照該實施例所述方法進行消毒。在體外和體內測試時，這些顆粒表現出與時間有關的多肽釋放。
其它多肽和蛋白質，諸如骨形態形成蛋白、胰島素樣生長因子、表皮生長因子、神經生長因子、人生長激素、牛生長激素、或豬生長激素等，為可以由EDBM顆粒攜帶的幾個多肽或蛋白質實例。常規藥物，諸如四環素或其它抗生素，也可以通過該系統傳送。
實施例3可以制造蛋白基微膠囊，然后在控制條件下進行部分交聯，使得它們變為反應性的，并在控制條件下結合到有機生物高分子基質上。按照說明，制造明膠-蛋白質微膠囊，并將其部分交聯，以表面活化微膠囊。
于60℃下，將2.5克U.S.P.明膠和25毫克骨形態形成蛋白(按照以上Urist所述方法純化)在8ml無菌蒸餾水中混合。在明膠增溶和用骨形態形成蛋白(BMP)復合后，將2mllmM磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)加入明膠-BMP溶液中，同時恒定攪拌。該溶液于55-60℃下保持。在單獨的容器中，將20ml石油醚與80ml礦物油混合，制備100ml的油相。將該溶液加熱至55-60℃。
將明膠-BMP溶液在15秒內加入油相中，同時快速攪拌，導致明膠-BMP微球體的生成。冷至2-4℃時，明膠-BMP球體定形為珠粒。通過真空過濾除去該溶液的油相。珠粒用石油醚和乙醚洗滌。
然后，將如此獲得的微球體按照實施例1描述的方法交聯。在本實施例中，微球體在0.03％(重量)戊二醛的中性磷酸鹽緩沖的等滲鹽水中交聯。通過真空過濾過濾微球體，并用中性無菌等滲鹽水沖洗1次。將球體脫水并干燥貯藏。或者，球體可以與有機生物高分子基質復合，形成承受應力的生物假體。
實施例4將10g脫脂并用有機溶劑(諸如乙醚等)提取的研磨骨粉(不去礦質)浸入濃度為5-50mg/ml的HCl四環素溶液中。或者，將研磨的骨粉或顆粒首先于4℃下，在0.05-0.3M HCl溶液中部分去礦質30分鐘至5小時。然后，這些部分去礦質骨顆粒在上述HCl四環素溶液中接觸。
于4℃下，將顆粒浸入10mg/ml的HCl四環素溶液中1-24小時。浸入結束時，顆粒在中性結合等滲鹽水中沖洗1次。將顆粒收集、干燥或凍干。收集這時的顆粒，在周圍條件下干燥和凍干。
作為另一步驟，干燥的顆粒用戊二醛，按實施例1描述的方法進行部分交聯。如在實施例6將要描述的，這些四環素處理的去礦質骨基質顆粒經過其它化學基團活化方法，諸如通過表面羧基的碳化二亞胺活化和與胺或二胺反應等。
實施例5其它含蛋白顆粒由粉碎的重建膠原顆粒制造。例如，通過將HCl四環素加入酸性增溶重建膠原分散體中，制造膠原-四環素綴合物海綿。四環素的最終濃度為10-50mg/ml，而膠原濃度為0.5-3.5％(重量)的分散體。膠原用乙酸鹽或鹽酸在酸性范圍內增溶，或用氫氧化鈉在堿性范圍內增溶。通過重復對無菌蒸餾水或磷酸鹽緩沖的鹽水透析，將膠原分散體的pH調至中性或中性附近。
將膠原分散體調至中性附近后，將適當的藥物、多肽或蛋白質加入膠原分散體中，進行攪拌以確保完全(complex)混合。在該實施例中，將膠原-四環素組合物注入柱形模具中，讓它在無菌層流盒中靜置24小時，以使它開始膠凝。膠凝后，將分散體置于凍干機-60℃的架子上，進行凍干，形成海綿材料。從凍干機取出海綿結合材料，置于45-80℃的控制干燥-加熱烘箱中。結合到膠原的分子的熱穩定性決定適當的溫度。取出干燥的海綿，將其在A-20磨機中研磨成粉末。然后將生產的膠原-四環素顆粒表面活化和部分交聯。
實施例6通過增加表面結合位點的數目，增強蛋白基顆粒蛋白微膠囊、去礦質骨基質顆粒或蛋白結合無機顆粒的結合和共價粘附。這種結合位點的增加通過以下步驟完成。
獲得顆粒大小為50-400微米的10克去礦質骨基質顆粒。將顆粒浸入水溶性碳化二亞胺中，在等滲鹽水溶液中，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺的變化范圍為0.005-0.1M，優選為0.05-0.1M，優選大約0.05M。通過加入HCl，將碳化二亞胺溶液的pH保持在4.7-5.2。有時加入乙醇和其它有機化合物(諸如甘露醇等)，以改變交聯溶液的介電常數。或者，通過加入NaCl，將離子強度由大約0.1M增至1.0M。有時用戊二醛交聯步驟進行相似的修改。
與碳化二亞胺的反應進行大約20分鐘至12小時或12小時以上。在該具體實施例中，反應時間為2小時，反應在4℃下進行。然后，表面活化的去礦質骨顆粒與一種胺或二胺接觸。具有胺官能團的材料包括氨基酸、聚氨基酸、球狀蛋白質(諸如白蛋白和明膠蛋白等)、絲狀蛋白質(諸如膠原蛋白和彈性蛋白等)。或者，在該實例中，一種二胺-即己二胺用來與碳化二亞胺活化的顆粒反應。己二胺容許增加游離可利用的結合位點，以進行戊二醛活化。己二胺溶液含有0.01-2.0％(重量)的二胺。在中性緩沖鹽水溶液(pH7.4)中，最適二胺濃度為大約0.1-0.5％(重量)。接觸時間為2-10小時，通常的時間為4小時。
通過過濾從二胺溶液中取出顆粒，用中性緩沖鹽水沖洗幾次，以除去過量的二胺。將去礦質骨顆粒加入戊二醛交聯溶液中，后者的醛濃度為0.001-0.25％(重量)。所用的方法與實施例1相同，戊二醛濃度為0.05％(重量)。于4℃下，在中性緩沖等滲鹽水溶液中進行部分交聯。交聯溶液的時間為8-12小時。從溶液中過濾顆粒，用緩沖中性等滲鹽水洗滌1次。將顆粒干燥，這時顆粒可以按本文描述的方法，用來在有機生物高分子基質中結合，生產承受應力的骨移植物。或者將顆粒凍干，或者通過環氧乙烷、液體消毒溶液、γ輻射，或者通過電子束消毒進行消毒。
