專利名稱：引導癌細胞分化之藥物及其在癌癥之治療與預防上的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種治療和預防癌癥藥劑的制備致癌基因是人類細胞基因的一部分，有人類以來即有癌癥，到目前為止，還沒有很好的克服方法，可以說這是有史以來持續最久但卻仍無法解決的頑疾。癌癥之所以難以治療，癌細胞本身的組成復雜是一個原因，而未找到妥善的防治對策倒是更重要的因素。癌細胞會持續不斷地分裂，侵入正常的器管及組織，最后造成病害而致死。傳統醫學界向來把癌細胞持續分裂當作癌癥的最根本癥結，進而尋求細胞毒來中止DNA合成以防止細胞分裂，細胞毒療法源由于此。近四十年來治療癌癥的方針都著重于發展細胞毒療法。癌癥醫療市場亦被這種藥物所壟斷。二十多年前，甚至說服尼克松總統動用美國總統權威向癌癥宣戰，投入無數資源，動員美全國醫學界人力，期在短期內克服這難癥，但癌癥并沒有被制服。所以單靠財力和人力是無法解決癌癥問題，必須尋求突破性的新療法。
隨著醫學的進步，壽命的延長，加上工業發達促成環境的污染，世界癌癥的發生率和死亡率節節上升，每年死亡于癌癥的人數高達數百萬人，實際上癌癥在中年時代(30-60歲)的死亡率已高居首位，目前尋求有效的新療法已刻不容緩。
本發明人發現異常的甲基轉移復合酵素才是癌癥最根本的癥結，因為這復合酵素的異常才導致了癌細胞的持續分裂。甲基轉移復合酵素在細胞的分裂以及分化扮演著很重要的主導角色，這些酵素活性高時細胞就進行分裂，活性由高轉低時，細胞會合成缺甲基核酸，結果細胞就被導引進行分化而變成不再分裂的終末分化細胞。所有的癌細胞甲基轉移復合酵素都有異常的甲基轉移復合酵素，把這些酵素固定在活性很高又穩定的狀態，因而細胞不斷地分裂，所以異常的甲基轉移復合酵素是癌癥的病因，持續的細胞分裂是癌癥的癥狀。一般說來，要醫療一個疾病，從消除病因著手要比消除癥狀有效得多。中國醫學有這樣一個金科玉律，即“上醫醫病于未發，中醫治本，下醫治標”。就是說最好的醫療策略是預防疾病的發生，預防尤其適合于極困難治療的疾病，象癌癥、心血管病、愛滋病等；次好的醫療策略是消除致病的根本原因；最下策才從消除疾病癥狀治病。人們用治標的下策和癌癥斗爭四十多年，并沒有制服這個病。
其實正常人體內有足夠的化學物質抑制這些異常甲基轉移復合酵素的形成，這說明發癌的過程要經過漫長的促成時間，在這期間病人加速排泄抗癌化學物質，到這些抗癌物質減低到不足以抑制異常甲基轉移復合酵素時，癌細胞才開始生根繁殖，病癥才被發現。
細胞分化劑發展過程要解決癌癥問題必須先要掌握致病的根本原因，找出癌細胞和正常細胞根本的差異，對癥下藥才能解決這個難題。本發明人在1977年發現諾比可夫肝癌細胞的甲硫胺酸腺苷轉移酵素(MethionineAdenosyltransferase，MAT)和正常細胞的酵素不相同(文獻19)，其相異之處不僅是量的差異，還有質的不同。這發現對癌癥的治療有不可磨滅的貢獻，雖然重要性在那個時候并沒有被肯定，因為甲基轉移最重要的DNA甲基轉移的功能在當時還沒有被發現出來。一旦DNA甲基轉移在調節基因表現的功能被確定后(文獻12、15)，異常MAT的重要性就凸顯出來。因為這種酵素有重要的功能，癌細胞的酵素和正常細胞的酵素又有質的差異，我們可以利用這種差異找到理想有選擇性的抗癌藥物。
甲基轉移復合酵素的功能MAT是甲基轉移復合酵素三個成員酵素之一，另外兩個成員酵素是甲基轉移酵素和SAHH。甲基轉移酵素有許多種，(各色各樣都有)而且互不相干，因為每一個酵素都有特異的基質選擇性，不過由于和相同的MAT和SAHH形成復合酵素，這些功能殊異的甲基轉移酵素卻接受同一機理在調節活性。這三個成員酵素要結合在一起才能發揮甲基轉移的功能。在正常細胞內，復合酵素的結合需要依賴外來的促進因素，辟如固醇激素即是這激素靶組織之復合酵素的促進因素。有固醇激素時，這三個成員酵素會結合在一起形成穩定而有活性的復合酵素。一旦固醇激素不復存在，復合酵素就分離成單獨成員酵素，單獨成員酵素穩定性不好，會立即遭受破壞而失去活性(文獻23)。非固醇激素靶組織的細胞中，甲基轉移復合酵素的形成則有賴于生長激素的刺激，使該細胞產生類似固醇激素的促進因素。總而言之，正常細胞的甲基轉移復合酵素的活性是完全受制于外來的促進因素。
