專利名稱：降低潛在感染材料的感染性的方法
技術領域：
本發明的目標是一種降低潛在感染材料的病毒感染性的方法，潛在感染材料如人或動物體液或從中可分離出生物活性物質的體液部分，其中感染性歸因于非脂包被的病毒。
人或動物體液等潛在感染材料是生物活性、從而寶貴的物質的重要來源。然而，從這些來源分離生物活性物質并非毫無問題，這在過去已很明顯，尤其是在來自血漿的制品傳播HIV時。因而使用這些制品時一個必須的要求是它們是無病毒的，即這些制品應當不能傳播感染性顆粒。
脂包被的病毒可以非離子型生物相容的溶劑和去污劑處理有效地滅活。這些方法在EP0131740中有介紹。非脂包被的病毒這樣處理不能充分地滅活。WO94/17834報道了一種充分滅活甲肝病毒等非脂包被的病毒的方法。但該方法只有用非離子型去污劑和60到65℃加熱聯合處理才可滅活病毒。但加熱處理時間長達5到30小時是一個缺點，因為寶貴的生物活性物質主要是蛋白質，其復雜的結構被這樣的熱處理改變甚至破壞。這包括降低相應部分的活性。因而，已知的方法引起這些物質的可能收率的降低。
DE4021542A1公開了一種處理無感染性血漿制品的聯合方法。血漿用非離子型表面活性劑處理，除去脂層之前加入生物相容性脂類。此后，在疏水性材料上進行固相抽提分出脂層并除去非離子型表面活性劑。
EP-A0239859涉及一種由含脂溶性加工化學制劑的生物材料中除去脂溶性加工化學制劑的方法。該方法包括使含脂溶性加工化學制劑的生物材料與有效量的天然存在的油或具有類似化學結構的合成物質作用，上述天然存在的油來自植物或動物。振蕩所得混合物，沉淀分開上相和下相，移出上相。該方法在制備相對無病毒、生理可接受的血漿時特別有用。
歐洲專利申請EP-A0525502公開了一種制備用于靜脈使用、病毒已滅活的免疫球蛋白溶液的方法。免疫球蛋白以非離子型表面活性劑處理，隨后在疏水材料上進行固相抽提將其除去。
歐洲專利申請EP-A0112563公開了一種血漿蛋白制品的溶劑處理方法。血漿蛋白制品以干燥形式與一種有機溶劑混合以除去病毒感染性。
WO-A83/04371公開了一種滅活位于蛋白載體上的脂病毒的方法，所說的病毒選自乙肝病毒(HBV)和非甲非乙型肝炎(NANBH)病毒，該方法是使上述病毒與一種鹵代烴處理劑在常溫下長時間作用，鹵代烴的用量為5％(v/v)到50％(v/v)，優選鹵代烴為氯仿。
本發明要解決的問題是提供一種方法，該方法可降低潛在感染材料或已知感染材料中所含非脂包被病毒的感染性。
奇怪的是，我們發現潛在感染材料中非脂包被病毒的感染性可用疏水相處理該材料得以降低，疏水相與該潛在感染材料可形成雙相系統，隨后分離形成的兩相。
根據本發明降低潛在感染材料的病毒感染性的方法其特征在于以下措施，其中潛在感染材料如人或動物體液或從中可分離出生物活性物質的部分，其感染性可歸因于非脂包被的病毒。欲從中分離生物活性物質的潛在感染材料以基本不溶于水的疏水相處理，它與該潛在感染材料將會形成兩相系統。此后，將疏水相與這樣處理的潛在感染材料分開。
以下，潛在感染材料也包括已知感染材料。尤其包括血或血漿等體液或冷沉淀物等處理過的或血漿。此外還包括這些潛在感染材料的任何部分以及細胞裂解物或類似的天然物。
可從潛在感染材料中分離的生物活性物質尤指蛋白質，如因子VIII或維生素K依賴因子等血液凝固級聯因子，如C或S蛋白，γ-球蛋白，補體因子和絲氨酸蛋白酶抑制劑。
尤其，根據本發明可用來與潛在感染材料形成兩相系統的疏水相為一種非極性有機液體，如植物油或低熔點脂肪等在室溫下是油狀的液體。
根據本發明的方法不但與利用非離子型去污劑和二烷基或三烷基磷酸酯滅活病毒的現有方法相容，而且還被證實有另一個優點，即將潛在感染材料的疏水相處理和非離子型去污劑和二烷基或三烷基磷酸酯，特別是三正丁基磷酸酯(TNBP)的處理聯合使用。這種聯合處理可同時或依次進行。
下列衍生物可作為非離子型去污劑，其含量應為以重量計至少0.1％膽汁鹽、脂肪酸的聚氧乙烯衍生物、部分酯化的山梨糖醇酐，如商品名為Tween 80、Tween 20和Polysorbat 80的產品，以及非離子型、溶于油的表面活性劑，尤其是商品名為Triton X-100(乙氧基化的烷基酚)的表面活性劑。兩性離子試劑也可以使用，如N-十二烷基-N，N-二甲基-2-氨基-1-乙烷磺酸鹽或其衍生物等磺基甜菜堿，或辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷等非離子型去污劑。去污劑的用量優選為0.01％到10％。優選使用TNBP、Tween和Triton或膽酸鈉/TNBP聯合處理。
