編碼18型人乳頭狀瘤病毒的dna的制作方法

專利名稱：編碼18型人乳頭狀瘤病毒的dna的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼純化的18型人乳頭狀瘤病毒的DNA分子及其衍生物。
附圖的簡要說明

圖1顯示了HPV18L1的核苷酸和推測的氨基酸序列。
圖2是HPV18的L1蛋白質(zhì)中的氨基酸變化的目錄。
圖3顯示了HPV18L2核苷酸和推測的氨基酸序列。
圖4顯示了在酵母中表達(dá)的HPV18L1蛋白的免疫印跡。
圖5顯示了在酵母中表達(dá)的HPV18L2蛋白的免疫印跡。
圖6是酵母中表達(dá)的HPV18L1蛋白形成的病毒樣顆粒的電子顯微圖。
背景技術(shù)：
在各種動(dòng)物包括人，羊，狗，貓，兔，猴，蛇和牛中都存在乳頭狀瘤病毒(PV)感染。乳頭狀瘤病毒感染上皮細(xì)胞，通常在感染位點(diǎn)誘導(dǎo)良性上皮或纖維上皮腫瘤。PV是種特異性感染因子人乳頭狀瘤病毒不感染非人動(dòng)物。
根據(jù)它們感染的寄主，可以將乳頭狀瘤病毒分成明顯不同的幾類。根據(jù)DNA序列同源性，進(jìn)一步可以將人乳頭狀瘤病毒(HPV)分成70多種類型。由于抗一種類型的乳頭狀瘤病毒感染的中和免疫性不賦予抗另一種類型的乳頭狀瘤病毒的免疫性，PV型似乎是類型特異性免疫源。
在人中，不同的HPV型引起不同的疾病。1，2，3，4，7，10和26-29型HPV在普通和免疫妥協(xié)的個(gè)體中引起良性疣。5，8，9，12，14，15，17，19-25，36，46-50型HPV在免疫妥協(xié)個(gè)體中引起扁平斑。6，11，34，39，41-44和51-55型HPV引起生殖器或呼吸粘膜產(chǎn)生良性濕疣。16和18型HPV引起生殖器粘膜的上皮發(fā)育不良并與大多數(shù)原位的和侵入的子宮頸，陰道，外陰和肛門管的癌有關(guān)。
乳頭狀瘤病毒是小的(50-60nm)，無包衣的，二十面體DNA病毒，它編碼最多達(dá)8個(gè)早期基因和兩個(gè)后期基因。病毒基因組的開放讀碼框架(ORF)被命名為E1至E7和L1和L2，其中“E”意指早，“L”意指晚。L1和L2編碼病毒衣殼蛋白。早期(E)基因與如病毒復(fù)制和細(xì)胞轉(zhuǎn)化的功能有關(guān)。
L1蛋白是較大的衣殼蛋白并且分子量為55-60kDa。L2蛋白是較小的衣殼蛋白，具有推測分子量55-60kDa和由聚丙烯酰胺凝膠電泳測定的表觀分子量75-100kDa。免疫學(xué)數(shù)據(jù)表明在病毒殼粒中大多數(shù)L2蛋白在L1蛋白內(nèi)部。L1ORF在不同乳頭狀瘤病毒之間是高度保守的。L2蛋白在不同乳頭狀瘤病毒之間幾乎不保守。
已經(jīng)鑒定L1和L2基因是好的免疫預(yù)防靶。對(duì)于棉尾兔乳頭狀瘤病毒(CRPV)和牛乳頭狀瘤病毒(BPV)系統(tǒng)的研究表明，用細(xì)菌中表達(dá)的L1和L2蛋白或使用疫苗載體的免疫方法保護(hù)動(dòng)物不受病毒感染。在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)乳頭狀瘤病毒L1基因中或使用疫苗載體導(dǎo)致組裝成病毒樣顆粒(VLP)，該病毒樣顆粒已經(jīng)用于誘導(dǎo)與保護(hù)免受病毒侵襲有關(guān)的高效價(jià)病毒中和抗體應(yīng)答。
在16型HPV后，HPV18是宮頸癌中發(fā)現(xiàn)的第二種最流行的HPV類型。在從世界各地收集的宮頸癌活檢的5-20％中檢測到HPV18(Ikenberg，H.1990.在侵襲性的生殖器癌中的人乳頭狀瘤病毒DNA。生殖器乳頭狀瘤病毒感染，G.Gross et al.，eds.p.85-112)。由于來自非洲和南美婦女的腫瘤活檢比來自歐洲和北美婦女的同樣的活檢更頻繁地含有HPV18，HPV18的感染似乎存在地理依賴性。之所以造成這些地理差異的潛在原因還未知。由于HPV18也與更具侵略性生長的癌有關(guān)并且在較溫和的前體損害，CINI-II中很少發(fā)現(xiàn)，開發(fā)抗HPV18感染的疫苗變得尤其必要。
發(fā)明概要本發(fā)明涉及編碼純化的18型人乳頭狀瘤病毒(18型HPVHPV18)的DNA分子和所述DNA分子的用途。
發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明涉及編碼純化的18型人乳頭狀瘤病毒(18型HPVHPV18)的DNA分子及其衍生物。這些衍生物包括但不限于該DNA編碼的肽和蛋白質(zhì)，抗該DNA的抗體或抗該DNA編碼的蛋白質(zhì)的抗體，含有該DNA的疫苗或含有該DNA編碼的蛋白質(zhì)的疫苗，含有該DNA或該DNA編碼的蛋白質(zhì)的免疫組合物，含有該DNA或該DNA起源的RNA或該DNA編碼的蛋白質(zhì)的試劑盒。
根據(jù)已知的方法如通過混合一種藥學(xué)可接受載體可以配制含有該DNA或該DNA編碼的蛋白質(zhì)的有藥學(xué)用途的組合物。在Remington’sPharmaceutical Sciences中可以找到這樣的載體和配制方法的例子。為了形成適于有效給藥的藥學(xué)可接受組合物，這樣的組合物將含有有效量的DNA或蛋白質(zhì)或VLP。這樣的組合物可以含有起源于一種以上類型的HPV的DNA或蛋白質(zhì)或VLP。
給個(gè)體施用足以治療或診斷PV感染的量的本發(fā)明的治療或診斷組合物。該有效量可以根據(jù)各種因素如個(gè)體的癥狀，體重，性別和年齡而變化。其它因素包括給藥的方式。通常，該組合物將以約1ug-約1mg范圍的劑量給藥。
該藥物組合物可以以各種途徑如皮下，局部，口，粘膜，靜脈內(nèi)和肌肉內(nèi)給個(gè)體給藥。
本發(fā)明的疫苗含有DNA，RNA或該DNA編碼的蛋白質(zhì)，該DNA含有在寄主中誘導(dǎo)中和抗體形成必需的抗原決定簇。這樣的疫苗給藥時(shí)也是足夠安全的，沒有臨床感染的危險(xiǎn)；沒有毒性副作用；可以以有效途徑給藥；穩(wěn)定；并且與疫苗載體相容。
該疫苗可以以各種途徑如口，腸胃外，皮下，粘膜，靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)給藥。給藥的劑量可以隨著個(gè)體的癥狀，性別，體重和年齡；給藥的途徑；和疫苗的PV類型而變化。疫苗可以以如膠囊，懸浮液，配劑，或液體溶液的劑量形式使用。疫苗可以與免疫學(xué)可接受載體一起配制。
以治療有效量，即足以產(chǎn)生免疫保護(hù)應(yīng)答的量施用該疫苗。治療有效量可以根據(jù)PV的類型而變化?？梢砸詥伪痘蚨啾兜膭┝渴┯靡呙纭?br> 本發(fā)明的DNA和DNA衍生物可以用于配制免疫源性組合物。當(dāng)將這樣的組合物導(dǎo)入適當(dāng)寄主時(shí)，能在寄主中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
DNA或它的衍生物可以用于生產(chǎn)抗體。本文所用的術(shù)語“抗體”包括多克隆和單克隆抗體，以及其片段，如，F(xiàn)v，F(xiàn)ab和F(ab)2片段，這些片段能結(jié)合抗原或半抗原。
本發(fā)明的DNA和DNA衍生物可以用于血清型HPV感染和HPV篩選。將DNA，重組蛋白，VLP和抗體本身用于配制適用于對(duì)HPV進(jìn)行檢測和血清分型的試劑盒。這樣的試劑盒含有適于密封地容納于至少一個(gè)容器的分割化載體。載體將進(jìn)一步含有適用于檢測各種HPV類型的試劑如HPV18DNA，重組HPV蛋白或VLP或抗HPV抗體。載體也可以含有檢測用工具如標(biāo)記抗原或酶底物或諸如此類。
DNA和由此起源的蛋白質(zhì)也用作分子量和分子大小的標(biāo)志。
由于遺傳密碼是簡并的，一個(gè)以上的密碼子可用于編碼特定的氨基酸，所以，氨基酸序列可以被任何一組類似的DNA寡核苷酸編碼。該組只有一個(gè)成員將與HPV18序列相似，但是在適當(dāng)條件下甚至存在錯(cuò)配DNA寡核苷酸時(shí)能夠與HPV18DNA雜交。在改變的條件下，錯(cuò)配的DNA寡核苷酸仍然可以與HPV18DNA雜交以便允許鑒定和分離編碼HPV18的DNA。
本發(fā)明的純化的HPV18DNA或其片段可以用于分離和純化其它來源的HPV18的同系物和片段。為了完成這一過程，可以在適當(dāng)?shù)碾s交條件下將第一個(gè)HPV18DNA與含有編碼HPV18的同系物的DNA的樣品混合?？梢詫⒃撾s交DNA復(fù)合物分離，并由此純化編碼同源DNA的DNA。
