專利名稱：馬萊克氏疾病疫苗的制作方法
技術領域：
本發明是關于一種改良的馬萊克氏疾病病毒[MDV]疫苗株，以及該病毒的生長方法和包含該病毒的疫苗。
馬萊克氏疾病病毒會給家禽工業帶來嚴重的經濟損失。大部分嚴重的經濟損失是由血清1型野生型病毒引起的。血清2型和3型也可在該領域中發現。血清1型是一種致癌基因株，血清2型是非致癌基因，血清3型是一種火雞皰疹病毒(HVT)。不同的類型在它們的抗原特性方面具有高度的相似性，但是臨床重要性方面又各不相同。
為了降低由馬萊克氏疾病[MD]引起的經濟損失，已經研制了疫苗。抗MD的疫苗來自于上述三種血清型。本發明是關于血清1型疫苗病毒。
血清1型MD病毒在體外通常與細胞密切相關。作為這種病毒生長的基質，小雞胚胎成纖維細胞(CEF)經常被使用。但應用CEF有一些不足之處。CEF是從胚胎化的特異無病原體的雞蛋中獲得。為了獲得足夠的細胞，需要大量這種昂貴的雞蛋，而且，收獲這些細胞要消耗時間和精力。CEF的質量是變化的，收獲的過程要求大量無菌操作，否則很有可能被污染。
在現有技術中，已經描述了幾種可以用來生長MDV的細胞型，例如從火雞、鵝、鴿子野雞、鶉，以及日本鵪鶉的胚胎中得到的原始成纖維細胞培養物。然而，得到可以產生疫苗病毒的連續細胞系卻是非常方便的。
使用連續細胞系獲得產品的優點是細胞樣品可以很容易地從已經建立并被很好控制的細胞庫中獲得，細胞庫儲存在如液氮之中。連續細胞系的質量要比CEF穩定，因為使用連續細胞系費力較少，必須實行的無菌操作較少，被污染的危險也比較低。
令人驚奇的是，現在已經發現MOV血清1型可以在一種連續鳥細胞系中順利生長。尤其是可以使用鵪鶉細胞系如QT35(日本鵪鶉腫瘤)細胞系。已能適應生長的病毒可以在鳥類細胞系中生長并產生足夠高產量的疫苗商品。實驗證據表明已適應在例如QT35細胞中繁殖的疫苗病毒還能在小雞中誘導對抗MD的保護免疫性。這種適應生長的馬萊克氏疾病病毒株可源自毒性減弱了的MDV株，例如毒株Rispens，CVI988。
這個發現很令人驚奇，因為從現有技術(cho，1981，Aviandiseases 25839-846)中已經知道可以用一項實驗將血清1型病毒與血清3型病毒區分開，實驗中QT35細胞系用作病毒基質。接種血清3型病毒會導致明顯的細胞病理學效應(c.p.e.)而接種血清1型病毒后沒有檢測到c.p.e.，表明這些病毒在QT35細胞中生長不充分。
連續或已建立的細胞系培養物的生長不受條件限制并可無限傳代。這與只能維持幾代的原始細胞培養物形成對照。原始細胞培養物是細胞的體外培養物，它們是直接從如肝、腎、脾、蛋等組織分離出來的。如果這些供給細胞的組織被微生物污染，那么細胞被污染的可能性也就會很高。甚至對于那些供給細胞或卵的動物的各個方面都進行控制并嚴格要求其居住條件，也不能保證細胞不帶有無關因素。
使用已建立細胞系使建立細胞庫成為可能。這是一大批充滿alicots的細胞，儲存在例如液氮之中。這些細胞都被廣泛檢測以證實不存在無關因素。因而由于使用這個細胞庫而成為產品污染源的風險極其小。而且，與原始細胞培養物相比，已建立細胞系的使用明顯地降低了終產品受到污染的危險。
與原始細胞培養物相比，來自細胞庫的已建立細胞系的另一優點在于其質量穩定可靠。細胞系的每一個alicot具有相同的質量。與此相對比，以前細胞的質量依靠提供組織的動物或蛋的情況而定。
為了制備適應生長的MDV，用毒株CV1988在QT35細胞中傳代。發現病毒在傳第一代時增殖程度非常低。在滾瓶(roller bottle)中應用傳染的高多重性可以得到一些細胞病理學效應(c.p.e.)。還發現在滾瓶中連續傳代許多次之后，病毒產量增加了。相反，在固定培養(魯氏瓶，每瓶75cm2)傳代期間，病毒消失了。
圖1表示的是MDV的CV1988株以滾瓶或魯氏瓶兩種培養方式在QT35細胞上適應生長的情況，兩種瓶中的每一次傳代都分別有一個病毒滴度(以每3.107個細胞的10logTCID50表示)與之相對應。在滾瓶中傳代足夠多次之后，病毒產量非常高，以至于可獲得一個有利可圖的生產系統。可以看到，在滾瓶中第12次傳代之后，病毒滴度增加了。
隨后又進行了適應生長實驗。在這個實驗中，傳代期間滴度也增加了。為了閱明適應效應，在第二代中產生每3.107個細胞為106.03的TCID50滴度，從一個滾瓶中收獲的病毒能接種5個有QT35細胞的滾瓶。在第19代中，產生每3.107個細胞107.02的滴度，一個滾瓶的產量足夠接種50個滾瓶。
