Tau－Tau結合的抑制的制作方法

專利名稱：Tau－Tau結合的抑制的制作方法
技術領域：
本發明涉及檢測能調節或抑制病理性tau-tau蛋白(T形物蛋白)結合和病理性神經微絲聚積物質的新方法。本方法特別用于篩選、預防和治療阿耳茨海默氏病的物質。
阿耳茨海默氏病(簡稱AD)是老年性癡呆最常見的原因[Lingstone(1994)疾病等級，癡呆(Burns和Levy編)Chapman & Hall倫敦，21-35頁]。阿耳茨海默氏病患者的特征表現為進行性癡呆伴隨逐漸加重的記憶力喪失，辨認、感覺和語言能力受干擾，以及全腦智力減退(Roth，Zversen(1996)英國醫學通報，42(特刊))。
AD的主要病理特征為老年斑和神經纖維纏結，兩者中均含有由微管結合蛋白Tau構成的雙股螺旋形纖絲(PHF)(Wischik等(1988)美國國家科學院匯刊，85，4506-4510)。老年斑中還存在β-淀粉樣纖維，這些纖維來源于尚未探明的淀粉樣前體蛋白(APP)形成過程中的畸變(APP；Kang等(1987)自然，325，733-736)。
對AD的研究一直著眼于正常的微管結合蛋白Tau的喪失(Mukaetova-Ladinska等(1993)美國病理雜志，143，565-578；Wischik等(1995a)神經生物老化，16409-417；Lai等(1995b)神經生物老化，16433-445)，病理性雙股螺旋纖絲的聚集(PHFs；Mukaetova-Ladinska等(1993)，出處同前；Harrington等，(1994a)癡呆，5，215-228；Harrington等(1994b)美國病理學雜志，145，1472-1484；Wischik等，(1995a)，出處同前)；以及作為識別力損傷的明顯辨別標志的額中部皮層突觸的喪失(Terry等(1991)神經病學年刊，30，572-580)。突觸的喪失(Terry等，出處同前)以及錐體細胞的喪失(Bondareff等(1993)普通精神病學文獻，50，350-356)均與Tau反應性神經原纖維病理的形態測定相關，這在分子水平上關系到AD中Tau蛋白池從溶解形式轉化為聚合形式(PHFs)的完全重分配(Mukaetova-Ladinska等，(1993)，出處同前；Lai等，(1995)，出處同前)。這些轉化的一種可能解釋為病理性Tau蛋白重分配形成雙股螺旋形纖絲(PHFs)，使錐體細胞內聚合狀態的軸突微管蛋白產生失衡，造成皮層-皮層交聯通路的軸突傳導障礙(Wischik等(1995a)，出處同前；(Wischik等(1995b)神經生物老化，(在印刷中)；Wischik等(1995c)，AD中雙股螺旋形纖絲的結構、生化和分子病理，A.Goate，F.Ashall編(在印刷中)；Lai等，(1995)，出處同前)。從體細胞到遠距離神經皮層的突觸傳導障礙會造成突觸喪失及識別力損傷。另一些因素包括錐體細胞中PHF聚積的直接毒性(Bondareff等，(1993)，普通精神病學文獻，50350-356；(1994)，神經病理學與實驗神經病學雜志，50158-164)和損傷細胞功能的Tau聚積性可能的直接毒性(Mena等，(1991)，神經病理學與實驗神經病學雜志，50474-490)。
盡管分子病理模型的研究強調β-淀粉樣聚積的神經毒性作用[Harrington，Wischik(1994)探討AD的分子病理生物學癡呆(A.Bums，R.Levy編)Chapman & Hall，倫敦，211-238頁]，但有關β-淀粉樣聚積與人類識別力損傷相關聯的證據不足。APP轉變過程可能只是引發Tau蛋白轉化的多種因素之一。其它引發因素包括未明的與載脂蛋白E4(apoE4)相關的過程(Harrington等，(1994b)，出處同前)、染色體21的三體性[Mukaetova-Ladinska等(1994)腦功能不全展望，7311-329]以及環境因素，例如鋁亞毒性環境長期暴露(Harrington等(1994c)Lancet，343，993-997)。可能誘發一般模式的Tau-蛋白作用障礙的明確病因學因素包括谷氨酸-391(Glu-391)處C-末端截斷、PHF-Tau多聚體的形成、可溶性tau蛋白的丟失以及異常磷酸化Tau種類的聚積[Wischik等，(1996)國際精神病學評論(印刷中)]。
作為抗蛋白酶PHF核心成分的微管交聯蛋白tau片段93/95是來自Tau蛋白微管交聯區的氨基酸殘基片段[Wischik等，(1988)，出處同前；Kanda等，(1988)，神經原，1，827-834；Jakes等(1997)歐洲分子生物學學會雜志，10，2725-2729；Novak等(1993)，歐洲分子生物學學會雜志，12，365-370]。Tau蛋白在成人腦中有6種351至441個氨基酸殘基組成的固型體[Goedert等，(1989)，神經原，3，519-526]。在一般結構中tau分子的組成是一個有252個殘基的N-末端區(從微管分子處凸出來)、一個由3或4個前后重復構成的93-125個殘基的前后重復區(該區為微管結合區)、以及一個含64個殘基的C-末端尾。每個前后重復結構由一種含19個殘基的微管蛋白結合區段和一種含12個殘基的連接區段構成[Butner，和Kirschner，(1991)，細胞生物學雜志，115，717-730；

圖1]。tau蛋白的主要有效成份是一種來源于3-或4-重復同型體的12(KDa)的片段。該片段可以從富含抗蛋白酶的核心PHF制劑中提取，但每一同型體都限制在3個前后重復結構的平衡狀態(Jakes等，出處同前；圖2)。該片段的N和C-末端邊界限定了特征性抗蛋白酶PHF核心tau單位的確切范圍，該范圍根據Butner和Kirschner定義的正常分子結合體/連接體的結構按14/16個殘基發生周期性變化(Butner，Kirschner，出處同前，圖1)，并在與Glu-391或4-重復同型體的3個重復結構相同的位置發生C-末端截斷(Novak等(1993)，出處同前，圖3)。一種單克隆抗體(mAb423)可以特異性識別該C-末端截點，并應用該抗體進行的組織學研究表明在整個神經原纖維退化過程中都在Glu-391有C-末端截斷的tau蛋白(Mena等(1995)神經病理學報，89，50-56；Mena等(1996)神經病理學報(印刷中))。因此，涉及PHF形成的翻譯后修飾可能是一種異常的蛋白水解作用。
現在已發展的一些方法可以識別AD人的腦組織中不同tau-蛋白池，包括正常可溶性Tau蛋白、磷酸化Tau蛋白、以及抗蛋白酶PHFs[Harrington等，(1990)(1991)(1994a)，出處同前]。這些方法已經被推廣應用于研究嚴重的AD和Down′s綜合征[Mukaetovce-Ladinska等，(1993)(1995)，出處同前]，也應用于早期AD患者(Wischik等(1995a)，出處同前；Lai等(1995)，出處同前)和其它由神經病理性診斷的病例(包括雷維小體病和帕金森氏病引起的老年癡呆)的前瞻性研究(Harrington等，(1994a)(1994b)，出處同前)。根據腦組織中完整的PHF構成能明確區別有或沒有阿耳茨海默型癡呆的患者，兩者PHF含量存在19倍的差異，在顳部皮層中可達40倍。組織學研究認為主要的PHF聚積點(按抗蛋白酶PHFs或磷酸化tau蛋白形成的聚積來說)與年齡控制區無差別(Harrington等，(1994a)(1994b)，出處同前)。而且載脂蛋白E4基因型在雷維小體病皮層和在AD中具有相同程度的E4等位基因。因此，E4等位基因的存在不是AD tau蛋白病理特征的唯一原因，因為該病理特征尚未在雷維小體病中發現(Harrington等(1996)出處同前)。
正常溶解性tau蛋白的數量是鑒別有或沒有AD病例的另一參數。盡管白質中tau蛋白水平比灰質中高，但對于軸突微管交聯蛋白，灰質中的數量也能反映傳入神經軸突的分布。AD患者存在明顯的正常可溶性tau蛋白喪失，該喪失均勻地影響到全腦各部位(Mukaetova-Ladinska等，(1993)，出處同前)。這種腦衰退的分子基礎尚屬未知，也無法用tau蛋白mRNA減少來解釋(Goedort等，(1988)，美國國家科學院匯刊，85，4051-4058)。PHFs聚積和可溶性tau蛋白喪失造成了tau蛋白池解剖上的再分配由白質占主體轉變為灰質占主體，由額面占主體轉變為顳壁占主體。
AD中全腦tau蛋白再分配的程度可用圖4中顯示的數據表示。該圖對全部正常活動的tau蛋白池和PHF交聯tau池進行了比較，對照組中97％的tau蛋白池處于可溶狀態，而AD中87％的處于不可溶狀態，而且幾乎全部為截斷形式和聚合成PHFs形式(Mukaetova-Ladinska等(1993)，出處同前)。應用臨床診斷儀CAMDEX對早發AD病患者進行的前瞻性研究(Roth等(1986)，英國精神病學雜志，149，698-709)和按Braak的標準進行的尸體解剖(Braak(1991)，神經病理學報，82，239-259)研究表明可溶性Tau蛋白的喪失與纏結數及PHF聚積的程度直接相關(Lai等，(1995)，出處同前)。
盡管異常磷酸化tau蛋白被認為可能是一種PHF前體(Lee等(1991)科學，251，675-678；Goedert等，(1994)微管(Hyams，Llogd編)183-200頁，John Wiley and Sons，紐約)，但在許多曾被認為是PHF結合的tau蛋白異常磷酸化的部位，正常tau蛋白也發生了磷酸化(Matsuo等，(1994)，神經元，13，989-1002)，對早發AD研究發現，非溶解性高度磷酸化tau蛋白最早出現于可測知的tau蛋白重分配后轉化為PHFs后(Lai等，1995；圖5)。尚無證據表明磷酸化tau蛋白在出現PHFs或神經原纖維混亂之前有選擇性的聚集(Lai等，(1995)，同前)。同樣，也無證據表明在病理進程中有磷酸化tau蛋白供應PHF-結合池(Lai等，(1995)，同前)。tau蛋白的磷酸化至今仍是一種異常現象，它可能是在病理階段影響大約5％PHFs的一種次級過程(Wischik等(1995a)(1995c)同前)。
早期AD研究還表明溶解性tau蛋白轉變為PHFs的轉化率與PHF水平呈等比級數關系隨周圍高水平的PHFs聚集率而逐漸增長(Lai等，(1995)，出處同前，圖6B)。而且，病理進程中所觀察到的溶解性Tau喪失率不能充分解釋PHFs聚集率，當周圍溶解性tau水平降至580pmol/g以下時，可引起進行性新的tau合成，并進入PHF組成系統(圖6A)。因此PHF聚集率并非由溶解性前體的狀態或聚集濃度決定。(該前體的狀態和聚集情況即使在AD中也是完全正常的)。(Wischik等，(1995a)(1995b)出處同前)。更確切地說，可溶性tau蛋白轉化為PHFs的轉化率是由周圍PHF-tau水平決定的，這就提示，在tau蛋白轉變為PHF聚積時的關鍵性翻譯后的修飾決定了PHF聚積的發生。
這些發現的一個可能解釋為Tau蛋白在轉變為PHF聚積時遭受了結構上的變化。這一變化與前后重復區的半重復階段的轉變相聯系，如以前的文獻報導一樣(Novak等(1993)，出處同前)。該tau蛋白結構的變化使高親和tau蛋白捕獲位點暴露，捕獲tau蛋白并誘導另一tau分子發生結構調整，等等。這種決定PHF聚積率的tau蛋白關鍵性結構變化不是可溶性tau所需的化學修飾，而是一個由tau蛋白結合到病理性基體時發生的誘導性結構改變。這一過程也可被非tau蛋白啟動，例如APP代謝產物(Caputo等(1992)腦研究，597，227-232)、修飾后線粒體蛋白(Wallale(1994)，美國國家科學院匯刊，91，8739-8746)等。一旦tau捕獲過程發生，將使下一捕獲過程的發生率超出病理性tau復合物的降解率。PHF核心tau復合物抗蛋白酶的作用會限制這一降解過程(Wischik等(1988)，出處同前；Jakes等，出處同前)。一般認為，在沒有任何可溶性tau蛋白間插性化學修飾的干擾下，tau蛋白淀粉樣作用過程會被啟動并呈等比級數速度發展。
圖7概括描述了AD中tau蛋白轉變為PHFs的過程。PHF核心主要的蛋白組成形式是一種截至93個殘基的tau蛋白，該片段是tau分子前后重復區的移碼翻譯形成的，tau分子的前后重復區在正常情況下作為微管結合區。PHF系統的裝配可以看作為一種重復序列的結果，其中病理性tau-tau結合起到主導作用。游離tau蛋白的這種結合只有在不對稱情況中才有助于生理性聚積，在這種情況中tau分子經受了病理性捕獲，例如APP代謝產物(caputo等(1992)神經生物學，老化，13，267-274)，或修飾后線粒體蛋白(Jancsit等，(1989)細胞能動力與細胞骨架，14，372-381；Wallace，出處同前)。下一tau蛋白結合由捕獲種類的不完全蛋白水解過程促進，最后只剩下截形的tau蛋白單位。一旦一個全長或截形tau單位與另一全長tau分子結合，病理性復合物的不完全蛋白水解過程將產生一個核心tau單位的二聚體，伴隨著失去前一完整tau分子的N-或C-末端區。蛋白水解過程的局限性是由tau-tau結合區域決定的，該區域與最小抗蛋白酶tau單位準確對應，對這方面我們已作了報道(Novok等，(1993)，出處同前)(見圖16，17)。但是，不完全水解的最終結果是核心tau單位的再生，該tau單位能捕獲下一全長tau分子，這一過程不斷重復直到可獲得的tau-蛋白池耗竭，其中需要兩個關鍵步驟首先是截斷的單位重復捕獲全長tau蛋白，第二是截斷結合的全長tau蛋白，再產生核心單位。
