低聚糖化合物的細菌抑制的制作方法

專利名稱：：低聚糖化合物的細菌抑制的制作方法
技術領域：
：本發明背景本發明的范圍本發明涉及使用低聚糖以及含相同成分的藥用組合物治療由選自肺炎雙球菌(Streptococcuspneumoniae)、流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenza)、副流感嗜血桿菌(Haemophilusparainfluenza)、洋蔥假單胞菌[Burkholderia(Pseudomonas)cepacia]和其混合物的細菌引起的細菌感染的方法。背景討論肺炎雙球菌、流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、洋蔥假單胞菌是與如肺炎、細菌性支氣管炎、結膜炎、竇炎和中耳炎等呼吸道疾病有關的致病菌。在上述每種疾病中，所述的細菌都可移生到鼻咽，結膜、肺、支氣管或耳道等健康組織中，使眾多人染病。所述的細菌粘連在細胞表面的細菌特菌異受體部位。為了減緩細菌移生，常規治療是依靠抗生素的用藥。可是，抗生素治療常受到產生抗生素耐藥菌的影響(和最終產生用已知的抗生素無法治療的“超級細菌”)。美國微生物學會在1995年5月發表的一篇報告中指出越來越多的傳染性病菌正變成用抗生素可不治療的，在公共衛生危機發生之前必須采取措施扭轉這種趨勢。研究人員已對致病菌與組織受體粘連的互相作用進行了研究，并已證明特定的碳水化合物序列化合物能抑制細菌的粘連。Krivan等人在美國專利5386027中報道了用含有在中間或含在末端的GalNAcβ1-4Galβ1-4-Glc序列的化合物粘合抑制與呼吸道感染有關的特異“機會致病菌”。所報道的粘合抑制的特異肺致病菌是綠膿桿菌、流感嗜血桿菌、金葡球菌、肺炎雙球菌、肺炎桿菌和大腸桿菌。該文獻假定神經節苷脂GM1大量的存在于人的肺部組織中和假定肺致病菌需要至少一個未被唾液酰基(Sialyl)取代的末端或中間的GalNAcβ1-4Gal。Andersson等人在J.Exp.Med.[(1983)，v.158，p.559-570，]中報道關于肺炎雙球菌粘合抑制研究并確定二糖GlcNAcβ1-3Galβ作為特異的糖共軛物(glycoconjugate)受體。該文獻報道化合物3即NeuAcα2-3Galβ1-4-GlcNAcβ1-3Galβ1-4-Glc-Cer無粘合抑制作用(564頁，表IV下的首句)。Rosenstein等人在InfectionandImmunity[(1992)，Vol.60，no.12，5078-5084]中報道從囊性纖維變性患者中分離出的綠膿桿菌M35和大腸桿菌C600對于各種低聚糖結構的粘合特異性。指出Galβ1-4-GlcNAcβ1-3Galβ1-4-Glc具有高粘合活性，而NeuAcα2-6Galβ1-4-GlcNAcβ1-3Galβ1-4-Glc卻無活性。Ramphal等人在Infection和Immunity[(1991)Vol.59，no.2，p.700-704]中報道綠膿桿菌對1型(Galβ1-3-GlcNAc)和2型(Galβ1-4-GlcNAc)二糖的粘合抑制研究。在直接粘連測定中，NeuAcα2-6Galβ1-4-GlcNAcβ1-3Galβ1-4-Glc無活性。Ginsburg等人在美國專利5225330中報道了使用特定的碳水化合物受體序列化合物吸收微生物的診斷方法。該文獻指出肺炎支原體(表I，11列)的粘合抑制中，Sialylparagoboside無活性，但是報道了N-glycolylsialoparagloboside的大腸桿菌的抑制作用。Feizi等人在Biochemistry(1994，33，6342-6349)中報道NeuAcα2-6Galβ1-4-GlcNAcβ1-3Galβ1-4-Glc沒有被免疫球蛋白E-粘合蛋白粘合或僅微弱的粘合，而NeuAccα2-3Galβ1-3-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc卻被該蛋白緊緊粘合。Magnani等人在WO92/18610中，報道于體內和體外抑制惡性細胞對內皮細胞的粘合中應用了唾液酰-Lea(Neu5Acα2-3-Galβ1-3[Fucα1-4]GlcNAc)和唾液酰-Lex(Neu5Acα2-3-Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc)。Andersson等人在J.ofInfectiousDiseases[(1986)，Vol，153，no，2，232-237)中報道了人乳成份可抑制肺炎雙球菌和流感嗜血桿菌對人咽或頰的上皮細胞的粘合。因此，尋找治療選自肺炎雙球菌，流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、洋蔥假單胞菌和其混合物的細菌的細菌感染的新方法，該法具有產生抗生素耐藥菌的較低可能性。在該研究中，抗粘連化合物是潛在有用的候選物。本發明概述因此，本發明目的之一是提供通過給予粘合抑制有效量的式I化合物，抑制選自肺炎雙球菌、流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、洋蔥假單胞菌和其混合物的細菌移生的新方法，其中R1是H，(β-1)GalNAc-，SO3B(其中B是H或陽離子)或式II唾液酸；其中R6、R7、R8和R10各自獨立為H、C1-6酰基、乳酰基、C1-6烷基、硫酸酯、磷酸酯、脫水、式II的唾液酸、(α-1)Fuc、(β-1)Glc或(β-1)Gal；R9是NH-C1-6酰基、乙醇酰胺基、氨基或羥基；和A是H或陽離子；R2是H或(α-1)Fuc-；R3和R4各自獨立為OH或NHAc；R5是H、SO3B(其中B是H或陽離子)或同上述定義的式II的唾液酸；和Y是化學鍵或是連接基團；Z是H或多價載體(support)；m是0或1；和p是1-1000的整數。