實施例7由高純度藥物級無菌粉狀膠原生產水性膠原分散體。通過將膠原粉末在0.01N乙酸緩沖液中增溶，生產2.5％(重量)膠原構建的膠原分散體。有時加入0.5-2.5％(重量)的膠原粉末。有時其它有機酸(諸如乳酸等)或無機酸(諸如鹽酸等)也用來促進膠原基質的溶脹。
中度攪拌膠原酸性分散體進行混合，貯藏過夜以進行膠原凝膠的完全溶脹。在中速至高速下，在韋林氏混勻器中劇烈攪拌膠原分散體并進行剪切，使用3-5次間隔、30秒的混合時間。然后將膠原分散體注入適當大小的離心管中，以800rpm離心，以除去膠原分散體中含有的空氣。然后分散體對無菌蒸餾水溶液透析。膠原分散體對新鮮更換的無菌蒸餾水重復透析，直至膠原分散體的pH為pH5.3-7.0。以收效方式獲得pH6.8-7.6的分散體時，膠原分散體對緩沖液(諸如中性磷酸鹽緩沖液等)透析。收集透析的膠原分散體，將其于4℃下置于容器中。該分散體作為基質材料。
按該步驟利用兩種類型的去礦質骨基質顆粒。第一種類型為正常的去礦質骨顆粒，沒有用戊二醛進行表面活化。第二種類型的去礦質骨基質顆粒與第一類相同，只是它們按實施例1所述方法，在戊二醛中部分交聯，進行活化。這兩個系統描述如下(1)將85％(重量)的去礦質骨顆粒分散在含水膠原基質中，置于圓柱形模具中，于周圍條件下通過強制空氣脫水鑄塑。保留綴合物圓柱體，以進行物理試驗。
(2)按照實施例1所述方法，在戊二醛中活化與(1)相同的去礦質骨顆粒。然后，將85％(重量)的這些顆粒分散于含水膠原基質中。將綴合物置于圓柱形模具中，于周圍條件下通過強制空氣脫水進行鑄塑。保留綴合物圓柱體，以進行物理試驗。
為了更好地理解戊二醛在這些基質顆粒綴合物中的作用，也使用加入0.5％(重量)戊二醛的其它三種方法，這些方法是(3)將85％(重量)的去礦質骨顆粒分散于膠原基質中。將中性緩沖戊二醛加入水分散體中，使得其最終濃度為0.5％(重量)。將綴合物置于圓柱形模具中，于周圍條件下通過強制空氣脫水進行鑄塑。保留綴合物圓柱體，以進行物理試驗。
(4)在加入去礦質骨顆粒(未活化)之前，將中性緩沖戊二醛加入膠原分散體中。加入戊二醛，使得其濃度為綴合物總重量的0.5％(重量)。然后加入85％(重量)的去礦質骨基質顆粒進行混合。將綴合物置于圓柱形模具中，于周圍條件下通過強制空氣脫水進行鑄塑。保留綴合物圓柱體，以進行物理試驗。
(5)按照上述系統(1)所述方法，制造綴合物圓柱體，但然后于4℃下，浸入中性緩沖的0.5％(重量)戊二醛溶液中72小時，取出圓柱體，在中性磷酸鹽緩沖的等滲鹽水中重復洗滌。將圓柱體置于原來的模具中，于周圍條件下通過強制空氣脫水進行干燥。保留綴合物圓柱體，以進行物理試驗。
下表顯示出用不同系統進行物理試驗所獲得的結果。在InstronTester中，根據材料的強度，以5-20克的恒定負荷測試圓柱體的直徑拉伸強度。在測試之前，測量圓柱體的大小，按通常用于材料直徑內聚強度的方法，在圓柱體兩邊進行測試。
系統12 3 4 5施加的力 5Kg 20Kg 5Kg 5Kg 5Kg應變圖 海綿狀耐屈服點 海綿狀海綿狀海綿狀負荷直徑拉伸強度 ＜2.5psi90psi ＜2.5psi ＜2.5psi ＜2.5psi注釋膠原-去礦質骨顆粒90％(重量)或90％(重量)以上的骨顆粒對膠原的組合物不能聚集為內聚團塊，在任何程度的力下都自發地分解。
實施例8基質生物高分子的性質對材料的內聚強度及其最終強度性質也有一定的影響。下面的步驟說明膠原基材料的制造，該材料為自聚的或粘附于其它骨組合物上，為止血和成骨的。
將10克無菌膠原粉末(Collastat)混合到100毫升0.1N HCl中，用攪棒攪拌。攪拌15分鐘后，膠原分散體用無菌蒸餾水稀釋兩倍，由10％(重量)稀釋為5％(重量)。使得最終酸濃度為0.05N HCl，最終pH為4.1-4.3。
將4.3克研磨的去礦質骨粉(顆粒大小不高于125微米；MW為0.250篩)加入膠原混合物中。在完全攪拌后，韋林氏混勻器中將5％(重量)的分散體攪拌5-10、20秒進行混合，以提高分散體的粘度。將增稠溶液注入離心管中，在臺式離心機中以400-600rpm旋轉5分鐘，除去空氣，并濃縮膠原。
通過吸取，除去過量的流體上清液，將膠原綴合物部分收集為單一的體積(大約170毫升)。該膠原-去礦質骨分散體于4℃下貯藏至少1小時，以檢查稠度和相分離的出現。該混合物的pH為4.50-4.57。
將膠原混合物轉移至透析管(Spectrapor.截止分子量為12,000-14,000)，對0.02MpH7.4的磷酸鈉緩沖液透析過夜。用無菌技術，從透析管中取出膠原-DBP分散體。該分散體為均相的，沒有顯示出分離跡象。透析液的pH為6.5。膠原分散體的pH為5.00-5.12。
收集透析過的膠原-DBP分散體，將其置于250毫升離心瓶中，然后以800rpm旋轉10分鐘。收集清亮的上清液，檢查其pH為5.10。
將膠原-DBP分散體置于無菌陪替氏培養皿中，在無菌條件下，在4℃真空下冷凍，將真空保持18-24小時，以確保完全脫水。將產生的泡沫樣海綿材料置于A-10磨機中，研磨成粉末。將該粉末分成等份，裝入瓶中。膠原-DBP粉末瓶在環氧乙烷下消毒2.5小時。這些瓶子在真空下暴氣至少24小時，然后在真空下密封。
所得材料為止血的，在于它促進血液凝結。
實施例9將實施例8描述的膠原-去礦質骨顆粒粉末在0.5mMpH8.0的磷酸鈉緩沖液溶液中重建。用1毫升緩沖液水合大約0.2克的粉末并進行混合，以確保完全混合。按實施例1所述方法，活化和部分交聯平均顆粒大小為250微米的去礦質骨顆粒。將重0.10克的這些顆粒加入緩沖液-膠原綴合物分散體中，同時進輕輕攪拌。將混合物置于圓柱形模具中，于周圍溫度下通過強制空氣進行脫水。產生的圓片干燥得非常快，即在4-10小時內干燥。如果將團塊凍干，那么產生更加多孔的結構。模具的細節很好地再生在圓柱體上。圓柱體顯示出光滑的表面外觀，并具有足夠的整體性，以用外科鉆或砂輪以低速或中速機頭磨成準確的形狀。在20公斤恒定負荷下，測試如此生產的圓柱體的直徑拉伸強度。結果如下系統6施加的力 20kg負荷應變圖 線性，彈性行為，拉伸模量增加直徑拉伸強度(PSI) 279-320psi
