專利名稱：：穩定的含脂質藥物傳遞復合體及其生產方法
技術領域：
：本發明涉及陽離子脂質及其作為載體而用于將核酸或如蛋白質的其它大分子轉入細胞的用途。確切地說，本發明涉及含脂質的藥物傳遞復合體，該復合體是穩定的、有生物活性、可被濃縮，本發明還涉及其生產方法。隨著將諸如蛋白質或核酸這樣的大分子用作治療劑的新治療方式的發展，已形成了這樣一種需求，即要求開發新穎而有效的方法以將這類大分子傳遞至其合適的細胞靶。可能需要這種新傳遞系統的治療實例有基于利用特異的多肽生長因子或專效基因來代替或補充缺乏的或缺損的基因的療法。這類療法的臨床應用，不但依賴于新傳遞系統的功效，還依賴于基于這些系統的技術的安全性和容易性，該技術是指適于治療調和物的大規模藥學生產、貯存和配給方法。基因療法已成為治療各種遺傳病的日益重要的方法。提供有效治療和甚至治愈的可能性，業已刺激巨大的努力以將該技術用于尚無有效療法的疾病。該領域內近期的進展已表明基因療法不僅對單一基因病的治療，而且對如癌癥的其它更復雜疾病的治療有顯著療效。然而，要達到有效的基因治療尚存在一個重要的障礙，即難于設計出將治療用核酸傳遞到細胞靶的新穎而有效的方法。因此，用于傳遞外源基因至細胞和組織的理想載體，在核酸傳遞、安全使用、易于大量生產和具有實用作藥物的足夠的穩定性方面應該是高效的。主要以陽離子脂質體為代表的非病毒性載體，基于下述理由已被認為是適用于基因療法的一種載體。首先，脂質體介導的基因療法所需的質粒DNA可被廣泛、常規地大規模制備，且比如逆轉錄病毒的病毒性載體的使用更簡便、危險性更小。其次，脂質體介導的基因傳遞可傳遞RNA或DNA，這就不同于逆轉錄病毒介導的基因傳遞。因此，DNA、RNA或寡核苷酸可被直接引入細胞中。此外，陽離子脂質體是無毒的、非免疫原性的，于是可在活體內重復使用，這已由陽離子脂質體在體內成功地傳遞基因至插有導管的血管(Nabel，E.G.，etal.(1990)Science，2491285-1288)、肺上皮細胞(Brigham，K.L.，etal.(1989)Am.J.Respir.CellMol.Biol.，195-200，Stribling，R.，etal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8911277-11281)和全身的其它用途(Zhu，N.，etal.(1993)Science.261209-211，Philip，R.，etal.(1993)Science，261209-211)所證實。盡管各種陽離子脂質體調和物、包括可商購的陽離子脂質體試劑DOTMA/DOPE(N-1，-(2，3-二油酰氧基)丙基-N，N，N-三甲基氯化銨/二油酰基磷脂酰乙醇胺)是本技術中已知的(Felgner，P.L.etal.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，847413-7417)，但名為DC-Chol/DOPE(3βN-(N′，N′-二甲氨基乙烷)-氨基甲酰基膽甾醇)/(二油酰基磷脂酰乙醇胺)的陽離子脂質體調和物，已由體外研究證實(Gao，X.，andHuang，L.(1991)Biochem.Biophys.Res.Commun.179280-285)較為無毒且比DOTMA/DOPE更有效。此外，在下述廣泛的活體內研究中(Plautz，G.E.，etal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，904645-4649，Stewart，M.J.，etal.(1992)Hum.GeneTher，3267-275)其中DC-Chol/DOPE已被證明作為核酸傳遞系統既安全又有效，該調和物已獲得theU.S.FoodandDrugAdministration(FDA)和theU.K.MedicinesControlAgency(MCA)的許可，并且已被應用于兩例不同的基因療法臨床試驗中(Nabel，G.J.，etal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，9011307-11311，Caplen，N.J.，etal.(1995)NatureMedicine，139-46)。然而，有很多理由認為，將DC-ChOl/DOPE和現有的其它陽離子脂質體作為載體以傳遞核酸至細胞靶，在大規模的治療應用上是不合適的。首先，在現有技術的摻合方法中，形成核酸脂質體復合體而采用的脂質體與核酸的比率會導致大直徑復合體的形成，因而穩定性相當低。所以，現用的包括DC-Chol/DOPE在內的陽離子脂質體調和物，沒有一種被設計成穩定的、即可使用的核酸/脂質體復合體的藥物調和物。摻合方法的該局限性要求使用者在每次使用前配制復合體，不便的是要求經專門訓練的人員才行。此外，每次使用前用摻和法配制復合體會引起可能的劑量變化，這就會因受體可能過量用藥或用藥不足而妨礙對利用這些復合體來治療的評價。其次，在每次使用前配制核酸/陽離子脂質體復合體的摻和方法，要求采用稀核酸溶液(低于4μg/ml)和稀脂質體分散體(低于50μM)來配制核酸/脂質體復合體以減小形成大而活性低的凝聚物的可能性。該局限性使得未采用亞于最佳條件如減小脂質體的量(會引起核酸轉移活性的降低)或增大脂質體的量(會導致毒性的增高)時，難于制備小的生物活性復合體。還有，復合體必須在稀濃度下配制，實際上是臨床應用的重大缺點，尤其是當腫瘤內注射該復合體時，因為在各部位只能注入小體積的復合體(Nabel，G.J.，etal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，9011307-11311).因此，本發明的目的在于，提供穩定的、有生物活性、含脂質的藥物傳遞復合體，它可被濃縮；并提供這類復合體的生產方法。本發明提供生產含脂質藥物傳遞復合體的方法，該復合體具有凈正電荷和/或正電性表面。在整個本說明書和權利要求書中用到的“藥物”是指任意分子實體，它可以是單體或低聚的，且當它與脂質或脂質和聚陽離子復合后，被施藥給個體以向受體提供治療效果。因此，具有整體凈負電荷或負電性區的大分子，有望形成本發明的傳遞復合體。特別適于和本發明的復合體合用的大分子例如有DNA、RNA、寡核苷酸或負電性蛋白質。然而，帶正電荷的大分子(如大的陽離子蛋白質)也有望形成本發明的復合體，是通過將陽離子大分子先與陰離子脂質或聚合物、再與陽離子脂質復合。本發明的復合體包括將待傳遞的藥物與陽離子脂質體混合而形成的藥物/脂質復合體，其中藥物與脂質的比率使得形成的藥物/脂質復合體帶凈正電荷；還包括將藥物與陽離子脂質體和聚陽離子混合而形成的藥物/脂質/聚陽離子復合體，其中藥物與脂質與聚陽離子的比率使形成的藥物/脂質/聚陽離子復合體帶凈正電荷。