到目前為至，尚無檢測病理性tau-tau交聯的可靠方法的報導，也無關于調節或抑制病理性tau-tau結合的藥物的發表。
在本申請權利要求書中提出了解決以上問題的具體方案的技術特征。
因此，本發明涉及檢測能調節或抑制病理性tau-tau結合制劑的方法，該方法包括a)一種tau蛋白或其含有tau核心片段的衍生物與b)一種推測能調節或抑制tau-tau交聯的制劑并與c)一種能與a)中tau蛋白結合的標記的tau蛋白或其標記的衍和物接觸，或與不同于a)中的tau蛋白，而也能與a)中的tau蛋白結合的tau蛋白或其衍生物接觸，以及d)tau-tau結合的檢測。
與聚合反應有關的tau蛋白修飾轉化為PHFs的過程是由物理結構變化而不是由tau蛋白的任何化學翻譯后的修飾而進行的。但令人吃驚的是，通過把tau先結合到固相上，將這種由病理性tau捕獲發生時產生的體內修飾轉移或按上述過程進行的體外方法是可能的。從新生大鼠腦中分離出的tau蛋白完全不能結合到PHF的核心tau單位上(圖14，“POTr”)。但以前已經被動結合到固相基質上的新生tau蛋白能夠被誘導與無修飾的全長tau蛋白結合，該全長tau蛋白與核心tau單位有相同的高親和力。因此，將一種不能發生病理性結合的tau蛋白轉化為能捕獲另一種高親和力的tau分子所需要的關鍵性因素是由新生tau蛋白與固相物質發生被動結合所導致的結構變化。這表明高親和tau捕獲位點的暴露能被發生在tau蛋白與適當物質結合時的結構變化所誘導。
根據本發明，在體外實驗中再現的病理性結合的某些重要特性與在人腦中所見到的相同，特別是結合在丙氨酸-390(Ala-390)(圖21，SEQ ID NO4)終止的核心tau單位的全長tau蛋白，該核心tau單位因此而缺乏被單克隆抗體423(mAb423)識別所需的Glu-391，在用廣譜蛋白酶(鏈霉蛋白酶)消化處理該結合的tau復合物后，能以一種定量依賴于鏈霉蛋白酶消化(圖16)程度的方式與mAb423發生反應(圖16)。N-末端tau蛋白免疫反應性的消化依賴性的喪失可表明它與獲得核心PHF的特征mAb423免疫反應性相平行(圖16)。因此從PHF核心分離并在AD患者腦中生成tau單位的必要條件是病理性tau-tau相互作用。這已在體外實驗中再現。
而且，全長tau蛋白重復循環結合到Ala-390上終止的tau單位上，接著用鏈霉蛋白酶處理，再與全長tau結合，以及再進行鏈霉蛋白酶的消化，就這樣一直到4個循環完成，都與Glu-391C-末端截斷的tau蛋白逐漸聚集相關(圖17)，并且每一循環都伴有全長tau蛋白結合能力的逐漸增加(圖18)。這表明圖7所示的模型中蛋白酶解的重要作用是防止飽和，并因此促進可溶性tau無限制逐漸轉化到PHF核心截斷的t單位。
已證明圖7中所有步驟均能在體外實驗中復制。這一進程的關鍵條件是tau捕獲階段的高親和力。這可證明對該結合情況的鑒定可用來尋找能阻斷高親和力tau-tau結合的化合物。
大多數有抑制能力化合物在其與tau蛋白的摩爾比為1∶1時，可顯示20％的競爭性抑制，進一步的抑制大約在其摩爾比提高到10∶1時才能顯現(圖19)。
因為前后重復區作為整體發揮作用，所以出乎意料的是病理性tau-tau結合的選擇性競爭的抑制作用不干擾同一分子區的tau與微管蛋白的正常結合是可能的。確定任何可能干擾的方法(即干擾tau或其衍生物與微管蛋白分子的結合)，包括將解聚的微管蛋白制劑或用紫杉酚固定的微管蛋白制劑與一種估計能調節或抑制病理性tau-tau交聯的制劑和一種上述c)中提到的tau化合物接觸，接著檢測tau-微管蛋白的結合。
“tau蛋白”這一術語指的是以上提到的tau蛋白家族中的任一種蛋白及其衍生物。tau蛋白是大量蛋白家族中的一類，這些蛋白家族在結合和分解的重復循環中與微管發生共純化(Shelanski等，(1973)，美國國家科學院匯刊)，70，765-768)，并且tau蛋白還被稱為微管結合蛋白(MAPs)。此外tau家族包含一個特征性N-末端片段，該片段為該tau蛋白家族的所有成員共有；一個插入到N-末端片段中在腦中發展調型的約50個氨基酸構成的序列；一個特征性前后重復區，由31-32個氨基酸前后重復3或4次構成；以及一個C-末端尾(圖2)。
在本發明的一優選方案中，tau蛋白包含圖21的氨基酸序列(SEQ IDNO5)，被稱為“T40”(Goedert等，(1989)，神經元3519-526)，或其片段，并且其形狀是含有2個N-末端插入和4個前后重復結構的tau蛋白。
“tau核心片段”是指最基本形式的tau片段，含有一個由前后重復區產生的截形的tau蛋白序列，該前后重復區在適當條件下能與另一高親和性tau蛋白的前后重復區結合。一般說來，優選的tau蛋白、tau蛋白衍生物以及tau蛋白核心片段都具有一氨基酸序列，該序列至少有70％與相應人類tau蛋白氨基酸序列(圖21，SEQ ID NO5)相同。至少80％為更優選，至少90％為最優選，并且它們的特征在于這些優選tau蛋白能與人類tau核心片段結合。本發明檢測方法的獨特優點體現在它包括了具有圖22中所示的氨基酸序列的tau核心片段(SEQ ID NO6；Novak等，1993)。這一由大腸桿菌在體外表達的重組tau肽與從抗蛋白酶PHF核心制劑中分離出的相應(Wischik等(1988)，出處同前；Jakes等，(1991)出處同前)。“tau核心片段”也包括它在以下所述的及在圖25、26中提及的衍生物(SEQ ID NO9，10)。
“tau蛋白衍生物”及“tau核心片段衍生物”包括天然或非天然生成的tau蛋白以及相關蛋白的片段。所謂相關蛋白是指那些至少含有與tau蛋白前后重復區部分相似的氨基酸序列的蛋白，即天然tau或其片段中一個或多個氨基酸已被取代或除去而未喪失結合活性的蛋白。與前后重復區有相似序列的天然蛋白，其實例有微管結合蛋白(MAP2；圖25、26；SEQ ID NO9，10；Kindler和Garner(1994)，分子腦研究，26，218-224)。這樣的類似物可由已知的肽化學方法或DNA重組技術制備。
“tau蛋白衍生物”和“Tau核心片段衍生物”是指那些可用現有技術中已知的方法從殘基的側鏈或N，C-末端基團制備的衍生物。這些衍生物包括羧基脂肪族酯、羧基與氨或者與伯或仲胺反應而產生的羧基酰胺、氨基酸殘基中游離的氨基團與酰基(例如鏈烷醇或碳環芳酰基團)形成的N-酰基衍生物或游離羥基團(例如絲氨酰基或蘇氨酰基殘基)與酰基部分形成的O-酰基衍生物。
核心PHF tau片段可用Wischik等所述的方法從AD患者腦組織中分離出來(1988，1995a出處同前)，這種方法依賴于一系列不同速度的離心。這些離心步驟是在經驗確定的緩沖液和濃度條件下進行的。最后關鍵性的一步離心在從1.05到1.18密度之間連續變化的蔗糖密度梯度以及10μg/ml鏈霉蛋白酶存在下進行的，在高濃度氯化銫緩沖墊層交界面上形成一抗蛋白酶PHF核心片段。tau蛋白是從PHF核心中釋放出來在pH＝5.5的上清液(50mmol氨基乙酸酯)中一種基本純化的制劑，該上清液經濃縮甲酸處理PHF制劑，凍干，并在pH5.5的緩沖液中進行聲處理后獲得。
正常可溶性tau可從死后3小時內尸解的AD患者、對照組人腦組織或動物腦組織中分離出來，微管蛋白可按Shelanski等所述(1973，同前)通過溫度依賴性的三個結合-分解循環獲得。tau蛋白可經凝膠過濾從耐熱級份中純化制備(Hezzog，Weber(1978)歐洲分子生化雜志，92，1-8)。或者也可按Lindwall和Cole(1984；生物化學雜志，259，12241-12245)的方法分離，這種方法以tau蛋白在2.5％高氯酸中的溶解性為基礎。
tau蛋白和其片段的產生也可用傳統的DNA重組技術。該技術屬于該領域的已知技術，在文獻中有詳細報道，例如Sambrook，Frisch和Maniatis編的“分子克隆、實驗手冊”(1989)，Cold Spring Harbor實驗室，紐約；及Ausubel等的“分子生物學實驗方案”Green出版社，Association & Wileyinterscience。
而且，編碼全部或部分tau蛋白的DNA分子或其衍生片段可經聚合酶鏈反應(PCR)技術獲得，編碼相關的DNA分子3′，5′部位的引物可合成為需要的tau蛋白，也可用來擴增tau蛋白家族中的各個成員。
目前已知的制備微管蛋白或其片段的方法由Slobuda等在“細胞活動”(R.Goldman，T，Pollard和J.Rosenbanm編，Cold Spring Harbor實驗室，ColdSpring港，紐約，1171-1212頁)一書中進行了說明。
DNA序列和DNA分子可應用多種宿主/載體聯合系統進行表達。例如，可應用的表達載體包含染色體片段、非染色體片段及合成的DNA序列片段。這些載體的例子有病毒載體，如多種已知的SV40(猿猴病毒40)；細菌載體如來自大腸桿菌的質粒；噬菌體DNA載體如大量的噬菌體λ衍生物，MB及其它絲狀單鏈DNA噬菌體；以及酵母中應用的載體如2μ質粒衍生物；用于真核生物細胞的載體(更優選用于動物細胞的載體)如包含來自SV40、腺病毒和/或反轉錄病毒的DNA序列的載體。
這里所述的“DNA序列”是指其形式為分散片段或較大DNA結構成分的DNA聚合物，來自至少分離一次的基本上純化形式DNA，即，未污染的內源性物質并且其量和濃度為使其序列和其組成的核酸序列能用標準生化方法(例如應用克隆載體)鑒定、調控及恢復。這些序列優選不含非翻譯區(或內含子，典型存在于真核生物基因中)的連續的開放讀框形式。但是，也能選用含有相關序列的基因組DNA。非翻譯區DNA序列可存在于開放讀框的5′或3′位置，同樣也不干擾編碼區的調控或表達。
這里所說的“表達載體”“表達質粒”是指包含轉錄單位的質粒。該轉錄單位的裝配成分包括(1)一遺傳因子或在基因表達中具有調控作用的一些因子，例如啟動子或增強子，(2)能轉錄為mRNA并翻譯成蛋白質的結構序列或編碼序列，(3)適當的轉錄和翻譯的啟動及終止序列。在多種真核細胞表達系統中應用的結構因子優選包含有能被宿主細胞用于進行細胞外分泌翻譯蛋白質的前導序列。或者，在無前導或轉運序列的重組蛋白表達的位置，可以含有N-末端蛋氨酸殘基。該殘基隨后可以從表達的重組蛋白斷裂而提供最終產物。
用以表達DNA序列的宿主細胞可從多種已知的宿主中選擇，這些宿主的例子有原核生物或真核生物細胞。從不同的保芷單位可獲得大量這樣的宿主，例如ATCC(美國典型培養物保芷中心)或德意志微生物保芷中心(DSM)。原核生物細胞宿主的例子包括大腸桿菌、枯葉桿菌及其它的一些菌株。優選宿主是可購得的哺乳動物細胞，例如小鼠3T3細胞、或神經細胞瘤細胞株(如NIE-115、N2A、PC-12、或SV40轉染的非洲綠猿腎細胞株COS等。
用本發明的DNA序列轉化的原核或真核生物細胞經發酵制備的tau蛋白能應用以下已知方法純化為基本的同型體，例如用不同速度離心的方法、與硫酸銨共沉淀、在常壓或低壓下透析、制備性等電聚焦、制備性凝膠電泳、或多種層析法例如凝膠過濾、高效液相色譜(HPLC)、離子交換層析、反相層析以及親和層析(例如應用Sepharose Blue CL-6B束縛載體的單克隆抗體)。
根據本發明將tau蛋白或其含有tau核心片段的衍生物與另一tau蛋白及推測有調節或抑制病理性tau-tau結合的制劑共同孵育。tau-tau結合程度與該制劑的抑制能力相關，可用以下各種方法檢測
優選方法tau蛋白或其含有tau核心片段的片段與一tau衍生物孵育，該衍生物具有明確的與第一種tau蛋白不同的免疫學特性。在這種情況下，tau衍生物的結合可用多克隆抗體或單克隆抗體或其衍生物檢測。以下的這一種檢測tau-tau結合的鑒定方法就是這類檢測方法的例子將相應于核心片段的截形tau蛋白與受試物質及全長tau蛋白或截形tau蛋白片段一起孵育，該片段能模擬含水相中核心PHF的tau單位(圖8，10)。
在此情況下，tau-tau結合可用傳統的方法應用識別抗體進行免疫生化檢測，該抗體能識別全長tau蛋白的N-末端區段，例如抗體mAb423能識別Glu-391截斷的tau核心片段。有利的是，本發明的單克隆抗體自身攜帶有標記物或直接或間接與標記物偶聯的基團，這將在下面舉例說明。也能使用由相應的tau抗原注射到動物(優選家兔)體內而產生的多克隆抗血清，應用免疫親和純化法可以恢復該抗血清，該方法包括將多克隆抗體經過一限制性抗原柱并用傳統方式洗脫該多克隆抗體。
本發明特別優選的實施方案包括應用一種能直接對抗位于tau蛋白N-末端附近Gly-16和Glu-26之間的人類特異性區段的抗體。該類抗體的應用使本方法能夠檢測全長重組人類tau蛋白與來自其它動物(如大鼠)在不同發育階段的全長tau同種型之間的結合。截形tau蛋白的結合可用一種特定抗體檢測，例如用mAb423能檢測在Glu-391末端截斷的Tau片段與在Ala-390末端截斷的相似片段之間的結合，后者不能被Ab423識別(圖8)。