實施例10將其它藥物、蛋白質或多肽加入這些含有活化顆粒組合物的基質相中。例如，在加入活化顆粒或微膠囊之前，將按美國專利4,294,753中Urist所述方法純化或重組的骨形態形成蛋白加入基質中。由于該綴合物的穩定性不依賴于將戊二醛加入骨基質中，所以BMP分子失活的機會減小。結合材料可以以其含水形式使用，然而，在該實例中，將活化去礦質骨顆粒-膠原-BMP綴合物，在周圍條件下按先前所述方法脫水。將另一試樣脫水，然后于-40℃至-60℃下凍干。
以組分加入順序的相同方式制造的另一綴合物由活化去礦質骨顆粒-膠原和鹽酸四環素組成。將該綴合物脫水并凍干。其它蛋白質和多肽生長因子在與該內聚新組合物的基質相復合時進行評價。
實施例11將活化和部分交聯的蛋白質顆粒、微膠囊或去礦質骨基質(它們的表面活化方法在上述實施例中進行了描述)加入血蛋白、糖蛋白或細胞組分部分的粘性混合物中。
具體地說，將0.5克活化去礦質骨基質或骨基質顆粒從將其消毒的容器中取出。在該實例中，該骨用來填入實驗動物的骨缺損中。通過靜脈穿刺術取5毫升動物血液。將血在臺式離心機中以800-1000rpm旋轉，以沉淀血小板、白細胞和紅細胞。將血放入不含任何類型抗凝劑的普通小瓶中。血細胞組分成片(pellet)后，用吸管小心地取出含有血清的上清液。將血清加入活化去礦質骨即顆粒中，使得顆粒被均勻涂布。活化骨顆粒與血清或血漿之比可以在20-95％(重量)變化。將該綴合物置于骨缺損中，使得它完全填滿。該缺損在6-12周內逐漸由新骨替代。
用另一研究動物進行相同的步驟，只是這時將血放入肝素化的管中，離心后獲得血漿。將該血漿與活化血顆粒以上述相同方式混合。
在諸如大的骨缺損或骨不連合等的某些情況下，將生物活性分子或抗生素加入血清或血漿部分中是有益的。用美國專利4,294,753中Urist所述方法，從兔去礦質骨基質中純化兔骨形態形成蛋白。將純化的BMP加入血漿中，以便構成大約0.5-3％(重量)。將凍干蛋白質混合入血漿中并將其完全分散后，將活化去礦質骨顆粒混入BMP-血漿中，重量比為80-90份顆粒對10-20份血漿。
另一實驗動物具有可能被細菌感染的骨缺損。按照上述方法取血并獲得血漿。將鹽酸四環素粉末加入血漿中，濃度為5-25微克/毫升。將抗生素完全混入血漿中，將血漿與活化去礦質骨顆粒混合，重量比為80-90份顆粒對10-20份血漿-四環素。
實施例12構成基質的蛋白質可以進一步通過加入磷脂進行修飾。具體地說，與不具有結合酸性磷脂的膠原基質相比，重建膠原和酸性磷脂一起證明增加鈣的吸收。
pH5.0-5.5的2.5％(重量)膠原分散體用于酸性磷脂、L-α-磷脂酸、二棕櫚酰的加入，將該分散體以0.10-10毫克/毫升加入上述重建膠原分散體中。綴合物分散體于周圍溫度下脫水和凍干。或者，按照該說明書中所述方法，將活化蛋白質顆粒、微膠囊或去礦質骨基質顆粒加入綴合物水分散體中。
實施例13重建膠原基質可以通過加入堿性鈣離子源進一步修飾。例如膠原組成為0.5-2.5％(重量)、pH5.0-5.5的重建膠原分散體對氫氧化鈣的無菌蒸餾水飽和溶液透析。當膠原分散體的pH達到10-10.5時，從堿性溶液中取出膠原分散體，將其置于適當大小的模具中，凍干形成海綿。將另一等份的膠原-氫氧化鈣與活化去礦質骨顆粒合并并混合，使顆粒完全分散于堿性基質中。將綴合物脫水和凍干，形成承受應力的海綿材料。
這些膠原-氫氧化鈣綴合物顯示出快速釋放鈣離子和氫氧根離子，僅僅負載足量的氫氧根離子，以稍微調節pH。
實施例14用以下方法制造氫氧化鈣(CaOH)/膠原-明膠微珠(microbead)。按先前實施例所述方法，生產中性或酸性pH的重建膠原分散體。將粉狀氫氧化鈣慢慢地加入該分散體中，直至pH使得膠原明顯地轉化為明膠。進行該轉化必需的pH為大約11.0或11.0以上。當膠原分散體失去其所有的半透明性，變為不透明和白堊時，該轉化的可見作用相當顯著。
膠體分散體可以按實施例3所述方法，通過浸入油相中定形為微珠。然而，在本實施例中，膠原-CaOH明膠分散體可以通過于-40至-60℃下凍干進行干燥。于周圍溫度下脫水也產生固體團塊。
將該團塊碾磨，粉碎為細顆粒。顆粒在0.05％(重量)、pH7.8的戊二醛溶液中進行部分交聯。沖洗1次后，將活化膠原/明膠-CaOH顆粒加入含有氫氧化鈣的堿性膠原分散體中。該混合物可以凍干或脫水。然而，可以加入10-85％(重量)的去礦質骨顆粒。
實施例15按美國專利3,767,437中Cruz所述方法，得到膠原-磷酸鈣綴合物。首先將在乙酸鈉中pH3.5-4.5的重建膠原分散體對更換3-7次的蒸餾水透析，然后對更換2-5次的氫氧化鈣飽和溶液透析。然后膠原-CaOH溶液對調至pH3.0-4.0的磷酸溶液透析。更換2-6次的透析產生膠原-磷酸鈣綴合物。該分散體凍干或在周圍條件脫水。產生的團塊在中等力下粉碎。將產生的顆粒篩選為50-1000微米的一致顆粒大小。將顆粒干燥，置于也含有8mM磷酸鈣緩沖液的0.08戊二醛溶液中。將顆粒過濾，用無菌蒸餾水洗滌1次。
將部分交聯的活化顆粒加入重建膠原分散體中，同時中度進行混合和攪拌。該分散體可以保持粘性凝膠狀態、凍干或于周圍條件下脫水。產生的干燥團塊的直徑拉伸強度大于100PSI。
