新的得自蘇云金芽孢桿菌蘇云金變種的抗增殖蛋白的制作方法

專利名稱：新的得自蘇云金芽孢桿菌蘇云金變種的抗增殖蛋白的制作方法
發明
背景技術：
領域本發明主要涉及免疫學和蛋白質化學領域。更具體地說，本發明涉及從蘇云金芽孢桿菌蘇云金變種中分離、純化和鑒定一種新的抗增殖蛋白。
相關技術選擇性地對腫瘤細胞表現出抗增殖特性的藥劑具有成為抗癌藥物的潛力。人們一直在從合成和天然兩種來源尋找著這類藥劑。這類具有抗增殖特性的化合物就其性質而言可能是蛋白質，也可能是非蛋白質類的。
已知，革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都能合成對真核細胞具有毒性的蛋白質。蘇云金芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性菌，在其芽孢形成過程中可合成大量蛋白質，該蛋白質在被昆蟲攝入后可將其殺死(Hofte和Whiteley，1989)。30多年來，這種蛋白質一直被用作微生物殺蟲劑，而且被認為對人無害(Green等，1990)。這類殺蟲蛋白在細菌內組裝成伴孢晶體，有三種不同的大小133-145kDa；65-67kDa和27kDa。不同的蘇云金芽孢桿菌亞種可能表達三類大小中的一種或多種。133-145kDa的蛋白質是一種熱毒素，在被中腸胃道蛋白酶降解時生成保留毒性部分的約67kDa的氨基末端片段(Ogiwara等，1992)。67kDa的毒素與其它蘇云金芽孢桿菌亞種的毒素具有一重要的結構同源性。但是，27kDa的毒素與任何其它大小的毒素沒有同源性，但在亞種內具有高度同源性(Luthy等，1982)。已對以色列亞種(Bacillus thuringiensis israeliensis)、kyushunsis亞種(Bacillusthuringiensis kyushunsis)和morrisoni亞種(Bacillus thuringiensis morrisoni)的27kDa毒素的基因進行了克隆，而且發現，蘇云金芽孢桿菌以色列亞種的毒素與蘇云金芽孢桿菌morrisoni亞種的毒素僅相差一個堿基；但與蘇云金芽孢桿菌kyushunsis亞種毒素的一致性只有39％(Waalwijk等，1985；Ward和Ellar，1986；Galjart等，1987；Koni和Ellar，1993)。許多亞種的毒素已被證明對培養中的昆蟲細胞具有溶胞性。
約20年前，有報道稱得自蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種的毒素在體內具有對某些鼠腫瘤，例如Yoshida腹水瘤的抗腫瘤活性。然后，得自蘇云金芽孢桿菌以色列亞種的某種毒素也被證明在體外具有抗某類鼠腫瘤細胞的的抗腫瘤活性。根據后繼腫瘤移植注射判斷，蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種蛋白加強了大鼠和豚鼠的體液免疫系統，由此誘導持久的抗腫瘤免疫。但是這種抗腫瘤蛋白的結構特征，以及其功能是否與上述許多其它亞種的殺蟲性毒素相關，是未知的。
現有技術中缺少一種有效抑制多種腫瘤生長的手段。本發明滿足了本領域中長期以來的這一需求。
發明概述本發明描述了從革蘭氏陽性菌蘇云金芽孢桿菌蘇云金變種中分離和鑒定一種被稱為癌毒素的蛋白質。對癌毒素的鑒定在一定程度上是以其對人組織細胞淋巴瘤U-937細胞的抗增殖活性為基礎的。使用這種分析法，可以通過溴化鈉差速梯度超速離心、蛋白酶消化，再經DEAE親和膠藍色親和性色譜來分離癌毒素。癌毒素活性使之與DEAE親和膠藍樹脂結合，并可用0.05M NaCl洗脫。在變性條件下，其分子量約為20kDa。
純化蛋白的生物活性對包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和鏈霉蛋白酶在內的多種蛋白酶敏感，對酸性條件(pH4以下)敏感，對三氟乙酸(0.1％)和乙腈(50％)敏感。但是，癌毒素活性能夠耐受高溫(100℃，30分鐘)和還原性條件(1毫摩爾濃度(mM)二硫蘇糖醇)。該蛋白質的氨基端氨基酸序列包括NH2-Pro-Ser-Thr-Val-Val-Asn-Val-Ser-Asn-Leu-Lys-Pro-Gly-Asp-Thr-Ile-Glu-Lys-Glu-Phe-。與已公開的其它蛋白質序列相比，該序列具有獨特性。以該序列為基礎的合成肽被用于在兔體內制備多克隆抗體，這些抗體在抗血清的濃度即使為1∶10,000時，仍完全中和了癌毒素的生物活性。利用這些抗體的Western印跡分析也顯示一條20kDa癌毒素的條帶。