這些抗體或其片段能應用于本學科已知的任一免疫檢測系統，包括但不僅限于放射免疫檢測、“三明治”檢測，酶聯免疫吸附測定(ELISA)、熒光免疫測定、蛋白A免疫檢測等方法。
以下tau-tau結合檢測的構型屬優選(圖10)將tau片段特別是重組tau片段(相應于核心PHF截斷的tau單位)在不會促進tau-tau結合的緩沖液條件下結合到固相物質板上，例如傳統的ELISA板上。該截斷的tau蛋白與固相的結合優選的是被動結合，這是因為在前后重復區內有高親和力的tau-tau結合位點。所用的固相物質通常為聚氯乙烯。也可以是纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯或聚丙烯等聚合物。固相支持物可以采用管、珠、盤、微板形式或其它適合于檢測方法的表面，它在被動結合tau蛋白時暴露高親和力的捕獲位點。結合后，清洗該固相抗體結合物作為測試樣品。
確定適當的緩沖液條件，使核心PHF截斷的tau單位與固相結合時不存在自身結合，也不干擾前后重復區內高親和力的捕獲位點。圖8建立的檢測系統中，Ala-390截斷的核心tau單位首先與固相基體結合，然后與Glu-391末端截斷的tau單位共孵育。只有后者能檢測mAb423的免疫反應性。圖9顯示了該檢測方法的特性，其中只有在預期有tau-tau結合的條件下才能顯示mAb423的免疫活性。堿性緩沖液(碳酸鈉，tris等)pH值范圍優選9-10，例如選用碳酸鈉緩沖液(50mM，pH9.6)可忽略核心tau單位的自身結合(圖9)。因此，被動結合到固相上的核心tau單位板就是在這種緩沖液中制備的。如果需要，解聚的微管蛋白制劑或在相同緩沖液中的微管制劑也能用平板培養法來測定tau-微管蛋白結合的被動結合。用以阻斷多余結合位點的合適試劑有牛奶提取物、牛血清蛋白、明膠等。將結合了核心tau單位的固相轉至生理性緩沖液中并與全長tau一起孵育為標準的結合鑒定形式(圖10)后，可以顯示極高親和力捕獲的正常全長tau蛋白。在固相板上未預先鋪上核心tau單位的未見到全長tau的結合。當兩者共存時，結合依賴于兩種tau蛋白的濃度。當固相或液相都飽和時，另一種類tau蛋白的結合常數依據所測tau蛋白同型體的不同在8-25nm之間變化(圖11)。tau-tau結合緩沖液的條件應包括適當的鹽濃度及適當的pH值(圖12，13)，該鹽濃度優選50-400nm的氯化鈉，更優選100-200nM氯化鈉或有相當離子強度的相應的鹽或鹽的混合物，例如PBS(137mMNaCl、1.47mM KH2PO4、8.1mMNCl2HPO4，2.68mM KCl)。pH值應在4-10范圍，優選5-8。為了飽和過剩的結合位點并避免非特異結合，固相應與阻斷劑一起孵育，例如牛奶提取物、小牛血清或明膠(優選)。將被動結合的核心tau單位轉移到生理性緩沖液中后，能夠顯示正常全長tau蛋白極高捕獲親和力(緩沖液Kd＝8-25nM，依據測試的具體tau種類而定)。
含有tau蛋白(該tau蛋白能結合到固相tau蛋白上)的液相，與被測物一起加到固相tau蛋白上，放置片刻使其充分結合，然后將結合的tau復合物在加有抗體的制劑中清洗，該抗體選擇性檢測二次結合的tau蛋白，而不是最初的固相tau蛋白。抗體與作為指示的分子結合，用以顯示第二種tau蛋白的結合的信號。
或者，應用能與第一種未標記的tau特異抗體結合的第二種抗體也能檢測結合的情況，在這種情況下，該二抗與報告分子結合。
“報告分子”在本說明書中是指這樣一種分子依據其化學特性能提供一種可供分析檢測的標記，該標記能檢測抗原限制性抗體。檢測必須至少能相對定量，即能按絕對單位計算或與一包含有已知正常抗原水平的標準(或標準系列)對照來確定樣品中抗原的數量。
本檢測方法中最常用的報告分子為酶或熒光團。在酶免疫測定時，經常通過戊二醛或過碘酸鹽將酶接到第二抗體上。這種標記很容易識別，有多種不同的接合技術均是專業人員已知的。通常所用的酶有辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶等。
結合了特異性酶的基質一般可以進行選擇生產，經相應酶水解后，產物發生可檢測的顏色變化。例如對硝基苯磷酸鹽適合于用堿性磷酸酶輟合物，對于過氧化物酶輟合物，常用于標記1，2-苯二胺或四甲基聯苯胺。也可用熒光底物標記，此時將產生一種熒光性產物而不是上述的顯色底物。在所有情況下，酶標抗體加到相應的tau-tau蛋白復合物上，能再結合其它復合物，然后將過剩的反應物洗掉。將含有適當底物的溶液(過氧化氫)加到三級復合物抗體-抗原-標記物上。該底物與結合到抗體上的酶反應，產生定性的可見信號，它可通過分光光度計定量評價血清樣本中抗原的量。
或者，熒光化合物如熒光素，或若丹明，也可經化學方法標記到抗體上而不改變抗體的結合能力。當用特定波長的光激活后，熒光標記抗體吸附光能，使分子處于激活狀態，發出特定的較長波長的光。應用光顯微鏡可以觀察到這種發光的特定顏色。在酶免疫測定(EIA)時，熒光標記的抗體可與一級抗體-tau蛋白-肽復合物結合。洗去未結合反應物后，將保留下三級復合物暴露在適當波長的光下，熒光觀察顯示抗原的存在。
在本發明另一優選實施方案中與受測物一起加到液相中的第二種tau蛋白可以與前面提到的報告分子結合，該第二種tau蛋白可以直接被修飾(例如用放射性或酶促方法標記)或在該分子的一個區內(例如N-末端區)被接合(例如與一熒光團接合)，例如該N末端區段，它不包含高親和力的tau-tau結合位點，因此其本身的作用是可以作為tau-tau結合測定中的配體，也可作為報告分子。
本發明的特別優選方案在實施例1中作了詳細說明。
本發明方法中應用的抗體及其片段可用傳統技術制備，即對tau抗原決定簇選擇性的單克隆抗體可采用Kohler和Milstein的方法獲得。相對于tau抗原決定簇的適當單克隆抗體可用已知的方法修飾以獲取Fab片段或(Fab′)2片段、嵌合的、人源化的或單鏈的抗體結構。
應用單克隆抗體測定tau-tau相互作用中的結合親合力并顯示體外實驗中的結合與人腦中發生的結合之間免疫化學關系的實施例如下識別N-末端或C-末端tau決定簇的單抗能測定截斷的與全長的tau蛋白之間的結合。能識別人類特異抗原決定簇的抗體是特別有用的抗體。一種單抗(標記為AK999)能識別在tau蛋白的Gly-16和Gln26之間的人特異性抗原決定簇，因此也能測定全長tau蛋白之間的結合，若其是由非人源化產生的話(Lai(1995)“tau蛋白的異常磷酸化在阿耳茨海默氏病的神經原纖維病理發展中的作用”，博士論文，(劍橋大學)。抗體342能識別位于Ser-208和Asn-265之間的一種非特異性的普通tau抗原決定簇(圖21，SEQ IDNO4)，該抗原決定簇在tau-tau相互作用中將會部分地被阻塞(Lai，出處同前)。
其它有用的抗體已有報道抗體423識別在Glu-391處C-末端截斷的tau蛋白(Novak等，(1993)，出處同前)。這種截斷作用自然發生在AD病例中PHF團形成的過程(Mena等，(1995)(1996)，出處同前；Novak等，(1993)，出處同前；Mena等，(1991)，出處同前)。相同的C-末端截斷在體外實驗中得到證實全長tau結合到Ala-390截斷的tau片段后，該片斷不能被mAb423識別(Novak等(1993)同前)，接著用廣譜蛋白酶(鏈霉蛋白酶)消化(圖16)。在這一過程中mAb423免疫反應性的唯一可能來源是結合的全長tau蛋白發生消化作用，這可以用濃度依賴法通過增加鏈霉蛋白酶濃度來顯示(圖16)。以上表明在體外產生tau-tau結合的分子構型與腦中產生的構型能確切地相對應，因此在體外實驗中顯示的對tau-tau結合的選擇性抑制同樣也能應用于人腦。
抗體7.51識別一種位于tau蛋白的倒數第三個重復結構的普通tau蛋白抗原決定簇(Novak等(1991)美國國家科學院匯刊，88，5837-5841)。當tau結合到與PHF類似的免疫化學構型時，該tau抗原決定簇被阻塞，但用甲酸處理后可以再暴露(Harrington等(1990)(1991)，出處同前；Wischik等(1995a)出處同前)。正常可溶性tau或結合微管的tau能用mAb7.51檢測而無需甲酸處理(Harrington等(1991)，出處同前；Wischik等(1995a)，出處同前)。在tau-tau結合的測定中全長tau的結合與mAb7.51抗原決定簇的不完全阻斷有關。
本發明應用的酚噻嗪在Ki為98-108nM(圖19)時發生了結合的抑制作用，其與tau蛋白摩爾比為1∶1時顯示20％的抑制，進一步的抑制作用在摩爾比達10∶1時大致呈線性，這與以下假說相一致tau-tau結合是由有限數量的飽和結合位點決定的，因此具有特異性；而無協同性，即一個tau分子的結合不影響另一tau分子在發生抑制的位點進行結合；結合是可逆的，處于動態平衡狀態，在平衡時結合僅由tau濃度和結合的親和力決定。
考慮到tau前后重復區作為微管蛋白結合區的正常功能，同時在相同的分子區也含有用于PHF集合的捕獲位點，如果更細微的分子差異能在兩種類型的結合間顯示，則只有藥物干預才可能阻止tau的病理性結合，這將會選擇性抑制病理性tau-tau結合而不抑制正常tau-微管蛋白的結合，因為許多正常的細胞作用過程，特別是突觸小泡的軸突遷移(Okabe，Hirokaua(1990)自然343，479-482)，都是依賴于細胞在聚合狀態時維持微管蛋白的能力。前面的實驗顯示了兩者間免疫化學的差異(在tau-tau結合時阻塞mAb7.51抗原決定簇而在tau-微管蛋白結合時不阻塞；Harringon等(1991)，出處同前；Novak等(1991)，出處同前)和分子差異(相對于微管蛋白結合區的正常區段/連接物區段，在類似PHF構型中結合的tau顯示出14/16氨基酸殘基的移碼，這可由特征性N-，C-末端蛋白水解斷裂位點來證明；Novak等(1993)，出處同前圖3)。使人驚奇的是，這些差異也是在完善的藥物分類內應用小分子進行藥物鑒別的基礎。特別是那些能抑制病理性tau-tau結合的酚噻嗪對正常tau-微管蛋白的結合是否有抑制作用，對此也做了試驗。可以看出，tau摩爾比高達1000∶1基本上不抑制結合。盡管如此，tau的過多磷酸化(這已表明了對tau微管蛋白的抑制作用)，在tau-微管蛋白結合測定中也能產生類似的抑制作用(Lai，出處同前)。因此，本發明提供的化合物抑制病理性tau-tau結合而不抑制tau與微管蛋白的正常結合。這是本發明的關鍵所在，因為這表明了在這里所述的篩選系統基礎上本發明化合物的技術可行性，該篩選系統可以用藥物來鑒別PHF前后重復區的病理性結合和正常的tau-微管蛋白的結合。
到目前為止唯一的PHF核心微管結合蛋白是tau蛋白。盡管如此，但PHFs均積聚在軀體的樹突間隙中，該間隙中MAP2是主要的微管結合蛋白(Matus，A，微管(Hyams，Lloyd編)，155-166頁，John Voley & Sons紐約)。MSP2同型體的前后重復區幾乎與tau蛋白相同，但兩者在N-末端區的序列和范圍都有顯著差異(圖25，26，SEQ ID NO9，10)。正如在實施例3中所示，在前后重復區的聚集不是選擇性針對特異性tau核心氨基酸序列，并且酚噻嗪抑制劑(如硫堇)的抑制活性也不依賴tau的特有序列。
另外，本發明也涉及相應的體內方法，這些方法用于篩選能調節或抑制病理性tau-tau結合的藥物。該tau-tau結合的特征是用tau蛋白或其含有tau核心片段的衍生物或者用表達tau蛋白或含有tau核心片段衍生物的載體轉染的細胞株，與一種推測能調節或抑制tau-tau結合的制劑接觸，然后檢測該細胞株的活性和/或形態。
實施例4和5顯示，當表達轉基因的全長tau蛋白以及該蛋白的細胞骨架分布不受潛在的tau-tau結合抑制劑培養細胞的干擾時，成纖維細胞是完全存活的，酚噻嗪硫堇未顯示明顯內在毒性。但當PHF的轉基因核心tau單位表達時，成纖維細胞死亡或呈現全形態異常。轉染物的存活頻率和截斷的tau的表達水平，受轉染后硫堇中細胞的生長而按劑量依賴方式增加。表達截斷的tau的活性轉染子依賴于硫堇，并伴隨提取后的低存活性而逆轉為異常形式。
這些發現是本發明在無神經元的細胞系統中的具體體現，即證實了細胞中高水平的PHF核心單位具有毒性；這種毒性可被病理性tau-tau結合作用的選擇性抑制劑化合物逆轉；這些化合物不干擾正常tau與微管蛋白在體外的正常結合。這些發現同時適用于其它實驗模型，包括可誘導的轉染系統及有截形tau蛋白的細胞直接轉染。