本發明的第二目的是提供抑制選自診斷患有肺炎病人中的肺炎雙球菌、流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、洋蔥假單胞菌和混合物的細菌的細菌移生的方法。本發明另一目的是提供抑制選自診斷患有細菌性支氣管炎病人中的肺炎雙球菌、流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、洋蔥假單胞菌和混合物的細菌的細菌移生的方法。本發明另一目的是提供抑制選自診斷患有中耳炎病人中的肺炎雙球菌、流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、洋蔥假單胞菌和混合物的細菌的細菌移生的方法。本發明另一目的是提供含有式I化合物的新的藥用組合物。其中R1是H，(β-1)GalNAc-，SO3B(其中B是H或陽離子)或式II的唾液酸；其中R6、R7、R8和R10各自獨立為H、C1-6酰基、乳酰基、C1-6烷基、硫酸酯、磷酸酯、脫水、式II的唾液酸、(α-1)Fuc、(β-1)Glc或(β-1)Gal；R9是NH-C1-6酰基、乙醇酰胺基、氨基或羥基；和A是H或陽離子；R2是H或(α-1)Fuc-；R3和R4各自獨立為OH或NHAc；R5是H、SO3B(其中B是H或陽離子)或同上述定義的式II的唾液酸；和Y是化學鍵或是連接基團；Z是H或多價載體(support)；m是0或1；和p是1-1000的整數；其中當R5是H時，R1不是H和當R1是唾液酸時，R2不是(α-)Fuc。在優選的實施例中，式I的化合物具有下述的結構式其中Y是化學鍵或連接基團；Z是H或多價載體；和p是1-1000的整數。通過本發明者的發現即借助式I化合物抑制選自肺炎雙球菌、流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、洋蔥假單胞菌和其混合物的細菌移生來使本發明這些和其它的目的成為可能的。優選實施例的詳細論述本文中使用下列縮寫“Gal”為半乳糖；“Glc”為葡萄糖、“GlcNac”為N-乙酰葡萄糖胺；“GalNAc”為N-乙酰半乳糖胺；“Fuc”為巖藻糖；“NAN或NeuAc”為N-乙酰神經氨酸。特定的低聚糖化合物包括NeuAcα2-6-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc，NeuAcα2-3-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc，Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc，NeuAcα2-6-Galβ1-4-[Fucα1-3]GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc，NeuAcα2-6-[GalNAcβ1-3]Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc，NeuAcα2-6-[GalNAcβ1-3]Galβ1-4-[Fucα1-3]GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc，NeuAcα2-6-Galβ1-4-GlcNAc，NeuAcα2-6-Galβ1-4-[Fucα1-3]GlcNAc，NeuAcα2-6-[GalNAcβ1-3]Galβ1-4-GlcNAc，NeuAcα2-6-[GalNAcβ1-3]Galβ1-4-[Fucα1-3]GlcNAc，GalNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc，GalNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAc，GalNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc，NeuAcα2-3-Galβ1-4-GlcNAc，NeuAcα2-6-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAc，NeuAcα2-3-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAc，Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAc，NeuAcα2-6-Galβ1-4-[Fucα1-3]GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAc，NcuAcα2-6-[GalNAcβ1-3]Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAc，NeuAcα2-6-[GalNAcβ1-3]Galβ1-4-[Fucα1-3]GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAc，GalNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAc和GalNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAc.]