人幾丁質酶,其重組生產,其分解幾丁質的用途及其在治療和預防感染性疾病中的應用的制作方法

專利名稱：人幾丁質酶,其重組生產,其分解幾丁質的用途及其在治療和預防感染性疾病中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于抗含幾丁質的生物體感染的人類個體的治療和預防領域，以及生產用于上述療法的物質的重組DNA技術。本發明還與另幾方面有關如診斷、基因治療，從含幾丁質的藥物載體或植入物的受控藥物釋放；化妝品，牙用品，甚至食品。
背景技術：
感染性疾病與天然防御人類經常處于被各種病原感染的危險中，所述的病原例如病毒、細菌、真菌、原生蟲和多細胞寄生蟲。一些相關的感染性疾病是嚴重致殘甚至致命的。在哺乳動物中存在著被稱作免疫反應的針對這些病原體的許多防御機制。關于這個問題可見參考文獻1中的1，2，15和16章。
在天然的(或非適應性的)免疫反應與適應性的免疫反應之間是有區別的。后一類的反應是對某一特定病原體具有高度特異性的，并且與感染原的每一次后繼接觸都會使這一反應增強。適應性免疫反應由各種各樣的淋巴細胞介導，天然的免疫反應基本上由巨噬細胞產生。這些更為原始的反應不是基于高度特異性識別作用，只是作為抵抗感染的第一道防線。一類重要的巨噬細胞是長壽細胞(單核細胞/巨噬細胞)，屬于單核吞噬細胞。單核細胞形成于骨髓干細胞并進入血液。當分化成各種類型的組織巨噬細胞后，這些細胞就可以遷移到組織之中。這方面的例子有大腦中的微神經膠質細胞，肺中的肺泡巨噬細胞，肝中的枯否式細胞，腎中的腎小球膜吞噬細胞，脾臟巨噬細胞，淋巴結駐留及重循環巨噬細胞和滑膜細胞。第二類吞噬細胞由多形核嗜中性粒細胞形成，它們壽命短暫，而且構成了血液淋巴細胞的主體。
吞噬細胞在防御中的作用已被很好地證明的是吞噬細胞在對細菌感染的免疫中所起的關鍵作用。吞噬細胞被細菌感染趨化性地吸引，與細菌的吸附可以通過多種相互作用，例如補體介導的、抗體介導的、或甘露糖結合蛋白介導的、或是通過外源凝集素寡糖的相互作用。隨后，微生物就暴露在吞噬體和溶酶體中的一系列殺傷機制之下，最重要的是氧依賴性殺傷機制，它產生超氧離子并隨之產生其它的有毒性的活性氧中間體。最近發現了在嗜中性粒細胞中通過氧化氮途徑的殺傷作用的重要性。氧依賴性殺傷作用的介導是通過防衛因子，小的陽離子多肽，溶酶體酶，溶菌酶，和乳肝褐質。吞噬細胞在針對真菌和寄生蟲的免疫作用方面的確切的作用還未十分了解，但認為與對細菌感染的抵抗作用類似。
除了直接殺死微生物之外，巨噬細胞在對外來微生物的免疫方面還起著其它一些重要作用。首先，這些細胞在呈遞抗原給T淋巴細胞并隨之引起免疫系統的更進一步反應上是十分有效的。其次，巨噬細胞與微生物產物的接觸能夠伴隨著細胞因子的釋放，影響免疫系統的其它成分。第三，巨噬細胞應答T淋巴細胞釋放的細胞因子。例如，在一些寄生蟲感染中，通過把寄生蟲阻擋在發炎細胞的囊膜外，可以減輕機體受到的損傷。這種T淋巴細胞依賴性過程導致巨噬細胞的局部性富集，這些巨噬細胞釋放能刺激肉芽組織形成的纖維化因子的釋放并最終導致纖維變性。
對感染性疾病的干預對病原體的天然防御機制對防止臨床并發癥的發生并非總是有效的，因此，要求對其(預防性)干預。
一種預防方法是免疫接種，例如，通過在宿主體內預先接種病原體(或其成分)來刺激防御機制。為了達到效果，疫苗必須誘導來自產生強烈細胞介導免疫反應的相應種類的T淋巴細胞的長期反應。雖然接種已被證明對于某些病原體是有效的，但這種方法也伴隨著一些固有的問題。最重要的是，必須避免接種的抗原產生錯誤的免疫反應，如抑制或甚至自身免疫。對于某些感染來說，免疫接種需要在特異性的體內部位獲得免疫性并由局部免疫或口服免疫進行。由于免疫系統的復雜性，病原體的不均一性，以及部分病原體逃避特異免疫應答的能力，對病原體的有效接種免疫的統一性方法是不可能有的。對于特殊的感染性疾病的種種對策仍然在不斷摸索研究。
另外一種干預感染性疾病的方法是使用藥物，阻止病原體的進一步繁殖與存活。就此而論最好是使用在病原體的水平特異性作用而不影響宿主的化合物。這種特異性的基礎在于哺乳動物細胞與其致病性入侵者之間在組成與需求方面的區別。青霉素與頭孢菌素是細菌細胞壁合成的特異性的抑制劑。氨基糖苷，氯霉素，四環素，大環內酯是細菌蛋白質合成的抑制因子。利福平，4-喹酮是細菌DNA復制的特異性抑制劑。兩性霉素B和制霉菌素通過結合真菌細胞膜上的特異性固醇，引起細胞成分的流失，而具有殺死真菌的作用。
針對宿主細胞中不存在的特異靶來干預病原體的藥物學方法在自然界也是存在的。一個很好的例子就是水解酶溶菌酶，和在無脊椎動物中一樣，它也存在于脊椎動物體內。很多細菌的細胞壁中含有胞壁酸和N-乙酰葡糖胺的交聯聚合物。水解酶溶菌酶能夠裂解胞壁酸和N-乙酰葡糖胺殘基之間的糖苷鍵，隨之使細胞壁解體。而溶菌酶的存在不會傷害宿主，因為在非細菌細胞內不存在類似的結構。
幾丁質幾丁質是一種多糖，哺乳動物細胞中并不存在，但存在于多種引起人類感染疾病的微生物中。因而，幾丁質就成為選擇性攻擊這類病原體的一個有吸引力的靶。
幾丁質是β(1-4)鍵連接的N-乙酰-D-葡糖胺單位的聚合物。它還可能以不同的比例含有葡萄糖胺單位。主要去乙酰幾丁質稱作幾丁糖。關于此問題可參考文獻2-5。
幾丁質及其衍生物是地球上含量最豐富的大分子生物產物之一。估計每年的產量約有一百億至一千億噸。幾丁質是真菌細胞壁的結構組分，也是幾乎所有無脊椎動物(除了海綿動物，大多數珊瑚蟲，和棘皮動物)的外骨骼的組分，但不存在于脊椎動物和自養生物中。幾丁質有很多功能保護細胞和生物體免受環境的機械或化學損傷，而且還能保持和確定它們的形態。N-乙酰葡萄糖胺鏈的長度可能從100至800單位。聚合物橫向排列形成微纖絲，依靠一條鏈上的糖的氨基與相鄰鏈上的糖的羧基間的強烈的氫鍵作用而穩定。可以識別出幾丁質的三種晶狀形態。在α-幾丁質中(是真菌和節肢動物中最豐富的形式)，相鄰的鏈之間是反平行方向排列的。在β-幾丁質中是平行方向排列的，而在γ-幾丁質中，兩條鏈是平行的，第三條鏈是反平行的。在甲殼綱和真菌中微纖絲的直徑常常為20-25nm。在大多數結構中，幾丁質是與其它物質結合在一起，在真菌細胞壁中結合的化合物是β-葡聚糖。在動物的外骨骼中，幾丁質與蛋白質的結合最占優勢。在甲殼綱中基質是由于碳酸鈣和磷酸鈣的淤積而變得堅硬，在昆蟲中基質是通過與酚類衍生物的革化而變得堅硬的。在原生動物中的幾丁質結構中還存在著糖蛋白與粘多糖。
幾丁質及有關化合物有很多應用，脫乙酰幾丁質用作繩索、纖維、膠片和凝膠的成分。在農用工業中，莊稼可以用含幾丁質衍生物的薄膜保護，免受真菌的傷害。在食品工業中，脫乙酰幾丁質用來制備果汁和可溶性咖啡。日常工業品生產的香波，膠質，冰激淋甚至海綿中都用了脫乙酰幾丁質。在制藥工業和醫學上，脫乙酰幾丁質可用于制造隱形眼鏡片，藥物賦形劑和燒傷敷料。
幾丁質合成與幾丁質酶對其的降解真菌中的幾丁質合成了解得最清楚，基本的前體是從葡萄糖合成的UDP-N-乙酰葡萄糖胺。幾丁質合成酶作為轉膜蛋白被運輸透過細胞膜后將從供體UDP-N-乙酰葡萄糖胺上得到的N-乙酰葡萄糖胺加到形成中的多糖鏈上。真菌的合成酶可以被UDP-N-乙酰葡萄糖胺的類似物，多氧菌素(由可可鏈霉菌產生)和煙霉素(由唐德鏈霉菌產生)競爭性地抑制。
其它物種中的幾丁質合成還未十分明白。有人說在昆蟲和甲殼綱中，幾丁質的合成起始于內質網蛋白質的糖基化，幾丁質長鏈在高爾基體內加到該蛋白質上，該幾丁質蛋白質隨后被運出到細胞表面。在節肢動物中的幾丁質合成似乎是涉及脂質連接的中間體的兩步驟過程。節肢動物中的合成可被苯甲酰基苯基脲類殺蟲劑特異性地抑制，但其機理尚不清楚。另外，在這些生物體內，蛋白質合成及N-糖基化作用的抑制劑(膜霉素)抑制幾丁質的合成。更多的證據表明，原生動物中的幾丁質合成發生于細胞表面，極似真菌中的過程。
所有含幾丁質的生物都有使其能降解幾丁質聚合物而形態發生，即其形狀的基本修飾的酶系統。另外，許多高等植物，魚類，食蟲動物(包括脊椎動物)都能產生降解幾丁質的酶類。一些酶解系統具有這些方面的特征i)β-己胺酶能從多糖的非還原末端去除末端N-乙酰葡萄糖胺部分；ii)一些具有廣譜特異性的溶菌酶(如蛋清溶菌酶)也能從幾丁質糖聚合物內部切開；iii)外切幾丁質酶能從多糖的非還原末端裂解二乙酰幾丁質二糖；iv)專一性內切幾丁質酶沿著幾丁質鏈隨機地切開糖苷鍵，最終的主產物為二乙酰幾丁質二糖，還有一些三乙酰幾丁質三糖。外切和內切幾丁質酶通常統稱為幾丁質酶。在此也使用此名稱。
在自然界中，幾丁質酶分布廣泛，在一些病毒、細菌、真菌、植物、無脊椎動物和脊椎動物中都有發現。幾丁質酶構成糖基化水解酶的18、19家族。Henrissat提出的這種分類基于氨基酸序列的相似性(6)。19家族僅含植物幾丁質酶；例如來自大麥的幾丁質酶，其三維結構已被解釋。僅僅所謂的III類植物幾丁質酶才屬于18家族。在糖基化水解酶的第18家族中的幾丁質酶的推斷活性位點區域存在著一定的同源性。催化結構域的假想結構是8股a/β桶式結構(“TIM桶”)(7，8)，其作用機理類似于溶菌酶和其它的糖基化水解酶，如普通的酸堿催化(8)。