實施例16將按照實施例15所述方法制備和活化的膠原-磷酸鈣顆粒，加入按實施例7系統2所述方法得到的組合物中。將無機顆粒加入膠原基質相中，使得不超過20％(重量)的整個綴合物由蛋白質/無機顆粒組成。整個團塊按上述實施例所述方法進行鑄塑和脫水。
實施例17將按照實施例15所述方法制備和活化的膠原-磷酸鈣顆粒，加入按實施例9所述方法得到的組合物中。將無機顆粒加入膠原基質相中，使得不超過20％(重量)的整個綴合物由蛋白質/無機顆粒組成。整個團塊按上述實施例所述方法進行鑄塑和脫水。
實施例18得自羥磷灰石或者得自磷酸三鈣顆粒的膠原-磷酸鈣顆粒綴合物，甚至當將低濃度的交聯劑(諸如戊二醛等)加入膠原基質時，也顯示出非常低的拉伸強度，即大約不大于30psi。該實施例描述了一個方法，提供的膠原-羥磷灰石或膠原-磷酸三鈣綴合物強度增加，以及無機顆粒從該基質的拔蝕減小。
按上述方法，用0.05的乙酸，在酸性pH范圍內生產重建膠原酸性分散體。生產在韋林氏混勻器中剪切的0.75％(重量)膠原的膠原分散體，然后對無菌等滲鹽水中透析，直至分散體的pH達到4.0-5.5。將顆粒大小為50-150微米、無菌藥物級磷酸三鈣顆粒加入該分散體中，同時中度攪拌。該分散體在真空下中度攪拌進行脫氣。將分散體置于透析管中，對0.01M、pH8.0的磷酸鹽緩沖液透析。周期性地無菌取出透析管，顛倒幾次，以防止無機相分離。透析24-48小時后，從透析管中取出分散體，倒入不銹鋼模具中，在-40℃至-60℃下凍干。
凍干結束時，將海綿樣團塊切成大約0.5cm2的立方體，在A-10磨機中以低設定值小心地研磨，以便提供一組大約250-550微米的膠原-礦質顆粒。按與本發明一個實施方案一致的方式活化顆粒。具體地說，在該實施例中，綴合物顆粒浸入大約0.08％(重量)戊二醛的中性緩沖等滲溶液中。戊二醛的濃度在0.001-0.25％(重量)戊二醛內變化。綴合物顆粒于4℃下活化大約8-12小時。通過真空過濾取出顆粒，在中性緩沖等滲鹽水中洗滌1次。
將活化蛋白涂布礦質顆粒加入1-2.5％(重量)膠原、pH3.5-5.0的重建膠原分散體中。將25-85％(重量)的活化顆粒加入分散體中。推薦的范圍為40-75％(重量)。將活化蛋白-礦質顆粒/重建膠原綴合物倒入不銹鋼模具中，于周圍溫度下通過強制循環空氣進行脫水。該綴合物一旦脫水，可以于-40℃至-60℃下凍干。
鑄塑該類型的另一綴合物，只是在脫水前，按上述實施例所述方法，將生物活性蛋白質、多肽或藥物加入基質中。
實施例19盡管可以在無機顆粒表面上的連續粘附層中形成重建膠原的穩定涂層，但推薦的方法是在富鈣表面和蛋白基表面層之間形成多螯合連結。
將大小為大約100毫微米的磷酸鈣陶瓷材料顆粒，即磷酸三鈣顆粒浸入10ppm的L-y-羧基谷氨酸溶液中。于4℃下顆粒在該溶液中保溫24-48小時。從在周圍條件下干燥的溶液中取出顆粒，浸入含有大約10-50ppmL-y-羧基谷氨酸的大約0.5-1％(重量)的膠原分散體中。在由分散體過濾的該溶液中輕輕攪拌顆粒，然后置于含有0.05M磷酸鈉緩沖液(用二代和三代磷酸鈉調至pH7.4)的0.15M NaCl溶液中。在該溶液中15分鐘至1小時后，將膠原涂布顆粒在0.075％(重量)的戊二醛溶液中部分交聯8-10小時。
通過過濾，從戊二醛溶液中取出顆粒，在無菌鹽水溶液中洗滌1次。一旦活化，將一些這些顆粒直接用于骨缺損中。或者，將一些活化顆粒混入1％(重量)重建膠原分散體中。將顆粒混合并攪拌，以確保分散體均勻。將如此獲得的凝膠用于某些骨缺損中。或者，將膠原顆粒分散體凍干，或在周圍條件下，在強制空氣下脫水。產生的材料用環氧乙烷、γ射線和/或通過浸入0.2％緩沖戊二醛溶液中進行消毒。
實施例20聚-L-谷氨酸或L-谷氨酸無規共聚物(在其重復結構中含有至少一個賴氨酸)的鈉鹽可以用來代替實施例19中公開的L-y-羧基谷氨酸，以在與重建膠原復合前涂布磷酸鈣顆粒。在該步驟中，將顆粒在聚氨基酸溶液中混合和攪拌，然后在周圍條件下將顆粒脫水，或者凍干。涂布顆粒在重建膠原分散體中混合，再干燥以提供均勻的涂層。于4℃下，如此產生的涂布顆粒在0.05％(重量)中性緩沖戊二醛中部分交聯大約10-12小時。從活化溶液中真空過濾顆粒，并干燥。然后按照本發明實施方案中所述方法使用顆粒。或者，聚氨基酸涂布顆粒一旦干燥，就可以加入含有大約0.05-0.1％(重量)戊二醛的重建膠原分散體中。整個綴合物可以脫水或凍干，然后如果計劃進一步復合，將其碾磨成粉末。
實施例21實施例7的系統2描述了內聚強度較高的重建膠原/活化去礦質骨基質綴合物的制造。活化顆粒的重量百分比證明在綴合物的5-85％范圍內是有用的。可以將綴合物總重量0-95％的非活化顆粒加入基質中。如果非活化或活化顆粒為惰性無機顆粒，具體地說為磷酸三鈣、羥磷灰石，那么它們的重量百分比不超過綴合物團塊總重量的20％。
實施例22實施例9描述了一種由粘性膠原-去礦質粉末(它為水合的，并與另外20％(重量)的活化去礦質骨顆粒混合)組成的內聚承受應力綴合物。該組合物由30％(重量)的原始失活顆粒加上20％(重量)活化去礦質骨顆粒(平均顆粒大小為150微米)組成。活化去礦質骨顆粒的百分比有時增至總團塊的50％(重量)。其它綴合物進行混合，以含有至多20％(重量)(相對于整個綴合物團塊)的活化或非活化惰性無機顆粒，后者由磷酸三鈣或羥磷灰石顆粒組成，其顆粒大小為20-750毫微米，優選范圍為20-150毫微米，任何類型顆粒的總重量百分比大于總團塊的85％。
實施例23上述實施例的基質組分可以含有非絲狀膠原類物質，諸如明膠等。將Bloom強度至少為200的足夠的明膠加入重建膠原中，使得不高于10％(重量)的基質由明膠組成。