除化合物Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc之外，低聚糖化合物的優選基團為上述定義的基團。所述的每一化合物也可以以一價(即，p＝1)或以多價形式(即，p＝2-1000)，用或不用連接基團Y來實施給藥。此外，所述的連接基團Y可直接鍵合Z(其中Z是H或是多價載體)。本發明的低聚糖可使用任何已知方法獲得，包括(1)酶催化，使用美國專利5180674中介紹的方法之一，(2)合成，使用經典有機化學方法，(3)通過天然的低聚糖、糖脂，或糖肽的降解或(4)從如人乳天然來源中分離。Kuhn，R.和GaucheA.[ChemBer.，95，513(1962)]和Dorland等人[Eur.J.Bioch，87，323(1978)]報道了LSTc的分離。例如，乳糖經酶催化可制備化合物NeuAcα2-6Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc。因此，乳糖與β半乳糖甙β1-3N-乙酰葡糖氨基轉移酶和UDP-GlcNAc、βN-乙酰葡糖氨基甙β1-4半乳糖基轉移酶和UDP-Gal及β半乳糖甙α2-3唾液酰基轉移酶和CMP-NeuAc在適當條件下反應以影響所述三個糖基從糖核苷酸到合適的受體分子的轉移。基團R1和R5可以是基團SO3B，其中B可以是H或是陽離子。因此，所述的式I化合物包括硫酸酯取代基及其鹽。合適的陽離子包括堿金屬、堿土金屬或銨。可使用任何已知適合藥用的陽離子，包括常用的無毒性鹽的陽離子，包括金屬鹽例如堿金屬鹽(如鈉鹽、鉀鹽等)或堿土金屬鹽(如鈣鹽、鎂鹽等)、銨鹽。有機堿鹽(如三甲胺鹽、三乙胺鹽、吡啶鹽、甲基吡啶鹽、二環己胺鹽、N，N’-二芐基乙二胺鹽等)、有機酸鹽(如甲酸鹽、乙酸鹽、三氟乙酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、甲苯磺酸鹽等)、無機酸鹽(如氫氯化物、氫溴化物、硫酸鹽、磷酸鹽等)、氨基酸鹽(如精氨酸鹽、天冬氨酸鹽、谷氨酸鹽等)以及諸如此類鹽。所述的式I化合物也可以是相應的氮雜糖，其中用氮置換吡喃環上一個或多個氧以形成哌啶環體系。用對本
技術領域：
的普通技術人員熟知的常規的方法可制備相應于式I的氮雜糖，例如經典的有機化學技術或使用適當的氮雜糖化物作受體底物的酶催化法。通過相應葡萄糖轉移酶將氮雜糖核苷酸轉移成天然糖。從天然資源中可分離出氮雜葡萄糖，再經半乳糖轉移酶的作用，在像UDP-gal半乳糖給予體的存在下，將其轉化成氮雜乳糖。所述的式I化合物也可以是相應的硫糖，其中用硫置換吡喃環上的一個或多個氧形成四氫噻喃環體系。用對本
技術領域：
的普通技術人員熟知的常規方法可制備相應于式I的硫糖，如經典的有機化學技術或使用適當的硫糖化物作受體底物的酶催化法。因常規經典有機化學技術將相應一糖化物制備成一硫糖化物。所述的式II化合物是唾液酸，即與神經氨酸有關的9位碳被羧化的糖類化合物。當A是H時，所述的羧酸以游離酸形式存在，當A是陽離子時，所述羧酸為鹽。合適的陽離子包括堿金屬，堿土金屬或銨。可以使用任何已知可作為藥用的適當陽離子，包括常用的無毒性鹽的陽離子，有像堿金屬鹽(如鈉鹽、鉀鹽等)或堿土金屬鹽(如鈣鹽、鎂鹽等)的金屬鹽、銨鹽、有機堿鹽(如三甲胺鹽、三乙胺鹽、吡啶鹽、甲基吡啶鹽、二環己基胺鹽、N，N’-二芐基乙二胺鹽等)、有機酸鹽(如甲酸鹽、乙酸鹽、三氟乙酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、甲苯磺酸鹽等)、無機酸鹽(如氫氯化物、氫溴化物、硫酸鹽、磷酸鹽等)、氨基酸鹽(如精氨酸鹽、天冬氨酸鹽、谷氨酸鹽等)以及諸如此類鹽。優選所述的式II化合物選自N-乙酰-神經氨酸、N-乙醇酰-神經氨酸、氧代-脫氧-nonulosonicacid、9-0-乙酰N-乙酰-神經氨酸、9-0-乙酰N-乙醇酰-神經氨酸、9-0-乙酰-氧代-脫氧-nonulosonic、7-0-乙酰-N-乙酰-神經氨酸、7-0-乙酰-N-乙醇酰-神經氨酸、4-0-乙酰-N-乙酰-神經氨酸、4-0-乙酰-N-乙醇酰-神經氨酸、7，9-二-0-乙酰-N-乙酰-神經氨酸、8，9-二-0-乙酰-N-乙酰-神經氨酸、7，9-二-0-乙酰-N-乙醇酰-神經氨酸、8，9-二-0-乙酰-N-乙醇酰-神經氨酸、4，9-二-0-乙酰-N-乙酰-神經氨酸、7，8，9-三-0-乙酰-N-乙酰-神經氨酸、7，8，9-三-0-乙酰-N-乙醇酰-神經氨酸、9-0-乳酰-N-乙酰-神經氨酸、9-0-乳酰-N-乙醇酰-神經氨酸、4-0-乙酰-9-0-乳酰-N-乙酰-神經氨酸、4-0-乙酰-9-0-乳酰N-乙醇酰-神經氨酸、8-0-甲基-N-乙酰-神經氨酸、8-0-甲基-N-乙醇酰-神經氨酸、8-0-甲基-9-0-乙酰-N-乙醇酰-神經氨酸、8-0-甲基-7，9-二-0-乙酰-N-乙醇酰-神經氨酸、8-0-硫代-N-乙醇酰-神經氨酸、8-0-偶磷-N-乙酰-神經氨酸、2，3-二脫氫2，6脫水-N-乙酰-神經氨酸、9-0-乙酰-2，3-二脫氫2，6脫水-N-乙酰-神經氨酸、9-0-乳酰-2，3-二脫氫2，6脫水-N-乙酰神經氨酸、2，3-二脫氫2，6脫水-N-乙醇酰-神經氨酸、9-0-乙酰-2，3二脫氫2，6脫水-N-乙醇酰-神經氨酸、9-0-乳酰-2，3-脫氫2，6脫水-N-乙醇酰-神經氨酸、8-0-甲基-2，3二脫氫2，6脫水-N-乙醇酰-神經氨酸、2，7脫水-N-乙酰-神經氨酸、2，7脫水-N-乙醇酰-神經氨酸、8-0-甲基-2，7脫水-N-乙醇酰-神經氨酸、4，8脫水-N-乙酰-神經氨酸及其鹽。