用于藥物/脂質復合體的“凈正電荷”是指脂質的正電荷多于藥物。用于藥物/脂質/聚陽離子復合體的“凈正電荷”是指陽離子脂質和聚陽離子的正電荷多于藥物的負電荷。但是，應理解，本發明也包括這樣的藥物/脂質以及藥物/脂質/聚陽離子復合體，即不管復合體的凈電荷是陽性、中性甚或是陰性，只需具有正電性的表面。復合體的正電性表面可通過本技術中已知方法由復合體在電場中的遷移而測知，例如通過測定ξ電位(Martin，A.，Swarick，J.，andCammarata，A.，PhysicalParmacy&PhysicalChemicalPrinciplesinthePharmaceuticalSciences，3rded.LeaandFebriger，Philadelphia，1983)；或者由復合體對細胞表面的結合親和力而測知。與具有中性或負電性表面的復合體相比，呈正電性細胞表面的復合體對細胞表面具有更強的結合親和力。因此，本發明涉及生產這些藥物/脂質和藥物/脂質/聚陽離子復合體的方法，該方法包括將待傳遞的藥物與陽離子脂質體混合并選擇性地與聚陽離子混合，其比率使得所形成的復合體具有凈正電荷和/或正電性表面。在本發明的另一實施方案中，生產藥物/脂質或藥物/脂質/聚陽離子復合體的方法可進一步包括，在其生產之后于過量的游離組分(藥物、脂質、聚陽離子)中純化該復合體這一步驟。本發明的藥物/脂質和藥物/脂質/聚陽離子復合體通常是穩定的、可在較高濃度下生產，而且長期貯存后仍保持生物活性。這類復合體在傳遞核酸、蛋白質和其它大分子至細胞和組織方面有實用性。圖1顯示核酸/脂質體復合體的典型的大小分布(平均直徑)，是由DC-Chol/DOPE(3∶2)脂質體和pRSVL質粒DNA(2μg)按所示的脂質與DNA的比率以摻合物形式制備的。圖2A和2B顯示脂質體標示物3H-膽甾烯基十六烷基醚(○)和32P-DNA標示物(■)在蔗糖梯度級分中的分布。圖2A和2B的蔗糖梯度中的各級分的位置如圖2A的頂端所示。圖2A顯示游離脂質體(10μmolDC-Chol/DOPE(2∶3)于2ml體積中)或游離DNA(50μgPRSVLDNA于2ml體積中)經蔗糖密度梯度在超速離心分離后，3H和32P標示物的分布。圖2B顯示DNA-脂質復合體(由20μmolDC-Chol/DOPE(2∶3)脂質體和0.4mgpRSVLDNA混合于2ml體積中而形成)經蔗糖密度梯度在超離心分離后，3H和32P標示物的分布。圖3顯示DNA/脂質體摻合復合體(○)、DNA/脂質體/聚L-賴氨酸(PLL)摻合復合體(□)、DNA/脂質復合體(●)和DNA/脂質/PLL復合體(■)在CHO細胞中的轉染活性。用于形成上述復合體的DC-Chol/DOPE脂質體，如圖3的底部所示含不同mol％的DC-Chol。DNA/脂質(●)和DNA/脂質/PLL(■)復合體在被測定轉染活性之前先通過蔗糖密度梯度純化。轉染活性如縱軸所示，以熒光素酶活性的相對光單位表示。圖4顯示DNA/脂質體摻合復合體(○)和DNA/脂質體/PLL摻合復合體(□)的轉染活性與DNA/脂質(●)和DNA/脂質/PLL復合體的轉染活性的比較，是當它們通過蔗糖密度梯度純化后在4℃下貯存達130天進行比較的。用于形成上述復合體的DC-Chol/DOPE脂質體含有如圖4的底部所示的不同mol％的DC-Chol。轉染活性如縱軸所示，以熒光素酶活性的相對光單位表示。圖5顯示用DNA/脂質體摻合復合體(○)；DNA/脂質體/PLL摻合復合體(□)；DNA/脂質復合體(●)或DNA/脂質/PLL復合體(■)處理細胞36小時后，可從CHO細胞中提取的蛋白質的濃度。DNA/脂質和DNA/脂質/PLL復合體在被測定轉染活性之前先通過蔗糖密度梯度純化。用于形成上述復合體的DC-Chol/DOPE脂質體含有如圖5的底部所示的不同mol％的DC-Chol。圖6顯示從有卵巢腫瘤的小鼠制備的腫瘤提取物的CAT測定結果。在第0天時，將2×106個人卵巢癌細胞經皮下注入SCID小鼠。在第14天，將含有與以摻和物形式與DC-Chol脂質體(30nmol)復合的pUCCMVCATDNA(含30μg大腸桿菌(E.coli)的氯霉素乙酰轉移酶基因)的100μl溶液(第1和2列，兩重復試樣)，或者將相同量的DNA以純化的復合體形式(從DNA/DC-Chol脂質體以1μg/25mmol的比率制得，第3和4列；兩重復試樣)直接注入腫瘤內。當轉染48小時后，將小鼠殺死，測定含100μg蛋白質的腫瘤提取物的CAT活性。第5列給出標準的大腸桿菌CAT的陽性對照組CAT活性。圖7A-7C顯示DNA/脂質摻合復合體和純化過的和未純化的DNA/脂質/PLL復合體在293細胞(圖7A)、C3細胞(圖7B)和BL6細胞(圖7C)中的轉染活性。轉染活性如圖7A-7C的縱軸所示，以熒光素酶活性的相對光單位表示。本發明涉及含脂質的藥物傳遞復合體，它在pH6.0-8.0時具有凈正電荷和/或正電性表面。這些復合體包括陽離子脂質、藥物，并選擇地進一步包括聚陽離子。本發明進一步涉及生產這些復合體的方法，其中該方法可選擇地包括從過量的、各成分中純化這些調和物的步驟。至于生產本發明的藥物/脂質復合體，包括純化步驟是優選的實施方案。應明白，將純化步驟應用于藥物/脂質/聚陽離子復合體時，則純化后呈不含多余組分的純凈態的這些復合體的回收率，低于純化后藥物/脂質復合體的回收率；因為經密度離心的蔗糖純化之后含藥物/脂質/聚陽離子復合體的峰比含藥物/脂質復合體的峰寬；且因此與游離組份的峰重疊。本發明的含脂質藥物傳遞復合體是穩定的，可在較高濃度下生產，并在長期貯存后仍保持生物活性。生產這些復合體的方法基于兩種帶相反電荷的聚合物(例如負電性的核酸和正電性的脂質)之間的結合模式，其中通過利用過量的、呈陽離子脂質體或陽離子脂質體和聚陽離子的正電荷來中和藥物的負電荷，從而避免形成大而不穩定的凝聚物。業已發現，當貯存于10％蔗糖緩沖溶液中達4個月之后，本發明的復合體仍可保持其初始直徑和生物活性。本發明的含脂質藥物傳遞復合體中包含的“藥物”可以是核酸、聚陰離子蛋白質、多糖和可直接與陽離子脂質復合的其它大分子。然而，陽離子藥物(例如大的陽離子蛋白質)可直接與陰離子脂質復合，或者相繼地先與陰離子脂質或聚合物復合、再與陽離子脂質復合。利用該方法，可由本發明的復合體將正電性的或電中性的藥物傳遞至細胞。為生產帶凈正電荷的藥物/脂質和藥物/脂質/聚陽離子復合體，脂質相對藥物或者脂質和聚陽離子相對藥物的過量正電荷，在復合體中總的脂質相對藥物或者脂質和聚陽離子相對藥物可高達約30倍正電荷超出量；優選是約2～10倍電荷超出量，且最優選是約2～6倍電荷超出量。表面帶正電荷的復合體可具有表面電荷相對于藥物過量的類似的優選范圍。