已知在編碼特定的氨基酸的各種密碼子中存在大量的豐余。所以，本發(fā)明還涉及那些含有替換密碼子的DNA序列，這些密碼子編碼同樣的氨基酸的最后轉(zhuǎn)譯。在本說明書中，將具有一個(gè)或更多替代密碼子的序列定義為簡并變化。同時(shí)包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的是DNA序列或轉(zhuǎn)譯蛋白質(zhì)的突變，這些突變基本上不改變表達(dá)蛋白的最后的物理特性。例如，纈氨酸代替亮氨酸，精氨酸代替賴氨酸，或天冬氨酸代替谷氨酸不會(huì)引起多肽功能的變化。
已知可以將編碼一種肽的DNA的序列進(jìn)行改變以便能編碼具有不同于天然存在肽的特性的肽。改變所述DNA序列的方法包括，但不限于定點(diǎn)突變。
如本文所用，HPV18的“功能衍生物”是具有基本上與HPV18的生物學(xué)功能相類似的生物學(xué)功能(功能的或結(jié)構(gòu)的)的化合物。術(shù)語“功能衍生物”將包括HPV18的“片段”，“變異體”，“簡并變異體”，“類似物”和“同系物”或“化學(xué)衍生物”。術(shù)語“片段”意指HPV18的任何多肽亞群。術(shù)語“變異體”意指基本上與整個(gè)HPV18分子或其一個(gè)片段的結(jié)構(gòu)和功能相似的分子。如果兩個(gè)分子有基本上類似的結(jié)構(gòu)或如果兩個(gè)分子具有相似的生物活性，一種分子與HPV18“基本上相似”。所以，如果兩個(gè)分子基本上具有相似的活性，可以認(rèn)為它們是變異體，即使一個(gè)分子的結(jié)構(gòu)在另一個(gè)中沒有發(fā)現(xiàn)或即使兩個(gè)氨基酸序列不同。
術(shù)語“類似物”指功能確實(shí)與整個(gè)HPV18分子或其片段相同的分子。
可以將各種方法用于分子克隆HPV18DNA。這些方法包括，但不限于，在構(gòu)建含HPV18的cDNA或基因組DNA文庫后在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體系統(tǒng)中直接HPV18基因的功能表達(dá)。另一個(gè)方法是用根據(jù)HPV18的氨基酸序列設(shè)計(jì)的標(biāo)記的寡核苷酸探針，篩選在噬菌體或質(zhì)粒穿梭載體中構(gòu)建的含HPV18的cDNA或基因組DNA文庫。另一個(gè)方法包括用編碼HPV18的部分DNA篩選在噬菌體或質(zhì)粒穿梭載體中構(gòu)建的含HPV18的cDNA或基因組DNA文庫。這一部分DNA是通過根據(jù)純化的HPV18的氨基酸序列設(shè)計(jì)的簡并寡核苷酸引物的特異聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來擴(kuò)增HPV18DNA片段得到的。另一個(gè)方法是從產(chǎn)生HPV18細(xì)胞分離RNA并通過體外或體內(nèi)翻譯系統(tǒng)將RNA翻譯成蛋白質(zhì)。將RNA翻譯成肽或蛋白質(zhì)將導(dǎo)致產(chǎn)生至少一部分的HPV18蛋白，這部分HPV18蛋白可以通過例如HPV18蛋白的活性或通過與抗HPV18抗體的免疫反應(yīng)性得到鑒定。在這一方法中，可以分析從產(chǎn)生HPV18細(xì)胞分離的RNA庫中至少編碼一部分HPV18的RNA的存在?？梢赃M(jìn)一步分級(jí)分離RNA庫以便從非HPV18 RNA純化HPV18 RNA。分析這一方法產(chǎn)生的肽或蛋白質(zhì)，以提供氨基酸序列，這些氨基酸序列用于提供生產(chǎn)HPV18 cDNA的引物，或可以分析用于翻譯的RNA，它提供編碼HPV18的核苷酸序列并產(chǎn)生用于篩選HPV18 cDNA文庫的探針。這些方法是本領(lǐng)域已知的并能在例如，Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，Maniatis，T.分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，冷泉港，紐約.1989中找到。
很明顯，其它類型的文庫，以及從其它細(xì)胞或細(xì)胞類型構(gòu)建的文庫可以用于分離編碼HPV18的DNA。其它類型的文庫包括，但不限于，來源于含有18型HPV的其它細(xì)胞或細(xì)胞系的cDNA文庫和基因組DNA文庫。
通過各種技術(shù)可以進(jìn)行cDNA文庫的制備。在Sambrook，J.，et al.，如上所述，可以發(fā)現(xiàn)cDNA文庫的構(gòu)建技術(shù)。很明顯，也可以從適當(dāng)?shù)幕蚪MDNA文庫分離編碼HPV18的DNA。通過各種技術(shù)可以進(jìn)行基因組DNA文庫的構(gòu)建。在Sambrook，J.，et al.如上所述可以找到基因組DNA文庫的構(gòu)建技術(shù)。
通過分子克隆進(jìn)入表達(dá)載體可以重組地表達(dá)用本文敘述的方法得到的克隆HPV18 DNA或其片段，所述表達(dá)載體含有適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和其它適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，并將它轉(zhuǎn)移進(jìn)原核或真核寄主細(xì)胞以便產(chǎn)生重組HPV18。在Sambrook，J.，et al.，如上所述中詳細(xì)敘述了這些操作的技術(shù)，并且是本領(lǐng)域已知的。
本文定義表達(dá)載體為在適當(dāng)寄主中轉(zhuǎn)錄基因的克隆拷貝和翻譯它們的mRNA所必需的DNA序列。這樣的載體可以用于在各種寄主如細(xì)菌，藍(lán)綠藻，植物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，真菌細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)真核基因。特異設(shè)計(jì)的載體允許DNA在寄主如細(xì)菌-酵母或細(xì)菌-動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)菌-真菌細(xì)胞或細(xì)菌-無脊椎動(dòng)物細(xì)胞之間穿梭。恰當(dāng)構(gòu)建的表達(dá)載體應(yīng)該含有在寄主中自主復(fù)制的復(fù)制原點(diǎn)，可選擇標(biāo)志，有限數(shù)目的有用的限制酶位點(diǎn)，高拷貝數(shù)的潛能，和有活性的啟動(dòng)子。定義啟動(dòng)子為指導(dǎo)RNA聚合酶與DNA結(jié)合并啟動(dòng)RNA合成的DNA序列。強(qiáng)啟動(dòng)子是引起mRNAs高頻啟動(dòng)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體可以包括，但不限于，克隆載體，修飾的克隆載體，特殊設(shè)計(jì)的質(zhì)?；虿《?。
各種哺乳動(dòng)物表達(dá)載體可用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)HPV18 DNA或其片段。適于重組HPV18表達(dá)的商業(yè)可得哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包括，但不限于pcDNA3(Invitrogen)，pMC1neo(Stratagene)，pXT1(Stratagene)，pSG5(Stratagene)，EBO-pSV2-neo(ATCC37593)，pBPV-1(8-2)(ATCC37110)，pdBPV-MMTneo(342-12)(ATCC37224)，pRSVgpt(ATCC37199)，pRSVneo(ATCC37198)，pSV2-dhfr(ATCC37146)，pUCTag(ATCC37460)，和λZD35(ATCC37565)。
各種細(xì)菌表達(dá)載體可用于在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)HPV18DNA或其片段。合適的商業(yè)可得細(xì)菌表達(dá)載體包括，但不限于pET1la(Novagen)，λgt11(InVitrogen)，pcDNAII(Invitrogen)，pKK223-3(Pharmacia)。
各種真菌細(xì)胞表達(dá)載體可用于在真菌細(xì)胞中表達(dá)HPV18或其片段。適當(dāng)?shù)纳虡I(yè)可得真菌表達(dá)載體包括，但不限于pYES2(Invitrogen)，畢赤氏酵母表達(dá)載體(Invitrogen)，和漢遜氏酵母表達(dá)(Rhein Biotech，Dusseldorf，德國)載體。