由含幾丁質病原體引起的人類感染性疾病由含幾丁質生物體引起的人類感染性疾病有許多種。最顯著的幾種列于表1。一種基于病原體類型的分類是i)真菌感染；ii)原生動物感染；以及iii)蠕蟲感染。關于此問題可見參考文獻9。
表1幾種由含幾丁質病原體引起的感染性疾病I真菌感染-皮真菌病-皮下真菌病-肺部真菌病-念珠菌病II.原生動物感染-弓漿蟲病-瘧疾(瘧原蟲)-利什曼病(利什曼蟲)-Chagas病，嗜睡癥(錐蟲)III.蠕蟲感染-血吸蟲病-毛線蟲病-絲蟲病-Ochocerciasis真菌感染現有的有限數量的抗真菌藥物通常并不十分有效。真菌感染通常發病于免疫缺陷人群，現在最常見的是艾滋病患者中。大多數皮膚真菌感染用局部藥劑治療，內臟感染和表皮感染需長期全身性治療。最常見的真菌感染是由白色念珠菌引起的。該生物體是一種口腔粘膜和陰道粘膜內共生菌，但在嚴重患病的患者中，以及在那些特異性免疫缺陷的患者中，和那些接受了廣譜抗生素治療的患者中對損傷的皮膚有致病性。念珠菌感染的最嚴重后果是肺炎，心內膜炎，敗血癥甚至死亡。唯一有效的治療方法是靜脈注射兩性霉素B。注射這種藥物可能引起低血壓和虛脫等副反應。因此第一次注射時需要注射少量進行耐受實驗。5-氟胞嘧啶是一種合成的氟化嘧啶，它能夠進入真菌細胞通過干擾DNA和RNA合成抑制代謝。該化合物在治療系統性真菌感染時和兩性霉素B同時使用。當單獨注射時，對5-氟胞嘧啶的抗性迅速產生。
在人類中能引起嚴重的感染疾病的其他種屬的真菌，如曲霉，隱球菌，球孢子菌，副球孢子菌，芽生菌，孢子絲菌，和莢膜組織胞漿菌。
組織胞漿菌病的臨床癥狀可能有很大區別。莢膜組織胞漿菌感染巨噬細胞，其致病原因類似于結核病。在正常宿主中肺部感染通常伴隨著咳嗽和胸痛，肌痛和體重減輕。在某些肺部結構性缺陷的個體中，可能會發生肺部慢性破壞性疾病，類似于結核病。在免疫損害的宿主中可能發展成傳播性組織胞漿菌病，伴隨著發燒，肝脾大，貧血，白血病，血小板癥和敗血癥。兩性霉素B是治療的通常選擇。由于它的毒性，研究了對各種真菌感染治療的其它藥物。
原生動物和蠕蟲感染原生動物是單細胞生物，在人體內能引起大量的嚴重的感染性疾病。(見表1)。幸運的是對于大多數的這類病原體，有效地藥物治療是可行的。對于克氏錐蟲引起的Chagas病的治療，目前尚未讓人滿意。心臟與腸道是被這種疾病以慢性形式嚴重影響的器官。對鼠弓形體的組織損傷的有效治療還是不可能的。細胞介導的免疫能力減弱后，可引起疾病的復發。蠕蟲感染一般地可用特效藥物非常有效地治愈。在這方面的難題是由班氏線蟲和Brugia引起的淋巴絲蟲病。在此病的高級階段，在用藥物乙胺嗪(DEC)殺死微絲蚴的同時，會由于大量蠕蟲死亡引起并發癥。
通過在幾丁質水平的相互作用得到對含幾丁質病原體的改善的抗性幾丁質在生物體中的不同分布使人產生這樣一個想法對于含幾丁質病原體的感染的控制，幾丁質代謝是一個很有吸引力的靶。在此有兩種獨特的實驗方法應該提到1.幾丁質合成的抑制(綜述見參考文獻2)真菌細胞壁合成抑制劑作為殺真菌劑的價值在植物中已得到大量證明。多氧菌素已被廣泛地用作出色的農用殺真菌劑。由于結構上與UDP-N-乙酰葡萄糖胺的相似性，多氧菌素成為幾丁質合成的一組競爭性抑制劑。最近，作為機理相近的潛在抑制劑，煙霉素也已得到檢驗。
苯甲酰芳香基脲是商業殺昆蟲劑，它們是昆蟲中幾丁質合成的強力抑制劑，但在真菌中則不然。
以上化合物在人體中的醫用價值尚未能得到說明。
2.幾丁質酶作為疫苗幾丁質酶在原生動物生命周期中的重要性，提示研究者考慮將原生生物幾丁質酶作為免疫接種的有吸引力的抗原(10-13)。還有一個原因是(錯誤地)認為在人體內不存在類似的蛋白質(見參考文獻13)在抗含幾丁質微生物的過程中，以上所闡述的實驗方法的優點可能比設想的要少。
第一，合成的化合物對幾丁質合成的抑制作用的特異性和有效性可能比所希望的要小。還不能有結論說抑制劑干擾哺乳動物細胞的內源性反應過程因而產生副作用。當原始化合物向一種有毒產物的生物轉化作用發生時，毒性也有可能上升。另外，由于這些藥物會通過尿液排出體外，因而也要求長期注射大量這類藥物。另外，在微生物體內可能存在或發展出幾丁質的替代合成途徑，使其完全抑制變得復雜。
第二，使用源于病原微生物的幾丁質酶作為疫苗可能產生一些未知的有害副作用。不能排除因這些幾丁質酶的片段與內源蛋白質同源而引發的不希望的免疫反應。這一點可能是個事實而非僅僅是一種理論上的難題，因為人幾丁質酶與其它物種的幾丁質酶具有很高的同源性(見下)。
幾丁質酶在植物和魚類中抵抗含幾丁質病原體中的作用許多植物幾丁質酶被認為是與致病性(PR)有關的蛋白質，這些酶可被病原體的存在或其它的應力所誘導。有些植物幾丁質酶己被證明有抗真菌作用。見參考文獻14。最令人吃驚的是有報道說，用一種來自粘質沙雷氏菌的在大腸桿菌中表達的細菌幾丁質酶(ChiA)處理植物可產生對真菌的抗性(15)。然而很清楚，對大多數真菌的更有效的抑制作用要求幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶同時存在。在植物中，后一種酶也因應答應力被誘導。
據報道，魚類的白細胞富含幾丁質酶活性并在防御系統中起著作用(16)。這種作用的證據最近已得到，確認從大比目魚中純化的幾丁質酶對含幾丁質的真菌大毛霉有抑制作用。
現在普遍的認識是人類吞噬細胞中不存在類似的幾丁質酶。但是，如下面將要討論到的，最近我們發現在人工培養的人類巨噬細胞中存在著類似的一種酶。
本發明的簡述鑒于現有的抗含幾丁質的病原體的方法的局限性，在此提出一種新的方法，解決困擾人類健康的這一難題。該方法基于新近發現的一種人幾丁質酶的運用，該酶能通過重組DNA技術(生物工程)生產，并作為一種安全而有效的抗含幾丁質病原體的藥劑，干預由含幾丁質病原體引起的感染性疾病。該方法的簡介及其發展述于其后。
本發明提供了一種基本上是分離的或純化的幾丁質酶，所說的幾丁質酶是人類的幾丁質酶，它具有基本上與圖1或圖2的氨基酸順序相應的氨基酸序列，或是所說的人幾丁質酶的修飾形式，它具有基本上相似的幾丁質水解活性。優選的是，這種新的人幾丁質酶通過一種基因工程化的宿主細胞生產，從所說的宿主細胞中或是培養所說的宿主細胞的培養基中純化，并且這種酶的氨基酸序列由基本上與圖1或圖2中的核酸序列相應的核酸序列所編碼。本發明特別地包括這樣的幾丁質酶，它具有基本上與圖1中的氨基酸序列相應的氨基酸序列，并且它的分子量大約50kDa，本發明還包括一種氨基酸序列基本上與圖2中所示的氨基酸序列相應的，分子量約為39kDa的幾丁質酶。
術語“基本上分離的或純化的”表明這種幾丁質酶從其天然存在的環境中分離，或是從應用重組DNA技術或用化學合成法生產或分泌幾丁質酶的環境中分離，本發明意在包括“基本上分離形式”的幾丁質酶，在此形式中，它基本上是與所說的環境中的其它成分分開的，而且優選的是幾丁質酶是“基本上純化的”，即意味著它已純凈到足以將其應用于醫藥用途，即是藥學可接受的。
雖然本發明已包括了從天然來源，如經適當活化的人類巨噬細胞中分離幾丁質酶的可能性，但通過重組DNA技術或通過化學合成來生產是優選方案，特別是通過一種基因工程化宿主或宿主細胞生產，并從所說的宿主或宿主細胞或是從培養所說的宿主或宿主細胞的培養基中分離的方法。
術語“基本上與……相應”意味著允許微小的序列變異，例如不會顯著影響酶的活性的天然產生的變異。人幾丁質酶的氨基酸序列中的某些氨基酸可能會被其它的氨基酸所取代，或是缺失，而不會因此而顯著影響酶的功能，活性和耐受能力，有時甚而會因此使酶的性質得到改進。一般地，這類序列上的變異是十分有限的，大約少于全部氨基酸的30％，常常是少于20％，甚至是少于10％。即是說，與圖1或圖2中的序列比較，變體通常有高于大約70％，通常是高于80％或甚至是高于90％的同源性。共同的是它們都有幾丁質酶活性的功能特征，該活性可用典型的幾丁質酶底物，如4-甲基傘形酰-幾丁質三苷來測定。
術語“具有基本上相似的幾丁質水解活性的修飾形式的人幾丁質酶”意味著包括了其氨基酸序列與圖1或圖2中所示的序列有顯著差異但卻仍然具有相似的幾丁質酶活性的變體。具有相似的甚至是有所改進的性質的這種修飾形式可在人幾丁質酶的結構域結構的基礎上進行設計，例如缺失一個與功能無關甚至有害的結構域，以及構建含有兩個或更多拷貝的希望存在的結構域的變體。
術語“具有基本上相似的幾丁質水解活性”意味著最低的要求是具有與圖1或圖2中所示的幾丁質酶相比至少是相等的幾丁質酶活性。“相等”指的是在底物范圍上等值，即等質性，以及在活性上等值，即等量性。
本發明還提供一種藥物組合物，它包括本文描述的新的人幾丁質酶，以及一種藥學可接受的載體或稀釋劑，更具體的是一種用于抗含幾丁質病原體引起的感染的治療的藥物組合物，它包括一種治療或預防有效量的新的人幾丁質酶和一種藥學可接受載體或稀釋劑。優選的藥物組合物還包括治療或預防有效量的人β-1，3-葡聚糖酶。
本發明還提供了包括新的人幾丁質酶和一種載體或稀釋劑的非藥物組合物。例如，這種組合物可以是來自培養細胞尤其是人類細胞的培養基，或者是化妝品(如體膚露)，牙用品(牙膏，漱口水)或食物(如奶，奶酪，及其它乳制品)。