若要生產脂質的正電荷多于核酸的核酸/脂質復合體，為產生在pH6.0-8.0時脂質的正電荷多于核酸的核酸/脂質復合體而與1μg核酸混合的陽離子脂質體脂質的摩爾量范圍可從約0.1nmol至約200nmol脂質，優選是約5nmol至約100nmol脂質，這取決于陽離子脂質體的正電荷含量。當然，如果藥物是蛋白質，則與1μg負電性蛋白質混合的脂質的量，同上述與1μgDNA混合的脂質的量相比，前者至少應小10倍，因為蛋白質的電荷密度低于核酸。本領域普通技術人員易于理解，為了使脂質的正電荷多于藥物，必須將不同摩爾量的陽離子脂質體與等當量藥物混合，它取決于陽離子脂質體的正電荷含量。若要生產具有凈正電荷和/或正電性表面的藥物/脂質/聚陽離子復合體，摻入聚陽離子可減少脂質的量，它必須與藥物混合至如此程度即脂質的正電荷少于藥物的負電荷。脂質的量的減少會降低含聚陽離子的調和物的毒性。配制核酸/脂質/聚陽離子復合體所用到的陽離子脂質體的摩爾量，其范圍可以是每1μg核酸約0.1nmol至約200nmol脂質，更優選是每1μg核酸約1至約25nmol脂質，這取決于陽離子脂質體的正電荷含量。通常應明白，在生產本發明的核酸/脂質和核酸/脂質/聚陽離子復合體時，生產這些復合體所需的脂質體的摩爾量將隨與脂質體混合的核酸濃度的增大而增加。本領域普通技術人員易于理解，當純化本發明的復合體時，就在混合之前，陽離子脂質體相對藥物或者陽離子脂質體和聚陽離子相對藥物的正電荷超出量，將大于純化過的復合體中脂質相對藥物或者脂質和聚陽離子相對藥物的正電荷超出量，因為純化步驟導致除去過量的游離脂質和/或游離聚陽離子。為了闡述在pH6.0-8.0時如何確定陽離子脂質、藥物和聚陽離子的電荷，而提供下列實例。假如待傳遞的藥物是DNA，則可這樣確定待傳遞的DNA的負電荷將待混合的DNA的量，或復合體中DNA的量除以330，330是指單個的核苷酸的分子量，此時一個核苷酸等于一個負電荷。因此，1μgDNA的負電荷是3.3nmol。至于10nmolDC-Chol/DOPE(2∶3)脂質體，脂質的有效電荷可計算如下將總脂質體脂質(10nmol)的量乘以0.4(總脂質體脂質的40％是陽離子脂質DC-Chol)而得脂質體中4nmolDC-Chol。由于在pH6-8時，一分子DC-Chol有一個正電荷，則在混合時或復合體中，脂質體脂質的有效正電荷是4.0nmol。當然，本領域技術人員易于明白，在pH6-8.0時，其它陽離子脂質，每分子陽離子脂質的正電荷量可能少于或大于DC-Chol。假如待混合而形成復合體的聚陽離子是聚L-賴氨酸(PLL)的溴鹽，則混合時PLL的正電荷可由待混合的PLL的量除以207而得，207是指一個賴氨酰殘基的分子量，此時一個賴氨酰殘基等于一個正電荷。因此，1μgPLL的正電荷約為5.0nmol。若要計算所形成的復合體中賴氨酰殘基貢獻的正電荷，則考慮到反荷離子如果存在的話的重量，將復合體中存在的賴氨酸的量除以一個賴氨酰殘基的分子量。將上述計算法應用于本文表1中所示的數據(參見實施例3)，可說明在混合DNA和脂質體時，和純化由DNA和脂質體混合而產生的復合體之后，如何計算正電荷與負電荷的比率。在實施例3的表1中，將0.4mgDNA和20μmol陽離子DC-Chol/DOPE脂質體混合而產生DNA/脂質復合體。至于DC-Chol/DOPE比率為4∶6的陽離子脂質體，求得脂質體脂質的正電荷含量為8000nmol，而有待與脂質體混合的0.4mgDNA的負電荷含量為1320nmol，都基于上文中給出的計算范例。因此，混合時正電荷與負電荷的比率是6.06(8000除以1320)。不過，一旦復合體被純化后，該純化過的復合體中脂質與DNA的比率為12.7nmol脂質/μgDNA，如表1所示(見“46行”)。12.7這一比率轉化成正電荷與負電荷的比率為1.5，于是表明純化作用可除去游離脂質體的過量正電荷。也是在表1中，其中將4μmol脂質體(46DC-Chol/DOPE)和1mgPLL與0.4mgDNA混合而配制成DNA/脂質/PLL復合體，可如下求算混合時正電荷與負電荷的比率基于上文中給出的計算范例，4μmol脂質體脂質貢獻1600nmol正電荷，1mgPLL貢獻5000nmol正電荷，而0.4mgDNA貢獻1320nmol負電荷。所以，將脂質體、PLL與DNA混合時，正電荷與負電荷的比率為5。本領域技術人員進一步理解，復合體的凈電荷可這樣確定使用合適的分析技術如利用各組分的放射性同位素標記或采用元素分析法，通過測定復合體中DNA、脂質和如果存在時的聚陽離子含量來確定。一旦知道在給定的pH下復合體中各組分(DNA、脂質和如果存在時的聚陽離子)的量，就可考慮已知的或經分析測知的各級分的PK值來求算給定pH下復合體的大致的凈電荷。在一個優選的實施方案中，藥物是核酸序列，優選是編碼有治療用途的基因產物的核酸序列。在本發明的一個實施方案中，生產在pH6-8.0時帶有凈正電荷和/或正電性表面的核酸/脂質復合體的方法包括將核酸與陽離子脂質體結合，其中核酸與脂質的比率使得形成的核酸/脂質復合體中脂質的正電荷多于核酸。在另一實施方案中，可將核酸和陽離子脂質體與聚陽離子混合，其中核酸與脂質與聚陽離子的比率使得形成的核酸/脂質/聚陽離子復合體在pH6-8時，脂質和聚陽離子的正電荷多于核酸。在一個優選的實施方案中，是這樣生產核酸/脂質和核酸/脂質/聚陽離子復合體的將核酸緩慢地加入脂質體或者脂質體和聚陽離子的溶液，并用攪拌棒混合而混合片刻。此外，可將脂質體或脂質體/聚陽離子混合物通過第一入口加到單一槽內，同時將核酸通過第二入口加到該槽內。然后同時用機械方法在同一槽中混合這些組分。與藥物或者與藥物和聚陽離子混合而形成本發明的復合體的陽離子脂質體，可只含陽離子脂質或是含有結合有中性磷脂的陽離子脂質。合適的陽離子脂質包括但不局限于1，2-雙(油酰氧基)-3-(三甲銨基)丙烷(DOTAP)；N-1，-(2，3-二油酰氧基)丙基-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)或其它N-(N，N-1-二烷氧基)-烷基-N，N，N-三取代的銨表面活性劑；1，2-二油酰基-3-(4′-三甲銨基)丁酰-sn-甘油(DOBT)或膽甾醇(4′-三甲銨基)丁酸酯(ChOTB)，中三甲銨基通過丁酰間隔臂連接到雙鏈(對DOTB)或膽甾烯基(對ChOTB)上；/DORI(DL-1，2-二油酰基-3-二甲氨基丙基-β-羥乙銨)或DORIE(DL-1，2-O-二油酰-3-二甲氨基丙基-β-羥乙銨)(DORIE)或其類似物，如W093/03709中所述；1，2-二油酰-3-丁二酰-sn-甘油膽堿酯(DOSC)；膽甾醇半丁二酸酯(ChOSC)；脂多胺類如雙十八烷基酰氨基甘氨酰精胺(DOGS)和雙十六烷酰磷脂酰乙醇酰胺精胺(DPPES)或陽離子脂質如USPatentNumber5,283,185中所示，膽甾醇-3β-羧基-酰氨基-亞乙基碘化三甲銨，1-二甲氨基-3-三甲銨基-DL-2-丙基-膽甾醇羧化碘，膽甾醇-3β-羧基酰氨基亞乙胺，膽甾醇-3β-羥丁二酰胺-亞乙基碘化三甲銨，1-二甲氨基-3-三甲銨基-DL-2-丙基-膽甾醇-3β-羥丁二酸碘，2-(2-三甲銨基)-乙基甲氨基乙基-膽甾醇-3β-羥丁二酸碘，3βN-(N′，N′-二甲氨基乙烷)氨基甲酰基膽甾醇(DC-Chol)，和3β-N-(聚乙烯亞胺)-氨基甲酰基膽甾醇。