實施例24聚氨基酸微膠囊可以用來形成實施例3所述的蛋白基部分交聯顆粒。按照相同的步驟，只是用聚-1-賴氨酸粘性溶液代替明膠。其它例外的步驟為聚-L-賴氨酸用來代替明膠。其它例外的步驟為只將聚-L-賴氨酸溫至37-43℃。
實施例25其它類型的無機顆粒可以活化，并與膠原、明膠、聚氨基酸或聚鏈烯酸反應，形成剛性承受應力植入物和牙骨質。含有變量氟化鈣的硅酸鋁玻璃用于承受應力牙骨質和可植入骨替代結構。
由粉末和液體的反應，形成這些硬結牙骨質。具體地說，提供研磨硅酸鋁玻璃，名為G-309或G-385。反應性液體由35-55％的聚丙烯酸(分子量為15,000-60,000)與2-35％的重建膠原和余下的蒸餾去離子水組成。
混合粉末與液體，粉末與液體之比為1.4-3克/毫升液體。牙骨質的工作時間為大約1分鐘45秒至2分鐘45秒，最后凝固5分鐘30秒至6分鐘45秒。
實施例26通過將0.01-3％的戊二醛加入實施例26所述的液體組分中，改變重建膠原-玻璃離子交換聚合物牙骨質。包含戊二醛縮短了工作/凝固時間，通過物理測試測定，產生較強的牙骨質。
實施例27通過加入聚氨基酸或用聚氨基酸代替液體組分中的聚鏈烯酸，可以進一步使實施例25和實施例26中所述的液體組分改性。液體的整個多元酸組分可以用聚-L-谷氨酸取代。或者，液體組分的5-45％可以由聚氨基酸，即聚-L-谷氨酸、聚-L-天冬氨酸酸、聚-L-賴氨酸組成，可以將這些聚氨基酸或任何聚氨基酸的均聚物或無規共聚物加入液體組分中，這些聚氨基酸聚合物的組合物改變牙骨質或植入物的凝固時間和最終物理強度。
實施例28由去礦質骨基質提取的骨形態形成蛋白和/骨蛋白可以加入均勻的單層脂質體中，以控制地傳送到骨缺損。生物活性蛋白加入雙層膜上或雙層膜中的步驟描述如下。
將一種磷脂， 1-棕櫚酰-2-油酰-phosphatodylchlorine通過超聲處理，分散于水(無菌蒸餾水)相中，然后與凍干BMP混合，使得產生最適大小(膠囊化效率高)的單層BMP脂質體的蛋白質與脂類的質量比為1∶2至1∶3，最適比率為1∶2.5。
在氮氣下，在旋轉燒瓶中干燥產生的混合物。然后在氮氣下，干燥的試樣在水介質中再水合，同時輕輕旋轉燒瓶。通過B-4或G200葡聚糖凝膠柱色譜，由游離的形態形成蛋白分離所得的單層脂質體。
BMP-脂質體于4℃貯藏，或者凍干。在植入前，重建膠原海綿同種骨自體骨移植物或去礦質骨基質可以浸泡在脂質體制劑中，以刺激骨生成。或者， BMP-脂質體可以與含水膠原分散體混合，以直接置于或注入到創傷位置，或加入本發明實施方案中所述的基質相中。
實施例29可以通過在病人本身的紅細胞中，通過在生物活性蛋白存在下重封血影細胞，收集骨形態形成蛋白和/或提取的骨蛋白。這提供一個高度生物相容性傳送系統，以將BMP傳送到創傷位置。
新鮮肝素處理的全血(大約50毫升)以1000gs離心10分鐘。除去血漿和血沉棕黃層，細胞在冷(4℃)Hanks堿式鹽溶液(HBSS)中洗滌3次。將封閉細胞與兩倍體積的冷溶血溶液(由含有大約0.5毫升/毫升BMP的蒸餾水組成)快速混合。在冷卻條件下平衡5分鐘后，加入足夠濃縮的冷HBSS，以恢復等滲性。將該懸液溫至37℃，在該溫度下保溫45分鐘。通過以1000gs離心15分鐘，收集重封細胞，用等滲HBSS洗滌3次，除去任何未捕捉的酶。
膠囊化BMP/RBC綴合物可以成片狀，將小片直接置于骨缺損中。結合RBC可以表面活化和部分交聯，將其加入成骨和/承受應力的植入物中。抗骨組織抗原標記物的單克隆抗體可以粘附于細胞表面，使得成骨蛋白可以不經腸而對準骨缺損，以促進愈合。
實施例30按照實施例20的方法，使得鈣結合蛋白或多肽用來在無機顆粒和基質之間建立一種結合。分子量為5,000-7,000的鈣結合多肽，即與羥磷灰石結合的骨鈣(osteocalcin)，可以用作該方法中的鈣結合界面。在干燥前，將顆粒浸入1-1000ppm的骨鈣溶液中，以進行該結合。然后按照實施例20的步驟。
實施例31本發明新骨移植材料的基質可以為去礦質凍干骨同種移植物或基質(DFDBA或DFDBM)，通過本領域眾所周知的步驟進行加工。例如，該方法可以包括Melloning所述的(參見“Freeze-Dried BoneAllografts in Periodontal Reconstructive Surgery，”Dental Clinics of NorthAmerica，Vol 35，No.3，July 1991.)以下所有步驟或其中一些步驟1.無菌收集骨密質。有時將該骨材料置于抗生素溶液中。
2.將骨密質大體切成500微米至5mm的顆粒。也可以制造骨條、楔形物、骨屑或其它形狀。
3.將移植材料浸入100％的乙醇中1小時，以除去脂肪和失活病毒。
4.然后，將骨于-80℃下冷凍1-2周，以抑制降解。在此期間，分析血清學試驗、抗體和直接抗原的試驗結果，獲得細菌培養物，將骨保留、丟棄或通過其它方法消毒。
5.將該骨凍干，以除去其95％以上的含水量。
6.骨密質可以研磨、過篩成較細的顆粒大小，例如大約250-750微米。
7.將骨移植材料再浸入100％的乙醇中，然后在蒸餾水中重復洗滌，以除去先前用于加工的所有化學品。
8.骨移植材料在0.6N HCl中脫鈣，以基本上除去所有無機鈣，留下有機骨基質。
9.該骨在無菌水和/或磷酸鈉緩沖液中洗滌，以除去殘留的酸。
10.將去礦質骨基質再凍干，在無菌容器內真空密封。
本領域技術人員會認識到，在加工骨移植材料的不同組織庫中，可以改變用于該方法中步驟的實際順序。該骨移植物用下述方法和材料進一步加工，生產本說明書中所述的增強的成骨骨移植材料。