各種昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體可用于在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)HPV18或其片段。適當(dāng)?shù)纳虡I(yè)可得昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體包括，但不限于pBlueBacIII(Invitrogen)和pAcUW51(PharMingen.Inc.)。
含有編碼HPV18的DNA或其片段的表達(dá)載體可以用于在細(xì)胞，組織，器官，或動(dòng)物(包括人)中表達(dá)HPV18蛋白或HPV18蛋白的片段。寄主細(xì)胞可以是原核或真核，包括但不限于細(xì)菌如大腸桿菌，真菌細(xì)胞如酵母，哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括但不限于人，牛，豬，猴和嚙齒動(dòng)物起源的細(xì)胞系，和昆蟲細(xì)胞包括但不限于果蠅和家蠶起源的細(xì)胞系。適當(dāng)?shù)牟⑶沂巧虡I(yè)可得的哺乳動(dòng)物種類起源的細(xì)胞系包括但不限于L細(xì)胞L-M(TK-)(ATCC CCL1.3)，L細(xì)胞L-M(ATCC CCL1.2)，293(ATCC CRL1573)，Raji(ATCC CCL86)，CV-1(ATCC CCL 70)，COS-1(ATCCCRL1650)，COS-7(ATCC CRL 1651)，CHO-K1(ATCC CCL61)，3T3(ATCCCCL 92)，NIH/3T3(ATCC CRL 1658)，HeLa(ATCC CCL 2)，C127I(ATCCCRL 1616)，BS-C-1(ATCC CCL 26)和MRC-5(ATCC CCL 171)。
可以通過許多技術(shù)包括但不限于轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染，原生質(zhì)體融化，和電穿孔將表達(dá)載體導(dǎo)入到寄主細(xì)胞中?？寺》敝澈斜磉_(dá)載體的細(xì)胞并各個(gè)分析以確定它們是否產(chǎn)生HPV18蛋白。可以通過幾條途徑對(duì)HPV18表達(dá)寄主細(xì)胞克隆進(jìn)行鑒定，這些途徑包括但不限于，與抗HPV18抗體的免疫反應(yīng)性，和與寄主細(xì)胞相關(guān)的HPV18活性存在，如定義為由HPV18特異配體與表達(dá)的HPV18蛋白相互作用傳導(dǎo)的應(yīng)答的HPV18特異配體結(jié)合或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
利用體外生產(chǎn)合成的mRNA或天然mRNA也可以進(jìn)行HPV DNA片段的表達(dá)。可以在各種無細(xì)胞系統(tǒng)包括，但不限于小麥胚芽提取液和網(wǎng)織紅細(xì)胞提取液中有效翻譯，以及基于細(xì)胞的系統(tǒng)包括，但不限于微注射進(jìn)蛙卵母細(xì)胞，優(yōu)選的是微注射進(jìn)蛙卵母細(xì)胞來有效翻譯合成的mRNA或從HPV18生產(chǎn)細(xì)胞分離的mRNA。
在寄主細(xì)胞中表達(dá)HPV18蛋白后，可以回收HPV18蛋白以提供純化形式的HPV18。有幾種適用的HPV18純化方法。如本文所述，可以通過鹽分級(jí)分離，離子交換層析，大小排斥層析，羥磷灰石吸附層析和疏水作用層析的各種組合或分別應(yīng)用從細(xì)胞溶胞物和提取液中純化重組HPV18蛋白。
另外，通過使用特異于全長新生HPV18，或HPV18的多肽片段的單克隆或多克隆抗體制成的免疫親和柱可以從其它細(xì)胞蛋白分離重組HPV18。根據(jù)各種本領(lǐng)域已知的方法可以制備單克隆和多克隆抗體。將本文所用的單克隆或單特異抗體定義為具有HPV18的同源結(jié)合特征的單個(gè)抗體種類或多個(gè)抗體種類。本文所用的同源結(jié)合是指抗體種類與特異抗原或表位結(jié)合的能力。
很明顯，可以利用生產(chǎn)單特異抗體的方法生產(chǎn)特異于HPV18多肽片段或全長新生HPV18多肽的抗體。具體地說，顯而易見可以生產(chǎn)特異于完全功能的HPV18或其片段的單特異抗體。
本發(fā)明還涉及篩選在體內(nèi)調(diào)節(jié)編碼HPV18的DNA或RNA的表達(dá)以及調(diào)節(jié)HPV18蛋白的功能的化合物的方法。調(diào)節(jié)這些活性的化合物可以是DNA，RNA，肽，蛋白質(zhì)，或非蛋白性質(zhì)的有機(jī)分子?；衔锟梢酝ㄟ^提高或減弱編碼HPV18的DNA或RNA的表達(dá)，或HPV18蛋白的功能來調(diào)節(jié)。通過各種測定方法可以檢測調(diào)節(jié)編碼HPV18的DNA或RNA的表達(dá)或HPV18蛋白的功能的化合物。測定方法可以是簡單的“是/否”測定方法以確定是否存在表達(dá)或功能的變化?？梢酝ㄟ^將測試樣品的表達(dá)或功能與標(biāo)準(zhǔn)樣品的表達(dá)或功能水平進(jìn)行比較而進(jìn)行定量測定。
可以制備含有HPV18 DNA，HPV18 DNA的片段，抗HPV18 DNA或HPV18蛋白的抗體，HPV18 RNA或HPV18蛋白的試劑盒。將這樣的試劑盒用于檢測與HPV18 DNA雜交的DNA或檢測樣品中HPV18蛋白或肽片段的存在。這一特征可用于各種目的包括，但不限于法醫(yī)分析和流行病研究。
可以合成與編碼HPV18的DNA序列互補(bǔ)的核苷酸序列以進(jìn)行反義治療。這些反義分子可以是DNA，DNA的穩(wěn)定衍生物如偶磷代硫酸鹽或甲基磷酸鹽，RNA，RNA的穩(wěn)定衍生物如2’-O-烷基RNA，或其它模擬的HPV18反義寡核苷酸?？梢酝ㄟ^微注射，脂質(zhì)體包被或從含有反義序列的載體表達(dá)將HPV18反義分子導(dǎo)入細(xì)胞。HPV18反義治療對(duì)于減弱HPV18活性是有利的疾病的治療特別有用。
術(shù)語“化學(xué)衍生物”描述了含有通常不是非基礎(chǔ)分子的部分的其它化學(xué)部分的分子。這些組分能提高基礎(chǔ)分子的溶解性，半壽期，吸收性，等等。另一種情況是，這些部分能減弱基礎(chǔ)分子的不需要的副作用或減少基礎(chǔ)分子的毒性。各種文章如Remington’s Pharmaceutical Sciences都敘述了這些部分的例子。
為了在使任何潛在毒性最小化時(shí)得到HPV18或它的活性最佳抑制，可以以常規(guī)測試確定的適當(dāng)劑量單獨(dú)使用根據(jù)本文公開的方法鑒定的化合物。另外，共同服用或依次服用其它試劑是令人滿意的。
優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明的化合物可以以單個(gè)的每天劑量給藥，或每天總的劑量以幾次分劑量施用。進(jìn)一步，可以通過各種途徑包括但不限于鼻內(nèi)，口，皮下或以栓劑施用本發(fā)明的化合物。
為了用超過一種活性試劑聯(lián)合治療，只要活性試劑是單獨(dú)的劑量配方，可以同時(shí)施用活性試劑，或可以在分開的時(shí)期單個(gè)施用。
根據(jù)各種因素包括病人的類型，種族，年齡，體重，性別和醫(yī)療條件；待治療癥狀的嚴(yán)重性；給藥的途徑；病人的腎和肝功能；所用的具體化合物來選擇利用本發(fā)明的化合物的劑量規(guī)則。一個(gè)普通技術(shù)人員可以容易地確定和預(yù)定用于防止，制止或抑制癥狀的發(fā)展所需要的藥物的有效量。達(dá)到產(chǎn)生無毒性效能范圍的藥物濃度的最佳精確度需要根據(jù)靶位點(diǎn)得到藥物的動(dòng)力學(xué)的規(guī)則。這包括藥物分布，平衡，和消除的情況。
在本發(fā)明的方法中，本文詳細(xì)敘述的化合物可以形成活性成份，并通常基于準(zhǔn)備給藥的形式，即口服片劑，膠囊，酏劑，糖漿，栓劑，凝膠和諸如此類的適當(dāng)選擇的合適的藥學(xué)稀釋劑，賦形劑或載體(本文總稱為“載體”物質(zhì))混合給藥，并符合常規(guī)的藥學(xué)實(shí)踐。