優選的陽離子脂質的實例包括膽甾醇-3β-羧基酰氨基亞乙基碘化三甲銨，1-二甲氨基-3-三甲銨基-DL-2-丙基-膽甾醇羧化碘，膽甾醇-3β-羧基酰氨基亞乙胺，膽甾醇-3β-羥丁二酰胺亞乙基碘化三甲銨，1-二甲氨基-3-三甲銨基-DL-2-丙基-膽甾醇-3β-羥丁二酸碘，2-(2-三甲銨基)乙基甲氨基乙基-膽甾醇-3β-羥丁二酸碘，3βN-(N′，N′-二甲氨基乙烷)-氨基甲酰基-膽甾醇(DC-Chol)，和3βN-(聚乙烯亞胺)-氨基甲酰基膽甾醇。由于本發明的復合體的一個特征是其貯存穩定性(即它們形成之后可長時間保持小直徑和保留生物活性的能力)；本領域普通技術人員應理解，優選的陽離子脂質是其中的親脂基和氨基之間的鍵在水溶液中穩定的脂質。雖然陽離子脂質中的這種鍵包括酰胺鍵、酯鍵、醚鍵和氨基甲酰基鍵，但優選的陽離子脂質具有氨基甲酰基鍵。具有氨基甲酰基鍵的優選的陽離子脂質實例是DC-Chol。本領域技術人員易于明白，含有多于一種陽離子脂質的脂質體可用于生產本發明的復合體。例如，業已公開了包括兩種陽離子脂質的脂質體，即包括賴氨酰-磷脂酰乙醇胺和β-丙氨酰膽甾醇酯的脂質體(Brunette，E.etal.(1992)Nucl.AcidsRes.，201151)。應進一步明白，就適于與藥物和選擇性地與聚陽離子混合以形成本發明的復合體的陽離子脂質體來說，本發明的方法不只限于使用上述脂質，只要能產生陽離子脂質體，也可使用任何脂質成分。因此，除了陽離子脂質，用來形成本發明的復合體的陽離子脂質體可包括除陽離子脂質之外的其它脂質。這些脂質包括但不限于溶解脂例如溶血卵磷脂(1-油酰基溶血卵磷脂)，膽甾醇，或中性磷脂包括二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)或二油酰卵磷脂(DOPC)。本發明的脂質復合體也可含有負電性的脂質和陽離子脂質，只要所形成的復合體凈電荷為正電荷和/或復合體表面是正電性的即可。本發明的負電性脂質是這樣的脂質，即該脂質包括至少一種在生理pH或其附近時帶凈負電荷的脂質，或是這些脂質的混合物。合適的負電性脂質包括磷脂酰甘油和磷脂酸或相似的磷脂類似物。進一步設想，在形成本發明的復合體而用到的陽離子脂質體中，可改變脂質的比率以包括結合有膽甾醇或結合有溶解脂質或中性脂質混合物的大部分陽離子脂質。如果要將選定的陽離子脂質與另一脂質結合，則優選的脂質是中性磷脂，最優選是DOPE。制備用來生產本發明的含脂藥物傳遞復合體的脂質體的方法，是通常本領域普通技術人員已知的。有關脂質體制備方法的綜述可參見LiPosomeTechnology(CFCPressNy1984)；LiposomesbyOrtro(MarcelSchher，1987)；MethodsBiochem.Anol.33337-462(1988)和U.S.Patent5,283,185。這些方法包括凍融擠出和超聲處理。單層脂質體(平均直徑小于約200nm)和多層脂質體(平均直徑大于約300nm)均可用作生產本發明的復合體的起始組分。在用于生產本發明的藥物/脂質復合體的陽離子脂質體中，存在于脂質體中的陽離子脂質占總脂質體脂質的約10～約100mol％，優選是約20～約80mol％，且最優選是約20～約60mol％。中性脂質若包括于脂質體中，則它存在的濃度為總脂質體脂質的約0～約90mol％，優選為約20～約80mol％，且最優選為40～80mol％。脂質體中若包括負電性脂質，則它存在的濃度占總脂質體脂質的約0mol％～約49mol％，優選為約0mol％～約40mol％。在一個優選的實施方案中，脂質體含有陽離子脂質和中性脂質，最好是DC-Chol和DOPE，其比為約2∶8～約6∶4。應進一步明白，本發明的復合體可含有修飾脂質、蛋白質、聚陽離子或受體配件，它們起導向因子的作用，將復合體引導至特定的組織或細胞類型。導向因子的實例包括但不限于脫唾液酸糖蛋白、胰島素、低密度脂蛋白(LDL)、葉酸和針對細胞表面分子的單克隆和多克隆抗體。可能的靶包括但不限于肝、血細胞、內皮細胞和腫瘤細胞。應進一步了解，本發明的復合體的正電荷不但受復合體的脂質組成的影響，還受形成藥物/脂質復合體的溶液pH的影響。例如，提高pH(堿性更強)會逐漸中和陽離子脂質DC-Chol的叔胺的正電荷。在一個優選的實施方案中，本發明的復合體是在可使復合體帶有凈正電荷和/或具有正電性表面的pH下被制備和貯存的。優選的pH范圍是pH6.0-8.0，最優選是pH7.0-7.8。若欲將聚陽離子與核酸和陽離子脂質體混合，則聚陽離子可選自分子量約300～約200,000的有機聚陽離子。這些聚陽離子在pH7.0時還優選具有約3～約1000的化合價。聚陽離子可以是天然的或合成的氨基酸、肽、蛋白質、多胺、糖類和任何合成的陽離子聚合物。聚陽離子的非限制性實例包括聚精氨酸、聚鳥氨酸、魚精蛋白和聚賴氨酸、Polybrene(海美溴銨)、組蛋白、陽離子樹枝狀物(cationicdendrimer)、精氨、亞精氨和來自SV40大T抗原的合成多肽，它有多余的正電荷并代表核定位信號。優選的聚陽離子是聚L-賴氨酸(PLL)。在生產本發明的核酸/脂質/聚陽離子復合體時，固定聚陽離子與核酸的比率而改變脂質體的量。不過，本領域技術人員會認識到，聚陽離子與核酸的比率受有待與核酸和聚陽離子混合的脂質體的電荷密度的影響。例如，若脂質體的電荷密度因脂質體中脂質組成的變化而減小(例如降低脂質體中陽離子脂質與中性脂質的比率)，則可增加有待與核酸和脂質體混合的聚陽離子的量，以補償因脂質體導致的正電荷的減少。但是，當用到聚陽離子時，優選是使用亞飽和量的聚陽離子(即不會將核酸的全部負電荷飽和的量)以便使陽離子脂質與核酸復合。這樣，在本發明優選的一個實施方案中，甚至將聚陽離子與脂質和核酸混合時，也使用相對于核酸而言正電荷過多的脂質。可與1μg核酸和變化量的陽離子脂質體混合的聚陽離子的量，在本發明中為約0.01μg～約100μg聚陽離子/μg核酸，優選為約0.1μg～約10μg聚陽離子/μg核酸。