除了胸苷摻入法之外，臺盼藍排阻和MTT法也證明了高度純化的癌毒素對U-937細胞長期生長的完全抑制作用。該癌毒素對許多不同的腫瘤細胞系表現出抗增殖作用，其中包括髓細胞系(U-937，THP-1，H1-60)，淋巴細胞系(Raji，Jurkat)，成紅細胞系(K-562)，乳腺癌細胞系(CLO，MCF-7)，卵巢癌細胞系(OVCA429，OVCA432，OVCA433)，腎細胞系(A-293)和肝癌細胞系(Hep3B，HepG2)。但是，在相似條件下，人成膠質細胞瘤(U-251)和鼠纖維瘤(L-929)對癌毒素具有耐受性。正常的人二倍體包皮成纖維細胞和正常的人外周血淋巴細胞也對高達100微克/毫升(μg/ml)的癌毒素具有耐受性。用癌毒素處理U-937細胞24小時后，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，造成了DNA的斷裂，這表明癌毒素令細胞致死的機制很可能是通過細胞凋亡。總之，本發明證明分離到一種新的細菌蛋白，它對許多腫瘤細胞具有抗增殖作用。
在本發明實施方式之一中，提供了一種組合物，其中包含分離和純化自蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種的蛋白質，該蛋白質的分子量經SDS-PAGE測定約為20kDa，所述的蛋白具有部分SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，而且，所述蛋白表現出抗腫瘤細胞的細胞毒性。
在本發明實施方式之二中，提供了一種藥物組合物，其中包含本發明的新蛋白質和藥學上認可的載體。
在本發明實施方式之三中，提供了一種制備本發明蛋白質的方法。
在本發明的另一實施方式中，提供了一種處理腫瘤細胞的方法，其中包括對所述細胞使用治療有效量的本發明組合物。
通過以下對優選實施方式的描述，本發明的其它方面內容、特點和優點將是顯而易見的，這些描述僅以說明為目的。


為了便于達到和具體理解本發明的上述特點、優點、目的及其它，將參照某些實施例來更具體地說明以上概述的本發明，附圖對這些實施方式進行了說明。這些附圖是本發明的一部分。但是，需要指出的是，附圖表示本發明的優選實施方式，因而不應被理解成對其范圍的限定。
圖1顯示對癌毒素的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠分析。如后文所述，1微克癌毒素在15％的丙烯酰胺凝膠上分離。
圖2對癌毒素氨基末端氨基酸序列的分析。
圖3A顯示利用Western印跡分析來檢測癌毒素。圖3B顯示抗合成癌毒素肽抗體對癌毒素生物活性的中和作用。
圖4顯示癌毒素與以其氨基酸序列為基礎的合成肽的作用的比較。
圖5顯示多種蛋白酶對癌毒素生物活性的作用。
圖6顯示pH(圖6A)和有機溶劑(圖6B)對癌毒素生物活性的作用。
圖7顯示對癌毒素的生物測定。在96孔微滴板中將5×103細胞(0.2ml)與癌毒素一起在37℃孵育72小時，然后以后文所述的含氚胸苷摻入法測定細胞活性。所有測定均一式三份。
圖8顯示癌毒素對不同髓細胞系的劑量依賴性作用。
圖9A顯示癌毒素對不同淋巴細胞系的劑量依賴性作用。
圖9B顯示癌毒素對成紅細胞系的劑量依賴性作用。
圖10顯示癌毒素對不同乳腺癌細胞系的劑量依賴性作用。
圖11顯示癌毒素對不同卵巢癌細胞系的劑量依賴性作用。
圖12顯示癌毒素對不同肝癌細胞系的劑量依賴性作用。
圖13顯示癌毒素對人胚腎細胞系的劑量依賴性作用。
圖14顯示癌毒素對人成膠質細胞瘤細胞的劑量依賴性作用。
圖15顯示癌毒素對鼠纖維肉瘤的劑量依賴性作用。
圖16顯示經臺盼藍排阻法(圖16A)和MTT法(圖16B)測定，癌毒素對人組織細胞淋巴瘤U-937細胞生長的劑量依賴性作用。
圖17顯示癌毒素對正常二倍體人成纖維細胞(圖17A)和對正常人外周血淋巴細胞(圖17B)的劑量依賴性作用。
圖18顯示癌毒素對U-937細胞DAN斷裂的劑量依賴性作用。