另外，本發明提供了包括幾丁質水解量的新的人幾丁質酶的幾丁質基制品。例如，幾丁質基制品可以是含藥物的藥物載體或是控制藥物釋放的植入物，或是瞬時功能植入物。
本發明還提供了一種人類個體抗含幾丁質病原體引起的感染的治療或預防方法，包括給予所述的人類個體含有有效治療或預防量的新的人幾丁質酶的組合物。本發明還提供了一種制備人幾丁質酶的方法，該酶有著基本上與圖1或圖2中所示氨基酸序列相應的氨基酸序列，或是有基本上相似的幾丁質水解活性的所說的人幾丁質酶的修飾形式，該方法包括培養能夠產生所說的人幾丁質酶或其修飾形式的基因工程化宿主或宿主細胞，以及從所說的宿主或宿主細胞或培養所說宿主細胞的培養基中分離所產生的幾丁質酶。在此方法中，優選的是所說的幾丁質酶的氨基酸序列是由基本上與圖1或圖2中所示的核苷酸序列相應的核苷酸序列所編碼的。
本發明還提供了一種能夠生產人幾丁質酶的基因工程化宿主細胞，該幾丁質酶具有基本上與圖1與圖2中所示氨基酸序列相應的氨基酸序列，或是有基本上相似的幾丁質水解活性的所說的人幾丁質酶的修飾形式。
本發明還提供一種重組的核酸，它包括編碼基本上與圖1或圖2中所示氨基酸序列相應的氨基酸序列的核苷酸序列，或是其互補序列。優選的，所說的核苷酸序列基本上與圖1或圖2中所示的核苷酸序列相應，或基本上與其互補。
術語“基本上互補于”意味著包括了所有與圖1或圖2中所示核苷酸序列雜交的變體，尤其是在嚴格雜交條件下。術語“基本上相應”意味著包括了編碼同一或相當的(指幾丁質酶活性)氨基酸序列并被宿主或宿主細胞表達的所有變體。
本發明還包括至少有大約8個核苷酸的寡核苷酸，它有與圖1或圖2中所示的核苷酸序列相應或互補的核苷酸序列，能夠在嚴格(即要求完全互補)條件下與編碼新的人幾丁質酶的核酸雜交結合。這類寡核苷酸可用于多種目的，例如，作為用于核酸擴增方法如PCR，NASBA等的引物，或是作為雜交分析的探針。其長度通常取決于所希望的用途，當作為引物時，正常的長度在12個核苷酸左右，優選是15，以及25，最佳選擇是20個核苷酸。當用作探針時，通常要更長一些，例如，從大約15或20至大約40或50個核苷酸，或甚至到完整的編碼序列。
類似的，本發明還包括至少大約8個氨基酸殘基的肽，它含有衍生于圖1或圖2中所示的氨基酸序列的氨基酸序列，并代表或模擬新的人幾丁質酶的抗原決定簇，特別是那些具有與圖1或圖2中所示氨基酸序列相應的氨基酸序列并具有抗原性的肽類。通常，這些肽類的長度至少為大約10個氨基酸殘基，甚至至少大約15個，多至40個氨基酸殘基，而優選的是長度為約30個氨基酸殘基。所說的肽類可用于診斷目的，或用于免疫接種方案中以產生人幾丁質酶特異性抗體。
本發明還包括能夠結合到新的人幾丁質酶上的抗體，尤其是單克隆抗體。這類抗體有多種用途，例如可用來分離和/或純化(親和層析)人幾丁質酶，或是用于診斷目的。
本發明還提供一種診斷試劑盒，它包括一種上述人幾丁質酶結合抗體，或是人幾丁質酶肽，或是本文所述的新的人幾丁質酶本身，還包括一套用于檢測抗原或抗體的診斷試劑盒的常規組分；以及另一種診斷試劑盒，它包括本文所述的人幾丁質酶特異性的寡核苷酸或編碼重組人幾丁質酶的核酸序列，隨之的還有一套常規的檢測核酸的診斷試劑盒所應有的組分。
另外，本發明還提供一種降解幾丁質的方法，包括在幾丁質水解條件下，應用新的人幾丁質酶接觸所說的幾丁質。
附圖簡要說明圖1.chi.50 cDNA克隆的核苷酸序列以及相應蛋白質的推測氨基酸序列圖2.chi.39 cDNA克隆的核苷酸序列以及相應蛋白質的推測氨基酸序列圖3.巨噬細胞產生的幾種不同的幾丁質三苷酶圖4.幾種幾丁質酶蛋白質家族成員中推定的活性中心區域的序列對比圖5.從脾臟中純化的39kDa和50kDa幾丁質三苷酶和轉染COS細胞生產的39和50kDa幾丁質三苷酶的免疫滴定。
本發明的詳細描述人類不斷地暴露于幾丁質(或含幾丁質微生物)面前這一事實強烈地提示著人類應該也具有降解這類材料的能力。否則，在生命進程中就會不可避免地逐漸引起幾丁質的溶酶體積累，例如在不斷與含幾丁質微生物接觸的肺泡巨噬細胞中。但是，這種幾丁質的積累從未見到過。這一現象促使我們去研究人類巨噬細胞中幾丁質酶活性的存在。事實上，如下所述，我們能夠確定，與以前的見解相反，巨噬細胞能產生一種與其它非哺乳動物生物中見到的幾丁質酶活性相似的幾丁質酶(17，18)，該酶具有很高的水解幾丁質的活性，而且顯示出幾丁質酶的其它一些共有的特征。基于最初鑒定這種新酶所用的底物，如4-甲基傘形酰-幾丁質三苷，人幾丁質酶被命名為幾丁質三苷酶(chitotriosidase)(17)。
最近在我們實驗室討論了大量的有關幾丁質三苷酶的新發現，這些信息增加了這種新發現的酶在將來的前景。
中等水平的幾丁質三苷酶可在溶酶體或特殊的嗜中性粒細胞顆粒中檢測到，在紅細胞，血小板，淋巴細胞和單核細胞中未能發現幾丁質三苷酶活性。我們觀察到，中性粒細胞暴露于脂多糖(LPS)導致幾丁質三苷酶的釋放。健康的志愿者注射GM-CSF也會導致血漿中幾丁質三苷酶活性的暫時上升，已被假定是由于中性粒細胞分泌酶所引起的。幾丁質三苷酶的釋放是模仿乳褐質在分離的血液中性粒細胞中沒能檢測到幾丁質三苷酶mRNA。它提示這種酶在骨髓中這些細胞的前體中生產的。
幾丁質三苷酶可以在巨噬細胞中大批地產生和分泌。在培養的單核細胞向巨噬細胞的分化過程中，幾丁質三苷酶的產生是一個晚期事件在細胞培養一周之后，第一條mRNA及相應的酶活性才被檢測出來，而其它的巨噬細胞標記例如酒石酸抗性酸性磷酸酶在分化過程中的極早期就已被誘導出來。在外周血液來源的細胞的長期培養過程中，自發發生的巨噬細胞的一種特定的活化，已被發現是幾丁質三苷酶的誘導所必需的。分離的大鼠外周巨噬細胞即使經過長期的培養，也不產生幾丁質三苷酶。因此假設某些類型的已分化的組織巨噬細胞已不再能合成幾丁質三苷酶。另外，并非每個引起巨噬細胞激活的因子都同時會誘導幾丁質三苷酶的表達。我們注意到帶有脂多糖(LPS)的單核細胞來源的巨噬細胞的活化事實上會降低幾丁質三苷酶的分泌。
一種使巨噬細胞產生幾丁質三苷酶的有力促進因子明顯的是由于溶酶體(糖)脂類的積累。已注意到在各種溶酶體脂沉積中幾丁質三苷酶的活性升高，例如，Nieman-Pick癥，Krabbe癥，GMI神經節苷脂沉積癥，以及Wolmann癥，雖然比Gaucher癥中要少。有趣的是，以特異性寡糖或粘多糖的積累為特征的溶酶體儲存失調不與幾丁質三苷酶升高相伴。已經很清楚的是在Gaucher癥患者的細胞中葡腦糖苷脂酶的缺乏不會引起幾丁質三苷酶的過量產生。Gaucher癥前期癥狀或非Gaucher癥沒有顯示出異常的幾丁質三苷酶水平。異常的酶水平實際與Gaucher癥的臨床癥狀；即在組織和骨髓中脂負載巨噬細胞的發生有關。
最近發現血漿中幾丁質三苷酶顯著上升是對處于某種活化狀態的巨噬細胞的存在的一種反映。上升的酶水平在遺傳性溶酶體脂沉積患者，內腔利什曼癥患者和肉樣瘤病患者中都能觀察到。令人感興趣的是注意到利什曼寄生蟲也存在于巨噬細胞的溶酶體中，并且可能流出類糖脂結構。肉樣瘤病的病因學仍未了解，一種可能是由于霉菌類感染因子引起的疾病，涉及具有巨噬細胞特征的含有多核性巨大細胞的免疫性肉芽腫的形成。
幾丁質三苷酶可能是其它有病理性巨噬細胞參與的疾病狀態的一種有用的標記。一個有吸引力的候選者是由動脈粥樣硬化形成的，其特征是存在膽固醇負載巨噬細胞。而且，我們還注意到X連鎖的腎上腺腦白質營養不良和多硬化癥患者的腦脊髓中幾丁質三苷酶的水平升高。據信在這兩種病中被激活的腦巨噬細胞(微神經膠質細胞)是疾病發生的基本特征。
很清楚，幾丁質三苷酶可用作Gaucher癥和其它的溶酶體脂沉積的診斷標記。另外，檢測血漿中酶的水平的升高可以用來診斷肉樣瘤病癥，腦脊液中酶水平的上升可診斷一些神經系統的異常。而在治療過程中酶的水平的測定則是檢測治療效果的一個重要工具。
要使用人幾丁質酶(幾丁質三苷酶)作為體內抗含幾丁質微生物的藥劑，還必須具備一些條件。
很重要的一點是機體對幾丁質三苷酶的耐受能力，如上所述，據信人體內不含內源性幾丁質。與溶菌酶相似，幾丁質酶活性可能對人體無害。由于幾丁質三苷酶是循環系統中產生的內源性蛋白質，似乎對人體給予這種酶不會引起免疫反應。Gaucher癥患者的循環系統中可能有高濃度的幾丁質三苷酶，該癥為獲得性遺傳的溶酶體儲存失調，其以各種組織中大量產生葡糖神經酰胺負載巨噬細胞為特征(17)。Gaucher癥患者血漿中超量的酶沒有其它任何可見的有害并發癥。這一點提示人體可以很好地耐受循環系統中超常量的幾丁質三苷酶，滿足了將其用于抗含幾丁質病原體的一個重要前提。
為了能用作抗含幾丁質病原體的藥物，幾丁質三苷酶還必須是能以均一形式大量可得的。對于人幾丁質酶沒有一種遍在的天然來源。在尿液和胎盤中該酶的含量很低。這使得我們嘗試去分離編碼幾丁質三苷酶的cDNA。由于巨噬細胞中幾丁質三苷酶基因的專一性表達，所有其它被試的細胞類型的cDNA文庫都是幾丁質三苷酶cDNA陰性的。然而，從能大量分泌幾丁質三苷酶的長期培養的巨噬細胞mRNA中構建的cDNA文庫，已被證明富含編碼幾丁質三苷酶的cDNA(占總cDNAs的0.1％)。以這種方式已有兩種cDNAs被鑒定和克隆。