如果需要從過量的游離DNA、游離脂質體和游離聚陽離子中純化核酸/脂質和核酸/脂質/聚陽離子復合體，則可采用離心法通過蔗糖密度梯度或適合于形成密度梯度的其它介質來進行純化。然而應明白，也可運用其它純化方法如色譜法、過濾、相分配、沉淀或吸附法。在優選的方法中，采用離心法通過蔗糖密度梯度來純化。蔗糖梯度可在約0％蔗糖～約60％蔗糖范圍，優選是約5％蔗糖～約30％蔗糖。配制蔗糖密度梯度的緩沖劑可以是適于貯存含復合體的級分的任何緩沖水溶液，且優選是適于將復合體施藥至細胞和組織的緩沖劑。優選的緩沖劑是pH7.0～8.0Hepes。應理解，在本發明中，優選的核酸序列是可導引蛋白質表達的那些。這種序列可用慣常方法插入本領域技術人員知道的質粒表達載體內，再與陽離子脂質體或者脂質體和聚陽離子混合而形成本發明的含脂質藥物傳遞復合體。與陽離子脂質體或與陽離子脂質體和聚陽離子混合的核酸的量可為約0.01μg～約10mg，優選是約為0.1μg～約1.0mg。應明白，當質粒表達載體中含有感興趣的核酸時，則上述核酸的量是指含有感興趣的核酸的質粒。純化本發明的核酸/脂質和核酸/脂質/聚陽離子復合體，是為了將含于所生成的復合體中的核酸和脂質濃縮約50倍～約500倍，使得復合體中所含的脂質含量高達約40μmol/ml，且核酸含量可高達約2mg/ml。本發明的方法生產的復合體直徑小于約400nm，優選小于約200nm，且更優選小于150nm。用本發明的方法形成的復合體在4℃下貯存時可穩定長達約一年。復合體從蔗糖梯度中收集后可貯存于10％蔗糖溶液中，或者可將復合體凍干而在使用前重新溶于10％蔗糖溶液中。在一優選的實施方案中，是將復合體貯存于溶液中。本發明的復合體的穩定性可用專門的方法測定，以確定貯存一段時間后復合體的物理穩定性和生物活性。復合體的物理穩定性的測定，可用本領域普通技術人員所知的方法通過測定復合體的直徑來進行，這些方法例如包括電子顯微鏡、凝膠過濾色譜，或者采用準彈性光散射法(其中用附如實施例中所述的CoulterN4SD粒度計)。當貯存后復合體的直徑與純化時測定的復合體直徑相比，前者增大不高于100$，優選是不高于50％，且最優選是不高于30％時，則認為貯存后復合體的物理穩定性“實質上未改變”。用于測定復合體的生物活性的分析方法視復合體中所含的藥物而定。例如，若藥物是編碼基因產物的核酸，則可在本領域普通技術人員采用的轉染細胞用的轉染條件下，通過用DNA和陽離子脂質體的摻和物體外處理細胞而測定生物活性。可被復合體轉染的細胞包括那些可被DNA/脂質體摻合復合體轉染的細胞。然后將貯存過的復合體的活性與經摻和制得的復合體的轉染活性進行比較。如果藥物是蛋白質，則可用適于該蛋白質的生物分析法來測定活性。本領域技術人員應進一步明白，本發明的復合體可用作活體內基因療法的載體。利用本發明的復合體的治療用調和物優選包括生理相容的緩沖液中的復合體，例如磷酸鹽緩沖的鹽水、等滲鹽水或低離子強度的緩沖液如10％蔗糖于H2O(pH7.4-7.6)或于Hepes(pH7-8，更優選的pH為7.4-7.6)中。復合體可以氣溶膠或液體溶液的形式施用于腫瘤內、靜脈內、氣管內、腹膜內和肌內。文中引用的任何文獻或專利均并入作參考。下述實施例闡述本發明的各方面，但決不是想限制其范圍。實施例原料DOPE購自AvantiPolarLipid，Inc.(Alabaster，AL).pRSVL，這種在Rous肉瘤病毒長末端重復序列控制下編碼熒光素酶基因的質粒(DeWet，J.R.etal.(1987)Mol.Cell.Biol.，7725-737)在大腸桿菌中擴增并利用標準的CsCl-EtBr超離心法純化(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.andManiatis，T.，MolecularCloningALaboratoryManual(2ded)ColdSpringHarborLaboratoryPressNewYork(1989))。所有的組織培養基均得自GibcoBRL(Gaithersburg，MD)。人胚胎腎293細胞、CHO(中國倉鼠卵巢細胞)、BL6和BHK(幼倉鼠腎細胞)均得自AmericanTypeCultureCollection(Rockville，MD)。小鼠肺細胞(MLC)系源自Balb/c小鼠的肺的初級培養細胞，由Dr.S.Kenned(OakRidgeNationalLaboratory，TN)而得。293、BL6、BHK和MLC細胞均用DMEM培養基培養，CHO細胞用F12培養基培養，而C3Hela細胞于RPMI-1640培養基中培養。所有培養基中均添加10％胎牛血清(HycloneLaboratories，Inc.，Logan，UT)和100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素。聚L-賴氨酸氫溴化物(MW3000和MW25，600)和其它化學藥品均得自Sigma(StLouis，MI)。DC-Chol按Gao和Huang(1991)的方法合成(Gao，X.，andHuang，L.(1991)Biochem.Biophys.Res.Commun.，179280-285)，其純化步驟中作如下改動在反應后加入10ml己烷，并用10ml水提取混合物三次。收集有機相并在4℃下真空干燥。在加熱下將所得固體溶于少量無水乙醇，并在0℃的乙腈中重結晶。DC-Chol的純度至少＞95％，是由TLC法和1H-NMR分析測得的，且產率約為70％，這比Gao，X.和Huang，L.先前報道過的方法((1991)Biochem.Biophys.Res.Commun.，179280-285)有顯著改進。方法復合體的制備和純化在20mM總脂質濃度下的陽離子脂質體的制備為按報道過的方法(Gao，X.，andHuang，L.(1991)Biochem.Biophys.Res.Commun.，179280-285)，通過超聲處理法用不同比率的DC-Chol和DOPE制備。基于定量目的包括有痕量的3H膽甾醇十六烷基醚(Amersham，ArlingtonHeights，IL)。這些脂質體的直徑大小介于100～150nm，是利用CoulterN4SD粒度計(CoulterElectronics，Inc.，Hialeah，FL)通過準彈性光散射法測定的。除非另有說明，下述實施例中的DNA/脂質復合體是在典型的實驗室規模制備的將各實施例中所示劑量的、在體積為1ml的2mMHepes緩沖液(pH7.6)中的游離DC-Chol/DOPE脂質體加入15×7.5聚苯乙烯培養管(Baxter，McGrawPare，IL)，管中放入一顆微磁力攪拌子，并充分混合此溶液。