圖19顯示與得自蘇云金芽孢桿菌庫氏亞種(Bacillus thuringiensis Kurstaki)的Cry IIA毒素的癌毒素活性比較。
本發明的詳細說明本發明涉及包含分離和純化自蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種的蛋白質的組合物，該蛋白質的分子量經SDS-PAGE測定約為20千道爾頓(kDa)，所述的蛋白具有部分SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，而且，所述蛋白表現出抗腫瘤細胞的細胞毒性。如后文所述，該新的蛋白對蛋白酶和酸性條件敏感，而且其細胞毒性能夠耐受二硫蘇糖醇和100℃的處理。
雖然本發明的新的蛋白質對許多腫瘤細胞具有細胞毒性，但是主要對U-937細胞、髓細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞、成紅細胞、乳腺癌細胞、卵巢癌細胞和肝癌細胞有細胞毒性。該蛋白對正常人細胞無細胞毒性，例如外周血淋巴細胞和人包皮成纖維細胞。該細胞毒性受抗該蛋白抗體的抑制。
我們特別考慮到，可以用本發明的新的蛋白質制備藥物組合物。此時，藥物組合物中包含本發明的新的蛋白質和藥學上認可的載體。無需過多的實驗，本領域一般技術人員就可確定本發明新蛋白質的合適劑量和給藥途徑。
當在體內用于治療時，給病人或動物使用的本發明蛋白質需是治療有效量的，即消除或縮小腫瘤的量。通常采用非腸胃給藥，以靜脈給藥為佳，但其它給藥途徑也適用。劑量和劑量方案將取決于癌癥的性質(初期，還是已轉移)及其數量，具體的免疫毒素的特征例如其治療指數、病人、病人的病史，以及其它因素。蛋白質的給藥量通常在約0.1至約10毫克/千克病人體重。療程將持續至獲得最佳療效，但需權衡治療的副作用。參見《雷明頓藥物科學》(Remington’sPharmaceutical Science)，第17版(1990)，Mark Publishing Co.，Easton，Penn；和Goodman和Gilman's《治療學的藥理學基礎》(The Pharmacological Basis ofTherapeutics)，第8版(1990)Pergamon Press；以上文獻均在此引用參考。
為了用于非腸胃給藥，通常將該蛋白與藥學上認可的非腸胃用媒質一起配制成可注射形式(溶液、懸浮液、乳液)單位劑量。這類媒質最好是無毒性和非治療性的。這類媒質的實例為水、生理鹽水、Ringer溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。也可以使用非水性媒質，例如混合油和油酸乙酯。也可使用脂質體作為載體。媒質中可含有微量的添加劑，例如加強等滲性和化學穩定性的物質，例如緩沖液和防腐劑。配制在這種媒質中的免疫毒素的濃度通常約為0.1mg/ml至10mg/ml。
近年來，本領域一般技術人員的分子生物學水平顯著提高。根據本說明書，本領域一般技術人員就能夠進行該新的細胞毒性蛋白基因的克隆。
本發明還涉及一種處理腫瘤細胞的方法，它包括對所述細胞使用治療有效量的本發明組合物。較好的是，腫瘤細胞選自髓細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞、成紅細胞、乳腺癌細胞、卵巢癌細胞和肝癌細胞。通常，腫瘤細胞是人或動物體內的。特別考慮到的是，新的組合物將抑制腫瘤病情的復發，延長所述腫瘤細胞的宿主的存活時間。
本發明的蛋白質還可以用在體外方法中。例如，該方法可被用于殺死取白骨髓的腫瘤細胞。在該方法中，先從患有腫瘤疾病的個體中取出骨髓。然后，用殺死細胞有效量的本發明蛋白處理骨髓，以消滅殘留的腫瘤細胞。可以將處理后的骨髓細胞回輸給病人，以在為了消除所有內源性腫瘤血液毒性細胞而接受強烈化療和/或放療之后促進免疫系統的重建。
以下實施例是為了說明本發明的各種實施方式，而不是對本發明任何形式的限定。