這兩種不同的cDNA的產生是由于RNA的可變拼接方式所致，產生了兩種不同但都有功能的mRNA。在COS細胞中表達這兩種cDNA，合成并分泌了兩種不同的幾丁質三苷酶蛋白質，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測得的表觀分子量分別為39kDa和50kDa。這兩種重組產生的幾丁質三苷酶同工酶，分別命名為幾丁質酶50和幾丁質酶39，都具有酶活性。對它們進一步的性質分析表明它們的比，即單位量抗原的酶活性，與從組織中分離出來的或是存在于血漿中的幾丁質三苷酶的比活性是相同的。
如同在“試驗數據”一部分中所詳述的，兩種幾丁質三苷酶蛋白質大部分相同，僅僅在C-端部分有區別。同工酶含有屬于糖基水解酶18家族的幾丁質酶的高度保守的催化中心區域(19)。克隆的cDNA的核苷酸序列預示這兩種幾丁質三苷酶蛋白質都缺失了N-鍵合的聚糖。事實上，39kDa形式的酶中未能發現任何聚糖的存在。而50kDa形式中不能排除O-糖基化的存在。
這些發現表明使用傳統技術大規模生產這兩種重組人幾丁質三苷酶是可行的。而且，不僅在真核細胞中生產是可行的，而且在原核細胞中也可生產，因為這些微生物也能自發生產與之高度同源的蛋白，例如粘質沙雷氏菌。一套純化幾丁質三苷酶的方法已開發成功(18及下述)。因此，獲得適于人用的純的、單一態的大量的這兩種重組人幾丁質三苷酶是可能的。
39kDa幾丁質酶不是糖基化蛋白質，所以它在真核細胞中的生產肯定是可行的。在提供一種正確的前導序列后，能夠產生和分泌高度同源性幾丁質酶的細菌原則上應能分泌正確折疊的人類幾丁質三苷酶到胞外空間。另外，還可以考慮使用酵母細胞生產重組幾丁質三苷酶，至少是39kDa的幾丁質酶。雖然如此，卻不能排除這種可能，即50kDa幾丁質酶不僅能在高等真核細胞中產生，而且也能在低等真核細胞甚至在原核細胞中生產。
用傳統技術在昆蟲細胞，植物細胞或脊椎動物細胞中生產幾丁質酶應該是可能的。最后，轉基因動物可望成為在其乳汁中大量生產幾丁質酶的生產者。已觀察到在37℃時，加到牛奶中的幾丁質酶在幾個小時內是完全穩定的。
一種酶作為治療藥物使用時的另一種限制是由于它在體內的生存和功能發揮所形成的。因而把注意力集中到了幾丁質三苷酶的性質上了。
兩種形式的重組幾丁質三苷酶(幾丁質酶39和50)都被證明是對各種蛋白酶穩定的。只是在變性之后才成功地對其完成了蛋白水解，如在SDS存在時加熱的條件下。37℃時血清或組織液的延時培養并未導致酶活性的可檢測的損失，暗示該酶是對血清蛋白酶不敏感的。類似的，37℃時，在含有大量各種其它分泌的裂解酶的巨噬細胞調節的培養基中，幾丁質三苷酶也是穩定的。
還有分析揭示在pH范圍3-8內幾丁質三苷酶是相當穩定和具有酶解活性的。而且在50℃時，該酶完全穩定，將酶液點在濾紙上室溫放置數天后，酶活性仍可恢復。在-20℃或-70℃儲存并經過重復的凍融過程后酶活性無損失。
所有這些觀察結果說明幾丁質三苷酶異構是真正穩定的酶，本質上對變性作用有高度抗性，而且顯示出在各種環境下都能強有力地發揮功能。
幾丁質三苷酶的靜脈應用的前提是它的清除。在血液中，占優勢的同工酶是50kDa蛋白質。而在組織中39kDa同工酶占優勢。這一現象的形成可能是由于50kDa蛋白被吸收隨之被水解成在溶酶體環境中顯著穩定的39kDa形式。大鼠中的實驗表明在血液循環中50kDa形式的半壽期比39Kda的要長。根據靜脈注射過的大鼠血液中人幾丁質三苷酶活性消失的測定結果，其消除速度并不快，半壽期大約為1個小時。每日僅有極少量的幾丁質三苷酶被近管排到尿液中。據猜測可能有些酶被近管上皮細胞重新有效地吸收了，因為在腎臟中發現能夠富集許多“溶酶體加工的”39kDa酶。這些觀察提示靜脈注射可以在血液循環系統中較長時間內維持高水平的人幾丁質酶活性，從而，允許酶到達不同的組織之中。
純化的幾丁質三苷酶能很好地水解幾丁質和人工合成的類幾丁質底物如PNP-幾丁質三苷，PNP-幾丁質二苷，4-甲基傘形酰-幾丁質三苷和4-甲基傘形酰-幾丁質二苷。而且，注意到在真菌(毛霉)中加入幾丁質三苷酶能抑制其生長。由于幾丁質三苷酶與其它物種的幾丁質酶之間的高同源性，這些發現是預料之中的事。
總之，兩種幾丁質三苷酶都有作為藥物使用的優勢。兩種酶都較易通過傳統的重組技術生產。在各種條件下酶都極其穩定而且有酶解活性。重組幾丁質酶39和幾丁質酶50，以及組織幾丁質三苷酶都不會立即從血液循環中消除(至少在大鼠模型中如此)，而且原則上能到達各種組織部位。
以上有關幾丁質三苷酶的發現促使我們在此宣稱天然的及重組的幾丁質三苷酶(幾丁質酶)是一種有吸引力的能用作抗含幾丁質或能被這些酶水解的相關結構的微生物感染的疾病的藥物。
兩種幾丁質三苷酶，幾丁質酶50和幾丁質酶39，它們的酶活性質總是一致的，即比活性，適用pH值范圍和穩定性。兩種幾丁質酶都可以用作抗含幾丁質病原體(見表1)的藥物。含幾丁質病原體的感染可能發生在身體的各個部位。由于它們的獨特性質，幾丁質酶被認為是適用于各個身體部位的。
局部應用被認為是治療發生于皮膚表面的真菌感染。通過局部給藥，還可以治療眼部、生殖道及腸道的含幾丁質微生物的感染。呼吸系統的相關感染可以通過含酶的霧劑治療。口服給藥可以用來抗口腔或胃腸道的含幾丁質微生物的感染。最后如前文所述，靜脈給藥可以抗血液或組織中的病原體，無論是細胞內還是細胞外的。另外應有研究揭示通過使用特異性的幾丁質酶異構體是否可能有更專一性的定位。
本發明還包括一些變體和修飾，特別是如下的可能性A.重組人幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶的混合使用在植物和魚類中幾丁質酶在抗真菌感染方面的重要作用已有詳盡報道。在植物中，由于真菌細胞壁是由幾丁質和β-葡聚糖原纖(15)混合物組成的，所以幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶是協同作用的。據信人類既不生產幾丁質酶也不產生β-葡聚糖酶，已注意到長期培養的巨噬細胞不僅能夠分泌幾丁質裂解酶，而且能具有裂解染料標記的β-葡聚糖的酶活性。因此我們猜想，與植物中的情形類似，將人幾丁質酶和β-葡聚糖酶混合使用應該比單獨使用其中的一種酶更加有效。分離長期培養的巨噬細胞產生的β-葡聚糖酶，隨后克隆其相應的cDNA，應該使重組人β-葡聚糖酶的生產成為可能。
B.修飾的重組人幾丁質酶的使用對幾丁質三苷酶的三維結構及其各結構域功能的深入了解可以為了一些特殊的用途而對酶進行工程化的修飾。例如，缺失了對酶的活性和專一性無關的結構域的重組酶的生產，可以使得核心蛋白更小但活性仍在，因而能更容易地滲透到身體的某些特殊部位。有關18家族和19家族的糖基化水解酶現有的和迅速擴展的知識，提示著工程化的修飾形式的幾丁質酶是確切可行的。
除了治療用途之外，本發明還包括預防方面的用途。
我們觀察到血漿中幾丁質三苷酶的活性隨著年齡增長而上升，60歲以上的人體內血漿中的水平比小孩的要平均高幾倍。另外，我們發現大約每十五個人中有一人不能產生有活性的幾丁質三苷酶(見文獻17)。這些個體的血漿和尿液中，以及淋巴細胞、長期培養的源于外周血液單核細胞的巨噬細胞中，都缺乏酶活性。在Gaucher癥患者和正常個體中幾丁質三苷酶缺乏的發生頻率是相似的。酶活性缺乏的患者和那些血漿酶活性升高了幾千倍的患者的臨床表現是一致的。它表明幾丁質三苷酶的升高是Gaucher癥的臨床表現的一種信號而不是前提條件。
我們注意到幾丁質三苷酶缺乏具有遺傳性。從幾丁質三苷酶缺乏的個體的外周血液單核細胞中得到的巨噬細胞的長期培養過程中，可見同蛋白質一樣，幾丁質三苷酶mRNA的水平也是大大降低了的。殘存的幾丁質三苷酶蛋白質表現出正常的大小，但卻喪失了酶的活性，這一事實表明至少在這些情形下實質的缺陷是在幾丁質三苷酶基因上的一些突變。代謝標記和Northern雜交分析表明這些突變導致了催化能力受損的幾丁質三苷酶蛋白的合成的減少。
不能排除由于幾丁質三苷酶的缺乏會伴隨一些不利。例如，對含幾丁質病原體的抗性會降低，巨噬細胞中溶酶體對幾丁質的降解作用會減弱，從而導致細胞的異常行為。仍需繼續研究以弄清幾丁質三苷酶的缺乏是否會真的帶來什么危險。如果這一點被證實，可以考慮給幾丁質三苷酶缺乏癥患者進行預防性注射。
其它可能導致幾丁質三苷酶的活性的功能性缺乏的情形是免疫缺陷狀態。我們注意到在由于艾滋病毒(HIV)感染而引起免疫缺陷的患者中，平均說來其血漿中幾丁質三苷酶的水平都下降了。另外，還注意到對肉樣瘤病患者的皮質類固醇治療會引起幾丁質三苷酶活性的迅速下降。很明顯，活化的巨噬細胞的存在是保持循環中正常幾丁質三苷酶水平的一個重要因素。可以考慮對免疫功能不全因而被含幾丁質病原體感染的危險大增的個體提供重組幾丁質三苷酶。
重組幾丁質三苷酶的局部應用，還可以考慮用在外傷上，以降低真菌感染的危險。
人幾丁質酶還可以被開發成用于醫學目的的降解注入的或植入的幾丁質基結構的工具。