例如，對(duì)于片劑或膠囊形式的口服給藥，可以將活性藥物成份與口服的，非毒性的藥學(xué)可接受惰性載體如乙醇，甘油，水和諸如此類組合。此外，只要是所需要的或必需的，也可以將適當(dāng)?shù)恼澈蟿瑵櫥瑒?，崩解劑和著色劑摻入混合物中。適當(dāng)?shù)恼澈蟿┌ú幌抻冢矸?，凝膠，天然糖如蔗糖或β-半乳糖，玉米甜味劑，天然和合成的樹膠如金合歡膠，黃蓍膠或藻酸鈉，羧甲基纖維素，聚乙烯乙二醇，蠟和諸如此類。以這些劑量形式使用的潤滑劑包括，不限于油酸鈉，硬脂酸鈉，硬脂酸鎂，苯甲酸鈉，乙酸鈉，氯化鈉和諸如此類，崩解劑包括，不限于淀粉，甲基纖維素，瓊脂，斑脫巖，黃原膠和諸如此類。
對(duì)于液體形式，可以將活性藥物成份與適當(dāng)調(diào)味的懸浮或分散劑如合成的和天然樹膠，例如黃蓍膠，金合歡膠，甲基纖維素和諸如此類結(jié)合?？墒褂玫钠渌稚┌ǜ视偷鹊?。對(duì)于腸胃外給藥，無菌的懸浮液和溶液是如人所愿的。當(dāng)需要靜脈內(nèi)給藥時(shí)使用通常含有適當(dāng)?shù)姆栏瘎┑牡葷B制劑。
可以將含有活性藥物成份的局部制劑與各種本領(lǐng)域熟知的載體物質(zhì)如乙醇，庫拉索蘆薈樹膠，尿囊素，甘油，維生素A和E油，礦物油，PPG2十四烷基丙酸酯，和諸如此類混合以形成例如酒精溶液，局部清潔劑，清潔奶液，皮膚膠，皮膚洗液，和奶液香波或凝膠配方。
本發(fā)明的化合物也可以以脂質(zhì)體釋放系統(tǒng)形式如小的單層泡囊，大的單層泡囊和多層泡囊給藥?？梢詮母鞣N磷脂如膽固醇，硬脂酰胺或磷脂酰膽堿形成脂質(zhì)體。
也可以通過利用單克隆抗體作為被化合物分子偶聯(lián)的單個(gè)載體來釋放本發(fā)明的化合物。也可以將本發(fā)明的化合物與作為可靶擊的藥物載體的可溶聚合物偶聯(lián)。這樣的聚合物包括聚乙烯基吡咯烷酮，吡喃共聚物，聚羥丙基甲基丙烯酰胺酚，聚羥乙基天門冬酰胺酚，或用棕櫚酰殘基取代的聚乙基氧化烯聚賴氨酸。進(jìn)一步，可以將本發(fā)明的化合物與一類用于獲得藥物的控制釋放的生物降解聚合物例如，聚乳酸，聚ε-己內(nèi)酯，聚羥基丁酸，聚正酯，聚乙縮醛，聚二氫吡喃，聚氰基丙烯酸酯和交聯(lián)的或兩親性封閉的水凝膠共聚物偶聯(lián)。
下面的實(shí)施例同樣不受限制地說明本發(fā)明。
實(shí)施例1HPV18基因組的克隆用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從人宮頸癌起源的細(xì)胞系，SW756(Freedman，R.S.，etal.，1982.體外，Vol18，719-726頁)制備總基因組DNA。用EcoRI消化DNA并在0.8％的低熔點(diǎn)的瓊脂糖制備性的凝膠上電泳。切下對(duì)應(yīng)于長度約12kbp的DNA片段的凝膠薄片。用AgaraseTM酶(BoehringerMannheim.Inc.)消化瓊脂糖并沉淀大小分級(jí)的DNA，脫磷酸，與EcoRI消化的λEMBL4臂(Stratagene，Inc.)連接。用Gigapack IIGold包裝提取液(Stratagene，Inc.)包裝λ文庫。用根據(jù)公開的HPV18L1 DNA序列(Cole和Danos，1987，J，Mol.Biol.，Vol.193599-608基因庫登記號(hào)#X05015)設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物和SW756DNA作為模板進(jìn)行的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)生的700bp HPV18L1 DNA探針來鑒定HPV18陽性克隆。分離HPV18陽性λ克隆，它含有12kbp EcoRI片段插入物并且被命名為#187-1。
實(shí)施例2構(gòu)建酵母表達(dá)載體通過利用#187-1克隆作為模板，腔門(Vent)聚合酶TM(新英格蘭實(shí)驗(yàn)室，Inc.)，10次擴(kuò)增循環(huán)(94℃，1分鐘；50℃，1分鐘；72℃，2分鐘)和下面含有側(cè)接BglII位點(diǎn)(底下劃線)的寡核苷酸引物有意義引物，5’-GAAGATCTCACAAAACAAAATGGCTTTGTGGCGGCCTAGTG-3’，反義引物，5′-GAAGATCTTTACTTCCTGGCACGTACACGCACACGC-3′.
的PCR擴(kuò)增HPV18L1開放讀碼框架(ORF)。有意義引物在緊接HPV18L1起始甲硫氨酸密碼子(黑體標(biāo)出)的上游導(dǎo)入酵母非翻譯引導(dǎo)序列(Kniskern，et al.，1986，基因，Vol.46135-141)。用BglII消化1.5kbp L1 PCR產(chǎn)物并凝膠純化。
通過從含有來自質(zhì)粒pBM272(由Mark Johnston，WashingtonUniversity，St.Louis，MO提供)的啤酒酵母雙向GAL1-GAL10啟動(dòng)子的pUC18/雙向GAL啟動(dòng)子質(zhì)粒分離一個(gè)1.4bp SphI片段構(gòu)建pGAL1-10酵母表達(dá)載體。雙向啟動(dòng)子的每側(cè)與一個(gè)拷貝的酵母ADH1轉(zhuǎn)錄終止子側(cè)接，一個(gè)BamHI克隆位點(diǎn)位于GAL1啟動(dòng)子和ADH1轉(zhuǎn)錄終止子的第一個(gè)拷貝之間，一個(gè)SmaI克隆位點(diǎn)位于GAL10啟動(dòng)子和ADH1轉(zhuǎn)錄終止子的第二個(gè)拷貝之間。用SphI消化由pBR322，酵母LEU2d基因，和酵母2u質(zhì)粒構(gòu)成的酵母穿梭載體(Benjamin Hall，華盛頓大學(xué)，西雅圖，WA惠贈(zèng))并與1.4kbp SphI雙向GAL啟動(dòng)子片段連接得到pGAL1-10。用BamH1在GAL1啟動(dòng)子和ADH1轉(zhuǎn)錄終止子之間切開使pGAL1-10線性化。連接BamHI消化的載體和BglII消化的HPV18L1PCR片段并用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5細(xì)胞(Gibco BRL，Inc)。分離含有HPV18L1基因的pGAL1-10質(zhì)粒并命名為p191-6。
構(gòu)建了協(xié)同表達(dá)HPV18L1和L2基因的酵母表達(dá)載體。用SmaI在GAL10啟動(dòng)子和ADH1轉(zhuǎn)錄終止子之間切開以便消化質(zhì)粒p191-6(pGAL1-10+HPV18L1)。用下面含有側(cè)接SmaI位點(diǎn)(底下劃線)的寡核苷酸引物有意義引物，5′-TCCCCCGGGCACAAAACAAAATGGTATCCCACCGTGCCGCACGAC-3′，反義引物，5′-TCCCCCGGGCTAGGCCGCCACAAAGCCATCTGC-3.
通過如上所述的PCR擴(kuò)增1.4kbp HPV18L2基因。有意義引物在緊接著HPV18L2起始甲硫氨酸密碼子(黑體標(biāo)出)的上游導(dǎo)入酵母非翻譯引導(dǎo)序列(Kniskern et al.，1986，如上所述)。用SmaI消化PCR片段，凝膠純化并與SmaI消化的p191-6質(zhì)粒連接。分離含有HPV18L1和L2基因的pGAL1-10質(zhì)粒并命名為p195-11。
實(shí)施例3臨床樣品分型將在Indianapolis，IN的退伍軍人管理局醫(yī)學(xué)中心(經(jīng)Dr.Darron Brown同意)和在Philadelphia，PA的Albert Einstein醫(yī)學(xué)中心(經(jīng)Dr.Joan Adler同意)收集的宮頸活體解剖樣品并冷凍在-20℃。如Brown etal.，1993(Brown.D.et al.，1993，J.Clin.Microbiol.，Vol.312667-2673)所述分離DNA。簡要地說，用Braun小肢解器II(B.Braun儀器。Melsungen，德國)加工臨床樣品，并增溶于含有10mM EDTA和0.6％(w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)的緩沖液中。用20mM Tris pH7.4調(diào)節(jié)樣品，在存在0.1mcg/mlRNase A時(shí)用50mcg/ml蛋白酶消化蛋白質(zhì)，接著用酚/氯仿/異戊醇萃取。乙醇沉淀DNA并用分光光度法定量測定。
用PCR和Southern印跡分析篩選DNA樣品中HPV18的存在。用下面的寡核苷酸引物有意義引物，5′-CAATCCTTATATATTAAAGGCACAGGTATG-3′，反義引物，5′-CATCATATTGCCCAGGTACAGGAGACTGTG-3′.