實施例32由一個組織庫獲得去礦質凍干骨基質粉末(DFBM)。在該實施例中，由Musculoskeletal Transplant Fundation(Homdel，N.J.)獲得DFBM粉末。例如，加工凍干去礦質骨基質的步驟可能涉及一些或所有以下步驟抗生素浸泡、骨基質的研磨、研磨骨基質在無菌水和/或100％乙醇中洗滌、在0.5-0.6N HCl中去礦質、無菌水沖洗以除去殘留的HCl，然后用乙醇洗滌和將去礦質骨基質粉末凍干的最后步驟。獲得的該材料以無菌粉末形式提供。
無菌凍干去礦質骨粉從其無菌玻璃瓶容器中取出，置于覆蓋的無菌塑料孔中。在無菌蒸餾水溶液中制備USP氫氧化鈣飽和溶液。CaOH溶液的不溶性部分沉淀到溶液容器的底部后，用吸管吸取出上清液，將其置于單獨的無菌容器中。
用帶有27標號針頭的無菌注射器取出飽和氫氧化鈣上清液。按照Lange’s Handbook ofChemistry，11th edition，飽和氫氧化鈣溶液的氫氧化鈣濃度0℃下大約為0.19份氫氧化鈣對100份水，或大約為19mg/100ml水。然而本領域技術人員會理解，該飽和溶液的鈣濃度是可變的，該濃度取決于溫度。在無菌凍干去礦質骨粉上配制氫氧化鈣溶液，直至骨粉基質用該溶液目測飽和為止。飽和DFBPM材料允許在周圍條件下，在無菌通風櫥中進行干燥。將干燥的富鈣去礦質骨基質輕輕地再研磨為細粉，再置于密封的無菌玻璃容器中，直至需要植入為止。例如，加入的鹽與骨的重量比例或重量比可以在大約0001-20％(重量)變化。例如，加入的鈣與骨的重量比例和重量比可以在大約0.001-10％(重量)變化。
實施例33飽和氫氧化鈣上清液在一系列稀釋液中稀釋，得到鈣鹽濃度的不同稀釋度。在無菌水溶液中制備兩個溶液，一個代表飽和氫氧化鈣上清液的2倍稀釋液(2∶1稀釋液)，第二個代表同一飽和溶液的4倍稀釋液(4∶1稀釋液)。
再使用帶有27標號針頭的注射器，分別將兩個稀釋的氫氧化鈣溶液中的每個加入單獨的1cc份量的凍干去礦質骨粉中，直至骨粉團塊出現完全濕潤，并用各個溶液飽和為止。
實施例34將實施例32和33所述的去礦質骨基質粉末組合物與來自相應的每個實驗配合料同一批量的去礦質骨基質粉末(由此作為相應的對照組)一起，通過肌內植入實驗小鼠的大腿內側(hind thigh)。在每個動物中，每個DFDBA實驗配合料與配對組中其相應的對照材料配對。肌內植入后，在第8天、第29天和第46天時，拍攝配對位置的放射照片，以評價通過肌內植入物骨生成產生的礦質化骨塊的存在和大小。在上述時間范圍殺死動物，解剖和制備帶有周圍組織的植入物，用于組織學評價和分析。
下面表I描述了這些DFDBA植入物的放射照片和組織學分析的結果表I.肌內植入物中骨誘導的頻率測試的系統 8天29天 46天頻率 百分比 頻率 百分比 頻率 百分比對照DFDBA0/280％0/280％0/280％實驗DFDBA10/10 100％ 10/10 100％ 10/10 100％(飽和溶液)實驗DFDBA0/100％0/100％1/1010％(1∶2稀釋液)實驗DFDBA0/100％0/100％0/100％(1∶4稀釋液)進行第二個植入物實驗，以評價第一個實驗的再現性，測定實驗DFDBA肌內植入物和對照DFDBA肌內植入物中骨誘導和礦質化的頻率和大小。表II描述了這些結果表II.肌內植入物中骨誘導的頻率和大小測試的系統 8天15天頻率鈣化大小*頻率鈣化大小*對照DFDBA0/10 0.00/10 0.0實驗DFDBA10/10 2.45 10/10 2.45(飽和鈣鹽)*通過“1”-“4”評級測定的鈣化大小，等級“4”為最大團塊。
如表I和表II所示，在所有時間范圍獲得的數據揭示，與飽和氫氧化鈣溶液絡合的實驗DFDBA證明，在所有肌內植入物中100％誘導和生成有活力的新骨。在肌內植入物中沒有用骨處理的DFDBA。不用飽和氫氧化鈣溶液處理的DFDBA，甚至在6周時也不能產生放射照片檢測到的骨。用飽和氫氧化鈣溶液的1∶2稀釋液處理的DFDBA骨粉，在6周評價時產生十分之一的植入物具有放射照片明顯的骨生成。用飽和氫氧化鈣溶液的1∶4稀釋液處理的DFDBA，在6周時沒有產生放射照片檢測到的骨。然而，與用未處理的標準去礦質骨基質見到炎癥細胞反應相比，用飽和氫氧化鈣溶液的1∶2稀釋液和1∶4稀釋液處理的DFDBA基質粉末的組織學分析，的確提供了炎癥細胞減少和成骨反應早期證據的有益的細胞反應。
實施例35去礦質骨基質材料在暴露于游離鈣鹽溶液之前，可以用多種其它緩沖液或鹽溶液沖洗。例如，骨基質可以在0.5N或0.6N HCl中去礦質，其時間足以除去足夠的表現成骨性能的礦質(通過不高于pH1.0的殘留pH水平測定)。去礦質骨基質從酸溶液中取出并通過在無菌蒸餾水中洗滌除去殘留的酸后，可以在各種濃度的緩沖液溶液中沖洗，可以調至所需的各種pH。使用中性或微堿性緩沖液系統，可以有助于中和水洗后留下的殘留酸。
例如，去礦質骨粉在0.5或0.6HCl中去礦質和在無菌水中沖洗后，可以在0.001M-0.2M(pH7.5-9.0)的磷酸鹽緩沖溶液(例如磷酸氫二鈉溶液)沖洗。用緩沖液沖洗后，去礦質骨基質用含有可溶性鈣的溶液(諸如氫氧化鈣飽和溶液)飽和，然后使其在周圍條件下干燥或凍干。
實施例36鈣源可以通過除水溶液外的其它方式，傳送到去礦質骨基質表面。例如，可溶性鈣源可以用于水溶性或水不不溶性成膜劑中。或者，用可溶性鈣鹽處理的DFDBA可以進一步與水溶性或水不溶性成膜劑混合。
例如，可溶性鈣增強的去礦質骨基質可以與明膠明膠溶液的水性膠原分散體復合，可選地進一步凍干或脫水為膜構型的海綿。或者，可溶性鈣溶液可以加入膠原分散體或明膠溶液中，此后將未處理的去礦質骨基質粉末加入鈣/膠原或鈣/明膠分散體或溶液中，整個綴合物脫水或凍干為固體形式，以用于植入。