然后按各實施例中所示的pRSVLDNA劑量，自貯液(0.2mg/ml，于2mMHepes緩沖液中，pH7.6)中逐滴加入脂質體溶液，歷時3分鐘。為定量目的，采用缺口平移試劑盒(Promega，Madison，WI)和32PdCTP(Amersham，ArlingtonHeights，IL)以32P標記的痕量的pRSVL被包括其中。為制備純的脂質/PLL/DNA復合體，將如各實施例中所示劑量的上述0.2mg/mlDNA溶液加入含有如各實施例中所示劑量的脂質體和PLL的1mlPLL/脂質體混合物中。將DNA/脂質復合體加注到由分別為0.5ml的5％、7.5％、10％和15％蔗糖(W/W)組成的蔗糖梯度頂層，并將DNA/脂質/PLL復合體加注到由分別為0.5ml的5％、10％、15％、20％、25％和30％蔗糖(W/W)組成的蔗糖梯度頂層。然后在4℃下通過100,000g下超離心從游離的脂質和PLL中純化DNA/脂質和DNA/脂質/PLL復合體。離心后，將200μl各級分從管頂部至管底部取出。用閃爍計數器對來自各級分的等分試樣分析3H和32p放射活性。收集并匯集含有32p峰值的級分。然后測定這些匯集的級分的粒度和轉染活性。體外轉染分析通過下述實施例中細胞的體外轉染來分析上述復合體的生物活性。簡言之，將生長于48孔板中的細胞與用0.5mlCHO-S-SFM(GibcoBRL)稀釋的DNA/脂質復合體或者與按Gao和Huang(1991)(Gao，X.，andHuang，L.(1991)Biochem.Biophys.Res.Commun.，179280-285)的方法制備的DNA/脂質體摻合復合體一起培養。至于在PLL存在下用DC-Chol脂質體轉染pRSVLDNA，是將脂質體先與PLL混合、再與DNA復合而進行的。所有的轉染作用均在37℃下進行4小時。轉染后，在含10％胎牛血清的合適的培養基中將細胞進一步培養36小時。再以PBS洗滌細胞，并用由熒光素酶分析試劑盒(Promega，Madison，W1)提供的100μlIX溶胞緩沖液溶解。取4μl溶胞產物試樣分析熒光素酶活性，其中用到來自重組的熒光素酶分析盒的100μl底物溶液與AutoLumatLB953光度計(Berthold，Germany)。各溶胞產物的蛋白質濃度，是按廠商的說明(Pierce，Rockford，IL)采用考馬斯藍染料方法來分析的。實施例1以DNA與脂質比率確定DNA/脂質復合體的大小進行該實驗以顯示由摻合而形成的DNA-脂質復合體的大小，隨著與脂質體混合的DNA的比率的改變而變化。簡言之，將pRSVL質粒DNA(2μg)與不同量的DC-CHOL/DOPE(3∶2)脂質體于pH7.6的2mMHepes緩沖液中混合，終體積為500μl。在7分鐘后，用CoulterN4SD激光散射粒度計在單一模式下操作以確定復合體的大小。如圖1中所示，當DNA過量時(脂質體與DNA的比率小于7)，不會形成大的凝聚物；但當脂質與DNA的比率為電中性時(～10)，則復合體的直徑達極大值。此外，當脂質體與DNA的比率恒定于10nmol/μg時，則DNA和脂質體的濃度均增大時，復合體的大小也會增大，并最后形成沉淀。但是，當增大脂質體與DNA的比率時，復合體的大小逐漸降低直至恒定(250-300nm)，此時脂質體與DNA的比率高于25nmol脂質/μgDNA。該結果可能是由于DNA可能被過量的脂質體包覆，所以復合體之間不會發生凝聚。基于圖1中給出的數據，脂質/DNA復合體的制備如下利用50nmol/Pμg的脂質體與DNA的比率，將200μg/ml的DNA溶液緩慢地加入過量的(10μmol)脂質體中而得。所形成的復合體大小約為250nm。如果將脂質體與DNA的比率改為25nmol/μg，則復合體的大小增大到大約350nm。利用25nmol/μg或50nmol/μg的比率形成的復合體似乎是物理穩定的，因為在4℃下貯存4周之久也未形成沉淀。實施例2DNA/脂質復合體的純化當將DNA與脂質體在1μg/50nmol的比率下混合后，則可看到過量的游離脂質體脂質與DNA/脂質復合體共存。由于過量的游離脂質對細胞有毒，所以進行實驗以確定是否可以用密度梯度超離心法將游離脂質體脂質從DNA/脂質復合體中分離。簡言之，游離脂質體(10μmol的DC-Chol/DOPE(2∶3)于2ml體積中)；游離DNA(50μgpRSVL于2ml體積中)和通過將20μmolDC-Chol/DOPE(2∶3)與0.4mgpRSVL質粒DNA(50nmol/μg)混合而形成的DNA/脂質復合體，分別在由各0.5ml的5％、7.5％、10％和15％蔗糖(W/W)組成的梯度上于4℃下以100,000g離心30分鐘。再分別從管頂至管底采集200μl各級分，并分析DNA標示物(32P，■)和脂質標示物(3H，O)的分布。圖2A和2B顯示在蔗糖梯度上，游離脂質體脂質、游離DNA(圖2A)和DNA/脂質復合體(圖2B)的典型分離結果。圖2B的結果顯示離心后，復合體在10％蔗糖層形成一條主帶。比較起來，圖2A顯示游離DNA或游離脂質體脂質的大部分放射活性分布在管的上半部，且并未進入蔗糖梯度。此外，盡管在圖2B中3H的峰和32P的峰共存于第16號級分，仍有相當量的3H分布于級分1～10，表明過量的游離脂質體脂質已從DNA/脂質復合體中充分分離。實施例3純化過的脂質/DNA和脂質/PLL/DNA復合體的物理穩定性將20μmol各種DC-Chol/DOPE組成(參見表1)的脂質體與0.4mgpRSVL質粒DNA在1μgDNA/50nmol脂質的比率下混合，以形成DNA/脂質復合體。而脂質/PLL/DNA復合體的形成如下將4μmol各種DC-Chol/DOPE組成的脂質體與1mgPLL(MW＝3000)和0.4mgpRSVL質粒DNA混合。然后通過如方法部分中所述的蔗糖梯度離心，將這兩種復合體從游離脂質、游離DNA和游離PLL中純化。收集并匯集峰級分。收集后立即(0天)或在4℃下貯存于10％蔗糖中達120天后分析所匯集的試樣的直徑。表1給出這些分析結果。表1.純化后的脂質/DNA和脂質/PLL/DNA預復合體的物理穩定性<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="889">脂質體組成物(DC-Chol/DOPE)PLL(μg/μgDNA)大小(nm)0天120天純化后的復合體脂質/DNA比率(nmol/μg)DNA的回收率(總數的％)2∶8016828023.2513∶7018725214.0664∶6017519512.7735∶5017421013.2706∶4019823210.169</table></tables></tables>表1中所示的數據顯示純化后的脂質/DNA和脂質/PLL/DNA復合體在第0天時尺寸很小(小于200nm)，并且其尺寸不因貯存而急劇增大。