例如，藥物可以摻在幾丁質基膠囊中(“幾丁質體”)。同時在膠囊中存在的一定量的人幾丁質酶能夠確保藥物的可控制的釋放。當藥物儲存在幾丁質基質中時可望得到緩慢地逐漸地釋放。在此系統中使用人類的酶可以實現幾丁質基膠囊的分解而又不至于引起免疫反應。用于這一系統中的藥物可以從小分子化合物到用于酶學和基因治療目的的蛋白質和核酸片段。幾丁質(或其類似物)已被用作藥物的載體(20)。
另一種相關的用途是將幾丁質三苷酶用于含有幾丁質作為結構單元的植入物的迅速降解。在植入物只是臨時不得不完成其功能時這一點是很有用的，給予重組幾丁質三苷酶可使之很方便地被“溶解”掉。
重組幾丁質三苷酶還可以在來自體內條件下用作殺真菌的化合物。例如，當某種人類細胞需要在無抗生素時培養并且將被重注入人體內時，其培養基中就可以加入重組幾丁質三苷酶(或是與β-1，3-葡聚糖酶混合使用)。這方面的例子可以是用于基因治療目的的細胞的來自體內培養或是用作傷口愈合目的的角質細胞的來自體內的培養。
最后，重組人類幾丁質三苷酶(或是與β-1，3-葡聚糖酶的混合物)還可以用作牙膏和體膚露的添加劑，以防止真菌感染。
下面將通過一些實施例對本發明作詳細說明，這些實施例僅僅是為了解釋而不是要限制本發明的范圍。
實施例1編碼人幾丁質三苷酶的cDNA的克隆與組成用下列策略克隆編碼人幾丁質三苷酶的cDNA。從1型Gaucher癥患者脾臟中純化幾丁質三苷酶，因為該器官中極富幾丁質三苷酶活性(18)。測定幾丁質三苷酶的N端氨基酸序列，并將該信息應用于幾丁質三苷酶cDNA的克隆。首先，應用已知的幾丁質三苷酶的N-端氨基酸序列設計一條簡并的有義寡核苷酸5’-TGYTAYTTYACNAAYTGGGC-3’。其次，根據幾丁質三苷酶中推測為催化活性中心的高度保守的結構域設計一條簡并的反義核苷酸5’-CCARTCIARRTYIACICCRTCRAA-3’。
通過RT-PCR技術，這些寡核苷酸被用來擴增一個DNA片段。為此目的，從大量分泌幾丁質三苷酶的長期培養的巨噬細胞中提取了總RNA。使用Super ScriptTM RNAseH反轉錄酶和寡dT，開始合成cDNA的第一條鏈。堿水解后，用乙醇沉淀cDNA，備用做模板。PCR按標準條件進行。通過RT-PCR得到的DNA片段大小是所預期的(根據同幾丁質家族的其它成員同源性推測)。片段純化后，用T4DNA聚合酶處理，克隆進載體pUC19中的HindII位點。通過雙脫氧核苷酸終止法測得的序列和純化的人幾丁質三苷酶的N-端氨基酸序列完全吻合，使之可以用作鑒定完整長度的幾丁質三苷酶cDNA的探針。
用來自培養的巨噬細胞中的總RNA制備了cDNA文庫。用GIBCO-BRL公司的Super Script Choice System cDNA合成試劑盒從RNA出發制備了雙鏈巨噬細胞cDNA。雙鏈的cDNA與過量的非回文結構的Bst XI連接子連接，并用低熔點膠分離。將超過500bp的cDNA純化后連到載體pcDNA1(InVitrogen)中的BstXI位點。連接混合物電穿孔轉化進大腸桿菌菌株MC106/P3，得到巨噬細胞cDNA文庫。
通過隨機引物方法，用放射性標記的部分幾丁質三苷酶cDNA探針進行克隆雜交，篩選cDNA文庫。與探針的雜交在1mM EDTA，0.5M磷酸氫二鈉緩沖液(pH7.2)中，并在7％(w/v)的SDS存在下于65℃進行4小時。隨后，用含0.1％SDS的150mM氯化鈉，15mM檸檬酸鈉(pH7.0)洗滌膜兩次。然后放射自顯影。大約有0.1％的克隆對部分幾丁質三苷酶cDNA克隆的雜交顯陽性。按上述方法對約20個克隆測序。用這種方式鑒別出了兩個不同的全序列的幾丁質三苷酶cDNA。這兩個克隆分別被稱作chi.50和chi.39。
chi.50的cDNA序列顯示的開放讀框起始密碼子ATG位于第13位而終止密碼子TGA位于第1410位(見圖1)。該開放讀框編碼的蛋白質具有一個特征性的N-端ER信號肽，緊接著已確定的幾丁質三苷酶的N-端序列。cDNA序列并未指明有可能的N-糖基化位點的存在，這一點與分離的幾丁質三苷酶中不存在N-鍵合葡聚糖一致。所預測的蛋白質，在去掉信號肽后長度為445個氨基酸殘基，計算分子量為49kDa。用培養的巨噬細胞的代謝標記試驗揭示，這些細胞優先合成和分泌的幾丁質三苷酶蛋白質在SDS存在的還原條件下經聚丙烯酰胺凝膠電泳測得表觀分子量為50kDa。預測的50kDa的人幾丁質三苷酶的C-端部分富含絲氨酸殘基，理論上能形成O-糖基化。在50kDa的人幾丁質三苷酶中這種類型的聚糖尚未被排除或確認。
chi.39的cDNA的核苷酸序列顯示了一個編碼387個氨基酸殘基的幾乎相同的幾丁質三苷酶蛋白的開放讀框(見圖2)。在去掉疏水性的前導肽后，chi.39 cDNA預期的蛋白質有366個氨基酸殘基，分子量為39kDa。信號肽和起始384個氨基酸和chi.50 cDNA編碼的幾丁質三苷酶蛋白質中的相應部分是相同的。39kDa的和50kDa的幾丁質三苷酶之間的區別僅僅在于C端的3個氨基酸殘基。
比較兩種cDNA的核苷酸序列表明在chi.39 cDNA中插入了一段額外的核苷酸序列。
另外，chi.39 cDNA編碼的幾丁質三苷酶中沒有預測到N-糖基化作用。
不同形式的幾丁質三苷酶之間的關系示于圖3。
兩種克隆的幾丁質三苷酶cDNA的組成強烈地暗示可變拼接方式產生了兩種不同的mRNA。與chi.50 cDNA相比，chi.39 cDNA含有一個附加的幾丁質三苷酶基因外顯子，這點已被試驗證實。基因組幾丁質三苷酶cDNA已被克隆且被部分測序，序列表明確實有內含子-外顯子轉換，與這兩種不同的cDNA克隆(代表不同的mRNA)是幾丁質三苷酶RNA的可變拼接而形成的這一假設相對應。
培養的巨噬細胞的代謝標記試驗表明，起始合成的是大量的50kDa幾丁質三苷酶和極少量的39kDa蛋白質。根據這些發現，RNA酶保護試驗揭示了在巨噬細胞中chi.50 RNA和少量的chi.39RNA的共同存在。還注意到分泌的50kDa的幾丁質三苷酶在被巨噬細胞吸收后能夠被水解成38-39kDa的蛋白質。有可能一些剛合成的幾丁質三苷酶尚未被分泌，而是直接到達溶酶體中，在那里發生水解。
從Gaucher癥患者的脾臟中至少可分離到兩種幾丁質三苷酶的異構體。在SDS存在下的PAGE電泳測得的表觀分子量是50和39kDa。使用電噴射質譜精確測定了從組織中分離的39kDa幾丁質三苷酶的分子量，這種分析指示39kDa組織酶(其有正常的N-端)經受過C-端的蛋白水解過程。應該注意到同50kDa前體(除去C-端83個氨基酸)一樣，39kDa(除去C-端4個氨基酸)也可能產生組織酶。
對EMBL和Gene Bank數據庫的檢索揭示了在兩種人類幾丁質三苷酶和一組從不同物種中得到的幾丁質酶以及有關蛋白質之間有顯著同源性。所有這些同源蛋白質都屬于“幾丁質酶蛋白質家族”(18，19)。
注意到同源性最強的區域是推測為幾丁質酶催化活性中心的基本單元的區域(見圖4)。還鑒別了幾丁質家族的另外的同源區域。在圖1中，用黑體字標出了39kDa幾丁質三苷酶與幾丁質酶蛋白質家族9個成員中的至少6個相同的氨基酸。
50kDa人幾丁質三苷酶的預測的C-端部分顯示僅僅與分別從Manduca sexta和Brugia malayi中得到的兩種幾丁質酶同源。在后者中報道過O-糖基化作用(12)。
實施例2人幾丁質三苷酶的重組生產通過DEAE-Dextran方法(見21)用兩種幾丁質三苷酶cDNA轉染COS-1細胞。通過測量分泌的酶的活性來計量幾丁質三苷酶的生產。培養基中的幾丁質三苷酶的活性測定使用前述的產生熒光的底物4--甲基傘形酰-幾丁質三苷。
COS-1細胞培養基中，無論是用chi.50還是用chi.39轉染過的，都在轉染7天后含有大量的幾丁質三苷酶活性(5-20IU/ml)。而在無轉染的COS-1細胞或是轉染了以無義的方向插入的相同cDNA的COS-1細胞中都未檢測到活性。
使用抗人幾丁質三苷酶的兔抗血清的免疫滴定，分析了COS細胞的幾丁質三苷酶的產生。這種抗血清能夠抑制人類幾丁質三苷酶的活性。圖5顯示，與分離的脾幾丁質三苷酶一樣，抗血清可以使幾丁質三苷酶失活。這個發現表明在每單位抗原的酶活性方面，這兩種重組幾丁質三苷酶與脾中的酶是相似的。
這兩種重組幾丁質三苷酶(50和39幾丁質酶)與脾臟幾丁質三苷酶相比較，其pH適應范圍，穩定性，對于4-甲基傘形酰-幾丁質三苷和4-甲基傘形酰-幾丁質二苷的Km值沒有顯著的差別。
代謝標記實驗表明，分別用chi.50 cDNA和chi.39 cDNA轉染的COS細胞產生的是預期分子量分別為50kDa和39kDa的幾丁質三苷酶蛋白質。
實施例3在此之前我們曾開發了一套從Gaucher癥患者的脾臟中得到的幾丁質三苷酶的純化方法。該方法可以得到純化的39kDa幾丁質三苷酶和部分純化的50kDa的酶。