通過PCR擴(kuò)增HPV18L1 ORF的一個(gè)256bp的部分。根據(jù)AmpliTaqTMDNA聚合酶/基因AmpTM試劑盒(Perkin Elmer corp.)的制造商的指導(dǎo)確定PCR條件不同的是利用0.5μl臨床樣品DNA作模板并且最后反應(yīng)混合物中存在每種引物10pmole，2mM dNTPs和2.0mM MgCl2。接著一個(gè)2分鐘，94℃變性步驟擴(kuò)增40次循環(huán)(94℃，1分鐘；45℃，1分鐘；72℃，1分鐘)。
將PCR產(chǎn)物通過3.0％瓊脂糖凝膠電泳，影印到尼龍膜上，與32P-標(biāo)記的HPV18L1特異性寡核苷酸探針雜交。
實(shí)施例4對(duì)L1和L2基因進(jìn)行DNA測序用PRIZM測序試劑盒和自動(dòng)DNA ABI測序儀#373A(AppliedBiosystems)對(duì)克隆#187-1，p191-6和p195-11的HPV18L1和L2基因進(jìn)行測序。為了得到共有HPV18序列，通過PCR從人臨床分離物擴(kuò)增L1基因DNA部分，序列分析，和已公開和要求保護(hù)的序列比較。為了這一目的，利用寡核苷酸和實(shí)施例3所述的熱循環(huán)從每個(gè)臨床DNA分離物擴(kuò)增一個(gè)256bp片段(核苷酸817-1072)。利用實(shí)施例3所述的熱循環(huán)將下面的引物，5’-5′-GAAGATCTCACAAAACAAAATGGCTTTGTGGCGGCCTAGTG-3′和5′-CCTAACGTCCTCAGAAACATTAGAC-3′用于擴(kuò)增L1DNA的氨基末端432bp部分(核苷酸1-431)。利用制造商推薦的試劑和方法將兩個(gè)PCR產(chǎn)物分別與質(zhì)粒pCRII(Invitrogen Corp.)連接。從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA并對(duì)那些含有EcoRI插入物的質(zhì)粒進(jìn)行序列分析。
實(shí)施例5分析DNA和推測的氨基酸序列圖1顯示了要求保護(hù)的HPV18L1的核苷酸和推測的氨基酸(aa)序列。該DNA序列起源于共有克隆#187-1，p191-6，p195-11。對(duì)要求保護(hù)的HPV18L1核苷酸序列和公開的HPV18L1序列(基因庫登記號(hào)#X05015)的比較鑒定出1524bp中有20bp變化。五個(gè)核苷酸變化(89位的C-G，263位的C-A，848位的C-G，967位的G-A和1013位的C-G)導(dǎo)致氨基酸取代。與公開物不同的五個(gè)殘基是氨基酸30，283，338位的P-R，氨基酸88位的T-N和氨基酸323位的V-I(圖2)。88和323位代表保守變化而三個(gè)P-R變化確實(shí)可以改變表達(dá)的L1蛋白的物理特性。
圖2顯示了對(duì)來源于臨床分離物(354，556，755，697，795和23號(hào))的氨基酸序列和要求保護(hù)的序列和已公開序列的比較。臨床分離物和要求保護(hù)的序列與公開序列在四個(gè)位點(diǎn)存在差異。在至今發(fā)現(xiàn)的所有分離物包括要求保護(hù)的序列中位點(diǎn)30，283和338編碼精氨酸(R)。這與公開序列完全相反，公開序列中每個(gè)這些位點(diǎn)是脯氨酸(P)。另外，在分離物和要求保護(hù)的序列的88位點(diǎn)是天冬酰胺(N)而在公開序列中是蘇氨酸(T)。最后的差異是發(fā)現(xiàn)在許多臨床分離物和公開菌株中位點(diǎn)323是纈氨酸(V)而在要求保護(hù)序列和一種分離物(#23)中是異亮氨酸(I)。結(jié)論是要求保護(hù)序列代表了與臨床感染相關(guān)的主要病毒序列，公開序列中缺乏含有任何30，283，338位點(diǎn)的脯氨酸的分離物暗示了已公開克隆是仿制物或不合邏輯的亞型。
HPV18L2的核苷酸和推測的氨基酸序列起源于克隆#187-1和p195-11的共有序列并表示在圖3。一個(gè)對(duì)L2核苷酸序列和公開的HPV18序列(基因庫登記號(hào)#X05015)的比較鑒定出1389bp中有40bp變化。bp差異導(dǎo)致14個(gè)氨基酸水平的變化氨基酸29的P→S，氨基酸33的P→N，氨基酸177的A→S，氨基酸266的D→E，氨基酸270的D→N，氨基酸346的D→G，氨基酸355的M→I，氨基酸359的V→M，氨基酸365的S→P，氨基酸369的F→S，氨基酸371的F→V，氨基酸372的F→S，氨基酸373的K→T和氨基酸409的S→P。
實(shí)施例6HPV18L2抗血清的生成用在大腸桿菌中表達(dá)的trpE-HPV18L2融合蛋白在山羊中制備HPV18L2特異性抗體。利用提供在5’-和3’-末端分別側(cè)接HindIII和BamHI位點(diǎn)的寡核苷酸引物通過PCR擴(kuò)增全長的L2ORF。將L2片段插入HindIII-BamHI消化的pATH23表達(dá)質(zhì)粒(Koerner etal.，1991，Meth.Enzymol.Vol.194477-490)。在用3-b-吲哚丙烯酸誘導(dǎo)后，在大腸桿菌RR1細(xì)胞(Gibco BRL)中表達(dá)融合蛋白。通過SDS-PAGE分析不溶部分接著用考馬斯藍(lán)染色。trpE-L2融合蛋白是大腸桿菌不溶組分的主要部分。根據(jù)Pocono Rabbit Farm和實(shí)驗(yàn)室Inc.的用于融合蛋白抗原(蛋白質(zhì)Rabbit Farm，Canadensis，PA)的標(biāo)準(zhǔn)方法用trpE-L2融合蛋白免疫接種山羊。
實(shí)施例7制備酵母菌株U9從Dr.Leland Hartwell(華盛頓大學(xué)，西雅圖，WA)處得到啤酒酵母菌株2150-2-3(MATalpha，leu2-04，adel，cir0)。在30℃在YEHD培養(yǎng)基(Carty et al.，J.Ind Micro 2(1987)117-121)中過夜繁殖菌株2150-2-3的細(xì)胞。在無菌蒸餾水中洗滌細(xì)胞3次，重懸浮于2ml無菌蒸餾水，為了篩選ura3突變體在6個(gè)5-氟乳清酸(FOA)平板的每一個(gè)上鋪0.1ml細(xì)胞懸浮液(冷泉港實(shí)驗(yàn)室酵母遺傳學(xué)手冊(cè))。在30℃溫育平板。培養(yǎng)基中每250ml蒸餾水含有3.5g，無氨基酸和硫酸銨的Difco酵母氮基質(zhì)；0.5g 5-氟乳清酸；25mg尿嘧啶；和10.0g葡萄糖。
通過0.2um膜過濾，將培養(yǎng)基滅菌，然后與250ml保持在50℃的4％的Bacto-瓊脂(Difco)，10ml1.2mg/ml腺苷酸溶液，和5mlL-亮氨酸溶液(180mg/50ml)混合。在每個(gè)培養(yǎng)皿中分配20ml得到的培養(yǎng)基。
在溫育5天后，出現(xiàn)大量的克隆。通過將起始FOA平板的菌落再劃線到新鮮FOA平板上分離單個(gè)菌落，然后在30℃溫育平板。通過復(fù)制平板到Y(jié)EHD平板和無尿嘧啶的平板上測試來自第二套FOA平板的大量菌落中ura3突變體的存在。預(yù)期的結(jié)果是在YEHD上良好生長，在無尿嘧啶培養(yǎng)基上不生長。得到一個(gè)顯示這些特性的分離物(U9)。將它以冰凍甘油儲(chǔ)存物(菌株#325)在-70℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例8制備一個(gè)破裂酵母MNN9基因的載體為了制備一個(gè)破裂MNN9基因的載體，必須首先從啤酒酵母基因組DNA克隆MNN9基因。這是通過標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)完成的。根據(jù)公開的酵母MNN9基因序列(酶遺傳學(xué)EPO專利申請(qǐng)?zhí)?88117834.7，公開號(hào).0-314-096-A2)設(shè)計(jì)PCR的全長MNN9編碼序列的5’有意義引物和3’反義引物。利用了下面含有側(cè)接HindIII位點(diǎn)(底下劃線)的低聚脫氧核苷酸引物有意義引物5’-CTT AAA GCT TAT GTC ACT TIC TCT TGT ATC G-3’反義引物5’-TGA TAA GCT TGC TCA ATG GTT CTC TTC CTC-3’。
用黑體字標(biāo)出了MNN9基因的起始甲硫氨酸密碼子。利用來自啤酒酵母菌株JRY188的基因組DNA作模板，Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer)和25次擴(kuò)增循環(huán)(94℃1分鐘，37℃2分鐘，72℃3分鐘)進(jìn)行PCR。用HindIII消化得到的1.2kbp PCR片段，凝膠純化，并與HindIII消化的，堿性磷酸酶處理的pUC13(Pharmacia)連接。命名得到的質(zhì)粒為pl183。
為了用酵母URA3基因破裂MNN9基因，用HindIII消化質(zhì)粒pBR322-URA3(它含有1.1kbp的編碼亞克隆到pBR322的HindIII位點(diǎn)的啤酒酵母URA3基因的HindIII片段)并且凝膠純化1.1kbp含有功能URA3基因的DNA片段，用T4DNA聚合酶補(bǔ)平末端，然后與PmlI-消化的質(zhì)粒pl183(在MNN9編碼序列內(nèi)用PmlI切)連接。得到的質(zhì)粒pl199含有被功能URA3基因破裂的MNN9基因。
實(shí)施例9