再者，純化后的復合體中DNA與脂質的比率介于10到23nmol脂質/μgDNA之間，這取決于所用的脂質體組成；且貯存120天后該比率不會改變。還可看出脂質體中DC-Chol的濃度與復合體中脂質含量之間的倒數關系，表明富含DC-Chol的脂質體比含更少DC-Chol的脂質體顯示更強的DNA結合或電荷中和活性。最右一欄顯示經蔗糖密度梯度純化后，32P標記的DNA從DNA/脂質和DNA/脂質/PLL復合體中的回收率。結果表明，從不含PLL的復合體中DNA的回收率高于從含PLL的復合體中DNA的回收率。實施例4純化后的復合體在各種細胞中的生物活性由于通過脂質體與DNA在脂質對DNA的高比率下混合而形成的DNA/脂質復合體既小又長期穩定，所以可進行實驗以比較這些復合體的轉染活性與由摻合法配制的DNA/脂質體復合體的活性。在一個實驗中，將培養于48孔板中的CHO細胞用1μgpRSVL只和不同脂質組成的10nmolDC-Chol/DOPE脂質體形成的摻合物(○)或二者還與1μgPLL(MW＝3,000)形成的摻和物(□)處理4小時；或者將細胞用純化過的DNA/脂質復合體(●)或用純化過的DNA/脂質/PLL復合體(■)處理，復合體是通過將1μgDNA與50nmolDC-Chol/DOPE脂質體(DNA/脂質復合體)或與10nmolDC-Chol/DOPE脂質體和1μgPLL(DNA/脂質/PLL復合體)混合，接著通過如方法部分中所述的蔗糖密度梯度離心而形成的。處理后36小時，將細胞溶于100μl溶胞緩沖液，并取4μl溶胞產物利用100μl熒光素酶底物溶液分析熒光素酶活性。然后在20秒內計算熒光素酶活性示于圖3的結果顯示轉染CHO細胞的最優選的脂質體組成為40％DC-Chol和60％DOPE。此外，在額外的1μg聚L-賴氨酸(PLL，MW＝3,000)存在下，在多數情況下均可看出轉染活性增高2-7倍。特別有趣的是，當將相等量的DNA加至細胞時，則純化后DNA/脂質復合體的活性類似于DNA/脂質體摻合復合體的活性。但是，純化過的DNA/脂質/PLL復合體的轉染活性比由摻合法制備的DNA/脂質體/PLL復合體的轉染活性低約30％～50％。為證實在CHO細胞中所得的結果不是細胞專一的，于是在兩種其它細胞即BHK和小鼠肺細胞(MLC)中，將純化過的DNA/脂質和DNA/脂質/PLL復合體的轉染活性，與由摻合法形成的DNA/脂質體復合體的轉染活性作了比較。簡言之，用與10nmolDC-Chol脂質體復合的1μgpRSVL(摻合復合體)轉染在48孔板上生長至60％鋪滿度的細胞(BHK或MLC)，用在1μg/50nmol的DNA/脂質體比率下與脂質體混合的相同量的DNA轉染細胞，所述二物質的混合是為了產生純化過的DNA/脂質復合體；或用1μg/10nmol/2μg的DNA/脂質體/PLL比率下制備的、純化過的DNA/脂質/PLL復合體轉染細胞。再在轉染后36小時收集細胞，按方法部分中所述測定轉染過的細胞溶胞產物的熒光素酶活性。這些實驗結果如表2和3中所示。表2.用pRSVL轉染的BHK細胞中熒光素酶基因的表達熒光素酶活性(相對光單位×10-3)<>表3.用pRSVL轉染的小鼠肺細胞中熒光素酶基因的表達熒光素酶活性(相對光單位×10-3)有趣的是，在BHK細胞系中，純化過的DNA/脂質復合體的轉染活性顯著高于經摻合而形成的DNA/脂質體復合體的轉染活性。至于如MLC的細胞，因難于轉染，所以由DNA/脂質體/PLL混合物制得的純化過的復合體明顯優于摻合復合體和不含PLL的、純化過的DNA/脂質復合體。為了確定脂質/PLL/DNA復合體是否可用不同比率的脂質/核酸和不同分子量的PLL(與先前的實施例中所用的相比)來制備，于是進行下述實驗。按表4中所示的脂質與DNA的比率，由20μgpRSVL質粒DNA、10μg聚L-賴氨酸(MW25,600)和DC-Chol/DOPE脂質體(4.5/5.5摩爾比)制得脂質/聚L-賴氨酸/DNA復合體。然后將所得復合體按方法部分中所述用蔗糖梯度超離心純化。純化后含0.5μgDNA的復合體的等分樣被用于轉染CHO細胞，然后測定熒光素酶活性。該實驗的結果如表4中所示。表4.脂質/DNA比率對純化過的含聚L-賴氨酸(MW25,600)的復合體的影響</tables>結果表明，若增大聚陽離子的存在量，則可用較低比率的脂質/DNA生產具有相當大轉染活性的DNA/脂質/聚陽離子復合體。實施例5貯存后的復合體的轉染活性用下述各種復合體處理培養于48孔板中的CHO細胞達4小時1μgpRSVL只和不同DC-Chol/DOPE組成的10nmolDC-Chol/DOPE脂質體的摻合物(○)；或前述摻和物中再摻有1μgPLL(MW3,000)的摻和物(□)或者純化過的DNA/脂質復合體(●)；或DNA/脂質/PLL(●)復合體，所述各種復合體被貯存于4℃下的10％蔗糖中達130天。純化過的復合體是這樣形成的將1μgpRSVL只與50nmol不同DC-Chol/DOPE組成的DC-Chol/DOPE脂質體混合(DNA/脂質)，或者與10nmolDC-Chol/DOPE脂質體和1μgPLL混合(DNA/脂質/PLL復合體)，接著按方法部分中所述通過蔗糖密度梯度進行離心。結果表明，從用貯存過的DNA/脂質和DNA/脂質/PLL復合體轉染的細胞制得的溶胞產物，其熒光素酶活性比得上用由摻合法配制的相應復合體轉染過的細胞的溶胞產物的熒光素酶活性。實施例6由摻合法配制的DNA/脂質體復合體與純化過的DNA/脂質復合體二者細胞毒性的比較不同復合體對CHO細胞的細胞毒性研究如下。將CHO細胞分別用下列復合體處理DNA/脂質體摻合復合體(○)，DNA/脂質體/PLL摻合復合體(□)；純化過的DNA/脂質復合體(●)；或純化過的DNA/脂質/PLL復合體(●)。摻合復合體是通過將1μgpRSVLDNA只與不同DC-Chol/DOPE組成的10nmolDC-Chol/DOPE脂質體混合而形成的，或還混有1μgPLL(MW＝3,000)。純化過的復合體則是這樣形成的將1gμpRSVLDNA只與50nmolDC-Chol/DOPE脂質體混合(DNA/脂質復合體)，或者與10nmolDC-Chol/DOPE脂質體和1μgPLL混合(DNA/脂質/PLL復合體)，接著按方法部分中所述通過蔗糖密度梯度進行離心。處理后36小時，將細胞溶解，提取出蛋白質，并用考馬斯藍染料法定量。圖5顯示本實驗的結果，其中在實驗結束之際回收的可提取的蛋白質總量，被用作所述處理之后存活細胞部分的指示劑。給出的數據顯示，雖然純化過的復合體對細胞的毒性似乎比DNA/脂質體摻合復合體稍大，但就形態學而言，轉染作用在用摻合復合體或純化過的復合體處理后的細胞中，都不會導致任何嚴重的細胞毒性作用。