實施例37按這些實施例所述方法加工的鈣鹽飽和骨塊可以凍干，而不讓它在周圍條件下干燥。
實施例38去礦質骨基質原材料可以通過其它方法加工，提取骨基質，以進一步除去其它潛在的抗原。首先，于25℃下將骨移植物在1∶1的氯仿-甲醇溶液中放置4小時。100％乙醇溶液可以代替氯仿-甲醇溶液。然后，于37℃下，將骨浸入含有10mM/L的碘乙酸和10mM/L的疊氮鈉的0.1MpH7.4的磷酸鹽緩沖溶液中72小時。骨移植物在無菌蒸餾水中沖洗后，在2℃下，將其置于0.6 N鹽酸中24小時，以促進去礦質。去礦質骨基質材料在無蒸餾水中徹底沖洗后，于-72℃下凍干24小時。這時，提取過抗原的DFDBA材料用可溶性鈣溶液(諸如飽和氫氧化鈣溶液等)飽和，或者讓其在無菌周圍條件下干燥，或者凍干(冷凍干燥)。然后，將富鈣DFDBA置于無菌容器中貯藏。
實施例39去礦質骨基質在用可溶性鈣溶液處理之前，可以用含有親膠劑(諸如4M胍、6M脲或1％十二烷基硫酸鈉等)的緩沖液提取。蛋白酶抑制劑也可以加入這些提取緩沖液中，以抑制去礦質骨基質的降解，也抑制用該方法提取的蛋白質的降解。提取去礦質骨基質后，骨基質在無菌水和新鮮磷酸鹽緩沖液中沖洗。將含可溶性鈣的溶液(諸如可溶性氫氧化鈣飽和溶液等)用于提取的骨基質，然后讓處理的骨基質在無菌周圍條件下干燥或通過凍干干燥。
實施例40其它含鈣的鹽溶液可以用于本發明中。例如，含有乙酸鈣、檸檬酸鈣、氯化鈣、甲酸鈣、甘油磷酸鈣、乳酸鈣、月桂酸鈣、油酸鈣、氧化鈣、棕櫚酸鈣、水楊酸鈣、硬脂酸鈣、琥珀酸鈣或硫酸鈣(無水、半水合物、二水合物)的可溶性溶液或飽和溶液為可接受的可溶性鈣源。這些化合物在100份水中的溶解度范圍從低至0.003份高至幾乎100份。本領域技術人員會認識到，除以上列出的那些化合物外，其它含鈣的化合物可能適用于本發明。
實施例41鈣鹽或礦物鹽改性的去礦質骨基質(參見實施例31-39)可以以這樣一種方式加入有機纖維或非纖維材料(諸如膠原或明膠基質等)中，以便形成增強的去礦質骨基質填充的多孔或半多孔海綿材料。通過將不同比例的鈣鹽或礦物鹽改性的去礦質骨粉或顆粒加入膠原或明膠的或者水分散體中或者加入其干粉分散體中，可以形成海綿。例如這一增強的成骨海綿的制造，在涉及上述步驟的可能途徑范圍下，以下步驟用來提供一個這種可能的實例。
通過將膠原粉末或羊毛狀物再分散于或者稀鹽酸或者氫氧化鈉的酸性或堿性溶液中，可以由純化牛膠原材料生產水性膠原分散體。例如，可以將干燥的膠原材料逐漸地加入0.01N HCl溶液中，生產大約0.01-5％的膠原分散體。在冷卻下，用韋林氏混勻器通過5-10秒短促的攪拌，將分散體完全混合。當逐漸將膠原分散體的pH提高至大約pH4-5.5時，混合的分散體可以在4℃下，對無菌蒸餾水透析，以降低酸濃度。然后于4℃下，可以將鈣鹽或礦物鹽改性的去礦質骨逐漸加入膠原分散體中。根據膠原分散體的初始pH，可以將不同重量比的去礦質骨加入膠原分散體中，范圍為大約5-95％(重量)的骨基質。例如，加入的去礦質骨可以為包含加入的鈣鹽或礦物鹽的去礦質骨、部分活化的去礦質骨或未處理的去礦質骨或它們的組合物。然后，例如水性膠原/增強的去礦質骨基質粉末分散體可以凍干為海綿，并且用刀口鋒利的器械或海綿切割裝置，通過常規方法切成所需的大小和構型。
或者，酸性或堿性膠原分散體可以通過常規方法凍干，然后可以在干冰和/或液氮冷卻下研磨成粉末。然后，該膠原粉末可以與不同比例的增強去礦質骨基質粉末進行干混。混合后，粉末混合物可以用足夠的無菌蒸餾水水合，形成均勻的分散體。然后，該混合膠原/增強去礦質骨分散體可以凍干成海綿構型。膠原源可以來源于人或動物。
實施例42尚未表面活化或用鈣鹽或礦物鹽(除磷酸鹽緩沖液外)改性的去礦質骨基質粉末，可以加入實施例41所述的不同形式的重建膠原或明膠中。去礦質骨粉與膠原或明膠基質的重量比為大約60-90％(重量)的去礦質骨粉對10-40％(重量)的基質組分。產生的海綿具有以下獨特的性能，這增加了它們的臨床效用1)增強潮濕條件下形狀、形式和彈性的保持。
2)增強在干燥和/或潮濕條件下的抗壓強度，同時保持彈性、海綿樣物理行為。
3)增強空間保持功能。
4)增強細胞浸潤，而不顯著增加炎癥細胞，諸如巨噬細胞等。
如果該組合物為海綿形式，那么其特征最好為密度大約為0.1克/立方厘米(cc)或高于0.1克/立方厘米(cc)。海綿密度的范圍可以為大約0.1-0.5克/cc，推薦的密度為大約0.11-0.35克/立方厘米。具有大約90％(重量)或90％(重量)以上去礦質骨的海綿，需要基質膠原(或明膠)的pH低于pH5.0，最好低于pH4.5。如果膠原(或明膠)作為酸性粉末提供，那么對于后面與去礦質骨的混合，在凍干和研磨成粉末用于混合前，膠原分散體的pH應該低于pH5.0，最好低于pH4.5。如果將膠原在堿性范圍內分散，那么pH應該高于9.0。膠原源可以來源于人或動物。
實施例43去礦質骨基質或重建膠原基質可以用濃度為低至10酶單位/毫克骨或膠原、高至或高于100單位/毫克骨或膠原的含水或可溶性堿性磷酸酶處理。測定為失活(在小鼠大腿動物模式中測試)的去礦質骨基質，可以通過用100單位/毫克堿性磷酸酶預處理，然后脫水或干燥處理的骨，而轉化為活性的。將重建含水膠原(含有大約18-20單位堿性磷酸酶/毫克膠原(干重))凍干，然后研磨成細粉。將該膠原-堿性磷酸酶粉末皮下植入小鼠中，產生的礦質化團塊在組織學評價下揭示出骨樣結構。
盡管本發明參考某些具體實施方案進行描述，但應該理解，除本文所示和所述的那些實施例外，本領域技術人員從以上描述會明顯看出本發明的各種修改。這類修改包括在所附的權利要求書的范圍內。