更優選所述的式II唾液酸是N-乙酰-神經氨酸或N-乙醇酰-神經氨酸、在A.VarkiGlycobiology[Vz，(1992)P25-40]中介紹了這些唾液酸。據此，該文獻描述唾液酸的來源以及酶催化合成式I低聚糖所必需的適當唾液酰轉移酶。當用唾液酸取代式II化合物時，所述的R7位為優選取代。所述的連接基團Y是能連接式I化合物的低聚糖部分與基團Z的任何基團。合適的連接基團包括糖化物、低聚糖、肽、蛋白質、C2-20烷基、氧化烯鏈基或不降低式I化合物的低聚糖部分粘合抑制活性的任何其它基團。此外，所述的連接基團也可以是化學鍵，其中式I化合物的低聚糖部分直接連接基團Z。可提供低聚糖作為根據式I的多價分子(即，p＝2-1000)。在該實施例中，使用已知的技術將所述的低聚糖部分連接到多價載體上，以使制備其中一個以上的低聚糖單個分子通過基團Y用共價鍵連接于所述的多價載體的共軛體(conjugate)。多價載體應是足夠長的以提供由2-1000(即，p＝2-1000的整數)之間，優選2-100，更優選2-50的連接于多價載體的低聚糖部分的分子留下的多價分子。合適的多價載體是在連接基團的末端上具有多個連接部位的化合物，(該連接基團不連接還原性末端糖化物)或是在葡萄糖C1配糖的氧或N-乙酰葡萄糖胺殘基上具有多個連接部位的化合物。實例包括(但不僅限于此)多元醇、多糖、聚賴氨酸、抗生物素蛋白、聚丙烯酰胺、葡聚糖、類脂、類脂乳狀液、脂質體、dendrimer、人血清白蛋白、牛血清白蛋白或環糊精。用連接基團Y連接還原性末端糖化物(即，Glc或GlcNAc)和將連接基團Y連接多價載體的所需的化學方法是眾所周知的連接化學領域的方法。例如，還原性末端糖化物和Y之間的鍵可以通過使還原性末端糖化物C1上的醛或羧酸或經氧化反應引入到還原性末端糖化物上的醛或羧酸基與所述Y基團反應形成的，從而形成合適的鍵，如-NH-、-N(R’)-，其中R’是C1-20烷基。羥基烷基胺、酰胺、酯、硫酯、硫酰胺。通過以吡喃糖形式的C1羥基與酰化劑和鹵代分子反應在還原性末端糖化物和Y之間形成所述的鍵，接著與親核試劑反應形成合適的鍵，例如-NH-、-N(R’)-，其中R’是C1-20烷基、-S-和-O-。Stowell等人在AdvanceinCarbohydrateChemistryandBiochemistry[37(1980)P225+]中介紹了該類型的連接化學方法。通過還原性末端糖化物的游離異頭碳，可以將低聚糖部分直接連接(即Y是化學鍵)于多價載體上。另一方面，通過Smith等人在ComplexCarbohydratesPartC，MethodsinEnzymology[VolumeL，EdbyV1Ginsburg(1978)，P169-171]中介紹的苯乙胺-異硫氰酸鹽衍生物可以連接還原性末端糖化物。優選所述的式I低聚糖在水中保持可溶性。然而將式I低聚糖以適合的載體中的懸浮液形式給藥也是可能的。通過對需用藥的患者給予粘合抑制有效劑量的式I低聚糖可完成抑制細菌移生的方法。用藥方法取決于輸送低聚糖所要求的部位。例如治療呼吸道感染，優選以氣霧劑形式，將低聚糖給藥于鼻咽、肺或支氣管。治療中耳炎，優選以滴劑方式將低聚糖給藥于鼻咽。治療結膜炎，優選以像滴眼劑或眼藥膏劑方式將低聚糖給藥于結膜組織。適當的組合物可以采取溶液劑、懸浮劑或適合感染部位給藥(尤其是肺、支氣管、鼻咽或中耳)的任何可接受用藥的方式。也可以以氣霧干粉末方式將低聚糖給藥于肺部和支氣管。藥用組合物通常是根據用藥途徑，使用標準組成方式，以選取適當載體的混合物形式用藥。在技術上加入慣用的任何稀釋劑制備溶液劑或懸浮劑。例如，合適的稀釋劑包括水〔抑菌的、無菌和/或無熱原〕、乙醇、丙二醇、聚氧化乙烯、山梨糖醇和山梨糖醇酐酯。可將氯化鈉、葡萄糖或甘油以適當的數量摻入該液體制劑中，以制備等滲溶液。所述的式I低聚糖也可以與對選自肺炎雙球菌、流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、洋蔥假單胞菌和其混合物的細菌有抗菌活性的抗生素聯合用藥。抗生素的合適類型的實例有氨基糖甙類、amphenicols類、利福霉素類、像碳青霉烯類、頭孢菌素類、頭霉素類、單菌霉素類、氧頭孢烯和青霉素類的β-內酰胺類、lincosamides、大環內酯類、多肽類、四環素類。2，4-二氨基嘧啶類、硝基呋喃類、喹諾酮類、氨苯磺胺類、砜類、β-內酰胺酶抑制劑和像多烯類的抗真菌類抗生素。合適的抗生素化合物的特定實例包括(但不僅限于此)甲硝噠唑、四環素、鉍、紅霉素、氨苯磺胺、青霉素、頭孢菌素、羥氨芐青霉素、環絲氨酸、磷霉素、萬古霉素、桿菌肽、多粘菌素類、絲裂霉素、新生霉素、放線菌素、利福霉素、氯潔霉素、林可霉素、異煙肼、氟胞嘧啶、氯霉素、嘌呤霉素、褐霉酸、灰黃霉素、對氨基水楊酸、三甲氧芐二氨嘧啶、亞胺硫霉素。合適的抗生素也包括默克索引第十一版所收載的抗生素化合物，尤其是列在THER-9、THER-10和THER-13頁上的，其全部內容在此結合到本發明中作為參考。與本發明低聚糖聯合使用的抗生素用量大約與其已知的治療用藥量相同。因此通過常規試驗可確定抗生素的有效劑量。所述治療的組合物也可以進一步包含常用的助溶劑，緩沖劑、解痛劑、技術防腐劑，和可任選著色劑、香味劑、調味劑、甜味劑以及在技術已知的其它可作藥用的活性試劑。所述的藥用組合物的優選組成方式是提供等滲溶液。該組合物的pH優選在6-8，優選為6.8-7.7，更優選為生理pH。一般講，合適的患者是人類。然而本方法也適用于動物的治療，包括(但不僅限于此)像豬類、牛類、馬類、綿羊、山羊、狗類、貓類、嚙齒動物和非人的靈長目動物。根據本發明的優選實施例，含有低聚糖的藥用組合物以氣霧劑給藥于所需要治療的患者，以抑制粘合或消除來自病人的喉、結膜、肺或支氣管道的選自肺炎雙球菌、流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌和其混合物細菌的移生。