實施例1材料RPMI-1640由Whittaker MA Bioproducts(Walkersville，MD)提供。胎牛血清(FBS)和慶大霉素由GIBCO(Grand Island，NY)提供。其它化學試劑和生物化學試劑由Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)提供。U-937(組織細胞淋巴瘤，CRL1593)，前髓細胞性白血病HL-60(CCL 240)；急性骨髓性白血病KG-1a(CCL246.1)；乳腺癌MCF-7(HTB 22)；上皮癌HepG-2(CCL 23)；乳腺癌BT-20(HTB19)；Burkitt淋巴癌Raji(CCL 86)；和Jurkat(急性T細胞白血病，TIB 152)細胞系由美國典型培養物保藏中心(Rockville，MD)提供。細胞常規培養在補充了谷胺酰胺(2mM)，慶大霉素(50mM)和胎牛血清(10％)的RPMI 1640培養基中。利用重組DNA方法獲得的蘇云金芽孢桿菌庫氏亞種的毒素由Ecogen Inc.(Langhorne，PA)的William P.Donovan博士提供。
實施例2癌毒素的生物測定通過癌毒素在人組織細胞淋巴瘤U-937細胞內，在72小時內抑制胸苷摻入的能力檢測其生物活性。根據已有文獻的記載進行該項測定(Higuchi和Aggarwal，1992)。簡而言之，將細胞(5×103/0.1ml)平板培養在96孔Falcon板上。將癌毒素的連續稀釋液加入靶細胞，在37℃培養72小時。在72小時培養的最后6小時中，在各孔中加入(0.5m Ci/孔)含氚胸苷(6.7居里/毫摩爾(Ci/mmole)；New EnglandNuclear，Boston，MA)。然后，用Packard Filtermate 196細胞收獲儀將細胞懸浮液收獲在玻璃纖維濾膜上，并在Packard Matrix 9600直接β計數儀(Packard Co.，Meriden，CT)中測定與濾膜結合的放射性。將處理后細胞內的摻入量除以非處理細胞中的量，計算出相對細胞活性，并將其表示為百分比。
利用修改過的四唑氮鹽法(MTT)(Hansen等，1989)測定U-937細胞的生長。簡而言之，在0.1ml的最終體積中，在有或無不同濃度癌毒素存在下，將細胞(5000細胞/孔)在37℃培養不同的天數。然后在各孔中加入0.025ml MTT溶液(5mg/ml的PBS溶液)。在37℃培養2小時后，加入0.1ml提取緩沖液(20％十二烷基硫酸鈉，50％二甲基甲酰胺)。在37℃培養過夜后，用96孔復式掃描自動讀數儀(Dynatech MR 5000)測定570納米(nm)處的光密度，以提取緩沖液為空白。
實施例3微生物和生長條件蘇云金芽孢桿菌蘇云金變種由Immunology and Virology Laboratory，Facultyof Biological Science，Autonoma University of Nuevo Leon提供。于4℃將細菌維持在營養瓊脂斜面上，根據現有技術每3個月傳代一次(Cheung和Hammock，1985)。
實施例4晶體和孢子的產生根據已有文獻的描述進行晶體和孢子的產生(Yamanoto和McLaughlin，1981；Yamamoto和Ilzuka，1983)。簡而言之，細菌在營養發酵液中于30℃振蕩培養18小時。從該培養物中取樣接種到瓊脂培養基培養燒瓶中，在30℃培養72小時，然后通過在4℃、10,000rpm離心30分鐘(Beckman)，將晶體收獲在1M NaCl中。沉淀用1M NaCl洗滌3次，保存于-20℃。
實施例5蛋白質晶體的分離利用以下溴化鈉梯度(30，31.5，33，34.5和36％)在4℃以25,000rpm的速度差速超速離心90分鐘，由此將晶體與孢子分離。將含有晶體的條帶匯集，用去離子水洗滌3次，冷凍干燥后保存于-20℃(Ang和Nickerson，1978)。
實施例6晶體的增溶此步驟按Prasad和Shethna(1974)所述進行。簡而言之，在室溫下將100毫克晶體蛋白在20毫升含1M NaOH的0.1M甘氨酸中懸浮5小時，然后離心(4℃，20,000rpm，30分鐘)。用pH7.2的磷酸鹽緩沖液透析被稱為堿溶解的晶體的上清液。將樣品冷凍干燥后于-20℃保存。
實施例7利用胰蛋白酶活化堿溶解的晶體該步驟采用Choma等(1990)所述的方法。簡而言之，用胰蛋白酶(10％；w/w)在37℃，在0.1M pH7.2的甘氨酸緩沖液中處理堿溶解的晶體(5mg/ml)30分鐘。樣品在4℃以20,000rpm的速度離心(Beckman離心機)30分鐘，然后用pH7.2的磷酸鹽緩沖液透析上清液。