在適應試驗中，做了一些嘗試以提高病毒滴度。在一些情況下，收荻的病毒不接種在QT35單細胞層上，而是與新鮮制備的QT35細胞懸液混合，然后種在滾瓶中。在另一些情況下，收獲得的病毒不與新鮮細胞混合，而是將收獲得物簡單地傳代培養于空的滾瓶中。這樣操作也可以使收荻得的病毒有足夠高的滴度繼續傳代。對于在QT35細胞上的繁殖，傳染的高多重性是關鍵。直到最后，高病毒滴度也是需要的。收荻之后，病毒通常是直接傳代，不需要冷凍。為了檢查收荻的病毒懸液中病毒的含量進行了免疫熒光測定。
QT35細胞系的發展，已經由Moscovici等人表述了(1977cell 1195-103)。QT35細胞系是由日本鵪鶉甲膽蒽誘導的纖維肉瘤建立起來的。這個細胞系的樣品保存在ATCC(Rockville，MD，USA)中，儲存號第CRL 10967。
QT35細胞可以用適合于錨基(anchorage)依賴性細胞的多種培養方法來生長。例如，細胞可以生長在滾瓶，立方細胞器(cellcube)中和微量載體上，這些器皿由明膠，塑料或玻璃構成或者包含有這些物質。
細胞也可以用各種細胞培養基或復合細胞培養基來生長。這樣的培養基如下1.Ham′s F10，補充有2％的2.8％碳酸氫鈉溶液，100個國際單位(IU)青霉素，10％磷酸鹽肉湯，8％胎牛血清及2％雞血清。(Moscovici et.al.，cell 11，page 95-103，05-1977)。2.含有Hanks鹽的培養基199，補充有0.3％的磷酸胰化蛋白胨肉湯，0.477％HEPES以及10％胎牛血清。(Fiorentine et.al.，Develop.biol.standard 60，page 421-430，1985)。3.Eagle′s MEM 含有10％的成年牛血清以及抗生素(青霉素100iu/ml，新霉素100μg/ml和100μg/ml)(Reddy et al.IdianVet.J.68，page 907-910，1991)。4.44％的營養混合物F-10和56％的培養基199，補充有5％磷酸胰化蛋白胨肉湯，10％胎牛血清，10μg/ml慶大霉素，10mM HEPES及0.015％碳酸氫鈉。(Schnitzlein et al.，Virus Research 10，page 65-76，1988)5.ham′s F12培養基。
這些細胞培養基或復合細胞培養基可以也可不補充現成可獲得的能量源(尤其是糖，如葡萄糖、果糖和/或核糖)和/或補充氨基酸源如蛋白質(如牛乳蛋白和/或血清蛋白)。
對于QT-35細胞的傳代培養，可以使用蛋白水解酶如胰蛋白酶和膠原酶。
在凍結保護劑如二甲基亞砜(DMSO)或甘油存在下可將細胞冷凍。細胞以及帶有病毒的細胞的冷凍方法，是將溫度逐漸降低，例如每分鐘降低1℃，直到所需的貯藏溫度，貯藏優選液氮的溫度。
疫苗的稀釋劑可以是任何生理學溶液，但優選磷酸鹽緩沖的含有NZ-胺的蔗糖溶液。
實施例1疫苗產品產品生產的最初原料是已經在QT35細胞上傳代16次的毒株CV1988。這個傳代16次后的病毒原料樣品于1995年6月7日以儲存號第1-1585存放在巴斯德學院(法國，巴黎)的CollectionNational de Microorganismes(CNCM)。
在產品生產中，細胞和病毒通常都在39℃下生長。為得到疫苗產品，將QT35細胞以8.8×104個細胞/cm2的濃度種在滾瓶中，然后孵育。孵育三天后，滾瓶與傳染多重性(m.o.f.)為0.01的第16代病毒共同孵育。4天后，以胰蛋白酶作為收荻傳染培養物，得每個滾瓶43.1×107個細胞(8.8×105/cm2)。
一份樣品被滴定而用另一份樣品接種(接種率1∶20)帶有QT35單細胞層的滾瓶。這些細胞在3天前以8.8×104個細胞/cm2的濃度種好。接種3天后，用胰蛋白酶作用收獲傳染的單細胞層。每個滾瓶收獲得58.8×107個細胞(12.0×105個細胞/cm2)。離心濃縮細胞懸液并在凝固培基中稀釋至濃度為3×107個細胞/ml。此細胞懸液裝入1ml小瓶中于液氮中凍存。這些安瓿被稱為MasterSeedVirus(MSV)。總共24個安瓿凍存于液氮中。兩個安瓿被滴定，滴度顯現106.20TCID50/ml。