構(gòu)建含有破裂的MNN9基因的U9-衍生菌株1372為了破裂菌株U9(#325)中的MNN9基因，用HindIII消化30ug質(zhì)粒pl199得到線性mnn9∷URA3破裂盒。用原生質(zhì)體方法(Hinnen etal.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA751929-1933)用HindIII消化的pl199DNA轉(zhuǎn)化菌株325的細(xì)胞，在缺乏尿嘧啶和含有1.0M的山梨醇的合成瓊脂培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體。合成培養(yǎng)基每升蒸餾水含有瓊脂，20g；酵母氮基質(zhì)w/o氨基酸，6.7g；腺苷酸，0.04g；L-酪氨酸，0.05g；山梨醇，182g；葡萄糖，20g；和去亮氨酸溶液#2，10ml。去亮氨酸溶液#2含有每升蒸餾水L-精氨酸，2g；L-組氨酸，1g；L-亮氨酸，6g；L-異亮氨酸，6g；L-賴氨酸，4g；L-甲硫氨酸，1g；L-苯丙氨酸，6g；L-蘇氨酸，6g；L-色氨酸，4g。
在30℃溫育平板5天，在此期間出現(xiàn)大量的菌落。從10個(gè)克隆制備染色體DNA制備物，然后用EcoRI和HindIII消化。然后用1.2kbp含有MNN9基因(從質(zhì)粒pl199分離)的HindIII片段作為探針通過Southern印跡雜交(J.Sambrook et al.，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，1989)評(píng)估DNA消化物。鑒定了在Southern印跡上顯示預(yù)期的DNA帶移動(dòng)以及通常由mnn9突變體顯示的特別凝塊的分離物(菌株#1372)。
實(shí)施例10構(gòu)建破裂酵母HIS3基因的載體為了構(gòu)建啤酒酵母HIS3基因被URA3基因破裂的破裂盒，用BamHI消化質(zhì)粒YEp6(K.Struhl et al.，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA761035)并凝膠純化含有HIS3基因的1.7kbp BamHI片段，用T4DNA聚合酶補(bǔ)平末端，與已經(jīng)用BamHI消化和用T4DNA聚合酶處理的pUC18連接。用NheI消化(在HIS3編碼序列切割)得到的質(zhì)粒(命名為pl501或pUC18-HIS3)并凝膠純化載體片段，用T4DNA聚合酶補(bǔ)平末端，然后用牛腸堿性磷酸酶處理。通過用HindIII消化從質(zhì)粒pBR322-URA3分離URA3基因并且凝膠純化含有URA3基因的1.1kbp片段，用T4DNA聚合酶補(bǔ)平末端，與上面的pUC18-HIS3 NheI片段連接。得到的質(zhì)粒(命名為pUC18-his3∷URA3或pl505)含有酵母HIS3基因被功能URA3基因破裂的破裂盒。
實(shí)施例11
構(gòu)建由HIS3基因破裂酵母PRB1基因的載體Carnegie-Mellon大學(xué)的Dr.E.Jones(C.M.Moehle et al.1987，遺傳學(xué)115255-263〕提供了含有啤酒酵母PRB1基因的質(zhì)粒FP8ΔH。用HindIII加XhoI消化，凝膠純化含有PRB1基因的3.2kbp DNA片段，用T4DNA聚合酶處理補(bǔ)平末端。用BamHI消化質(zhì)粒pUC18，凝膠純化，用T4DNA聚合酶處理來補(bǔ)平末端。將得到的載體片段與上面的PRB1基因片段連接產(chǎn)生質(zhì)粒pUC18-PRB1。用BamHI消化含有HIS3基因的質(zhì)粒YEp6。凝膠純化得到的含有功能HIS3基因的1.7kbpBamHI片段，然后用T4DNA聚合酶處理來補(bǔ)平末端。用EcoRV加NcoI在PRB1編碼序列內(nèi)切割以消化質(zhì)粒pUC18-PRB1，除去蛋白酶B活性位點(diǎn)和側(cè)接序列。凝膠純化含有pUC18中殘留的PRB1編碼序列5’和3’部分的5.7kbpEcoRV-NcoI片段，用T4DNA聚合酶處理來補(bǔ)平末端，用牛腸堿性磷酸酶去磷酸，與上述補(bǔ)平末端的HIS3片段連接。得到質(zhì)粒(命名為pUC18-prb1∷HIS3，母株#1245)含有代替了在上面缺失的PRB1基因部分的功能HIS3基因。
實(shí)施例12構(gòu)建含有MNN9和PRB1基因的破裂的U9相關(guān)的酵母菌株實(shí)施例9敘述了含有MNN9基因破裂的U9相關(guān)的菌株1372。將菌株1372的克隆分離物平鋪在FOA平板上(如實(shí)施例7所述)篩選ura3突變體。得到大量的菌株1372的ura3分離物，選擇一個(gè)特定的分離物(菌株12930-190-S1-1)用于隨后的HIS3基因的破裂。用XbaI加EcoRI消化pUC18-his3∷URA3基因破裂載體(pl505)產(chǎn)生線性his3∷URA3破裂盒并通過醋酸鋰方法(酶學(xué)方法194290(1991))將其用于轉(zhuǎn)化菌株12930-190-S1-1。在合成的缺乏尿嘧啶的瓊脂培養(yǎng)基上篩選Ura+轉(zhuǎn)化體，在同樣的培養(yǎng)基上再劃線得到克隆分離物，然后復(fù)制平板接種到缺乏尿嘧啶或組氨酸的培養(yǎng)基上篩選那些Ura+和His-的分離物。選擇一個(gè)分離物(菌株12930-230-1)作隨后的PRB1基因的破裂。用SacI加XbaI消化PRB1基因破裂載體(pUC18-prb1∷HIS3，母株#1245)產(chǎn)生線性prb1∷HIS3破裂盒并用醋酸鋰方法將其用于轉(zhuǎn)化菌株12930-230-1。在缺乏組氨酸的瓊脂培養(yǎng)基上篩選His+轉(zhuǎn)化體并在同樣的培養(yǎng)基上再劃線得到克隆的分離物。從大量的得到的His+分離物制備基因組DNA，用EcoRI消化，然后在0.8％的瓊脂糖凝膠上電泳。然后用放射性標(biāo)記的617bp探針對(duì)PRB1基因進(jìn)行Southern印跡分析，已經(jīng)利用下面的低聚脫氧核苷酸引物5′TGG TCA TCC CAA ATC TTG AAA 3′5′CAC CGT AGT GTT TGG AAG CGA 3′制備了該P(yáng)RB1基因。
得到了十一個(gè)分離物，它們顯示了所希望的探針與2.44kbp prb∷HIS3DNA片段的雜交。這和探針與1.59kbp的野生型PRB1基因片段的雜交不同。選擇一個(gè)含有需要的prb1∷HIS3破裂的這些分離物作進(jìn)一步的使用并將它命名為菌株#1558。
實(shí)施例13酵母中HPV18L1和L2的表達(dá)利用質(zhì)粒pl91-6(pGAL1-10+HPV18L1)和pl95-11(pGAL1-10+HPV18L1+L2)轉(zhuǎn)化啤酒酵母菌株#1558(MATa，leu2-04，prb1∷HIS3，mnn9∷URA3，ade1，cir0)?？寺》蛛x物在30℃于含有2％半乳糖的YEHD的培養(yǎng)基上生長88小時(shí)。收集細(xì)胞后，用玻璃珠破碎細(xì)胞沉淀并通過免疫印跡方法分析細(xì)胞溶菌物中HPV18L1和/或HPV18L2蛋白的表達(dá)。將含有25ug總細(xì)胞蛋白的樣品在變性條件下通過10％Tris-甘氨酸凝膠(Novex，Inc.)電泳并電印跡到硝酸纖維濾紙上。利用抗trpE-HPV11L1融合蛋白產(chǎn)生的兔抗血清作為初級(jí)抗體(Brown et al.，1994，病毒學(xué)20146-54)和連接辣根過氧化物酶(HRP)的猴抗兔IgG(Amersham，Inc.)作為次級(jí)抗體免疫檢測L1蛋白。用化學(xué)發(fā)光ECLTM檢測試劑盒(Amersham，Inc.)處理濾紙。在L1和L1+L2共表達(dá)酵母克隆(分別是菌株1725和1727)中檢測到50-55KDaL1蛋白帶而在陰性對(duì)照(沒有L1或L2的pGAL1-10)中沒有(圖4)。
利用抗trpE-HPV18L2融合蛋白產(chǎn)生的山羊多克隆抗血清作為初級(jí)抗體接著利用與HRP綴合的，兔抗山羊IgG(Kirkegaard和Perry實(shí)驗(yàn)室，Gaithersburg，MD)通過Western分析檢測HPV18L2蛋白。如上所述加工濾膜。在L1+L2共表達(dá)酵母克隆(菌株1727)中檢測到作為75kDa蛋白帶的L2蛋白而在陰性對(duì)照或L1表達(dá)克隆中沒有(圖5)。