不過，用含有高mol％的DC-Chol的、純化過的復合體處理后的細胞，在實驗結束之際鋪滿度較小。實施例7用純化過的DNA/脂質復合體在活體內轉染腫瘤在第0天，將3×106個人卵巢癌細胞皮下注入SCID小鼠。14天后，將100μl含有pUCCMVCATDNA(30μg)、與前者復合的DC-Chol(3∶2DC-Chol∶DOPE)脂質體(30nmol)、呈摻合物形式(1和2列)的溶液，或者相同量的呈純化過的DNA/脂質復合體(由DNA和DC-Chol脂質體在1μgDNA/25nmol脂質比率下配制的)形式的DNA，直接注入腫瘤中。2天后殺死動物，取含有100μg蛋白質的腫瘤提取物在37℃下按Ausubel，etal.((1991)CurrentProtocolsinMolecularBiology(Wiley，Boston)，Vol.1，pp.9.6.2-9.6.5)測定CAT活性。結果表明，純化過的復合體，盡管在非最佳條件下制得，仍表現活體內轉染活性。實施例8純化過和未純化的DNA/脂質/PLL復合體與DNA/脂質摻合復合體的轉染活性的比較在三種細胞系(293、BL6和C3)中，測定純化過和未純化的DNA/脂質/PLL復合體以及DNA/脂質摻合復合體的轉染活性，方法如下純化過的DNA/脂質/PLL復合體是這樣形成的將1μgPRSVLDNA與10nmolDC-Chol/DOPE脂質體(2∶3mol/mol)和1μgPLL.(MW＝25,600)混合，接著按方法部分中所述通過蔗糖密度梯度進行離心。未純化的DNA/脂質/PLL復合體則是這樣形成的將100μgPRSVLDNA與80μgPLL(MW＝25,600)和1702nmolDC-Chol/DOPE(2∶3mol/mol)脂質體(即1μgDNA/17nmol脂質/10.8μgPLL的DNA/脂質/PLK比率)混合于終體積為500μl的水中。然后取20μl未純化的DNA/脂質/PLL復合體(即4μgDNA、3.2μgPLL和68.1nmol脂質)加入780μl適于待轉染的細胞系的無血清培養基中。將1μgPRSVLDNA與10nmolDC-Chol/DOPE(3∶2mol/mol)脂質體混合而形成DNA/脂質摻合復合體。用1μgDNA于37℃下轉染在24孔板中生長至80％鋪滿度的293、C3和BL6細胞達4小時，其中的DNA呈下列形式純化過的DNA/脂質/PLL復合體、DNA/脂質摻合復合體或未純化的DNA/脂質/PLL復合體。轉染后，將細胞于含有10％胎牛血清的合適的培養基中又培養36-48小時。然后按方法部分中所述測定熒光素酶活性。結果示于圖7A(293細胞)、圖7B(C3細胞)和圖7C(BL6細胞)，結果表明，未純化的DNA/脂質/PLL復合體在受試的三種細胞系中均表現最高的轉染活性。雖然在上文中已描述了本發明的若干實施方案，顯然，可改變基本結構以提供可利用本發明的方法和設備的其它實施方案。因此，應明白本發明的范圍由附上的權利要求書限定，而不是上文中通過實施例說明的特定的實施方案所限定。權利要求1.一種生產脂質的正電荷多于藥物的藥物/脂質復合體的方法，該方法包括將所述藥物與陽離子脂質體混合，其中藥物與脂質的比率使所述藥物/脂質復合體得以形成。2.權利要求1的方法，其中混合而形成所述復合體的藥物與脂質的比率為約1μg/0.1nmol～約1μg/200nmol。3.權利要求2的方法，其中該方法進一步包括純化所述復合體的步驟。4.權利要求3的方法，其中所述純化步驟是通過蔗糖密度梯度進行離心。5.權利要求1的方法，其中的藥物是核酸，而脂質體則是DC-Chol/DOPE脂質體。6.一種生產脂質和聚陽離子的正電荷多于藥物的藥物/脂質/聚陽離子復合體的方法，該方法包括將所述藥物與陽離子脂質體和至少一種聚陽離子混合，其中藥物與脂質與聚陽離子的比率使所述復合體得以形成。7.權利要求6的方法，其中所述藥物與脂質的比率為約1μg/0.1nmol～約1μg/200nmol。8.權利要求6的方法，其中所述聚陽離子含量為約0.01μg～約100μg。9.權利要求8的方法，其中的聚陽離子是分子量為約300～約200,000道爾頓的聚L-賴氨酸。10.權利要求6的方法，其中的陽離子脂質體包括陽離子脂質和中性磷酯。11.權利要求10的方法，其中的陽離子脂質是DC-Chol。12.權利要求11的方法，其中的中性磷脂是二油酰磷脂酰乙醇胺。13.權利要求12的方法，其中的藥物是核酸。14.權利要求1或6的方法，其中所述復合體的平均直徑小于300nm。15.權利要求14的方法，其中所述調和物在貯存長達一年后，其平均直徑保持實質上未變化。16.一種藥物/脂質復合體，它包括至少一種脂質和藥物，這種脂質與該藥物的比率使得所述復合體中脂質的正電荷多于藥物。17.權利要求16的復合體，其中所述的藥物是核酸。18.權利要求16的復合體，其中所述藥物與脂質的比率為約1μg/0.1nmol～約1μg/200mmol。19.權利要求16的復合體，其中所述的脂質是陽離子脂質。20.權利要求19的復合體，其中該復合體進一步包括中性磷脂。21.權利要求16的復合體，其中該復合體從過量的游離藥物和游離脂質中純化。22.一種藥物/脂質/聚陽離子復合體，它包括至少一種脂質、至少一種聚陽離子和一種藥物；其中該藥物與該脂質與該聚陽離子的比率使得所述復合體中脂質和聚陽離子的正電荷多于藥物。23.權利要求22的復合體，其中脂質與DNA的所述比率為約1μg/0.1nmol～約1μg/200nmol。24.權利要求22的復合體，其中所述聚陽離子含量為約0.01μg～約100μg。25.權利要求24的復合體，其中所述聚陽離子是分子量為約300～約200,000的聚-L-賴氨酸。26.權利要求16和22的復合體，其中所述復合體的凈正電荷在pH6.0-8.0下存在。27.權利要求26的復合體，其中的脂質是DC-Chol和DOPE。28.一種把藥物傳遞給個體的方法，它包括將權利要求16或22中任一項的復合體以治療上有效量施藥給需治療的個體。29.權利要求28的方法，其中的復合體是藥物/脂質復合體。30.權利要求28的方法，其中的復合體是藥物/脂質/聚陽離子復合體。全文摘要描述了新型穩定的、濃的、有生物活性和即可使用的含脂質藥物傳遞復合體及其生產方法。生產的復合體的生物活性比得上按現有技術摻合方法配制的調和物,由本發明的方法生產的復合體比由摻合而形成的復合體組分濃50～500倍。文中描述的方法可供大規模生產適用于基因療法和其它應用的含脂質藥物傳遞系統。文檔編號A61K48/00GK1177291SQ9619228公開日1998年3月25日申請日期1996年1月23日優先權日1995年1月23日發明者高祥,黃禮夫申請人:美國匹茲堡大學