權利要求
1.成骨組合物，包含去礦質骨和至少一種含鈣或其它礦物的鹽。
2.權利要求1的組合物，其中所述去礦質骨為部分去礦質骨。
3.權利要求1的組合物，其中所述去礦質骨為凍干去礦質骨同種移植物。
4.權利要求1的組合物，其中所述去礦質骨為海綿、顆粒、粉末、羊毛狀物膜或纖維的形式。
5.權利要求4的組合物，其中所述組合物為海綿粉末、顆粒、羊毛狀物、膜或纖維的形式。
6.權利要求1的組合物，其中含鈣或其它礦質的鹽和去礦質骨存在的重量比例或重量比為大約0.0001-20％(重量)。
7.權利要求6的組合物，其中重量比例或重量比為大約0.0010-10％。
8.權利要求1的組合物，其中鈣鹽選自乙酸鈣、檸檬酸鈣、氯化鈣、甲酸鈣、甘油磷酸鈣、乳酸鈣、月桂酸鈣、油酸鈣、氧化鈣、棕櫚酸鈣、水楊酸鈣、硬脂酸鈣、琥珀酸鈣或硫酸鈣。
9.權利要求8的組合物，其中鹽為氫氧化鈣。
10.權利要求9的組合物，其中在組合物中氫氧化鈣鹽和去礦質骨存在的重量比例或重量比為大約0.001-10％(重量)。
11.權利要求1的組合物，其中所述組合物還包含一種選自維生素、氨基酸、抗生素、骨形態形成蛋白(BMP)或蛋白質、生長因子、重建膠原、明膠、血纖維蛋白、血蛋白或甘油的物質。
12.生產成骨潛力增強的成骨植入物的方法，包括將至少一種可溶性鈣鹽或礦物鹽吸收到去礦質骨中。
13.權利要求12的方法，其中所述鈣鹽選自乙酸鈣、檸檬酸鈣、氯化鈣、甲酸鈣、甘油磷酸鈣、乳酸鈣、月桂酸鈣、油酸鈣、氧化鈣、棕櫚酸鈣、水楊酸鈣、硬脂酸鈣、琥珀酸鈣或硫酸鈣。
14.通過應用權利要求1的組合物來治療骨缺損或牙周缺損的方法。
15.可溶性鈣溶液，將其用于去礦質骨基質時，使得骨生成過程增強。
16.權利要求15的組合物，其中鈣溶液包括氫氧化鈣溶液。
17.權利要求16的組合物，其中將可溶性鈣溶液消毒。
18.用去礦質骨基質增強骨誘導的方法，包括將可溶性鈣鹽用于去礦質骨基質。
19.在硬組織缺損或軟組織缺損中誘導骨的方法，包括植入包含去礦質骨和可溶性鈣鹽的組合物。
20.成骨組合物，包含大約60-95％(重量)或大約60-90％(重量)的去礦質骨。
21.權利要求20的組合物，其中所述去礦質骨為部分去礦質骨。
22.權利要求20的組合物，其中所述去礦質骨為凍干去礦質骨同種移植物。
23.權利要求20的組合物，其中所述去礦質骨為海綿、顆粒、粉末、羊毛狀物膜或纖維的形式。
24.權利要求20的組合物，其中所述組合物為海綿粉末、顆粒、羊毛狀物、膜或纖維的形式。
25.權利要求24的組合物，其中所述組合物為海綿的形式。
26.權利要求25的組合物，其中海綿的密度為大約0.1克/cc或大于0.1克/cc。
27.權利要求20的組合物，其中該組合物的大約5-10％(重量)至40％(重量)由選自膠原或明膠的一種物質組成。
28.權利要求27的組合物，其中膠原為重建膠原。
29.成骨組合物，包含大約60-95％(重量)的去礦質骨和大約5-40％(重量)選自膠原和明膠的一種物質。
30.權利要求20的成骨組合物，其中該組合物包含大約60-90％的去礦質骨。
31.生產成骨組合物的方法，包括(a)將膠原分散于pH值不高于約5的酸性溶液中；(b)將酸性膠原分散體凍干；以及(c)將步驟(b)的凍干膠原與去礦質骨混合，這里最終組合物為大約90％(重量)的去礦質骨。
32.海綿形式的權利要求31的組合物。
33.包含載體和堿性磷酸酶的組合物，其中所述組合物能夠誘導骨樣礦質結構的生成。
34.權利要求33的組合物，其中所述載體選自膠原和去礦質骨。
35.權利要求34的組合物，其中所述堿性磷酸酶存在的量的范圍為大約10-5000單位/毫克載體。
36.權利要求35的組合物，其中該范圍為大約100-1000單位/毫克載體。
37.權利要求35的組合物，其中所述組合物為海綿的形式。
38.通過應用權利要求20的組合物來治療骨缺損或牙周缺損的方法。
39.通過應用權利要求27的組合物來治療骨缺損或牙周缺損的方法。
40.通過應用權利要求33的組合物來治療骨缺損或牙周缺損的方法。
41.包含95％(重量)選自以下的材料的成骨組合物(i)未處理去礦質骨；(ii)部分活化去礦質骨；(iii)通過加入含鈣鹽或含其它含礦質鹽改性的去礦質骨或(iv)(i)-(iii)的組合物。
42.成骨組合物，包含大約0-95％的去礦質骨。
43.權利要求1-11的成骨組合物的用途，用于治療受治療者骨缺損或牙周缺損的藥物生產。
44.權利要求20-26的成骨組合物的用途，用于治療受治療者骨缺損或牙周缺損的藥物生產。
45.權利要求27-30的成骨組合物的用途，用于治療受治療者骨缺損或牙周缺損的藥物生產。
46.權利要求33-42的成骨組合物的用途，用于治療受治療者骨缺損或牙周缺損的藥物生產。
全文摘要
包含膠原和去礦質骨顆粒的方法和產品。該產品可以含有最多20%(重量)的無機材料。該產品可以通過壓縮致密。其中可以加入其它成骨因子、促細胞分裂劑、藥物或抗生素。無機顆粒可以通過用鈣結合蛋白或羥磷灰石結合蛋白、多肽或氨基酸預涂布,結合到有機基質上。該材料也表現出藥物釋放持續時間長的特性。本發明的主題是,用去礦質骨基質提高骨誘導速率和預見性。特別是,本發明涉及表現出成骨潛力增強的去礦質骨和鈣鹽或其它礦物鹽的組合物。本發明還涉及包含大約60—90%(重量)去礦質骨的成骨組合物和能夠誘導骨樣結構的、包含載體和堿性磷酸酶的組合物。
文檔編號A61L27/24GK1192700SQ96196049
公開日1998年9月9日 申請日期1996年6月6日 優先權日1995年6月6日
發明者S·R·杰弗里斯 申請人:基因科學再生實驗室有限公司