對于氣霧劑給藥而言，優選以良好的分散形式與表面活性劑和拋射劑一道提供式I低聚糖化合物。所述的式I低聚糖的一般用量大約是0.5-30％(重量)，優選為1-10％(重量)。所述的表面活性劑應是無毒并優選溶于拋射劑中。該表面活性劑的代表性試劑是含有6-22個碳原子的脂肪酸(如己酸、辛酸、十二酸、十六酸、十八酸、亞油酸、亞麻酸、olesteric和油酸)與脂族多元醇或它的環酐(例如像乙二醇、甘油、赤蘚醇、阿糖醇、甘露醇、山梨糖醇、由山梨糖醇衍生的己糖醇酐)形成的酯或部分酯化物，和這些酯化物的聚氧化乙烯和聚氧化丙烯衍生物。可以使用像混合的或天然甘油酯的混合酯。所述的表面活性劑占組合物的約0.1-約20％(重量)，優選為約0.25-約5％。組合物的配物一般是拋射劑。液態的拋射劑一般在常態下為氣體，在壓力下凝聚成液態。合適的液態拋射劑一般是含多至5個碳原子的較低級烷烴如丁烷和丙烷；和優選像R-11的氟化的或氟氯化的烷烴。也可以使用上述的混合物。在制備氣霧劑中，配有適當氣閥的容器充有包含分散的化合物和表面活性劑的適當拋射劑。將該組分保持在高壓下直到經閥門的作用而釋放。就作為氣霧劑給藥而言，通過對于藥物傳遞領域的普通技術人員熟知的常用的方法，制備該氣霧劑。當以單價形式的氣霧劑給藥治療呼吸道感染時，組成的組合物提供的粘液膜中濃度為0.0001-20mg/ml，優選0.01-10mg/ml。當作為多價分子用藥治療呼吸道感染時，用含有式I低聚糖的藥用組合物的氣霧劑給藥以達到粘液膜中濃度為0.00001-2mg/ml，優選0.001-1mg/ml。根據本發明的另一實施例，經鼻咽對需要治療病人的耳部給予含低聚糖的藥用組合物，以便抑制粘合，或消除來自病人中耳的選自肺炎雙球菌、流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、洋蔥假單胞菌和其混合物的細菌的移生。需要治療的患者一般診斷為中耳炎。該給藥模式就是對感染部位給予粘合抑制有效劑量的式I低聚糖。最一般的方式為將含有式I的低聚糖的滴鼻劑或噴霧劑經鼻咽對耳部給藥。式I低聚糖也可以以口腔洗液的形式給藥，其中所述的低聚糖通過嗽口和反復洗嗽的作用對感染部位用藥。當對耳部用藥時，合適的方式是用無毒可藥用的稀釋劑或溶劑制備成液體溶液劑或懸浮劑，例如像在1，3-丁二醇中的溶液劑。可使用作為載體和溶劑的是水、Ringer’s溶液和氯化鈉等滲溶液。此外，通常使用無菌非揮發油作為溶劑或懸浮介質。為此，可使用任何溫和的非揮發性油，包括合成的單或雙甘油酯。此外，在可注射的制劑中可較好地使用像油酸的脂肪酸。當以單價形式對耳部給藥治療中耳炎時，所組成的組合物在感染部位提供的濃度為0.0001-20mg/ml，優選0.01-10mg/ml。當以多價分子用藥治療中耳炎時，所組成的組合物在感染部位提供的濃度為0.00001-2mg/ml，優選0.001-1mg/ml。根據本發明的另一實施例，對需要治療的病人眼部給予含低聚糖的藥用組合物，以抑制粘合或消除來自病人眼部的選自肺炎雙球菌、流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、洋菌假單胞菌和其混合物的細菌的移生。需要治療的患者一般診斷為結膜炎。當對眼部用藥時，合適的形式是用無毒可藥用的稀釋劑或溶劑制備成的液體溶液劑或懸浮液劑，例如像眼用鹽溶液。當以單價形式對眼部用藥治療結膜炎時，所組成的組合物在感染部位提供的濃度為0.0001-20mg/ml，優選0.01-10mg/ml。當以多價分子的用藥治療結膜炎時，所組成的組合物在感染部位提供的濃度為0.00001-2mg/ml，優選0.001-1mg/ml。通過至少一日一次給藥達到上述劑量，優選一日兩次，更優選一日三次和最優選一日四次給藥。本發明也可用于在需要的患者身上預防肺炎雙球菌、流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、洋蔥假單胞菌的細菌感染。盡管在所有對細菌感染無癥狀的病人身上防止細菌感染一般是合乎需要的，然而有特定的人群，對其而言，細菌感染結果能產生不可接受的細菌感染的風險。特別對于兒童、老年人或免疫受損的人的細菌感染結果尤其嚴重。因此，可以將式I低聚糖以足夠預防細菌感染的劑量給藥于需要預防選自肺炎雙球菌、流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、洋蔥假單胞菌的細菌感染的病人。為預防呼吸道的細菌感染，一般以單價形式給予式I低聚糖以提供粘液膜中的濃度為0.0001-20mg/ml，優選0.01-10mg/ml。至少一日一次，優選一日兩次用藥，以達到預防劑量。當為預防呼吸道感染，以多價分子用藥時，給予含有式I低聚糖的氣霧劑藥用組合物，以達到粘液膜中濃度為0.00001-2mg/ml，優選0.001-1mg/ml。當為預防中耳炎，經鼻咽對耳部給藥時，以單價形式組成的組合物提供在耳膜中的濃度為0.0001-20mg/ml，優選0.01-10mg/ml。當為預防中耳炎，以多價分子形式經鼻咽對耳部給藥時，包括式I低聚糖的治療中耳炎的用藥在耳膜中的濃度達0.00001-2mg/ml，優選0.001-1mg/ml。用于抑制細菌感染的本發明藥用組合物的組成基本上如上所述。式I低聚糖的量將根據用藥的方式而變化，基于將粘合抑制的有效量傳遞到感染部位所必需的用量。總而言之，所述藥物含低聚糖的濃度在單價形式時為約0.01-2000mg/ml，優選1-1000mg/ml，而在多價形式時為約0.001-200mg/ml，優選0.1-100mg/ml。