簡而言之，是將不含去污劑的提取物加到多緩沖液交換柱(PBE94，Pharmacia Biotech Inc.)，交換柱用25mM的Tris-緩沖液(pH8.5)平衡和洗脫。收集活性最高的洗脫峰并用超濾法濃縮。然后上Sephadex C-1000柱并用25mM的Tris緩沖液(pH8.0)洗脫。收集活性峰值部分，濃縮后進行制備型等電聚焦電泳，電泳使用Pharmacia公司的含0.5％(v/v)Triton X-100和0.1％(w/v)的兩性電解質(pH4-9范圍，Serva公司產)的Ultrodex(Pharmacia)進行。電泳在10℃，400V進行一夜后，分離膠條并用水提取。等電點8.0的部分含有在SDS-PAGE電泳中表觀分子量為39kDa的純的幾丁質三苷酶。等電點在7.2左右的部分含有混雜了其它蛋白的50kDa的幾丁質三苷酶。
不純的50kDa的幾丁質三苷酶的完全純化可以這樣進行，將酶制劑與幾丁質顆粒在4℃時于pH5.2的檸檬酸/磷酸緩沖液中保溫，稍后用含4M氯化鈉的同種緩沖液在室溫下洗脫。污染物將不會結合，或用含0.1M的氯化鈉和0.5％(v/v)的Triton X-100的冰預冷的磷酸緩沖液洗滌幾丁質顆粒將其完全除去。
同樣的分離方法可以用來從幾丁質三苷酶cDNA轉染的培養細胞的培養基中分離重組幾丁質三苷酶(幾丁質酶)。
純化的39kDa和50kDa的重組幾丁質三苷酶的比活性和純化的組織中的酶是一樣的，即，在前述條件下，使用人工合成的4-甲基傘形酰-幾丁質三苷作為底物，其活性為6-6.5mmol底物水解/mg蛋白×小時。
實施例4幾丁質的降解純化的50kDa和39kDa的組織幾丁質三苷酶，以及純化的重組技術生產的39kDa和50kDa的幾丁質三苷酶，都能水解4-甲基傘形酰-幾丁質三苷和4-甲基傘形酰-幾丁質二苷。對幾丁質二苷的活性和對幾丁質三苷的活性的比為大約0.7。而且，對硝基苯-幾丁質三苷和對硝基苯-幾丁質二苷也能夠被有效水解。
幾丁質苯胺藍(Sigma)溶于pH5.2，終濃度為10mg/ml的檸檬酸/磷酸緩沖液。用它來檢測幾丁質酶的活性。測550nm波長下的吸光確定可溶性苯胺藍的釋放來檢測幾丁質的降解(18)。用Sigma公司的源于粘質沙雷氏菌的幾丁質作為對照。人幾丁質三苷酶的對于4-甲基傘形酰-幾丁質三苷的水解活性與細菌幾丁質酶的活性作了比較，見文獻18。
人幾丁質三苷酶對溶壁微球菌的細胞壁懸液未測到明顯活性，說明此酶缺少溶菌酶活性。
實施例5為了試驗人幾丁質三苷酶能否發揮抗真菌作用，在覆有一層Cellophane膜的平板(含麥芽提取物，蛋白胨，葡萄糖和瓊脂)上培養含幾丁質真菌(大毛霉)，覆蓋膜是為了防止菌絲破壞平板瓊脂表面(見參考文獻16)。切下個別的扇區，在顯微鏡下計數。純化的幾丁質酶50和幾丁質酶39對0.5M氯化鈉透析。將含酶溶液的樣品和0.15M氯化鈉加到菌絲尖部。顯微鏡分析表明，酶的使用立即中止了菌絲的生長，形態也發生了變形。用氯化鈉則沒有這種效果。即使是用的酶的濃度只有0.005mg/ml這么少，也檢測到了它對菌絲生長的負效應。


圖1.chi.50 cDNA克隆的核苷酸序列及相應蛋白質的推測氨基酸序列。
下劃線的是疏水性信號肽(氨基酸1-21)。與幾丁質酶家族9個成員中的至少6個相同的幾丁質三苷酶的氨基酸用黑體字印出。除了從苜蓿銀紋夜蛾病毒和Nicotiana tabacum中得到的幾丁質酶之外，所用的幾丁質酶家族的9個成員列于圖4的說明中。
圖2.chi.39 cDNA克隆的核苷酸序列及相應蛋白質的推測氨基酸序列。
下劃線的是疏水性信號肽(氨基酸1-21)。
圖3.在巨噬細胞中產生的不同幾丁質酶異構體的圖示。
由于拼接方式的不同，產生了兩種不同的mRNA，翻譯成表觀分子量為39kDa和50kDa的幾丁質三苷酶蛋白質。然而，有些酶可能直接進入到溶酶體或是通過內吞到達那里。在溶酶體中，在C端可能發生另外的裂解過程。產生大約38-39kDa的形式。這兩種前體(39-50kDa)能用這種方式成為同一種溶酶體內的形式。不能排除50kDa幾丁質三苷酶中的C-端含有O-連接的聚糖。39kDa的前體和溶酶體中的幾丁質三苷酶則不含聚糖。
圖4.在某些幾丁質酶蛋白家族成員中推測的活性中心區域的序列對比這些蛋白質包括人幾丁質三苷酶；來源于苜蓿銀紋夜蛾病毒的幾丁質酶(GenBank L22858)；來源于煙草角蟲Manduca sexta的幾丁質酶(GenBank U02270)；來源于線蟲Brugia malayi的內源幾丁質酶(GenBank M73689)；一種人輸卵管糖蛋白(GenBankU09550)；HCgp-39，一種由人軟骨細胞和滑液細胞產生的糖蛋白(GenBank M80927)；YM-1，一種被激活的小鼠巨噬細胞中的分泌性蛋白(Pir S27879)；一種源于真菌Aphanocladium album的幾丁質酶(SwissPort P32470)；一種源于絲狀真菌Trichoderma harzianum的幾丁質酶(GenBank L14614)；源于原核環狀芽孢桿菌的幾丁質酶Al(SwissPort P20533)；以及從植物Nicotiana tabacum中得到的V類幾丁質酶(GenBank X77110)。與幾丁質三苷酶相同的殘基用陰文字體給出。蛋白HCgp-39和YM-1預計為是不能裂解幾丁質的。
圖5.從脾臟中純化的39和50kDa幾丁質酶以及轉染的COS細胞生產的39和50kDa的酶的免疫滴定。
含有純化的39kDa脾臟幾丁質三苷酶，或是由chi.50 cDNA轉染的COS細胞生產的50kDa幾丁質酶，或由chi.39 cDNA轉染的COS細胞生產的39kDa的幾丁質酶的制劑，與不同量的兔(抗人脾臟幾丁質三苷酶)抗血清在室溫、磷酸鹽緩沖液中保溫1小時。
抗體與幾丁質三苷酶的結合引起酶活性的喪失。將酶制劑與抗血清保溫后的殘留酶活力可以通過測定其對底物4-甲基傘形酰-幾丁質三苷的活性來確定(18)。不同幾丁質三苷酶的免疫滴定曲線的相似性表明在單位抗原酶活方面這些酶是相同的。
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序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱阿姆斯特丹大學(B)街道Spui21(C)城市阿姆斯特丹(D)州Noord-Holland(E)國家荷蘭(F)郵政編碼1012WX(A)姓名約翰內斯·馬麗亞·弗朗西斯庫斯·赫拉爾杜斯·阿爾特斯(B)街道Sandbergstraat3(C)城市Abcoude(D)州Utrecht(E)國家荷蘭(F)郵政編碼1391EJ(ii)發明名稱人幾丁質酶，其重組生產，其分解幾丁質的用途及其在治療和預防感染性疾病中的應用(iii)序列數目16(iv)計算機可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，#1.30版(EPO)(v)本申請數據申請號US08/486,839(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性未知(D)拓撲結構未知(ii)分子類型其它核酸(iii)假設無(xi)序列描述SEQ ID NO1TGYTAYTTYA CNAAYTGGGC 20(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性未知(D)拓撲結構未知(ii)分子類型其它核酸(iii)假設無(ix)特征(A)名稱/關鍵misc-特征(B)位置6..15(D)其它信息/產物＝“N代表肌苷”(xi)序列描述SEQ ID NO2CCARTCNARR TYNACNCCRT CRAA24(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度1643個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性未知(D)拓撲結構未知(ii)分子類型cDNA(iii)假設無