以疏水相處理潛在感染材料基本可以代替WO94/17834中必需的熱處理，該熱處理與非離子型去污劑和烷基磷酸酯聯合使用可滅活非脂包被病毒。
可能的非脂包被病毒尤指甲肝、柯薩奇、脊髓灰質炎和細小病毒。
根據本發明的方法在疏水相與潛在感染材料充分混合時特別有效。這可通過例如機械作用達到，如超聲處理、高效攪拌、強烈振蕩等。
兩相系統形成后，尤可通過離心或過濾除去疏水相。疏水相尤可使用大豆油和/或蓖麻油等植物油。油相可通過疏水濾器過濾除去。疏水相需要分離的程度主要取決于后續處理過程。若非脂包被病毒的感染性已降低的材料還需用陰離子交換或親和層析純化，則疏水相無需定量分離。因而必須確保可能抽提到疏水相的感染性顆粒被分開。然而，若疏水相需要定量分離，則其可用類似于DE4008852所述的方法除去。該分離過程可使用常規生化分離過程，包括電泳。
根據本發明的方法極適合分離生物活性物質，如因子VIII、維生素K依賴的凝血因子等凝血級聯因子。
本發明用以下實施例進一步說明。
實施例向潛在感染血漿部分加入非脂包被病毒。各病毒層可見附表。非包被病毒則使用柯薩奇B6和脊髓灰質炎1。脂包被的PRV病毒用作對照。實驗過程如下非脂包被病毒以非離子型去污劑和TNBP(SD)處理，或不用TNBP處理(表中SD欄為(-))。樣品以油處理。
各種血漿部分(如含因子VIII的部分)大約20ml均加入柯薩奇、脊髓灰質炎或假性狂犬病病毒至表中所列感染性病毒的水平。
隨后強烈振蕩。
1.將0.2ml Tween 80和0.06ml TNBP加入19.74ml的部分，或2.將0.2ml TritonX-100和0.2ml TNBP加入19.6ml的部分。
向制品1和2中各加入1ml蓖麻油，隨后在室溫下強烈抽提1小時。
3.另一含病毒的20ml部分同上以1ml蓖麻油短暫處理，但此前沒有用去污劑處理(SD-)。
上述各例均以離心分相。處理前后由水相取出1ml樣品作為感染性對照。
*每毫升的log10TCID50
權利要求
1.一種降低潛在感染材料的病毒感染性的方法，潛在感染材料如人或動物體液或從中可分離出生物活性物質的體液部分，其中感染性歸因于非脂包被的病毒，該方法的特征在于欲從中分離所說生物活性物質的潛在感染材料以疏水相處理，該疏水相基本上不溶于水，且能與潛在感染材料形成兩相系統，和將該疏水相由這樣處理的潛在感染材料中分離出來。
2.根據權利要求1的方法，其中的潛在感染材料為血或血漿或冷沉淀物等處理過的或血漿。
3.根據權利要求1或2中任一項的方法，其中可由潛在感染材料中分離的生物活性物質為蛋白質，如血液凝固級聯因子。
4.根據權利要求1到3中至少一項的方法，其中所說的疏水相由非極性有機液體組成，如室溫下為油狀的液體或低熔點脂肪。
5.根據權利要求1到4中至少一項的方法，其中潛在感染材料除以疏水相處理外，還以非離子型去污劑和三正丁基磷酸酯(TNBP)等烷基磷酸酯或Triton衍生物等聚醚同時或后續處理，以更有效地降低其感染性。
6.根據權利要求1到5中至少一項的方法，其中所說的疏水相與潛在感染材料充分混合，分相后使各相分開。
7.根據權利要求1到6中至少一項的方法，其中經疏水相處理已降低感染性的材料通過分離過程進一步分成不同部分，分離過程如親和層析、離子交換層析、電泳、凝膠滲透層析和疏水反相層析。
8.根據權利要求1到7中至少一項的方法，用來回收病毒已滅活的生物活性物質，如血液凝固級聯因子。
全文摘要
一種降低潛在感染材料的病毒感染性的方法,潛在感染材料如人或動物體液或從中可分離出生物活性物質的體液部分,其中感染性歸因于非脂包被的病毒,該方法的特征在于:欲從中分離所說生物活性物質的潛在感染材料以疏水相處理,該疏水相基本上不溶于水,且能與潛在感染材料形成兩相系統,和將該疏水相由這樣處理的潛在感染材料中分離出來。
文檔編號A61K35/14GK1190900SQ96195517
公開日1998年8月19日 申請日期1996年4月4日 優先權日1995年5月20日
發明者W·馬爾古雷, H·施文, L·比瑟爾特 申請人:奧克塔法馬有限公司