本發明的其它特征將在下面描述實施例過程中表現出來，對發明給予說明且并不限于其實施例。在全部實施例中使用下列縮寫LSTcNeuAcα2-6-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcLNnTGalβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcLSTd(3′LSTc)NeuAcα2-3-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcGalNAcβ1-3LNnTGalNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcHSA人血清白蛋白實施例1NeuAcα2-6-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc的合成使乳糖與UDP-N-乙酰葡萄糖胺和β-半乳糖甙β1-3N-乙酰葡萄糖胺基轉移酶(在37℃，在0.1MHEPS緩沖水溶液中從豬血清提取而得)接觸。然后，使所得三糖產物與UDP-Gal和β-N-乙酰葡萄糖氨基甙β1-4半乳糖基轉移酶(在37℃，在0.1MHEPS緩沖水溶液中從牛奶中分離而得)接觸。然后，使所得的四糖產物與CMP-NAN和β-半乳糖甙α2-6唾液酰基轉移酶(在37℃，在0.1MHEPES緩沖水溶液中從鼠肝分離而得)接觸。用常規方法分離得到的目的五糖產品。實施例2使用類似Rostand，K，和Esko，[(1993)J.Biol.Chem.268pp24053-3，]研究對CHO細胞放射性同性素標記綠膿桿菌的粘合方法的類似方法，試驗低聚糖化合物的粘合抑制作用。對在此所述的研究而言，是在含有3H-賴氨酸的賴氨酸缺乏tryptic大豆液體培養基中培養標記肺炎雙球菌(菌株R-6、P70和其它臨床呼吸道分離菌株)。用來自大腸桿菌的賴氨酸脫羧酶預處理tryptic大豆液體培養基則得到賴氨酸缺乏型的該液體培養基，培養所述細菌4-5小時，此時培養物成指數增長。收集并在補充0.2％低內毒素的牛血清白蛋白LeibovitzL-15培養基中沖洗所述細菌。將該菌稀釋至約3×108/ml，然后與L-15-BSA或與待試驗的各種化合物以1∶1混合。將該細菌混合物置搖瓶機上輕微搖動進行室溫培養。10-15分鐘后，將細菌混合物的樣品轉移到96-穴的聚苯乙烯平板中的融合單層的培養上皮細胞表面上。最常用的細胞是Chang結膜的Wong-Kilbourne衍生物。也使用人鼻咽細胞系Detroit562，和人肺細胞系A549。在室溫輕搖下用所述細胞培養細菌30分鐘。用含有0.2％的牛血清白蛋白的PBS洗去未粘合的細菌。往各穴中加入閃爍體溶液，和將該平板置于微片閃爍計數器中測定粘合細菌的數量。用相同方法進行流感嗜血桿菌對上皮細胞粘連操作，其改動之處為所述的細菌在賴氨酸缺乏的嗜血桿菌試驗培養基上培養過夜。在近107/ml的濃度下用所述細胞培養細菌60分鐘。IC50(mM)LSTcLSTc-HSA3Det-562和FaDu鼻咽癌CaLu-3和A4591肺癌10lung鼠氣管初級上皮HUVEC2人臍靜脈內皮細胞1用IL1α激活細胞2用TNFα或凝血酶激活細胞3LSTc粘合人血清白蛋白主鏈；低聚糖prot的摩爾比＝20∶1。給定低聚糖的摩爾濃度。抑制肺炎雙球菌對呼吸道上皮細胞的粘連IC50(mM)[均值(SD)]單價</tables>多價4</tables>1.Detroit-562和FaDu人鼻咽癌GaLu-3和A549人肺癌HUVEC人臍靜脈內皮細胞(初級)鼠氣管上皮單層(初級)Chang人結膜癌2.用IL1α激活3.用TNFα或凝血酶激活4.人血清白蛋白主鏈低聚糖port的摩爾比＝20∶1。給定低聚糖的摩爾濃度。實施例3LSTc和LNnT的體內試驗兔子將肺炎雙球菌株AII與低聚糖混合，并用氣管滴注法給予新西蘭白兔，用Saukkonen等人(1991，J.Exp.Med，1731143-9)所介紹的方法在指示時間計數肺洗出菌落數。在粘連抑制劑低聚糖的存在下兔肺的肺炎雙球菌的移生</tables>*在第四天洗肺和將洗液定量涂在血瓊脂上以便計數每毫升洗液中的細菌菌落。2只兔為一組。**給予該高的接種物的鹽水對照動物病得非常嚴重，肺部具有大量移生菌。一只兔子患菌血癥(104CFU/ml血)。經低聚糖治療的動物在整個試驗中均為健康。實施例4用使粘連逆轉的低聚糖治療兔肺炎雙球菌的預移生用氣管滴注法將肺炎雙球菌株AII給予新西蘭白兔。24小時所有兔子生病并伴有肺炎癥狀。24小時后，通過氣管內給予低聚糖(LNnT)或對照物(鹽水)。再過24小時后，按實施例3所述計數洗肺菌落數。</tables>在48小時，LNnT處理的兔子是健康的，反之鹽水處理的對照兔子生病伴有肺出血、充血。實施例5鼠將新生Sprague-Dawley鼠鼻內接種20μl鹽水中的106肺炎雙球菌株SIII。在指示時間灌洗鼻腔，經連續稀釋，涂于血瓊脂上，測定菌落數。在粘連抑制劑低聚糖的存在下鼠鼻咽的肺炎雙球菌的移生</tables>*在指示時間，灌洗鼻腔并測定每毫升洗液中的CFU數目。實施例6使用實施例2中介紹的試驗方法，用不同的低聚物化合物試驗四株細菌的粘連抑制。抑制其它致病菌對呼吸道上皮細胞的粘連IC50(mM)[均值(SD)]</tables>*試驗的最高濃度為10-15mM的單價低聚糖和0.2-0.25mM的多價低聚糖，給定其碳水化合物的摩爾濃度。實施例7將含有500mg的NeuAcα2-6-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc、100ml無菌水和10ml的丙二醇的10ml等滲藥用組合物以氣霧劑形式給藥于診斷患有肺炎的病人。