(xi)序列描述SEQ ID NO3CTGAGCTGCA TCATGGTGCG GTCTGTGGCC TGGGCAGGTT TCATGGTCCT GCTGATGATC60CCATGGGGCT CTGCTCCAAA ACTGGTCTGC TACTTCACCA ACTGGGCCCA GTACAGACAG120GGGGAGGCTC GCTTCCTGCC CAAGGACTTG GACCCCAGCC TTTGCACCCA CCTCATCTAC180GCCTTCGCTG GCATGACCAA CCACCAGCTG AGCACCACTG AGTGGAATGA CGAGACTCTC240TACCAGGAGT TCAATGGCCT GAAGAAGATG AATCCCAAGC TGAAGACCCT GTTAGCCATC300GGAGGCTGGA ATTTCGGCAC TCAGAAGTTC ACAGATATGG TAGCCACGGC CAACAACCGT360CAGACCTTTG TCAACTCGGC CATCAGGTTT CTGCGCAAAT ACAGCTTTGA CGGCCTTGAC420CTTGACTGGG AGTACCCAGG AAGCCAGGGG AGCCCTGCCG TAGACAAGGA GCGCTTCACA480ACCCTGGTAC AGGACTTGGC CAATGCCTTC CAGCAGGAAG CCCAGACCTC AGGGAAGGAA540CGCCTTCTTC TGAGTGCAGC GGTTCCAGCT GGGCAGACCT ATGTGGATGC TGGATACGAG600GTGGACAAAA TCGCCCAGAA CCTGGATTTT GTCAACCTTA TGGCCTACGA CTTCCATGGC660TCTTGGGAGA AGGTCACGGG ACATAACAGC CCCCTCTACA AGAGGCAAGA AGAGAGTGGT720GCAGCAGCCA GCCTCAACGT GGATGCTGCT GTGCAACAGT GGCTGCAGAA GGGGACCCCT780GCCAGCAAGC TGATCCTTGG CATGCCTACC TACGGACGCT CCTTCACACT GGCCTCCTCA840TCAGACACCA GAGTGGGGGC CCCAGCCACA GGGTCTGGCA CTCCAGGCCC CTTCACCAAG900GAAGGAGGGA TGCTGGCCTA CTATGAAGTC TGCTCCTGGA AGGGGGCCAC CAAACAGAGA960ATCCAGGATC AGAAGGTGCC CTACATCTTC CGGGACAACC AGTGGGTGGG CTTTGATGAT1020GTGGAGAGCT TCAAAACCAA GGTCAGCTAT CTGAAGCAGA AGGGACTGGG CGGGGCCATG1080GTCTGGGCAC TGGACTTAGA TGACTTTGCC GGCTTCTCCT GCAACCAGGG CCGATACCCC1140CTCATCCAGA CGCTACGGCA GGAACTGAGT CTTCCATACT TGCCTTCAGG CACCCCAGAG1200CTTGAAGTTC CAAAACCAGG TCAGCCCTCT GAACCTGAGC ATGGCCCCAG CCCTGGACAA1260GACACGTTCT GCCAGGGCAA AGCTGATGGG CTCTATCCCA ATCCTCGGGA ACGGTCCAGCl320TTCTACAGCT GTGCAGCGGG GCGGCTGTTC CAGCAAAGCT GCCCGACAGG CCTGGTGTTC1380AGCAACTCCT GCAAATGCTG CACCTGGAAT TGAGTCGTAA AGCCCCTCCA GTCCAGCTTT1440GAGGCTGGGC CTAGGATCAC TCTACAGCCT GCCTCCTGGG TTTTCCTGGG GGCCGCAATC1500TGGCTCCTGC AGGCCTTTCT GTGGTCTTCC TTTATCCAGG CTTTCTGCTC TCAGCCTTGC1560CTTCCTTTTT TCTGGGTCTC CTGGGCTGCC CCTTTCACTT GCAAAATAAA TCTTTGGTTT1620GTGCCCCTCT TCAAAAAAAA AAA1643(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度466個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性未知(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(iii)假設無(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Val Arg Ser Val Ala Trp Ala Gly Phe Met Val Leu Leu Met Ile1 5 10 15Pro Trp Gly Ser Ala Ala Lys Leu Val Cys Tyr Phe Thr Asn Trp Ala20 25 30Gln Tyr Arg Gln Gly Glu Ala Arg Phe Leu Pro Lys Asp Leu Asp Pro35 40 45Ser Leu Cys Thr His Leu Ile Tyr Ala Phe Ala Gly Met Thr Asn His50 55 60Gln Leu Ser Thr Thr Glu Trp Asn Asp Glu Thr Leu Tyr Gln Glu Phe65 70 75 80Asn Gly Leu Lys Lys Met Asn Pro Lys Leu Lys Thr Leu Leu Ala Ile85 90 95Gly Gly Trp Asn Phe Gly Thr Gln Lys Phe Thr Asp Met Val Ala Thr100 105 110Ala Asn Asn Arg Gln Thr Phe Val Asn Ser Ala Ile Arg Phe Leu Arg115 120 125Lys Tyr Ser Phe Asp Gly Leu Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Gly Ser130 135 140Gln Gly Ser Pro Ala Val Asp Lys Glu Arg Phe Thr Thr Leu Val Gln145 150 155 160Asp Leu Ala Asn Ala Phe Gln Gln Glu Ala Gln Thr Ser Gly Lys Glu165 170 175Arg Leu Leu Leu Ser Ala Ala Val Pro Ala Gly Gln Thr Tyr Val Asp180 185 190Ala Gly Tyr Glu Val Asp Lys Ile Ala Gln Asn Leu Asp Phe Val Asn195 200 205Leu Met Ala Tyr Asp Phe His Gly Ser Trp Glu Lys Val Thr Gly His210 215 220Asn Ser Pro Leu Tyr Lys Arg Gln Glu Glu Ser Gly Ala Ala Ala Ser225 230 235 240Leu Asn Val Asp Ala Ala Val Gln Gln Trp Leu Gln Lys Gly Thr Pro245 250 255
Ala Ser Lys Leu Ile Leu Gly Met Pro Thr Tyr Gly Arg Ser Phe Thr260 265 270Leu Ala Ser Ser Ser Asp Thr Arg Val Gly Ala Pro Ala Thr Gly Ser275 280 285Gly Thr Pro Gly Pro Phe Thr Lys Glu Gly Gly Met Lau Ala Tyr Tyr290 295 300Glu Val Cys Ser Trp Lys Gly Ala Thr Lys Gln Arg Ile Gln Asp Gln205 310 315 320Lys Val Pro Tyr Ile Phe Arg Asp Asn Gln Trp Val Gly Phe Asp Asp225 330 335Val Glu Ser Phe Lys Thr Lys Val Ser Tyr Leu Lys Gln Lys Gly Leu340 345 350Gly Gly Ala Met Val Trp Ala Leu Asp Leu Asp Asp Phe Ala Gly Phe355 360 365Ser Cys Asn Gln Gly Arg Tyr Pro Leu Ile Gln Thr Leu Arg Gln Glu370 375 380Leu Ser Leu Pro Tyr Leu Pro Ser Gly Thr Pro Glu Leu Glu Val Pro385 390 395 400Lys Pro Gly Gln Pro Ser Glu Pro Glu His Gly Pro Ser Pro Gly Gln405 410 415Asp Thr Phe Cys G1n Gly Lys Ala Asp Gly Leu Tyr Pro Asn Pro Arg420 425 430Glu Arg Ser Ser Phe Tyr Ser Cys Ala Ala Gly Arg Leu Phe Gln Gln435 440 445Ser Cys Pro Thr Gly Leu Val Phe Ser Asn Ser Cys Lys Cys Cys Thr450 455 460Trp Asn465(2)SEQ ID 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Gln Thr Tyr Val Asp180 185 190Ala Gly Tyr Glu