盡管前述結果都支持tau-tau結合抑制劑在逆轉被截形tau單位毒性時的應用，但還需要建立這些過程的神經元模型。一般說來，成神經細胞瘤細胞株在分化過程中經受了復雜的細胞骨架改變，該分化過程依賴于微管網絡的發育和神經絲網絡的相應發育之間的平衡。更高分子量的微管結合蛋白(MAPIA，MAPIB)被認為是在這些細胞骨架系統之間的橫橋(Schoenfied等(1989)，神經科學雜志，9，1712-1730)。用解聚劑(Wisniewski，Terry實驗研究，17，577-587)或鋁(Langui等(1988)，腦研究，438，67-76)直接干擾微管系統會導致中間微絲斷裂并在細胞質中形成特征螺環(WishcidcCrowther(1986)英國醫學通報，42，51-56)。相同的神經微絲細胞骨架聚集可在未發生分化的成神經細胞瘤細胞株中自發產生。MAPS在這些聚集體形成時的作用目前尚不清楚。但這些聚集體的形成、促染和抑制表明了微管細胞骨架連結和轉運神經系細胞骨架至新生軸突的能力。
實施例6和7表明硫堇等酚噻嗪抑制劑在濃度為2μm時，對神經細胞株不產生毒性，硫堇也不干擾轉基因tau蛋白加入到內源性微管網絡。隨著表達截形tau質粒穩定的轉染，活性神經細胞株的產生，需要有酚噻嗪的存在。而且截形tau蛋白的結構表達促進了pNFH聚集體的形成，而后者又能被全長tau蛋白的表達所抑制。細胞質pNFH聚集體的形成被酚噻嗪(如硫堇)抑制，而且pNFH免疫反應性在神經元進程中的體現也由這些化合物促進。
這些發現表明神經元細胞株穩定的轉染截形tau具有固有毒性，通過生存細胞中微管系統的去穩定，導致神經絲聚集體的形成，該聚集體不能被運送到正在生成的軸突上。這些作用能被體外具有阻斷tau-tau聚集能力的化合物所抑制，并且這種作用可受內源性tau或其它穩定微管所需的MAPs的表達作用的影響。硫堇等酚噻嗪竟然也具有阻斷未轉染細胞中神經絲聚集體的能力，這是由于促進神經元分化或直接抑制神經絲聚集體的形成所發揮的作用。除了它們在預防AD中tau聚集的用途之外，這些化合物在治療以病理性神經絲聚集為特征的疾病(例如運動神經元疾病，雷維小體病)時還有潛在的作用。現已發現，過度表達神經絲亞單位的轉基因小鼠在退化的大運動神經元中選擇性地發育神經絲，致使肌肉萎縮(Cote等，(1993)，細胞73，35-46；Xu等，(1993)，細胞，73，23-33)。其它的神經元退行性紊亂，如皮克病和進行性神經核上麻痹，在齒狀回和新大腦皮層的衛星錐體細胞中出現截形tau的聚集。前述的化合物也在這些神經退行性紊亂中起作用。
因此，本發明特別涉及上述的體內方法，在這種方法中優選細胞株為成纖維細胞或神經元細胞株，更優選成纖維細胞3T3、PC-12或NIE-115細胞珠。這些細胞株優選用至少包含有核心tau單位的截形tau蛋白轉染，tau蛋白的表達可按結構或在可誘導的調控下進行，或者這種tau蛋白也可或直接轉染。
本發明也涉及由上述任一方法獲得的能調節或抑制tau-tau結合的化合物。
根據上述結果，本發明也提供了式I酚噻嗪及其藥用鹽的應用，
其中R1、R2、R3、R4、R6、R7和R9可獨立地選自氫、鹵素、羥基、羧基、取代或未取代的烷基、鹵烷基或烷氧基；R2，R8可獨立地選自氫或
R5選自氫，羥基、羧基、取代或未取代的烷基，鹵烷基、烷氧基或單鍵；R10和R11可獨立地選自氫、羥基、羧基、取代或未取代的烷基、鹵烷基、烷氧基或單鍵；它們用于生產預防和治療病理性tau-tau或病理性神經絲聚集的藥物組合物，特別是用于預防和治療阿耳茨海默氏病、運動神經元病或雷維小體病的藥物組合物。
這里所用的“烷基”一詞是指直鏈或支鏈基團，優選有1-8個，更優選1-6個碳原子。例如“烷基”可以是甲基，乙基，正丙基，異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、叔戊基、己基、異己基等。本發明應用的烷基合適的取代基包括巰基、硫醚、硝基、氨基、芳氧基、鹵素、羥基和羰基團，也包括芳基、環烷基和無芳基的雜環基團。
“烷氧基”是指上面提到的烷基團同時攜帶氧原子，該氧原子間隔于烷基和其結合的基本殘基之間。
“鹵烷基”代表一種具有3-4個碳原子與1、2或3個鹵素原子結合的直鏈或支鏈烷基。典型的鹵烷基團有氯甲基，2-溴甲基、1-氯異丙基、3-氟丙基、2，3-二溴丁基、3-氯異丁基、碘-叔-丁基、三氟甲基等。
“鹵素”是指氟，氯，溴或碘。
本發明的一些化合物具有1個或多個不對稱取代的碳原子，因此存在外消旋的和光學活性的形式，本發明旨在包括外消旋形式的化合物及其任何的光學活性形式。
藥用酸加成鹽是分子式(I)的基本化合物與無機酸(例如氫鹵酸如氫氯酸和氫溴酸)、硫酸，硝酸，磷酸等)或有機酸(例如乙酸、檸檬酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、甲磺酸、對甲苯磺酸等)形成的化合物。
本發明優選實施方案中提供了上述酚噻嗪及其藥用鹽，其中R1、R3、R4、R6、R7和R9各自選自-H、-CH3、-C2H5、或-C3H7；R2和R8各自選自
其中R10，R11各自選自單鍵，-H、-CH3、-C2H5，或C3H7；R5是單鍵，-H、-CH3、-C2H5，或C3H7。
特別優選的是以下一些酚噻嗪a)甲苯胺藍O
b)硫堇
c)天藍A
d)天藍B
和e)1，9-二甲基亞甲蘭
能阻斷病理性tau-tau結合的化合物，優選酚噻嗪(圖23，24)，其特征是結合系數小于0.4，對tau-微管蛋白結合沒有抑制，其與tau摩爾濃度比優選1000∶1。
本發明中應用的酚噻嗪是本領域已知的，并能通過標準方法制備(例如Merck Manual，Houben-Weyl，BeilsteinE III/IV 27，1214ff，雜環化學雜志，21，613(1984)等)。
具有上述分子式的化合物、其藥用鹽或其它具有測定中所需特性的化合物，在進一步毒性試驗后能被用作藥物(例如以藥物制劑的形式)。亞甲蘭在以前的廣譜適應癥中的藥劑作用包括治療正鐵血紅蛋白血癥和預防躁狂抑郁精神病(Naylor(1986)生物精神病學21，915-920)及系統性給藥后的中樞神經系統(CNS)穿透(Muller(1992)解剖學報，144，39-44)。天藍A和B是亞甲蘭的正常代謝降解產物(Disanto和Wagner(1972a)藥學科學雜志，61，598-602；Disanto和Wagner(1972b)藥學科學雜志，61，1086-1094)。這些藥物的用法可采用腸胃外給藥例如口服(以片劑、糖衣片劑、糖衣丸、硬或軟膠囊、溶液劑、乳劑、懸浮劑的形式)或鼻腔吸入(例以鼻噴霧形式)或從直腸給藥(例如栓劑)。但腸胃外給藥也可采用肌注或靜脈點滴(例如以注射液的形式)。
具分子式(I)的化合物及其藥用酸加成鹽在制備片劑、糖衣片劑、糖衣丸、硬膠囊過程中可加入藥用惰性的無機或有機賦形劑。可以用乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石粉、硬脂酸或其鹽等作為片劑、糖衣丸、硬膠囊的賦形劑。
軟膠囊中適合的賦形劑可以是植物油、蠟、脂肪、半固態或液態多元醇等。
溶液劑和糖漿制品的適合賦形劑可以是水、多元醇、糖精、轉化糖、葡萄糖等。
注射液的適合賦形劑可以是水、酒精、多元醇、甘油、植物油等。
栓劑中合適賦形劑是天然油或硬化油、臘、脂肪、半液態或液態多元醇等。
此外，這些藥物制劑中也可含有防腐劑、增溶劑、增粘劑、穩定劑、濕潤劑、乳化劑、甜味劑、色素、香味素，用以改變滲透壓的鹽類、緩沖液、包衣劑或抗氧化劑。它們也可含有具有其它療效的物質。
根據本發明，具有上述分子式的化合物及其藥用鹽可用于治療或預防阿耳茨海默氏病，特別用于阻斷、調節，和抑制病理性tau-tau結合。劑量可在較寬的限度內變化，但要適合每一具體病例的個體要求。一般說來，口服給藥時日劑量約50-約700mg應當是足夠的，優選約150-約300mg，分成1到3單位劑量服用，每單位劑量相同。但如果需要也可超出上面給出的上限。
參考附圖可以更好的理解本發明圖1tau蛋白與微管結合(Butner，Kirschner(出處同前)之后作了修改)。
圖2tau蛋白同型體的示意結構，與圖21所示的氨基酸和cDNA序列相對應。N-末端區的252個殘基中包含1或2個由58個殘基組成的插入子(“1”，“2”)，后接93-125個殘基組成的前后重復區包括3或4個前后重復，以及一個由64個殘基組成的C-末端結尾。從富含抗蛋白酶PHF核心的制劑中分離出的tau片段被命名為
由來自3-或4-重復同型體兩者衍生的各種混合物，但包括93-95個殘基，相當于3-重復，相對于前后重復區的正常組織的銜接而言是由14-16個殘基移碼的。所有種類的
和正常tau蛋白都可被mAb7.51識別，但mAb423只能識別那些以Glu-391為結尾的
片段。該圖也顯示了mAb499、AT8和342抗原決定簇的位置。
圖3對來自核心PHF制劑的12kDa的F5.5片段的N-末端序列進行分析，揭示了存在6種不同的肽，可以歸為3對由
或4-重復的同型體組成的組，即3-重復同型體(A
3；SEQ ID NO1)；或4-重復同型體(B重復1-3；SEQ ID NO2，或C重復2-4；SEQ ID NO3)的同型體(Jakes等，出處同前)。mAb423的免疫反應性可用于確定Glu-391處的C-末端界限(箭頭所示，Novak等，(1993)，出處同前)。N-和C-末端的界限又能用來確定PHF核心內前后重復區的相，該PHF核相對于該序列同源重復，存在14-16個殘基的變移。這個最小的抗蛋白酶核心PHF tau單位長93或95個殘基，相當于3個重復結構。該單位的界限相對于Butner和Kirschner(同前)所提出的微管蛋白結合區(下線顯示)而言也是在相之外。
圖4對照組和AD組中的全部tau蛋白的含量，正常可溶性tau(白色)形式在對照組中占優勢，而在AD組中該優勢的tau聚合成PHF的形式(黑色)。
圖5在AD的早期，可溶性tau、磷酸化tau及纏結數的變化(Lai等，(1995)出處同前)。橫坐標顯示PHF-tau蛋白聚積。伴隨有正常可溶性tau的相對喪失。磷酸化tau的首次出現與纏結的首次出現密切相關。但是，這兩者只有在tau蛋白從可溶性變為聚合相的再分配發生后才出現。
圖6AD早期新生tau轉變成可溶性tau池(a)的轉化率(計算值)與可溶性tau形成PHF池的轉化率(Lai等，(1995)，出處同前)。當可溶性tau水平低于580pmo/g時，需要不斷形成更多的新tau以趕上PHF的合成速度，并以負反饋的形式調整周圍可溶性tau水平(a)，可溶性tau轉化為PHFs的轉化速率與周圍PHF-tau水平(b)呈幾何等級關系。
圖7AD中tau蛋白轉化為PHF的假說情況。一旦tau蛋白被固定并截斷，就暴露高親合力的病理性tau捕獲位點。當另一tau分子被捕獲時，只可能產生部分的蛋白水解，因為高親合的tau-tau結合區受到保護不發生水解，剩余的另一高親合tau捕獲位點可以再捕獲另一tau分子。該tau蛋白池從可溶性到截形PHF結合相的再分配是由重復進行高親合性tau捕獲和不完全水解所引起的自催化過程。
圖8測定兩個截形tau單位結合的構型。首先將Ala-390截形的tau蛋白(“a”)涂到ELISA板上(碳酸鈉緩沖液50mM，pH9.6)。然后第二個Glu-391截形的tau蛋白(“e”)在圖9所示的多種緩沖液條件下孵育。因為只有“e”這種tau能被mAb423識別，因此mAb423免疫反應性只測定在第二次孵育期間結合的tau蛋白。
圖9“e”種tau蛋白(0或20μg/ml)與“a”種tau蛋白(0或10μg/ml)在磷酸鹽緩沖的生理鹽水(“nomal”)、蒸餾水(“water”)及碳酸鈉緩沖液(“Carbonate”50mM，pH9.6)中的結合。縱坐標表示mAb免疫反應性，當單獨涂“a”時，沒有免疫反應性，因為mAb423不能識別“a”。當“e”不首先與“a”板孵育時，也無免疫反應性。這是因為阻斷了所用的防止“e”非特異性結合到ELISA板上的條件。只有當“a”和“e”都存在的條件下免疫反應性才能顯示，這是只對結合有“a”的“e”的特定檢測的結果。當“e”加到Na2CO3緩沖液中時無結合發生。因此該條件代表當初用“a”涂板的最佳條件，因為在此條件下自身聚集最少。
圖10全長tau(“t”)與原先已被動結合到固相上(“a”)的截形核心tau單位進行結合所測定的標準構型。將對應于核心PHF的截形tau單位的重組tau片段(“a”)在不利于tau-tau結合的條件下(圖9)在一塊ELISA板上涂成不同的濃度。鎖定后，在允許選擇性測定tau-tau結合的條件下將全長重組tau(“t”)涂到板上。應用一種適當的抗體(該抗體能識別全長tau的“N-末端附近的抗原決定基)檢測結合情況。這種抗體不能識別“a”。
圖11確定全長tau(“T40”)與Ala-390處終止的截形核心tau單位進行結合的Kd值，用mAb499測定結合的全長人類tau。上圖橫坐標表示T40的濃度，縱坐標表示mAb499的免疫反應性。每一結合曲線都是在所示的“a”的涂板濃度下獲得的。沒有“a”就不發生結合，證明在所用的測定條件下不存在T40的非特異性結合。結合既依賴于T40的濃度也依賴于“a”的濃度。下圖表示對應于每一“a”涂板濃度時計算得到的Kd值。隨著“a”濃度的增加，曲線逐漸接近飽和狀態，該圖顯示使T40與截形核心tau單位結合的飽和KCl值為22.8nM。