為得到工作種子病毒(WSV)產品，在滾瓶中種好細胞，濃度為8.7×104個細胞/cm2，然后孵育。滾瓶用moi為0.01的MSV接種。孵育4天后，用胰蛋白酶收獲感染培養物，得每瓶55.4×107個細胞(11.3×105個細胞/cm2)。
一份樣品被滴定而用另一份樣品接種(比率1∶20)QT35單細胞層。這些單細胞層在3天前以8.7×104個細胞/cm2的濃度種好。病毒生長3天后，用胰蛋白酶收獲感染的單細胞層。每個滾瓶收獲細胞32.6×107(6.65×105個細胞/cm2)。離心濃縮此細胞懸液，并在凝固培基中稀釋至濃度為3×107個細胞/cm2。將此細胞懸液裝入1ml安瓿中，在液氮中冷凍。一份樣品被滴定，滴度顯現106.20TCID50/ml。這些安瓿被稱為＂工作種子病毒＂。
為得到疫苗產品，將QT35細胞以8.7×105個細胞/cm2的濃度種于滾瓶中。播種三天后，用moi為0.01的工作播種病毒接種滾瓶。孵育4天后，用胰蛋白酶作用收獲傳染培養物。每瓶收獲得細胞59.6×107個(12.2×105個細胞/cm2)。
一份樣品被滴定，而用另一份樣品接種(比率為1∶20)QT35單細胞層。這些單細胞層在3天前以8.7×105個細胞/cm2的濃度種好。4天后，用胰蛋白酶作用收獲傳染培養物。
一份樣品被滴定，而用另一份樣品接種(比率1∶30)QT35單細胞層。這些單細胞層在3天前，以8.7×105個細胞/cm2的濃度種好。三天后，以胰蛋白酶作用收獲得傳染的單細胞層。
離心濃縮細胞懸液，并在凝固培基中稀釋至濃度為3×107個細胞1ml。將此細胞懸液裝入1ml小瓶中，并凍存于液氮中。一份樣品被滴定，滴度顯現為106.72TCID50/ml。這些安瓿被稱為一批第23代疫苗生產日期1995年3月13日。
用于接種的是第23代。也就是從MSV起5代。由1小瓶MSV可以生產±1200安瓿工作種子病毒。用1安瓿工作種子病毒我們可以生產±37500安瓿疫苗，接種37,500,000只雞。
實施例2由QT35細胞上適應生長的毒株Rispens產生的疫苗的功效疫苗功效的檢測使用在歐洲藥典對馬萊克氏疾病疫苗的專著589(1994)中所描述的方法，只是雞是在接種5天后被激發免疫，而不是專著處方規定9天的間期。是5天后而不是9天后再激發，這樣使檢測更靈敏。為了在QT35細胞上傳代，Poulvac Marek CVI369批被用作最初原料。檢測按實驗例1在QT35細胞上傳代21次的疫苗病毒。
一天齡SPF小雞以常規疫苗量的劑量(103.0TCID50或更高)接種一次。接種5天后，將這些雞用致病性馬萊克氏疾病病毒株激發。激發后，常規性檢查這些雞有無馬萊克氏疾病癥狀。激發70天后，將所有的雞殺掉，調查馬萊克氏疾病的宏觀損傷。
研究的結果總結于表1
這個結果表明，在未接種組，有86％的雞染上馬萊克氏疾病(符合歐洲藥典)。因此，產生于QT35細胞的疫苗符合歐洲藥典規定的保護指數應至少是80％的指標。
結論上述實驗表明，產生于QT35細胞的馬萊克氏疾病疫苗是有效的。
權利要求
1.適于生長在一種鳥類連續細胞系上的馬萊克氏疾病毒[MDV血清1型]。
2.權利要求1中的病毒，其特征為該鳥類細胞系是一種鵪鶉細胞系。
3.權利要求2中的病毒，其特征為該鵪鶉細胞系是一種QT-35細胞系。
4.存放在巴斯德學院(法國巴黎)的CNCM處的毒株1-1585MDV。
5.一種保護家禽抵抗馬萊克氏疾病的疫苗，其特征為包含一種適于在一種鳥類連續細胞系上生長的MDV病毒材料。
6.權利要求5的疫苗，其特征為該鳥類細胞系是一種鵪鶉細胞系。
7.權利要求6的疫苗，其特征為該鵪鶉細胞系是一種QT-35細胞系。
8.一種保護家禽抵抗馬萊克氏疾病的疫苗，其特征為它包含來自毒株1-1585的MDV的病毒材料，該毒株存放在巴斯德學院(法國，巴黎)的CNCM處。
9.生長MDV的方法，其特征為將權利要求1-5的病毒生長在一種它所適應的合適的連續細胞系中。
全文摘要
本發明涉及適應生長于一種鳥類連續細胞系尤其是鵪鶉細胞系QT-35的馬萊克氏疾病病毒，也涉及該適應生長病毒在鳥類連續細胞培養物上的生長方法以及包含此病毒的疫苗。
文檔編號A61P31/12GK1147015SQ9611101
公開日1997年4月9日 申請日期1996年6月10日 優先權日1995年6月12日
發明者H·E·M·施皮克斯, J·J·盧韋倫斯 申請人:杜法爾國際研究公司