實(shí)施例14HPV18L1(菌株1725)和18L1+ΔL2(菌株1727)的發(fā)酵將菌株1725和菌株1727的表面生長的平板培養(yǎng)物無菌地轉(zhuǎn)移到無亮氨酸的液體培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有(每L)8.5g無氨基酸和硫酸銨的Difco酵母氮基質(zhì)；0.2g腺苷酸；0.2g尿嘧啶；10g琥珀酸；5g硫酸銨；40g葡萄糖；0.25gL-酪氨酸；0.1gL-精氨酸；0.3gL-異亮氨酸；0.05gL-甲硫氨酸；0.2gL-色氨酸；0.05gL-組氨酸；0.2gL-賴氨酸；0.3gL-苯丙氨酸；在滅菌前用NaOH將該培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至pH5.0-5.3。在28℃，250rpm的旋轉(zhuǎn)搖床上生長后，通過在儲(chǔ)存于-70℃前加無菌甘油到最后濃度17％(w/v)制備冷凍培養(yǎng)物小玻璃瓶(每個(gè)冷小玻璃瓶1ml)。通過轉(zhuǎn)移冷凍培養(yǎng)小玻璃瓶的解凍內(nèi)含物和在28℃，250rpm的旋轉(zhuǎn)搖床上溫育29小時(shí)開始在同樣的培養(yǎng)基中擴(kuò)展接種物(500ml每2-L燒瓶)。在接種后每個(gè)菌株的發(fā)酵使用具有工作體積10L的NewBrunswick SF-116發(fā)酵器。生產(chǎn)培養(yǎng)基含有(每L)20g Difco酵母提取液；10g Sheffield Hysoy蛋白胨；20g葡萄糖；20g半乳糖；0.3ml UnionCarbide UCONLB-625防沫劑；在滅菌前將培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)至5.3。將2-L接種物燒瓶的全部內(nèi)含物(500ml)轉(zhuǎn)移到發(fā)酵器中，在28℃，每分鐘5L空氣，400rpm，3.5psi壓力下溫育發(fā)酵器。由于需要保持溶解氧水平高于飽和度的40％，需要增加攪拌。通過脫線葡萄糖測量(Beckman葡萄糖2分析器)和在線總光譜測定法(Perkin-Elmer1200)檢測發(fā)酵的進(jìn)程。在溫育66小時(shí)后達(dá)到每L9.5-9.7g干細(xì)胞重的密度。用中纖維濾器(在Amicon DC-10過濾系統(tǒng)中的Amicon H5MP01-43柱體)濃縮培養(yǎng)物到約2L，用2L磷酸緩沖鹽二次過濾，在分配進(jìn)500-ml離心瓶中之前進(jìn)一步濃縮(到約1L)通過在4℃，在8,000rpm(Sorval GS-3離心機(jī))離心20分鐘收集細(xì)胞沉淀。丟棄上清液后，在-70℃儲(chǔ)存沉淀(總共191-208g濕細(xì)胞)直到使用。
實(shí)施例15重組HPV型18L1衣殼蛋白的純化除非特別說明所有步驟在4℃進(jìn)行。
在-70℃冷凍儲(chǔ)存細(xì)胞。在20-23℃解凍冰凍細(xì)胞(濕重＝126g)，重懸浮于70ml“Breaking Buffer”(20mM磷酸鈉，pH7.2,100mMNaCl)。分別加入蛋白酶抑制劑PMSF和pepstatinA到最后濃度為2mM和1.7μM。在約16,000psi的壓力下通過于M110-Y小流體化器(Microfluidics Corp.，Newton，MA)傳遞4次破碎細(xì)胞不溶解物。在12,000×g離心破碎的細(xì)胞不溶解物40分鐘除去細(xì)胞碎片。收集含有L1抗原的上清液體。
通過加緩沖液A以1∶5稀釋上清液，并加到用緩沖液A平衡過的FractogelEMD TMAE-650(M)樹脂(EM Separations，Gibbstown，NJ)的陰離子交換捕獲柱(9.0cm ID×3.9cm)。在用緩沖液A洗后，用緩沖液A中0-1.0M NaCl的梯度洗脫抗原。用Bradford方法測定柱餾分的總蛋白。然后以同樣的總蛋白負(fù)載用Werstern印跡和銀染檢測的SDS-PAGE分析這些餾分。
合并顯示可比純度和豐度的L1蛋白的TMAE餾分。用硫酸銨分級(jí)分離濃縮抗原。通過邊加入固體試劑，邊溫和攪拌10分鐘以上將溶液調(diào)節(jié)到含35％飽和硫酸銨。將樣品置于冰上，允許進(jìn)行沉淀4小時(shí)。在16,000×g離心樣品45分鐘。將沉淀重懸浮于20.0mlPBS(6.25mM磷酸鈉，pH7.2，1.50mM NaCl)。
在Sephacryl 500HR樹脂(Pharmacia，Piscataway，NJ)的大小排阻柱(2.6cm ID×89cm)上層析重懸浮沉淀。跑柱緩沖液是PBS。用Western印跡和銀染檢測的SDS-PAGE分析收集的餾分。合并purest餾分。用43mmYM-100平層膜(Amicon，Beverly，MA)，在4-6psi的N2下在50ml的攪動(dòng)室中濃縮得到的合并物。
用Western印跡和膠質(zhì)考馬斯檢測的SDS-PAGE分析最后的產(chǎn)物。估計(jì)50％-60％L1蛋白是同質(zhì)的。用Western印跡證實(shí)L1蛋白的同一性。等分最后的產(chǎn)物并儲(chǔ)存于-70℃。這一過程總共得到12.5mg的蛋白質(zhì)。
Bradford分析測定總蛋白用市場購買得到的考馬斯Plus試劑盒(Pierce，Rockford，IL)測定總蛋白。在Milli-Q-H2O中將樣品稀釋到適當(dāng)?shù)乃?。?duì)于標(biāo)準(zhǔn)和微測定方法需要的體積分別是0.1ml和1.0ml。對(duì)于兩種方法，都利用BSA(Pierce，Rockford，IL)產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)制造商的指導(dǎo)進(jìn)行測定。用CricketGraph軟件在Macintosh Iici計(jì)算機(jī)上畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
SDS-PAGE和Western印跡測定所有凝膠，緩沖液，和電泳儀器是從Novex(San Diego，CA)得到的并根據(jù)制造商的指導(dǎo)進(jìn)行。簡要地說，在Milli-Q-H2O中將樣品稀釋成相等的蛋白質(zhì)濃度并以1∶1與含有200mMDTT的樣品溫育緩沖液混合。在100℃溫育樣品15分鐘并加到預(yù)先鑄好的12％Tris-甘氨酸凝膠。在125V將樣品電泳1小時(shí)45分鐘。用更改的Heukeshoven和Dernick[電泳，6(1985)103-112]方法銀染或者用市場得到的試劑盒(IntegratedSeparation Systems，Natick，MA)膠質(zhì)考馬斯染色將凝膠顯色。
對(duì)于Western印跡試驗(yàn)中，在25V用40分鐘時(shí)間將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用Milli-Q-H2O洗膜，空氣中干燥。初級(jí)抗體是抗TrpE-HPV11L1融合蛋白(Dr.Brown贈(zèng)送)產(chǎn)生的多克隆兔抗血清。過去的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明該抗血清在Western印跡中與18型HPVL1交叉反應(yīng)。用吸印緩沖液(5％的溶于6.25mM磷酸鈉中的脫脂牛奶，pH7.2，150mMNaCl，0.02％NaN3)稀釋抗血清制備抗體溶液。在20-23℃溫育至少1小時(shí)。變換3次PBS(6.25mM磷酸鈉，pH7.2，150mM NaCl)各洗滌印跡1分鐘。用印跡緩沖液稀釋與山羊抗兔IgG堿性磷酸酶連接的共軛抗血清(Pierce，Rockford，IL)制備次級(jí)抗體溶液。在同樣條件下進(jìn)行溫育至少1小時(shí)。如上所述洗滌印跡，用一步NBT/BCIP底物(Pierce，Rockford，IL)檢測。
實(shí)施例16電子顯微鏡研究在EM分析(Structure Probe，West Chester，PA)中，將每個(gè)樣品的等分試樣置于200目碳包衣的銅網(wǎng)上。將一滴2％的磷鎢酸(PTA)pH7.0置于網(wǎng)上20秒。在透射EM檢查前允許將網(wǎng)空氣干燥。用JEOL100CX透射電子顯微鏡(JEOL USA，Inc.)在加速電壓100kV下進(jìn)行所有的顯微觀察。產(chǎn)生的顯微相片最后放大100,000倍。在含有HPV18L1表達(dá)質(zhì)粒中觀察到病毒樣顆粒大小范圍50-55nm(圖6)。在酵母對(duì)照樣品中沒有觀察到VLP。
實(shí)施例17將HPV18cDNA亞克隆到表達(dá)載體為了在轉(zhuǎn)染寄主細(xì)胞中表達(dá)HPV18蛋白和在體外轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯，將編碼HPV18的cDNA亞克隆進(jìn)入幾個(gè)載體。這些載體包括pBluescriptIISK+(其中T7或T3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá))，pcDNAI/Amp(其中巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá))，pSZ9016-1(其中HIV長終止重復(fù)(LTR)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá))，和桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pAcUW51(PharMingen，Inc.)(其中多面體(PH)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá))，用于生產(chǎn)含有編碼HPV18的DNA序列的重組桿狀病毒。
a)pBluescript II SK+HPV18。
通過限制性EcoRI消化從λ噬菌體重新得到全長的HPV18cDNA克隆和連接進(jìn)EcoRI切割的，CIP處理的pBluescriptIISK+。收集獨(dú)立的亞克隆，其中HPV18的有意義方向與T7或T3啟動(dòng)子相接。
b)pcDNAI/AmpHPV18。
為了簡化定向的克隆，用EcoRV和XbaI從pBliuscriptIISK+HPV18的純化質(zhì)粒制備物中切下HPV18，在該質(zhì)粒中，HPV18DNA序列是在T7啟動(dòng)子的下游。純化得到的EcoRV，XbaI HPV18片段，將其與EcoRV切割的，XcaI切割的，CIP處理的pcDNAI/Amp連接以致編碼HPV18的DNA在CMV啟動(dòng)子的下游。
c)pSZ9016-1HPV18。
通過有限的EcoRI消化從pBluescriptIISK+HPV18切下HPV18并隨后從瓊脂糖凝膠上純化1.3kb的片段。將得到的EcoRI HPV18片段與EcoRI切割，CIP處理的pSZ9016-1連接。選擇HPV18的有意義方向在HIVLTR啟動(dòng)子下游的亞克隆。