圖12按圖10所示的標準測定方案，將以10μg/ml涂板的“a”并加如圖所示濃度(0-50μg/ml)的T40，在恒定的pH(pH＝7.4)值而氯化鈉濃度不同的條件下測定結合情況。在生理性鹽濃度為137mM附近有一高峰。在中等鹽濃度下結合減少，但在極低鹽濃度下變得更易結合。
圖13與圖12所示的實驗相似，保持氯化鈉濃度為137mM，但pH值在0-10間改變，在磷酸鹽緩沖的生理鹽水(；PBS”pH＝7.4)中進行結合并作比較。結果顯示，在極端pH值時的結合被降低。所示的結合可用mAb499和342檢測。
圖14這兩條曲線表示在固相中使用截形核心tau單位“a”，并應用Biernet等(1992，歐洲分子生物學學會雜志，11，1593-1597)的方法在體外孵育全長tau蛋白，包括磷酸化的(T40P)和未磷酸化的tau蛋白(T40)，由此測得的典型的結合情況。在本實驗中進行磷酸化使Kd值降低了10倍，但在水相和固相中的磷酸化狀態不同，磷酸化對結合阻抑作用的總體影響平均為20倍。盡管有人提出胎化狀態的磷酸化對確定病理性tau-tau結合很重要，但大鼠胚胎tau(“POTr”)引入水相時不能與核心tau單位發生病理性結合。
圖15與圖14相反，胚胎tau被動結合到固相后，能結合全長非磷酸化的tau。在A中顯示一組典型的結合曲線，全長tau(T40)濃度和胚胎tau(“PO Tau”)的濃度在如圖所示的范圍內變化。B中顯示了Kd的漸近曲線。伴隨全長tau與截形核心tau單位的結合，全長tau與固定的胚胎tau的結合有相同的Kd值，大約為20nM。因此，簡單地通過被動聚結到固相上，可將胚胎tau轉變為tau結合形式，該胚胎tau當存在于水相時不與tau發生結合(圖14)。因此說明tau與固相基質的被動結合暴露高親和的tau捕獲位點。
圖16用含水相或固相的幾種tau蛋白測定tau-tau結合時的Kd值比較。水相中全長重組tau的磷酸化可使其結合作用抑制10倍，胚胎或新生鼠的tau不發生結合，如圖14所示。當固相中用新生tau時，T40以相同的親和力結合截形tau核心PHF單位。T40在水相中的磷酸化對結合產生30倍的抑制作用。新生tau在固相中的高磷酸化也有相當程度的抑制作用，在該兩種相中高磷酸化均可產生50倍抑制作用。因此與磷酸化假說相反，磷酸化抑制了本測定的所有情況下tau蛋白的病理性自身聚集。
圖17聚集的全長tau蛋白水解消化過程。(A)全長tau(20μg/ml)與dGA(20μg/ml)在PBS中結合，清洗，并與鏈霉蛋白酶在水中按圖所示濃度孵育5分鐘。免疫反應性用mAb 342(▲)、499(o)和423(·)測定。(B)全長tau(10μg/ml)(該tau在固相中沒有dGA存在時產生自身聚集)經簡單消化后用mAb342(▲)和423(·)測定其免疫反應性。在上述兩種情況下，mAb′s499或(和)342的蛋白酶濃度依賴性的免疫反應性丟失，同時得到mAb423免疫反應性。(c)簡略描述了A的結果。先將截形dGA涂在孵育過的固相上，與具有高親和力的全長tau經重復區的相互作用發生結合。兩種蛋白在消化前都缺乏mAb423抗原決定簇。蛋白水解消化的復合物(點線)去除了全長tau蛋白的N-末端部分，丟失了所示位置的mAb499和342抗原決定簇。mAb423免疫反應性的獲得表示全長tau在Glu-391處截斷。蛋白水解穩定的復合物在N-末端的確切范圍尚不清楚，但可確定其不包括緊鄰重復區的mAb342抗原決定簇，而應包括tau結合區。
圖18通過重復tau捕獲積累截形tau蛋白。以固相中截形tau蛋白片段(dGA 20μg/ml)開始，結合全長重組人類tau(20μg/ml)，用鏈霉蛋白酶(1ng/ml)消化5分鐘，洗脫，然后再與另一全長tau(20μg/ml)一起孵育，再次消化。該結合/消化的循環重復四次；前后各測定mAb499的免疫反應性，每次用鏈霉蛋白酶消化后測定mAb423活性。(A)伴隨每一消化循環而發生的復合物鏈霉蛋白酶消化作用，與Glu-391截形蛋白在固相中積累增加的關系。(B)通過顯示N-末端tau(mAb499)免疫反應性檢測全長tau的結合，經鏈霉蛋白酶消化后這樣的結合完全消除。隨后的孵育循環中，在水相恒定濃度中孵育的全長tau結合能力增加。循環后剩余的免疫反應性不能解釋mAb499免疫活性的增加。因此經鏈霉蛋白酶消化后的蛋白水解穩定的復合物保持了與其它tau結合的能力，并且這種結合能力隨截形tau在固相的聚積而增加。
圖19原形抑制性酚噻嗪濃度增加時(橫坐標)相對的tau-tau結合情況(縱軸)。這種抑制作用用標準競爭抑制模式表示，計算值Ki為98-108nM。這些近似值之間的相關系數為0.99，這一系數在統計學上是很高的(如圖所示)。
圖20硫堇對tau-tau結合的選擇性抑制。如圖實圈所示在液相和固相測定中各用489nM的截形tau蛋白。在該tau-微管蛋白測定中，用解聚的微管蛋白以200nM(濃度)涂板(空圈)，tau在400nM濃度下孵育。結合的數據用數學上的標準模式描述，該模式假定在高親和力的tau俘獲位點存在競爭性抑制。Ki值用Kd值來計算。Kd值是用全長tau時從相應的結合情況獲得。圖上的各點數據代表四次重復測定結果的平均值。
圖21人類tau蛋白同型體的核苷酸和預測的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。該序列從人類tau40(htau40)cDNA克隆推測，與前面確定的三重復形式(Goedert等(1988)，出處同前)不同的是該序列在氨基末端區(下劃線)插入額外58個氨基酸重復結構，以及一個前述(Goedert等(1989歐洲分子生物學學會雜志，8，393-399))的31個氨基酸組成的額外重復結構(下劃線)，核酸按5′→3′方向編碼。htau40cDNA克隆(Goedert等(1989b)，神經元，3，519-526)包含的上述這一序列是插入一個Ndel位點(5′端)和一個3′端的EcoRl位點到該克隆的終止(***)。
圖22氨基酸和cDNA序列的PHF核心tau單位(SEQ ID NO6；Novak等(1993)，出處同上)，以及構成優選的核心tau單位所用的引物(SEQ IDNO7和8)。
圖23化合物抑制tau-tau相互結合的等級。該等級以相對于不用化合物時所顯示的標準結合為基礎來劃分，取濃度為1或10μg/ml時的平均值。該等級中“1”相當于無該化合物存在時的結合情況，而“0.2”表示聚結降至被測物濃度為1和10μg/ml時結合被抑制20％的平均值。因此該值越低表明化合物對于e和a兩種結合的抑制越有效。如圖所示，前5種酚噻嗪標準結合系數低于0.4，也就是說1-10μg/ml范圍內的結合比在無該化合物存在時的結合少40％。
圖24根據圖17的標準結合所測試的這些化合物的化學結構。
圖25代表tau蛋白、MAP2(成人形式)、MAP2c(青少年形式)及高分子量tau(在外周神經系統和神經細胞瘤細胞株中發現的)的簡圖。這些蛋白都具有相似的微管結合區，但N-末端區的序列和范圍有顯著不同。青少年形式的tau與MAP2只有3個前后重復結構。MAP2中也存在4-重復形式。
圖26人類tau(上線，SEQ ID NO9)與人MAP2(下線，SEQ ID NO10)的前后重復區的序列差別。縱箭頭顯示Glu-391末端的截形PHF核心片段的界線。微管蛋白結合區用下劃線表示。
圖27pIF2表達載體是以SV40為基礎的真核細胞表達載體(pSV2neo；Sambrook等，(1989)，出處同前；SEQ ID NO11和12經修飾后包含一個啟動外源DNA表達的β-珠蛋白啟動子(M.N.Neuberger)。該載體具有遺傳霉素選擇用的抗新霉素標記。
圖28轉染PIF2∷740的小鼠成纖維細胞3T3，表達全長人類tau蛋白(T40)，用mAb7.51(上圖)和mAb499(下圖)進行免疫標記。細胞形成細長的過程，能看到tau免疫反應性在核周體內有細胞骨架的分配。
圖29轉染PIF∷dGAE的小鼠成纖維細胞3T3，表達Glu-391截形PHF核心tau片段，用mAb7.51作免疫標記。早期轉染細胞株在無硫堇下生長。細胞總體異常、多核、形成空泡、胞質中含有tau蛋白聚集。
圖30脂質轉染/tau蛋白轉移至PIF2T40轉染的3T3細胞內。顯示不含(無陰影)或含(陰影)3.5μM硫堇時，加入大約等摩爾濃度的全長tau(T40，220nM)和截形tau(dGAE，300nM)時的相對細胞存活情況(相對于不用蛋白處理的脂質轉染后正常細胞計數)，如圖所示。截形tau比全長tau毒性更大(p＝0.02)，盡管摩爾濃度相同，但全長tau比截形tau的總蛋白重大5倍。
圖31(A)截形tau毒性的逆轉截形tau的毒性經脂質轉染轉移至表達全長tau的3T3細胞，這種毒性是具有濃度依賴性的。與無硫堇(虛線)相比，硫堇(實線)存在時所有三種截形tau濃度下的毒性顯著逆轉。(B)在類似的實驗中將全長tau經脂質轉染轉至表達全長tau的3T3細胞中。tau毒性和硫堇的作用都大大降低。
以下實施例用以解釋本發明的具體細節，并非由此而限制本發明。
實施例實施例1tau-tau結合的測定本測定是在一個96孔的PVC微量滴定板上進行的，所加溶液及取得的讀數均按各個孔而定。
a)將50μl純化的截形tau肽，以50mM碳酸鈉緩沖液(pH9.6)中的0+50μg/ml(0，1，5，10，50μg/ml)不同濃度加到各孔并在37℃下孵育1小時，b)用水(含或不含0.05％吐溫)清洗微量滴定板的孔3次。
c)將200μl 2％的牛奶提取物溶液(“Marvel”)與磷酸鹽緩沖生理鹽水(“PBS”，137mM氯化鈉，1.47mM磷酸二氫鉀，8.1mM磷酸氫二鈉，2.68mM氯化鉀)混和加到各孔并在37℃下孵育1小時。
d)如b)所示清洗加樣板。
e)將50μl全長重組tau在1％明膠、0.05％吐溫的PBS中的溶液按上面a)中相同的濃度范圍加到各個孔中，并在37℃下孵育1小時。
f)如b)所示清洗加樣板。
g)將50μl單抗499(mAb499)以1/2稀釋的組織培養上清液與含2％牛奶提取物(“Marvel”)的PBS一起加到各孔，并在37℃孵育1小時。
h)如b)所示清洗加樣板。
i)將50μl二抗(用印記法親和純化的山羊抗小鼠IgG(H+L)與辣根過氧化物酶-Biorad分類號170-6516結合)與1/1000稀釋的含0.05％吐溫的PBS一起加到各孔中，37℃孵育1小時。
j)用0.05％吐溫水溶液洗3次板，再用水洗一次。
k)顯色溶液的配制如下在二甲基亞砜中溶解10-15mg3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺(TMB，BCL分類號784 974)至終濃度為10mg/ml(TMB溶液)。加10mL乙酸鈉的基料(0.5M，pH5.0)至90mL水中，攪拌并慢慢加1mL TMB溶液，再加10μl過氧化氫。
l)將50μl TMB溶液加入各孔使其發生過氧化物酶顯色反應，應用動力學L1 softmax軟件包在650nm處，用分子微盤讀數儀顯示其顯色速度超過2分鐘。實施例2重組tau片段的制備Tau-cDNA是用標準方法(Sombrook等，出處同前)由死后3小時的AD患者腦組織中分離的mRNA制備的。應用合成的17個單元聚合的寡核苷酸探針檢測cDNA文庫，該探針來自部分PHF核心蛋白序列(Goedert等，(1988)，出處同前)。全長cDNA的克隆被亞克隆到M13mp18的EcoRI位點并用定位誘變并在啟動密碼子鄰近介入NdeI位點。將NdeI和EcoRI切割后產生的cDNA片段在T7RNA聚合酶啟動子下游亞克隆到NdeI/EcoRI切割表達質粒pBK172中(Mclcod等(1987)，歐洲分子生物學學會雜志，6，729-736)。pRK172來自pBR322，它是在大腸桿菌中以高考貝數增殖以便消除pBR322拷貝數控制區。該質粒攜帶抗氨芐青霉素基因，可用于選擇重組克隆。
編碼截形tau的結構來自Novak等所述的mRNA(1993，出處同前)。用該mRNA作為PCR模板進行聚合酶鏈反應(PCR)，應用特定的寡核苷酸作引物。有義引物含有-個NdeI位點和反義引物含有EcoRI切點。將PCR擴增片段亞克隆到上述pRK172中。用于擴增dGAE的引物序列由圖22給出。用于表達全部DNA片段的真實性由雙股全長序列確定。
構建htau40(T40)cDNA的具體細節在Goedert等的文章(1989，出處同前)中有報道，該序列是中樞神經系統中發現的最大形式的tau序列并且它編碼tau蛋白，該tau蛋白的N-末端各含29個氨基酸的插入子和在微管蛋白結合區含31個氨基酸構成的額外重復結構。該DNA序列及其預測的氨基酸序列見圖21(SEQ ID NO4)。
重組質粒用以轉染大腸桿菌BL21(DE3)，一種用于原核生物表達的菌株。該質粒攜帶有一個在lacUV5啟動子調控下的噬菌體T7RNA聚合酶基因的染色體拷貝(Studier，Moffat(1986)，分子生物學雜志，189，113-130)。呈指數生長的培養基用IPTG(異丙基硫半乳糖苷)誘導3小時。