實施例8DEAE-親和膠藍色親和性色譜將由以上步驟獲得的一份癌毒素(約2mg/ml)上樣在DEAE-親和膠藍色色譜柱(1×6.5厘米(cm))上，色譜柱在pH8的20mM Tris中預平衡。用平衡緩沖液洗滌色譜柱，然后用遞進梯度0.05-1.0M的NaCl洗脫。利用生物測定法來鑒定癌毒素組份，利用Biorad法測定蛋白質濃度。
實施例9DNA斷裂的分析用癌毒素(50微克/毫升(μg/ml))處理細胞(5×106/ml)24或72小時，然后離心沉淀，用PBS洗滌，重懸在10mM tris-Cl，pH7.4和1mM EDTA，pH8中。然后用裂解緩沖液(10mM tris-Cl，pH8，100mM NaCl，25mM EDTA和0.5％SDS)裂解細胞，加入RNase(1微升10mg/ml的溶液)去除RNA。在50℃培養30分鐘后，在各試管中加入1微升蛋白酶K(20mg/ml)，在50℃繼續培養30分鐘。加入0.4微升加樣染料(0.025％溴酚藍，0.25％二甲苯腈藍FF和30％甘油水溶液)之后，將樣品在有TAE緩沖液(0.04M Tris-乙酸，0.001M EDTA)的1.2％瓊脂糖中分離。
實施例10氨基酸序列分析在Baylor College of Medicine(Houston，TX)，由蛋白質測序實驗室進行癌毒素的氨基酸序列分析。蛋白質被從SDS-PAGE凝膠上轉移到PVDF膜上，然后在473A型微測序儀(Applied Biosystems Inc.，Foster City，CA)上進行序列分析。在National Center for Biotechnology Information(NCBI)，利用BLAST網絡服務進行序列同源性的研究。
實施例11肽的合成根據對癌毒素的氨基酸序列分析，由Baylor College ofMedicine(Houston，TX)的蛋白質化學核心實驗室合成了一段18個氨基酸長的肽。用Fmoc多抗原肽(MAP)樹脂來合成癌毒素肽。利用反相HPLC純化合成的肽，并測定其氨基酸組成。
實施例12抗體的產生利用以上合成的肽來制造抗體(Bethyl Laboratories，Montgomery，TX)，即用100微克抗原的完全Freund佐劑溶液(多位點)皮下免疫兔。然后在第14天和第21天，兩次肌內注射各50微克抗原的不完全Freund佐劑溶液。然后，在癌毒素生物測定中在血清中進行中和滴度的檢測，并利用Western印跡分析檢測其免疫反應性。
實施例13Western印跡分析在SDS-聚丙烯酰胺凝膠(15％)上進行蛋白質樣品的電泳。在電泳后，將樣品轉移到浸在含有Tris-HCl(25mM，pH8.3)，甘氨酸(192mM)和甲醇(20％，v/v)的緩沖液中的硝酸纖維素濾紙上。用封閉緩沖液，即含有BSA(5％)和吐溫20(Tween20)(0.1％，v/v)的PBS(PBS吐溫緩沖液)在室溫下封閉1小時，將硝酸纖維素濾紙上的非特異性結合減至最小。在用PBS吐溫緩沖液洗滌3次后，濾紙在室溫下與抗癌毒素抗體(1∶10,000稀釋液)一起孵育1小時。濾紙經再次洗滌后，與山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶結合物(1∶10,000稀釋液)一起在室溫下孵育1小時。然后，將濾紙洗滌4次，利用加強化學發光系統(Amersham)目測條帶。
實施例14癌毒素的分離及其理化性質鑒定利用U-937細胞毒性生物測定和包括梯度超速離心、蛋白酶反應和DEAE親和膠藍色親和性色譜的純化步驟，分離到一種在0.05M NaCl時從DEAE上洗脫的蛋白質。該蛋白在本文中被稱為癌毒素。在變性條件下的SDS-PAGE分析顯示，利用考馬斯藍和銀染色，都在約20kDa處具有一主條帶(圖1)。將癌毒素電印跡到PVDF膜上，然后進行氨基酸序列分析。圖2表示了由此獲得的氨基末端的序列。無論用肽還是用核苷酸序列數據庫進行檢查，癌毒素的序列都是新的。
根據該序列來合成肽，并將其用于免疫兔。由此獲得的抗癌毒素肽的抗體在Western印跡分析中與癌毒素蛋白發生交叉反應(圖3A)。該抗體即使在1比10,000的抗血清稀釋液時，仍能夠中和癌毒素的生物活性。雖然比全長蛋白質短得多，合成癌毒素仍具有一定程度的抗U-937細胞活性(圖4)。