一日治療三次，每隔8小時給藥一次直至細菌感染已消除為止。實施例8將含有1000mg的NeuAcα2-6-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc和100ml的1，3-丁二醇的5滴藥用組合物以滴鼻劑或鼻噴霧劑形式給藥于診斷患中耳炎病人的鼻咽中。一日治療兩次，每12小時給藥一次，直至已消除細菌感染為止。實施例9將含有800mg的NeuAcα2-6-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc和100ml的等滲鹽溶液的5滴滴眼溶液以滴眼劑的形式給藥于診斷患有結膜炎的病人眼中。一日治療4次，每隔6小時給藥一次，直至已消除細菌感染為止。實施例10將含有500mg的GalNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc、100ml的無菌水和100ml丙二醇的10ml的等滲藥用組合物以氣霧劑形式給藥于診斷患有肺炎的病人。一日治療三次，每隔8小時給藥一次，直至已消除細菌感染為止。實施例11將含有500mg的NeuAcα2-6-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc、100ml的無菌水和10ml丙二醇的10ml的等滲藥用組合物以氣霧劑形式給藥于診斷患有肺炎的病人。一日治療三次，每隔8小時給藥一次，直至已消除細菌感染為止。實施例12將含有200mg的NeuAcα2-6-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc-HSA(20∶1的低聚糖prot的比例)、100ml的無菌水和10ml的丙二醇的10ml的等滲藥用組合物以氣霧劑形式給藥于診斷患有肺炎的病人。一日治療三次，每隔12小時給藥一次，直至已消除細菌感染為止。顯然，按照上述的技術有可能對本發明做修改和改動。因此，在附帶的權利要求范疇之內，除在此特別描述的方法之外實施本發明是可以理解的。權利要求1.通過給予粘合抑制有效量的式I化合物，抑制選自肺炎雙球菌、流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、洋蔥假單胞菌和其混合物的細菌移生的方法，其中R1是H，(β-1)GalNAc-，SO3B(其中B是H或陽離子)，或式II的唾液酸；其中R6、R7、R8和R10各自獨立為H、C1-6酰基、乳酰基、C1-6烷基、硫酸酯、磷酸酯、脫水、式II的唾液酸、(α-1)Fuc、(β-1)Glc或(β-1)Gal；R9是NH-C1-6酰基、乙醇酰胺基、氨基或羥基；和A是H或陽離子；R2是H或(α-1)Fuc-；R3和R4各自獨立為OH或NHAc；R5是H、SO3B(其中B是H或陽離子)或同上述定義的式II的唾液酸；和Y是化學鍵或是連接基團；Z是H或多價載體；m是0或1；和p是1-1000的整數。2.權利要求1的方法，其中所述的患者受選自肺炎雙球菌、流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、洋蔥假單胞菌和其混合物的細菌感染。3.權利要求2的方法，其中所述的患者患有支氣管炎。4.權利要求2的方法，其中所述的患者患有肺炎。5.權利要求1的方法，其中所述的患者患有中耳炎。6.權利要求1的方法，其中所述的式I化合物選自NeuAcα2-6-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc，NeuAcα2-3-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc，Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc，NeuAcα2-6-Galβ1-4-[Fucα1-3]GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc，NeuAcα2-6-[GalNAcβ1-3]Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc，NeuAcα2-6-[GalNAcβ1-3]Galβ1-4-[Fucα1-3]GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc，NeuAcα2-6-Galβ1-4-GlcNAc，NeuAcα2-6-Galβ1-4-[Fucα1-3]GlcNAc，NeuAcα2-6-[GalNAcβ1-3]Galβ1-4-GlcNAc，NeuAcα2-6-[GalNAcβ1-3]Galβ1-4-[Fucα1-3]GlcNAc，GalNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc，GalNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAc，GalNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc，NeuAcα2-3-Galβ1-4-GlcNAc，NeuAcα2-6-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAc，NeuAcα2-3-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAc，Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAc，NeuAcα2-6-Galβ1-4-[Fucα1-3]GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAc，NeuAcα2-6-[GalNAcβ1-3]Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAc，NeuAcα2-6-[GalNAcβ1-3]Galβ1-4-[Fucα1-3]GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAc，GalNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAc，GalNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAc，和其混合物。7.權利要求1的方法，其中所述的式I化合物具有下式其中Y是化學鍵或是連接基團；Z是H或多價載體；和p是1-1000的整數。8.權利要求7的方法，其中Y是化學鍵，Z是H和p是1。9.通過給予粘合抑制有效量的式I化合物，抑制選自肺炎雙球菌、流感嗜血桿菌，副流感嗜血桿菌、洋蔥假單胞菌和其混合物的細菌移生的藥用組合物，其中R1是H，(β-1)GalNAc-，SO3B(其中B是H或陽離子)，或式II唾液酸；其中R6、R7、R8和R10各自獨立為H、C1-6酰基、乳酰基、C1-6烷基、硫酸酯、磷酸酯、脫水、式II的唾液酸、(α-1)Fuc、(β-1)Glc或(β-1)Gal；R9是NH-C1-6酰基、乙醇酰胺基、氨基或羥基；和A是H或陽離子；R2是H或(α-1)Fuc-；R3和R4各自獨立為OH或NHAc；R5是H、SO3B(其中B是H或陽離子)或同上述定義的式II的唾液酸；和Y是化學鍵或連接基團；Z是H或多價載體；m是0或1；和p是1-1000的整數。其中當R5是H時，R1不是H和當R1是唾液酸時，R2不是(α-)Fuc。10.權利要求9的組合物，其中所述的式I化合物選自NeuAcα2-6-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc，NeuAcα2-3-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc，NeuAcα2-6-Galβ1-4-[Fucα1-3]GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc，NeuAcα2-6-[GalNAcβ1-3]Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc，NeuAcα2-6-[GalNAcβ1-3]Galβ1-4-[Fucα1-3]GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc，NeuAcα2-6-Galβ1-4-GlcNAc，NeuAcα2-6-Galβ1-4-[Fucα1-3]GlcNAc，NeuAcα2-6-[GalNAcβ1-3]Galβ1-4-GlcNAc，NeuAcα2-6-[GalNAcβ1-3]Galβ1-4-[Fucα1-3]GlcNAc，GalNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc，GalNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAc，GalNAcβ1-3-Galβ1-4-Glc，NeuAcα2-3-Galβ1-4-GlcNAc，NeuAcα2-6-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAc，NeuAcα2-3-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAc，Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAc，NeuAcα2-6-Galβ1-4-[Fucα1-3]GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAc，NeuAcα2-6-[GalNAcβ1-3]Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAc，NeuAcα2-6-[GalNAcβ1-3]Galβ1-4-[Fucα1-3]GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAc，GalNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAc，GalNAcβ1-3-Galβ1-4-GlcNAc，和其混合物。11.權利要求9的藥用組合物，其中所述的組合物是像氣霧劑的合適給藥形式。全文摘要本發明涉及通過給予粘合抑制有效量的式Ⅰ化合物,治療選自肺炎雙球菌、流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、洋蔥假單胞菌和其混合物的細菌引起的呼吸道感染的方法。文檔編號A61K31/7012GK1192687SQ96196047公開日1998年9月9日申請日期1996年6月3日優先權日1995年6月7日發明者P·M·西蒙,D·措普夫,R·A·巴塞爾森,K·F·約翰遜申請人:尼奧斯技術公司