大規模純化(1升細胞培養基)tau片段可用Goedert和Jakes所述的方法進行(1990，歐洲分子生物學學會雜志，9，4225-4230)，可略作調整。在液氮中速凍細胞團以破裂細胞，該細胞團懸浮在含50mM PIPES及1mMDTT(pH6.8)的緩沖液中。熱穩定蛋白在上清液中用PIPES/DTT透析，然后加到一在相同的緩沖液中平衡過的磷酸纖維素柱中。用含氯化鈉(0-0.5M)的上述緩沖液洗脫tau蛋白，用SDS-PAGE和Coomassie染色法及免疫雜交法分析洗脫后的各級分，將這些含有tau的級分混合后用25mM MES、1mMDTT(pH6.25)透析，并以約5mg/ml的濃度存放在-20℃，蛋白濃度用Lowry法測定(Harrington(1990)，出處同前)。實施例3胚胎MAP2C與截形或全長tau進行結合PHFs中缺乏MAP2的一個可能解釋為MAP2在PHFs中不能與PHF的核心tau單位結合，因為它們在重復區的序列不同。這已用標準結合測定法用2種組成成分進行了實驗檢測在固相中的截形tau與在液相中的胚胎MAP2C，以及固相中的MAP2C與液相中的全長tau。這兩種情況都出現了結合，硫堇可以阻斷tau/MAP2結合。因此，在前后重復區的聚集不是選擇tau，酚噻嗪抑制劑(例如硫堇)的抑制活性不依賴于tau序列。MAPs為什么不存在于PHFs的確切原因目前尚不清楚，可能包括如下因素成人型MAP2中發現的長N-末端區的構成；細胞內腔隙的差異；或MAP2分子形成過程中的其它差異。實施例4人類tau蛋白轉染小鼠3T3細胞在β-珠蛋白啟動子控制下，用含有全長或截形tau蛋白的真核生物表達載體轉染小鼠成纖維細胞3T3。該載體含有抗新霉素基因，可以作為選擇性標記(PSV2neo；Sambrook等(1989)，出處同前，M.N.Neuberger改進)。細胞培養在含抗微生物制劑和10％小牛胚胎血清的DMEM中進行，37℃含5％CO2的環境。用標準磷酸鈣配方或脂質轉染(生產手冊，Gibco BRL)來轉染質粒DNA。具有完整質粒DNA的細胞用含遺傳霉素(0.5mg/ml；Southern和Berg(1982)，分子遺傳學與應用遺傳學雜志，1，327)的培養基篩選。
表達全長tau蛋白的穩定轉染3T3成纖維細胞很容易制備。蛋白的表達可以用一般的(mAb7.51)和人類特異性的(mAB499)抗tau抗體來顯示(圖28)，或通過細胞提取物免疫雜交法(未表示)顯示。用攜帶截形核心tau單位的相同載體轉染后可形成2個活性細胞株。截形tau能在這些細胞中表達，但這些細胞的形態異常與表達全長tau的細胞有所不同(圖29)。該細胞異常包括細胞發展停止、長園細胞形成、細胞質中聚集tau、胞質出現空泡。但這些細胞是不穩定的，若無遺傳霉素存在，易逆轉為非tau蛋白表達的形式。截形tau的毒性可用細胞中毒性tau-tau結合或截形tau與內源性小鼠MAPs結合來解釋，該內源性MAPs是細胞所必需的。實施例5tau轉染的細胞在酚噻嗪抑制劑中的生長如果原形酚噻嗪抑制劑能在體內阻斷自身聚集，截形核心tau單位的毒性可以部分的逆轉。只有當該化合物在鎖定tau-tau結合所需的濃度下不具有內源性毒性時才可能實現毒性逆轉。對3T3細胞毒性最低的抑制劑是硫堇和吖啶黃。當3T3細胞延長暴露于這些化合物時(其濃度顯著超出Ki值(100nM)時在體外抑制tau-tau結合)，仍能存活。實際上，3T3細胞在2μM硫堇中能存活數月。
通過在一定濃度范圍的硫堇中培養轉染了全長tau蛋白的3T3成纖維細胞，可以檢測硫堇在體內對tau-微管蛋白結合的影響，在濃度為4-8μM時，可以見到tau免疫反應性的正常細胞骨架分布與體外實驗中已知的抑制tau-微管蛋白結合的Ki具有可比性(8μM)，但在3T3轉染細胞的常規培養濃度范圍(0.5-2μM)內不產生作用。這些發現表明在原形抑制劑存在的情況下培養轉染的細胞株而不損傷細胞活性和全長tau蛋白正常細胞骨架分布的可能性。
轉染細胞在tau-tau結合抑制劑存在時的生長，以劑量依賴性的形式增加了轉染截形tau細胞的活性。當細胞生長在高濃度硫堇環境中時轉染了截形tau的活性細胞株數量增加，而且截形tau表達的強度(可用免疫組化法以半定量的方式測定)也有所增加。
當在硫堇存在下轉染細胞株時，3T3細胞的形態及截形tau蛋白的分布很少發生異常，截形tau蛋白的出現與內生的微管蛋白網絡一致，但該tau蛋白染色比全長tau更易被破壞。當去除硫堇后，截形tau高表達的細胞與細胞胞質碎片形成聚集物，這與缺乏硫堇時轉染的細胞的最初表現一致。實施例6未轉染的神經元細胞株神經元細胞株(N2A，NIE-115)在含有2％或10％小牛胎胚血清和5％馬血清的DMEM中，在涂有膠原的組織培養板上培養，5％CO2、37℃。轉染之前先對神經元細胞株進行免疫組化研究，以明確胞質與mAb423的聚集免疫反應性，經用二丁酰環腺苷酸(db-cAMP在組織培養中來自分化的神經細胞瘤細胞)簡單處理后，該mAb423在未分化的神經母細胞(N2A細胞)的胞質和PC-12細胞中產生。這些結構與識別神經微絲蛋白的抗體具有免疫反應性(NFH；SMI-31，Sternberger等(1985)，美國國家科學院匯刊，82，4274-4276)，與MAP1A識別抗體具有更少的免疫反應性，該識別抗體可與神經微絲結合。分化過程中內源性mAb423免疫反應性由細胞質轉移到軸突。從這些細胞的mAb423免疫反應性發生免疫沉淀作用導致有230KDa的凝膠活動性tau種類的識別，該tau可被SMI-31識別。這些結果提示在嚙齒類神經原細胞株中可被mAb423識別的結構包括高分子量聚集狀態的神經微絲蛋白，但也不排出除包含有變態MAPs的可能性，因此我們稱之為假定的NFH聚集(PNFH)。PNFH在胞質中聚集的劑量依賴性抑制作用可在未轉染的PC-12細胞中通過硫堇顯示。實施例7用全長和截形tau蛋白轉染神經元細胞株及tau聚集抑制劑的效用A.PC-12細胞PC-12細胞用PIF2載體轉染，該載體包含有Glu-391截形的PHF-核心tau片段或全長tau蛋白。與3T3成纖維細胞一樣，轉染后若不在硫堇中生長，將無轉染的截形tau的活性細胞存在。將穩定轉染的細胞株在有或無dbcAMP和有或無硫堇的情況下進行分析，檢測兩個終點胞質PNFH聚結的形成及PNFH免疫反應性分布到軸突。
與db-cAMP簡單孵育可使細胞中神經微絲聚集的含量從9％增加至37％(P＜0.001)，在截形tau轉染的細胞也可見到這種效應(由10％增加到47％，P＜0.001)，而截形tam本身的鑒別效果很明顯(P＝0.005)。相對于db-cAMP來說，用截性tau轉染促進了PNFH聚集的形成。
db-cAMP處理后抽出硫堇能使細胞PNFH聚集的頻率加倍。(由27％到49％，P＝0.05)，這用效應可見于用全長tau轉染的細胞(16％到32％)和截形tau轉染的細胞(36％到60％)。另一效應是硫堇依賴性的PNFH免疫反應性轉至軸突。這種情況在轉染有截形tau而非轉染有全長tau蛋白的PC-12細胞或未轉染細胞中特別明顯(pNFH-軸突指數在有或無硫堇時分別為0.49對0.04，P＝0.07)。B.NIE-115細胞一般說來，在N2A細胞質中所見的pNFH聚集不發生在未轉染的NIE細胞中，而pNFH免疫反應性在分化過程中通常體現在成長期軸突中，盡管在早期的核周弧中也能見到。NIE細胞用含有全長或截形tau蛋白的pIF2載體轉染，并在硫堇中生長。然后，檢測有或無硫堇時加入db-cAMP的效應。
與PC-12細胞一樣，NIE細胞在缺乏硫堇時，無截形tau轉染的穩定NIE細胞存在。轉染截形tau的細胞與轉染全長tau的細胞相比，在胞質中pNFH聚集顯著升高(由9％對26％，P＜0.001)。與db-cAMP一起孵育時可在轉染截形tau的細胞中產生pNFH聚集而不在轉染全長tau的細胞中產生(0％對36％P＜0.001)。
在全長tau轉染的細胞中硫堇的存在不干擾轉基因tau蛋白進入微管細胞骨架，包括微管形成中心、分散的胞質分布并擴散至軸突。在轉染全長tau的細胞中撤回硫堇可增加pNFH聚積的含量(7％對16％，P＝0.03)。在轉染截形tau的細胞中撤出硫堇可導致特定細胞株中pNFH的聚積增加(如NIE-ND6，14％對44％P＝0.07)，并抑制分化。這種現象以前只在未分化N2A細胞中出現而不在NIE細胞中出現。
與PC-12細胞一樣，pNFH進入軸突的硫堇依賴性體現能在特定細胞中(例如NIE-NDI，pNFH-軸突指數在有無硫堇時分別為0.1對0.66，P＝0.01)用db-cAMP處理后顯示。pNFH轉至軸突的硫堇依賴性轉運可被定量地看作是有硫堇存在時轉染的細胞中胞質和軸突神經微絲NHF免疫反應性之間關系的回復。(有或無硫堇時分別為r＝-0.52對r＝+0.52，P＝0.01及0.02)。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)姓名HOFFMANN-LA ROCHE AG(B)街道Grenzacherstrasse 124(C)城市Basle(D)洲BS(E)國家瑞士(F)郵編(ZIP)CH-4070(G)電話061-688 51 08(H)傳真061-688 13 95(I)電報962292/965542 hlr ch(ii)發明題目Tau-Tau蛋白結合的抑制(iii)序列數12(iv)計算機可讀形式(A)媒介形式軟盤(B)計算機相容的IBM PC(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Release #1.0，版本號1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的序列信息(i)序列特征(A)長度109個氨基酸(B)類型氨基酸(C)股形(D)拓樸結構線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO1Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys1 5 10 15His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp20 25 30
Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His35 40 45Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe50 55 60Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His65 70 75 80Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe85 90 95Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu100 105(2)SEQ ID NO2的序列信息(i)序列特征(A)長度108個氨基酸(B)類型氨基酸(C)股形(D)拓樸結構線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO2Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys1 5 10 15His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp20 25 30Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His35 40 45Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu50 55 60Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys65 70 75 80Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys85 90 95Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn100 105(2)SEQ ID NO3的序列信息(i)序列特征(A)長度109個氨基酸(B)類型氨基酸