用多種蛋白酶胰蛋白酶、、胰凝乳蛋白酶和鏈霉蛋白酶(10％，w/w)處理癌毒素24小時，蛋白質的活性被消除(圖5)。該結果表明生物活性存在于全長蛋白質中。除了蛋白酶之外，癌毒素的活性還被發現對酸性條件敏感。當癌毒素處于pH2條件下時，雖然不是全部但大部分活性被破壞(圖6A)。癌毒素的活性還被發現對三氟乙酸(0.1％)或乙腈(50％)處理敏感(圖6B)。但是，該活性能夠耐受二硫蘇糖醇(1mM，2小時)處理或在100℃處理30分鐘(數據未顯示)。
實施例15癌毒素的生物學鑒定根據胸苷摻入的測定，用癌毒素對U-937細胞處理72小時可抑制這些細胞的生長(圖7)。在癌毒素濃度為50微克/毫升時可觀察到50％的抑制作用。還在幾種其它細胞系中檢測了癌毒素的這一作用。癌毒素對以下細胞具有抑制性髓細胞(圖8)，淋巴細胞(包括B細胞和T細胞)(圖9A)，成紅細胞(圖9B)，乳腺癌細胞(圖10)，卵巢癌細胞(圖11)和肝癌細胞(圖12)。胚腎細胞對癌毒素相對具有抗性(圖13)。人成膠質細胞瘤細胞和鼠纖維瘤被發現對癌毒素具有完全耐受性(圖14和圖15)。在分析誘導50％生長抑制所需的癌毒素量時，該量根據腫瘤細胞的類型而有顯著差異(表I)。
表I癌毒素對人腫瘤細胞系生長的抑制作用細胞系[濃縮] 50％生長抑制性(微克/毫升)人巨噬細胞腫瘤細胞系組織細胞性淋巴瘤(U-937) 15急性單核細胞白血病(THP-1)32前髓細胞性白血病(HI-60) 52人肝細胞癌肝細胞癌(Hep 3B) 15肝細胞癌(Hep G2) 78人T和B淋巴細胞急性T細胞白血病(Jurkart) 25Burkitt B細胞淋巴瘤(Raji)63人乳腺癌乳腺癌(MCF-7)35乳腺癌(CLO) 90人紅白血病慢性骨髓性白血病(K-562) 80人卵巢癌卵巢癌(OVCA-429) 40卵巢癌(OVCA-432) 50卵巢癌(OVCA-433) 100人成膠質細胞瘤成膠質細胞瘤(U-251)＞100其它人轉化胚腎(A-293) ＞100鼠纖維瘤(L-929)＞100正常細胞人包皮二倍體成纖維細胞 ＞100人外周血淋巴細胞 ＞100
細胞(5×103)在96孔平板中于37℃培養72小時。在最后6小時中，用含氚胸苷對細胞進行脈沖。所有測定均重復進行三份。
除了胸苷摻入之外，還用臺盼藍排阻法和用MTT染色細胞對細胞的生長進行了檢測。圖16顯示了在有或無癌毒素條件下，利用這兩種方法獲得的U-937細胞生長曲線。這些結果也證明了癌毒素對細胞生長的完全抑制。
除了腫瘤細胞之外，還測試了幾種正常細胞對癌毒素的敏感性(圖17)。正常、新鮮的外周血淋巴細胞和人包皮成纖維細胞都被發現對即使是100微克/毫升的癌毒素具有耐受性。該結果表明癌毒素只對腫瘤細胞具有抑制性。
從形態學上說，有兩種類型的細胞死亡，細胞凋亡的特征為DNA的斷裂、膜的分解和染色體的縮聚，而壞死性細胞死亡則涉及線粒體的膨脹。對U-937細胞的癌毒素處理造成DAN斷裂(圖18)，由此表明細胞死亡是通過細胞凋亡。
還將癌毒素的活性與分離自蘇云金芽孢桿菌其它亞種的毒素進行了比較。人們已經對得自蘇云金芽孢桿菌庫氏變種的毒素的cDNA進行了克隆。由其推斷的氨基酸序列與癌毒素的不同。利用重組DNA技術制得的蘇云金芽孢桿菌庫氏亞種的毒素具有約66kDa的分子量(稱為Cry IIA)(Donovan等，1988)。在生物測定中，Cry IIA毒素沒有作用(圖19)。
本發明證明蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種表達一種分子量約20kDa的新的蛋白質。被稱為癌毒素的該蛋白質具有獨特的氨基酸序列，并且能夠殺死多種腫瘤細胞，但不殺死正常細胞，這很可能是通過細胞凋亡機制。