Val Asp Lys Ile Ala Gln Asn Leu Asp Phe Val Asn195 200 205Leu Met Ala Tyr Asp Phe His Gly Ser Trp Glu Lys Val Thr Gly His210 215 220Asn Ser Pro Leu Tyr Lys Arg Gln Glu Glu Ser Gly Ala Ala Ala Ser225 230 235 240Leu Asn Val Asp Ala Ala Val Gln Gln Trp Leu Gln Lys Gly Thr Pro245 250 255Ala Ser Lys Leu Ile Leu Gly Met Pro Thr Tyr Gly Arg Ser Phe Thr260 265 270Leu Ala Ser Ser Ser Asp Thr Arg Val Gly Ala Pro Ala Thr Gly Ser275 280 285Gly Thr Pro Gly Pro Phe Thr Lys Glu Gly Gly Met Leu Ala Tyr Tyr290 295 300Glu Val Cys Ser Trp Lys Gly Ala Thr Lys Gln Arg Ile Gln Asp Gln305 310 315 320Lys Val Pro Tyr Ile Phe Arg Asp Asn Gln Trp Val Gly Phe Asp Asp325 330 335Val Glu Ser Phe Lys Thr Lys Val Ser Tyr Leu Lys Gln Lys Gly Leu340 345 350Gly Gly Ala Met Val Trp Ala Leu Asp Leu Asp Asp Phe Ala Gly Phe355 360 365Ser Cys Asn Gln Gly Arg Tyr Pro Leu Ile Gln Thr Leu Arg Gln Glu370 375 380Leu Asn Gly385(2)SEQ ID 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Pro1 5 10(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性未知(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(iii)假設無(xi)序列描述SEQ ID NO14Phe Asp Gly Ile Asp Val Asp Trp Glu Tyr Pro15 10(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性未知(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(iii)假設無(xi)序列描述SEQ ID NO15Phe Asp Gly Val Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro1 5 10(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性未知(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(iii)假設無(xi)序列描述SEQ ID NO16Phe His Gly Leu Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro1 5 10
權利要求
1.一種基本上分離或純化的幾丁質酶，所說的幾丁質酶是人幾丁質酶，具有與圖1中所示的氨基酸序列或圖2中所示的氨基酸序列基本上相應的氨基酸序列，或者是具有基本上相似的幾丁質水解活性的所說人幾丁質酶的修飾形式。
2.權利要求1的幾丁質酶，其用基因工程化宿主細胞生產并從所說的宿主細胞或培養所說宿主細胞的培養基中分離出來，其中該酶的氨基酸序列是由與圖1中的核苷酸序列或與圖2中的核苷酸序列基本上相應的核苷酸序列所編碼的。
3.權利要求1的幾丁質酶，具有基本上與圖1中所示的氨基酸序列相應的氨基酸序列并且分子量大約為50kDa。
4.權利要求1的幾丁質酶，具有基本上與圖2中所示的氨基酸序列相應的氨基酸序列并且分子量大約為39kDa。
5.一種藥物組合物，包括權利要求1-4中任一項所述的幾丁質酶以及一種藥學上可接受的載體或稀釋劑。
6.一種用于人類個體中抗含幾丁質病原體感染的治療或預防用的藥物組合物，包括治療或預防有效量的權利要求1-4中任一項所述的幾丁質酶以及一種藥學上可接受的載體或稀釋劑。
7.權利要求6的藥物組合物，進一步包括治療或預防有效量的人類β-1，3-葡聚糖酶。
8.一種非藥物組合物，包括權利要求1-4中任一項所述的幾丁質酶以及一種載體或稀釋劑。
9.權利要求8的組合物，它是一種培養細胞的培養基。
10.權利要求8的組合物，它是一種培養人類細胞的培養基。
11.權利要求8的組合物，它是一種化妝品如體膚露，牙用品如牙膏，漱口水，或食品如牛奶，奶酪或其它乳制品。
12.一種幾丁質基制品，它包括幾丁質水解量的權利要求1-4中任一項所述的幾丁質酶。
13.權利要求12的幾丁質基制品，它是一種控制藥物釋放的含有藥物的藥物載體或植入物。
14.權利要求12的幾丁質基制品，它是一種起暫時功能的植入物。
15.一種用于人類個體中抗含幾丁質病原體感染的治療或預防方法，包括給予所說的人類個體權利要求5-7中任一項所述的藥物組合物。
16.一種制備人幾丁質酶的方法，所述的酶具有與圖1中所示的氨基酸序列或圖2中所示的氨基酸序列基本上相應的氨基酸序列，或者是具有基本上相似的幾丁質水解活性的所說人幾丁質酶的修飾形式，所述方法包括培養能夠生產所說的人幾丁質酶或其修飾形式的基團工程化宿主或宿主細胞，以及從所說的宿主或宿主細胞中或從培養所說宿主或宿主細胞的培養基中分離所生產的幾丁質酶。
17.權利要求16的方法，其中所說的幾丁質酶的氨基酸序列是由與圖1的核苷酸序列或與圖2的核苷酸序列基本上相應的核苷酸序列所編碼的。
18.一種能夠生產人幾丁質酶的基因工程化宿主細胞，所說的幾丁質酶具有與圖1中所示的氨基酸序列或圖2中所示的氨基酸序列基本上相應的氨基酸序列，或者是具有基本上相似的幾丁質水解活性的所說人幾丁質酶的修飾形式。
19.一種重組核酸，包括一種編碼與圖1中所示的氨基酸序列或圖2中所示的氨基酸序列基本上相應的氨基酸序列的核苷酸序列，或是互補于該核苷酸序列的核苷酸序列。
20.權利要求19的重組核酸，其中所說的核苷酸序列基本上相應于，或基本上互補于，圖1中所示的核苷酸序列或圖2中所示的核苷酸序列。
21.一種至少有8個核苷酸的寡核苷酸，具有基本上相應于或基本上互補于圖1中所示的核苷酸序列或圖2中所示的核苷酸序列的核苷酸序列，并且能夠在嚴格雜交條件下與編碼權利要求1-4中任一項所述的人幾丁質酶的核酸通過雜交結合。
22.一種至少含有8個氨基酸殘基的肽，含有源于圖1中所示的氨基酸序列或圖2中所示的氨基酸序列的氨基酸序列并且代表或模擬權利要求1-4中任一項所述的人幾丁質酶的一個抗原決定簇。
23.權利要求22的肽，具有與圖1中所示的氨基酸序列或圖2中所示的氨基酸序列相應的氨基酸序列且具有抗原性。
24.一種能夠與權利要求1-4中任一項所述的人幾丁質酶結合的抗體。
25.權利要求24的抗體，其是一種單克隆抗體。
26.一種診斷試劑盒，包括權利要求24或25的抗體，以及檢測抗原或抗體的診斷試劑盒的常規組分。
27.一種診斷試劑盒，包括權利要求22或23的肽，以及檢測抗原或抗體的診斷試劑盒的常規組分。
28.一種診斷試劑盒，包括權利要求21的寡核苷酸，以及檢測核酸的診斷試劑盒的常規組分。
29.一種診斷試劑盒，包括權利要求19或20的重組核酸，以及檢測核酸的試劑盒的常規組分。
30.一種診斷試劑盒，包括權利要求1-4中任一項所述的人幾丁質酶，以及檢測抗原或抗體的試劑盒的常規組分。
31.一種分解幾丁質的方法，包括使所說的幾丁質與權利要求1-4中任一項所述的人幾丁質酶在使幾丁質水解的條件下接觸。
全文摘要
本發明公開了一種具有圖1或圖2中所示的氨基酸序列的新的人幾丁質酶,及其具有相似的幾丁質水解活性的修飾形式,以及呈現其一個抗原決定簇的抗原性肽。還公開了通過工程宿主或宿主細胞生產重組人幾丁質酶的方法,以及編碼該酶的重組核酸,和人幾丁質酶特異性寡核苷酸。本發明也描述了用于對人體含幾丁質病原體感染的治療或預防的方法,或是用于分解如幾丁質基制品中的幾丁質的方法,與人幾丁質酶結合的抗體,包括人幾丁質酶、其抗原性肽、人幾丁質酶抗體、重組核酸或寡核苷酸的診斷試劑盒。
文檔編號A61K8/00GK1193352SQ96195511
公開日1998年9月16日 申請日期1996年6月6日 優先權日1995年6月7日
發明者約翰內斯·馬麗亞·弗郎西斯庫斯·, 赫拉爾杜斯·阿爾特斯 申請人:阿姆斯特丹大學