d)pAcUW51HPV18L1。
用提供側(cè)接BglII位點(diǎn)的寡核苷酸引物從克隆#187-1通過PCR擴(kuò)增全長HPV18L1ORF。將L1基因插入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pAcUW51(PharMingen，Inc.)的BamHI位點(diǎn)處于多面體啟動(dòng)子的控制下。根據(jù)Pharmingen手冊(cè)敘述的方法生產(chǎn)含有HPV18L1表達(dá)盒的重組桿狀病毒。通過有限稀釋和點(diǎn)印跡雜交純化重組克隆。
實(shí)施例18通過體外轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯和轉(zhuǎn)染進(jìn)寄主細(xì)胞表達(dá)HPV18多肽利用含有HPVDNA序列的載體在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞溶胞物，哺乳動(dòng)物寄主細(xì)胞，和桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)HPV18多肽的轉(zhuǎn)譯。這些實(shí)驗(yàn)方案基本上概況于制造商的說明中。
a)體外轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯。用BamHI在HPV18插入的下游消化使pBluescriptIIISK+HPV18質(zhì)粒DNA(在T7方向具有HPV18)線性化。純化線性質(zhì)粒，存在m7G(5’)ppp(5’)G時(shí)利用T7RNA聚合酶，將該質(zhì)粒用作模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。通過LiCl沉淀純化得到的帶帽的HPV18轉(zhuǎn)錄物并用于在核酸酶預(yù)處理的兔網(wǎng)織紅血球溶解物中，在存在L-[35S]甲硫氨酸時(shí)驅(qū)動(dòng)HPV18的轉(zhuǎn)譯。
b)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。在用pcDNAI/AmpHPV18(在CMV啟動(dòng)子的控制下)或pSZ9016-1HPV18(在HIVLTR啟動(dòng)子的控制下)轉(zhuǎn)染后在哺乳動(dòng)物寄主細(xì)胞中表達(dá)HPV18蛋白。在后一種情況(pSZ9016-1HPV18)，將細(xì)胞與TAT表述質(zhì)粒pSZ90161TAT共轉(zhuǎn)染。對(duì)于兩個(gè)HPV18表達(dá)質(zhì)粒，用DEAE-葡聚糖或用Lipofectamine的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(BRL)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞。
c)在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。通過體內(nèi)同源重組，利用含有HPV18L1的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pAcUW51HPV18L1生產(chǎn)重組桿狀病毒(Autographacalifornica)。然后在用含有HPV18的重組桿狀病毒感染后在生長在懸浮培養(yǎng)物中的Sf9(Spodopterafrugiperda)昆蟲細(xì)胞中表達(dá)表位標(biāo)記的HPV18L1。
實(shí)施例19通過各種方法可以檢測影響HPV18活性的化合物。一個(gè)鑒定影響HPV18的化合物的方法包括(a)將測試化合物與含有HPV18的溶液混合形成混合物；(b)測定混合物中HPV18活性；和(c)將混合物中的HPV18與標(biāo)準(zhǔn)比較。
可以將影響HPV18活性的化合物配制成藥物組合物。這些藥物組合物可用于治療具有HPV18感染特征的疾病和癥狀。
實(shí)施例20用探針檢測與編碼HPV18的DNA結(jié)構(gòu)上相關(guān)的DNA。一個(gè)適當(dāng)?shù)奶结樋梢詠碓从诰哂袌D1或圖3的所有或部分核苷酸序列的DNA，具有所有或部分圖1或圖3的核苷酸序列或起源于圖1或圖3的部分序列的簡并寡核苷酸的DNA編碼的RNA。
權(quán)利要求
1.編碼18型人乳頭狀瘤病毒的分離和純化DNA分子或其功能衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離和純化的DNA分子，它選自圖1顯示的核苷酸序列，圖3顯示的核苷酸序列，圖1顯示的核苷酸序列的功能衍生物，和圖3顯示的核苷酸序列的功能衍生物。
3.在寄主中表達(dá)權(quán)利要求1的DNA分子的表達(dá)載體。
4.權(quán)利要求1的DNA分子編碼的基本純化的蛋白質(zhì)。
5.與選自權(quán)利要求1的DNA分子，與權(quán)利要求1的DNA分子互補(bǔ)的RNA或權(quán)利要求1的DNA分子編碼的蛋白質(zhì)的化合物發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體。
6.在寄主中表達(dá)18型人乳頭狀瘤病毒蛋白的方法。包括(a)將權(quán)利要求4的表達(dá)載體轉(zhuǎn)移入適當(dāng)?shù)募闹?；?b)在允許從表達(dá)載體表達(dá)18型人乳頭狀瘤病毒的條件下培養(yǎng)步驟(a)的寄主。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中蛋白質(zhì)選自HPV18L1蛋白，HPV18L2蛋白和它們的組合。
8.能在用該組合物處理的個(gè)體中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的組合物，所述組合物含有選自權(quán)利要求1的DNA分子，權(quán)利要求1的DNA分子編碼的肽，與權(quán)利要求1的DNA分子互補(bǔ)的RNA的化合物，或它們的組合。
9.防止或治療人乳頭狀瘤病毒感染的疫苗，所述疫苗含有選自由權(quán)利要求1的DNA分子，權(quán)利要求1的DNA分子編碼的肽，與權(quán)利要求1的DNA分子互補(bǔ)的RNA的化合物，或它們的組合。
10.誘導(dǎo)抗人乳頭狀瘤病毒引起的感染或疾病的免疫應(yīng)答的方法，它包括在動(dòng)物中導(dǎo)入權(quán)利要求1的DNA分子，與權(quán)利要求1的DNA分子互補(bǔ)的RNA，權(quán)利要求1的DNA分子編碼的蛋白質(zhì)，或它們的組合。
11.包括人乳頭狀瘤病毒18的L1蛋白或重組L1+L2蛋白的病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒的純度至少是60％。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的病毒樣顆粒，其中重組L1蛋白或重組L1+L2蛋白是在酵母中產(chǎn)生的。
13.根據(jù)生產(chǎn)權(quán)利要求11所述的類病毒的方法，包括(a)用編碼乳頭狀瘤病毒L1蛋白或乳頭狀瘤L2蛋白或乳頭狀瘤病毒L1+L2蛋白的重組DNA分子轉(zhuǎn)化酵母；(b)在允許表達(dá)重組DNA分子以生產(chǎn)重組乳頭狀瘤病毒蛋白的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的酵母；和(c)分離重組乳頭狀瘤病毒蛋白以便生產(chǎn)權(quán)利要求1的病毒樣顆粒。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法生產(chǎn)的重組乳頭狀瘤病毒蛋白。
15.包括權(quán)利要求11所述的病毒樣顆粒的疫苗。
16.包括權(quán)利要求11所述的病毒樣顆粒的藥物組合物。
17.防止乳頭狀瘤病毒感染的方法包括給寄主施用權(quán)利要求15所述的疫苗。
18.生產(chǎn)酵母起源的組裝成病毒樣顆粒的重組乳頭狀瘤病毒衣殼蛋白的方法，包括(a)將至少編碼一個(gè)乳頭狀瘤病毒衣殼蛋白的乳頭狀瘤病毒基因克隆進(jìn)載體；(b)將載體轉(zhuǎn)移進(jìn)入寄主細(xì)胞以便產(chǎn)生重組寄主細(xì)胞；(c)在允許生產(chǎn)乳頭狀瘤病毒衣殼蛋白的條件下培養(yǎng)重組寄主細(xì)胞；和(d)在允許形成病毒樣顆粒的條件下純化乳頭狀瘤病毒衣殼蛋白。
19.由權(quán)利要求18所述的方法生產(chǎn)的病毒樣顆粒。
20.在動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法包括給動(dòng)物施用權(quán)利要求11所述的病毒樣顆粒。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼純化的18型人乳頭狀瘤病毒及其衍生物的DNA分子。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1185176SQ96194121
公開日1998年6月17日 申請(qǐng)日期1996年3月18日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月22日
發(fā)明者K·J·霍夫曼, K·U·雅森, M·P·內(nèi)佩爾, J·G·喬伊瑟, H·A·格奧爾格 申請(qǐng)人:麥克公司