得自蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種的癌毒素的氨基酸序列非常獨特。已經對得自蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種的晶體蛋白Cry A4分子量為130kDa)的基因進行了克隆(Brizzard和Whiteley，1988)。癌毒素的序列與該蛋白質明顯不同。而且，據報道，有一種得自蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種的分子量為13kDa的酸性毒素同時具有抗腫瘤和殺蟲活性。該抗腫瘤蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種蛋白質并不是癌毒素，因為其分子量不同(13kDa，癌毒素為20kDa)，而且其中有大量酸性殘基(42％的Asp和Glu)。它們的分離方法也與本文的不同，主要在于它們的活性組份是在0.27M的NaCl時從DEAE纖維素上洗脫的(癌毒素是在0.05M NaCl時洗脫的)，而且其中沒有胰蛋白酶消化步驟。該酸性毒素還缺少含硫氨基酸殘基，但具有晶體形態。沒有報道該13kDa的蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種蛋白質的氨基酸序列。
據報道得自蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種的另一種蛋白質是一種原毒素，它能夠被胰蛋白酶活化而釋放出一種分子量為70,000的毒素，該毒素進一步降解成為分子量為55,000的次級毒素(Huber-Lukac等，1983)。該毒素可被熱和堿滅活，這表明了其特殊構象和巰基基團的作用。相反，癌毒素的大小為20kDa，而且對熱(100℃，30分鐘)和還原性條件穩定。得自蘇云金芽孢桿菌庫氏亞種的毒素需要強堿條件來完全表現出其生物活性(Gringorten等，1992)，這一特征也與癌毒素不同。而且，蘇云金芽孢桿菌庫氏亞種的蛋白沒有被證明具有抗腫瘤活性。這與在此所述用重組蘇云金芽孢桿菌庫氏亞種的毒素所觀察到的一致。另外一種得自蘇云金芽孢桿菌以色列亞種的、20kDa的蛋白質促進CytA蛋白質(27.3kDa)晶體的形成，由此抑制了CytA的毒性(Wu和Federici，1993)。
得自蘇云金芽孢桿菌不同亞種的大多數晶體蛋白質具有兩個結構域，具有毒素活性的氨基末端段α螺旋結構，和β鏈與卷曲交錯的羧基末端段，這對晶體結構的形成和穩定性具有重要意義(Convents等，1990)。d-內毒素(cry IIIA，60-70kDa)的晶體結構顯示其具有3個結構域，一個7螺旋束，一個3片層結構域和一β夾心層(Li等，1991)。有人提出，螺旋是為了在膜中形成孢子，而片層結構域則負責受體的結合。
人們對于得自蘇云金芽孢桿菌的蛋白質抗腫瘤細胞細胞毒性知道的很少。已經證明，25kDa的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種的毒素本身具有對鼠腫瘤細胞的細胞毒性，而且在體外和體內加強某些抗腫瘤藥物的細胞毒性(Thomas&Ellar，1983；Yokoyama等，1988；Yokoyama等，1991)。在許多化療藥物中，它與博來霉素的協同作用最大。得自蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種的蛋白顯示在體內對鼠腫瘤細胞有細胞毒性。(Prasad和Shethna，1973，1974)。
有關蘇云金芽孢桿菌衍生的蛋白質殺死腫瘤細胞的機制還不知道，但是已經證明，蘇云金芽孢桿菌以色列亞種衍生的毒素結合特定的細胞膜脂質體，造成脂質的去垢劑樣重排，破壞了膜的完整性，最后造成細胞裂解(Thomas和Ellar，1983)。在昆蟲細胞中，毒素抑制(Na，K)-ATPase(English等，1986)。對于癌毒素是否通過相似的機制殺死如此之多的細胞還不清楚。癌毒素在細胞內誘導DNA的斷裂，后者是細胞凋亡機制的標志之一。而且，癌毒素被發現對正常細胞無毒。但是，并非所有的腫瘤細胞都對癌毒素敏感。
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對本領域技術人員來說顯而易見的是，本發明非常適合實施本發明的目的，并獲得所述的以及隱含的結果和優點。在此描述的實施例、方法、過程、處理方法、分子和具體的化合物都代表著優選的實施方式，它們是范例性質的，而不是對本發明范圍的限定。屬于后文權利要求書精神范圍內的改動和其它用途對本領域技術人員來說是顯而易見的。