(C)股形(D)拓樸結構線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO3Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys1 5 10 15His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp20 25 30Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His35 40 45Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe50 55 60Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His65 70 75 80Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe85 90 95Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu100 105(2)SEQ ID NO4的序列信息(i)序列特征(A)長度1326個堿基對(B)類型核酸(C)股形單股(D)拓樸結構線型(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1-1326(xi)序列描述SEQ ID NO4ATG GCT GAG CCC CGC CAG GAG TTC GAA GTG ATG GAA GAT CAC GCT GGG 48Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly1 5 10 15ACG TAC GGG TTG GGG GAC AGG AAA GAT CAG GGG GGC TAC ACC ATG CAC 96Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His20 25 30CAA GAC CAA GAG GGT GAC ACG GAC GCT GGC CTG AAA GAA TCT CCC CTG 144Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu35 40 45CAG ACC CCC ACT GAG GAC GGA TCT GAG GAA CCG GGC TCT GAA ACC TCT 192Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser50 55 60GAT GCT AAG AGC ACT CCA ACA GCG GAA GAT GTG ACA GCA CCC TTA GTG 240Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val65 70 75 80GAT GAG GGA GCT CCC GGC AAG CAG GCT GCC GCG CAG CCC CAC ACG GAG 288Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu85 90 95ATC CCA GAA GGA ACC ACA GCT GAA GAA GCA GGC ATT GGA GAC ACC CCC 336Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro100 105 110AGC CTG GAA GAC GAA GCT GCT GGT CAC GTG ACC CAA GCT CGC ATG GTC 384Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val115 120 125AGT AAA AGC AAA GAC GGG ACT GGA AGC GAT GAC AAA AAA GCC AAG GGG 432Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly130 135 140GCT GAT GGT AAA ACG AAG ATC GCC ACA CCG CGG GGA GCA GCC CCT CCA 480Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro145 150 155 160GGC CAG AAG GGC CAG GCC AAC GCC ACC AGG ATT CCA GCA AAA ACC CCG 528Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro165 170 175CCC GCT CCA AAG ACA CCA CCC AGC TCT GGT GAA CCT CCA AAA TCA GGG 576Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Glyl80 185 190GAT CGC AGC GGC TAC AGC AGC CCC GGC TCC CCA GGC ACT CCC GGC AGC 624Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser195 200 205CGC TCC CGC ACC CCG TCC CTT CCA ACC CCA CCC ACC CGG GAG CCC AAG 672Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys210 215 220AAG GTG GCA GTG GTC CGT ACT CCA CCC AAG TCG CTG TCT TCC GCC AAG 720Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Leu Ser Ser Ala Lys225 230 235 240AGC CGC CTG CAG ACA GCC CCC GTG CCC ATG CCA GAC CTG AAG AAT GGC 768Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Gly245 250 255AAG TCC AAG ATC GGC TCC ACT GAG AAC CTG AAG CAC CAG CCG GGA GGC 816Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly260 265 270GGG AAG GTG CAG ATA ATT AAT AAG AAG CTG GAT CTT AGC AAC GTC CAG 864Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln275 280 285
TCC AAG TGT GGC TCA AAG GAT AAT ATC AAA CAG GTC CCG GGA GGC GGC 912Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys Gln Val Pro Gly Gly Gly290 295 300AGT GTG CAA ATA GTC TAC AAA CCA GTT GAC CTG AGC AAG GTG ACC TCC 960Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser305 310 315 320AAG TGT GGC TCA TTA GGC AAC ATC CAT CAT AAA CCA GGA GGT GGC CAG 1008Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln325 330 335GTG GAA GTA AAA TCT GAG AAG CTT GAC TTC AAG GAC AGA GTC CAG TCG 1056Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser340 345 350AAG ATT GGG TCC CTG GAC AAT ATC ACC CAC GTC CCT GGC GGA GGA AAT 1104Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn355 360 365AAA AAG ATT GAA ACC CAC AAG CTG ACC GTC CGC GAG AAC GCC AAA GCC 1152Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Val Arg Glu Asn Ala Lys Ala370 375 380AAG ACA GAC CAC GGG GCG GAG ATC GTG TAC AAG TCG CCA GTG GTG TCT 1200Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser385 390 395 400GGG GAC ACG TCT CCA CGG CAT CTC AGC AAT GTC TCC TCC ACC GGC AGC 1248Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser405 410 415ATT GAC ATG GTA GAC TCG CCC CAG CTC GCC ACG CTA GCT GAC GAG GGG 1296Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Gly420 425 430TCT GCC TCC CTG GCC AAG CAG GGT TTG TGA 1326Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu *435 440(2)SEQ ID NO5的序列信息(i)序列特征(A)長度442個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結構線型(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO5Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly1 5 10 15Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His20 25 30Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu35 40 45Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser50 55 60Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val65 70 75 80Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu85 90 95Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro100 105 110Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val115 120 125Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly130 135 140Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro145 150 155 160Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro165 170 175Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly180 185 190Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser195 200 205Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys210 215 220Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Leu Ser Ser Ala Lys225 230 235 240Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Lau Lys Asn Gly245 250 255Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly260 265 270Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln275 280 285Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys Gln Val Pro Gly Gly Gly290 295 300Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser305 310 315 320Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln325 330 335Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser340 345 350Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn355 360 365
Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Val Arg Glu Asn Ala Lys Ala370 375 380Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser385 390 395 400Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser405 410 415Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Gly420 425 430Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu435 440(2)SEQ ID NO6的序列信息(i)序列特征(A)長度291個堿基對(B)類型核酸(C)股形單股(D)拓樸結構線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO6ATCAAACACG TCCCGGGAGG CGGCAGTGTG CAAATAGTCT ACAAACCAGT TGACCTGAGC 60AAGGTGACCT CCAAGTGTGG CTCATTAGGC AACATCCATA AACCAGGAGG TGGCCAGGTG 120GAAGTAAAAT CTGAGAAGCT TGACTTCAAG GACAGAGTCC AGTCGAAGAT TGGGTCCCTG 180GACAATATCA CCCACGTCCC TGGCGGAGGA AATAAAAAGA TTGAAACCCA CAAGCTGACC 240TTCCGCGAGA ACGCCAAAGC CAAGACAGAC CACGGGGCGG AGTGAGAATT C 291(2)SEQ ID NO7的序列信息(i)序列特征(A)長度48個堿基對(B)類型核酸(C)股形單股(D)拓樸結構線型(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO7GCCCGGGCCC CATAGATCAA ACACGTCCCG GGAGGCGGCA GTGTGCAA 48(2)SEQ ID NO8的序列信息(i)序列特征(A)長度47個堿基對(B)類型核酸(C)股形單股(D)拓樸結構線型(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO8AGATTACAGA ATTCTCACTC CGCCCCGTGG TCTGTCTTGG CTTTGGC 47(2)SEQ ID NO9的序列信息(i)序列特征(A)長度140個氨基酸(B)類型氨基酸(C)股形(D)拓樸結構線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO9Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys1 5 10 15His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp20 25 30Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His35 40 45Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu50 55 60Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys65 70 75 80Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys85 90 95Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val100 105 110Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg115 120 125Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu130 135 140(2)SEQ ID NO10的序列信息(i)序列特征(A)長度140個氨基酸(B)類型氨基酸(C)股形(D)拓樸結構線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO10Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Asp Asn Ile Lys1 5 10 15Tyr Gln Pro Lys Gly Gly Gln Val Arg Ile Leu Asn Lys Lys Ile Asp20 25 30Phe Ser Lys Val Gln Ser Arg Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His35 40 45Ser Ala Gly Gly Gly Asn Val Gln Ile Val Thr Lys Lys Ile Asp Leu50 55 60Ser His Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Lys Asn Ile Arg His Arg65 70 75 80Pro Gly Gly Gly Arg Val Lys Ile Glu Ser Val Lys Leu Asp Phe Lys85 90 95Glu Lys Val Gln Ala Lys Val Gly Ser Leu Asp Asn Ala His His Val100 105 110Pro Gly Gly Gly Asn Val Lys Ile Asp Ser Gln Lys Leu Asn Phe Arg115 120 125Glu His Ala Lys Ala Arg Val Asp His Gly Ala Glu130 135 140(2)SEQ ID NO11的序列信息(i)序列特征(A)長度34個堿基對(B)類型核酸(C)股形單股(D)拓樸結構線型(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述序列號11CGCGACGCGT ATGATCAAAC ACGTCCCGGG AGGC 34(2)SEQ ID NO12的序列信息(i)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類型核酸(C)股形單股(D)拓樸結構線型(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO12CGGCTTTGTC TGGTGCCCCG CCTCACTCCT AGGGCGC3權利要求
1.一種用于調節或抑制tau-tau蛋白結合制劑的篩選方法，包括a)一種tau蛋白或其含有tau核心片段的衍生物與b)一種推測能調節或抑制tau-tau結合的制劑和c)一種能結合tau蛋白的標記的tau蛋白或其標記的衍生物接觸，或與一種有別于a)中tau蛋白的并能結合tau蛋白的tau蛋白或其衍生物進行接觸，以及d)檢測tau-tau結合
2.權利要求1的方法，其特征在于通過將一種解聚的微管蛋白制劑或微管蛋白制劑與b)和c)中定義的化合物接觸，然后檢測tau-微管蛋白的結合情況，以確定tau與微管蛋白的結合。
3.權利要求1-2的方法，其特征在于步驟a)的蛋白是結合到固相的。
4.權利要求3的方法，其特征在于與固相的結合是在一種pH值為9-10的堿性緩沖液中進行。
5.權利要求3的方法，其特征在于tau蛋白或其片段結合后剩余的結合位點由一阻斷劑阻斷。
6.權利要求1-2中的方法，其特征在于步驟b)中的制劑和c)中的tau蛋白在液相中與步驟a)中的蛋白一起孵育。
7.權利要求1-6中的方法，其特征在于tau-tau結合是在50-400mM氯化鈉或有類似的離子強度的一種鹽或鹽的混合物中和在pH值4-10范圍內進行。
8.權利要求1-7中的方法，其特征在于步驟c)中的tau蛋白的免疫反應性不同于a)中的tau蛋白。
9.權利要求8中的方法，其特征在于tau蛋白結合用抗體檢測。
10.權利要求1-7中的方法，其特征在于步驟c)中的tau蛋白用放射性或酶檢測標記來標記。
11.權利要求1-10中任一項的方法，包括一種用來檢測tau-tau結合和tau-微管蛋白結合的ELISA測定，其特征在于a)將一種對應于核心片段并具Ala-390的截形tau蛋白，在不利于tau-tau結合的緩沖液條件下，涂在固相上，b)在相同緩沖液條件下將微管蛋白涂在固相上，c)將一種全長tau蛋白與一種推測能調節或抑制病理性tau-tau結合而不干擾tau-微管蛋白結合的制劑一起加到液相中，以及d)用一種能識別全長tau蛋白N-末端片段的抗體按免疫化學法檢測tau-tau結合。
12.一種能調節或抑制tau-tau結合制劑的篩選方法，包括將a)用一種tau蛋白或其含有tau核心片段的一種衍生物或一種能表達tau蛋白或其含有核心片段衍生物的載體轉染的細胞株，與b)一種推測能調節或抑制tau-tau結合的制劑進行接觸，以及c)檢測該細胞株活性和/或細胞株形態。
13.權利要求12方法，其中所述的細胞株是成纖維細胞株或神經元細胞株。
14.權利要求13的方法，其中所述的細胞株是成纖維細胞3T3、PC-12或NIE-115細胞株。
15.權利要求12-14的方法，其中所述的tau蛋白是一種截形tau蛋白。
16.權利要求15的方法，其中該截形tau蛋白是核心tau單位。
17.權利要求12-16的方法，其中該tau蛋白的表達是在結構調控下進行的。
18.權利要求12至16的方法，其中該tau蛋白的表達是在可誘導調控下進行的。
19.調節或抑制tau-tau結合的化合物，可根據權利要求1-18中任一項的方法獲得。
20.下式酚噻嗪及其藥用鹽的應用
其中R1、R3、R4、R6、R7和R9各自選自氫、鹵素、羥基、羧基、取代或未取代的烷基、鹵烷基或烷氧基；R2和R8各自選自氫或
R5選自氫、羥基、羧基、取代或未取代的烷基、鹵烷基、烷氧基或單鍵；R10和R11各自選自氫、羥基、羧基、取代或未取代的烷基、鹵烷基、烷氧基或單鍵用于制備一種預防和治療病理性tau-tau結合或病理性神經纖絲聚集的藥物組合物。
21.權利要求20中酚噻嗪的應用，其中所述酚噻嗪選自以下這組其中R1，R3，R4，R6，R7和R9各自選自-H、-CH3、-C2H5或-C3H7；R2和R8各自選自
其中R10和R11各自選自單鍵，-H、-CH3、-C2H5或-C3H7；和R5為一單鍵，-H、-CH3、-C2H5或-C3H7；以及它們的藥用鹽。
22.權利要求21的應用，其中所述的酚噻嗪選自甲苯胺藍O，硫堇、天藍A，天藍B或1，9-二甲胺亞甲蘭。
23.權利要求20-22中所定義的酚噻嗪在制備用于預防或治療阿耳茨海默氏病、運動神經病、雷縫小體病、皮克病以及進行性神經核麻痹的藥物組合物中的應用。
24.權利要求20中所定義的化合物在制備用于阻斷病理性tau-tau結合制劑中的應用，其特征在于該化合物的結合系數小于0.4，在其與tau摩爾濃度的摩爾比為1000∶1時不能抑制tau-微管蛋白的結合。
25.用于治療病理性tau-tau結合的藥物組合物，其包括治療有效量的權利要求20中所定義的化合物和治療上惰性的載體物質。
26.一種治療病理性tau-tau結合的方法，其包括服用權利要求20中定義的酚噻嗪。
全文摘要
本發明涉及用于檢測能夠調節或抑制病理性tau－tau蛋白結合和病理性神經纖絲聚集的藥物的新方法。本發明的方法特別用于篩選那些預防和治療阿耳茨海默氏病、運動神經疾病、雷維小體病、皮克病以及進行性神經核上麻痹的藥物。另外,也對在保持正常細胞骨架功能的同時能選擇性地抑制病理性聚集的藥物作了說明。
文檔編號A61K31/54GK1179829SQ96192870
公開日1998年4月22日 申請日期1996年3月25日 優先權日1995年3月27日
發明者克勞德·M·維希克, 帕特里夏·C·愛德華茲, 查爾斯·R·哈林頓, 馬丁·羅思, 阿倫·克盧格 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司