序列表(1)一般信息(i)申請人Aggarwal，Bharat B.和Padilla，Cristina Rodriguez(ii)發明名稱新的得自蘇云金芽孢桿菌蘇云金變種的抗增殖蛋白(iii)序列數量1(iv)聯系地址(A)收件人James F.Weiler，Attorney-at-Law(B)街道One Riverway，Suite 1560(C)城市Houston(D)州德克薩斯(E)國家美國(F)郵政編碼77056(v)計算機可讀形式(A)介質類型DS，HD1.44Mb/1.44Mo(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件WordPerfect 6.0(vi)本申請信息(A)申請號(B)申請日(C)分類(viii)律師/代理人信息(A)姓名Weiler，James F.(B)登記號16,040(C)文獻/卷宗號D-5789(ix)通訊信息(A)電話713-626-8646(B)電傳713-963-5853(2)SEQ ID NO1的信息(I)序列特征(A)長度20
(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(ii)分子類型(A)種類蛋白質(iii)假定無(iv)反義鏈無(vi)原來源(B)菌株(C)單獨分離株(D)發展階段(F)組織類型(G)細胞類型(H)細胞系(xi)SEQ ID NO1的序列描述Pro Ser Thr Val Val Asn Val Ser Asn Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ile Glu Lys Glu Phe1 5 10 15 20
權利要求
1.一種分離和純化自蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種的蛋白質，經SDS-PAGE測定的分子量約為20千道爾頓(kDa)，所述的蛋白具有部分SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，而且，所述蛋白表現出抗腫瘤細胞的細胞毒性。
2.根據權利要求1所述的蛋白質，其中所述的蛋白質對蛋白酶和酸性條件敏感，所述的細胞毒性作用能夠耐受二硫蘇糖醇處理或暴露于100℃。
3.根據權利要求1所述的蛋白質，其中所述的蛋白質對U-937細胞、髓細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞、成紅細胞、乳腺癌細胞、卵巢癌細胞和肝癌細胞具有細胞毒性。
4.根據權利要求1所述的蛋白質，其中所述的細胞毒性作用受抗該蛋白的抗體的抑制。
5.根據權利要求1所述的蛋白質，其中所述的蛋白質對正常的人外周血淋巴細胞和人包皮成纖維細胞沒有細胞毒性。
6.一種藥物組合物，其中包含根據權利要求1所述的蛋白質和藥學上認可的載體。
7.一種處理腫瘤細胞的方法，它包括對所述細胞使用治療有效量的權利要求6所述的組合物。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述的腫瘤細胞選自髓細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞、成紅細胞、乳腺癌細胞、卵巢癌細胞和肝癌細胞。
9.根據權利要求7所述的方法，其中所述的腫瘤細胞存在于人或動物體內。
10.根據權利要求7所述的方法，其中所述的組合物抑制腫瘤的復發。
11.根據權利要求7所述的方法，其中所述的處理延長所述腫瘤細胞宿主的存活時間。
12.根據權利要求7所述的處理方法，其中所述的腫瘤細胞在體外。
全文摘要
本發明提供了一種得自蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種的分離和純化蛋白,該蛋白的分子量經SDS－PAGE測定約為20千道爾頓(kDa),所述的蛋白具有部分SEQ ID NO∶1所示的氨基酸序列,而且,所述蛋白表現出抗腫瘤細胞的細胞毒性。本發明還提供了一種處理腫瘤細胞的方法,該方法包括對所述細胞使用治療有效量的本發明組合物。
文檔編號A61P35/00GK1192220SQ96196036
公開日1998年9月2日 申請日期1996年5月31日 優先權日1995年5月31日
發明者B·B·阿加瓦爾, C·R·帕迪利亞 申請人:研究發展基金會, 新萊昂州自治大學