核酸的甲基轉移復合酵素在細胞的分裂以及分化上扮演著很重要的主導角色，其必要性與生長激素不相上下。核酸的甲基轉移種類繁多，然而其中只有兩種對細胞分裂以及分化特別有關聯，這兩種甲基轉移是DNA的5-甲基胞苷(5-mC)，和RNA的2′-氧甲基核糖。DNA的5-甲基胞苷發生在DNA雙股序列的對應位置上。
當一個基因的啟動子序列有這種甲基時，這個基因就被抑制而不能表現出來。人體內每一個細胞都有相同的基因，但是各種不同的細胞都只有一小部分不同的基因被表現出來而形成各種不同功能的細胞。DNA的甲基就是扮演選擇基因表現的角色(文獻12、15)。每一器官或組織都有其特殊的基礎細胞，這些基礎細胞已分化至某種程度，但是并未達到終末程度，所以還有分裂能力，但是有特殊功能的分化基因在基礎細胞仍然藉甲基的引入而處于被抑制的狀態。當基礎細胞受到生長激素刺激進行分裂時，甲基轉移復合酵素的活性隨著生長激素而提高，DNA甲基的分布照樣復制，所以分裂出來的子細胞和母細胞相同，都是基礎細胞。等到生長激素不復存在時，甲基轉移復合酵素的活性立即下降，可是DNA合成酵素是相當穩定，這時會合成缺甲基的DNA，經過兩個細胞分裂周期的缺甲基DNA合成，往往會使特殊和分化有關的基因表現出來而變成有特殊功能的終末分化細胞，這種細胞就不再具有分裂能力。缺甲基之DNA合成作用可以說是細胞分化的一個很重要的機理(文獻28)。
rRNA的甲基絕大部分發生在核糖這單位的2′氧位置，這種甲基的引入對核糖體的制造有很重要的調節作用(文獻18)。細胞在制造核糖體的過程是先合成分子量大于最后產物約兩倍的先驅RNA，這先驅RNA在細胞核內經過RNA分解酵素的剪修，把不用的序列剪修分解掉，有用的序列則保留下來形成核糖體。甲基的分布全部著落在有用的序列上，如果這部分序列缺乏甲基，則這部分有用序列也和無用的序列一樣會被分解掉。所以甲基化如果進行的完整就可以產生有用的核糖體；如果進行的不完整，就不能產生核糖體。換句話說，核糖體之生產取決于甲基轉移復合酵素的活性。核糖體的增產是細胞進入DNA合成前的必備要件，有核糖體的增產細胞才能提供用以復制DNA的必要蛋白質，包括核酸合成酵素、染色體蛋白質和細胞結構蛋白質等。如果沒有核糖體的增產，則這些必需蛋白質無法產生足夠的量，細胞也就不能進行DNA合成。核糖體的增產對細胞分裂的重要性可從兩個簡單的實驗證明。第一個實驗利用放射線菌素D的特殊敏感度，細胞經生長激素刺激8小時后，核糖體的生產才會提升上來，如果在這個時候加入微量的放射線菌素D選擇性地抑制核糖體的生產，則發現細胞停止在G1階段(文獻13)，另一個實驗利用特殊溫度的敏度細胞，這種細胞的rRNA的加工分解酵素在39℃完全失去活性，所以如果在生長激素刺激8小時后將溫度從37℃提升到39℃，核糖體的生產便停不來，細胞也隨著停止在G1階段(文獻41)。這個實驗很清楚地證明核糖體的增產是細胞分裂的一個必要因素，那么調節核糖體生產有決定性關聯的甲基轉移復合酵素當然對于細胞的生長也有決定性的影響。一旦生長激素不復存在，細胞就會停止分裂而不需大量的核糖體，甲基轉移復合酵素率先失去活性，但是細胞在短時間內仍繼續合成缺甲基的rRNA先驅產物，這種產物不能夠產生有用的核糖體，故相關蛋白質減產，細胞朝向分化的過程前進，終于變成終末分化細胞。可見甲基轉移復合酵素在細胞的生長與分化扮演著很重要的主導角色。
異常甲基轉移復合酵素在癌癥所扮演的角色異常的MAT是由干癌細胞產生一種特殊的蛋白質因素，這因素和正常的MAT結合而造成異常癌細胞酵素(文獻21)這一結合把原來正常酵素的活性和調節機理完全改觀，癌細胞的特殊蛋白質因素有如固醇激素對正常復合酵素的作用，將三個成員酵素結合成非常穩定有活性的復合酵素，因為有這種特殊蛋白質因素，癌細胞復合酵素的穩定性和活性遠遠超過正常細胞的復合酵素(文獻21)。正常酵素和癌細胞的特殊蛋白質因素的結合不只改變了復合酵素的調節功能，單獨成員酵素的動力性能也起了變化，正常MAT和異常MAT的Km(methionine)值不相同，前者為3μM而后者為20μM。為區別相異，前者定名為MATL后者為MATLT，T代表一個特殊的癌因素。癌細胞的MAT和正常酵素相異已被其他研究者證實。癌細胞的S-腺苷高胱胺酸水解酶S-adenosylhomocysteine hydrolase，SAHH)也有同樣或類似的因素改變其動力性能(文獻24)。因為癌細胞自行產生甲基轉移復合酵素的促進因素，癌細胞這種酵素的活性就不需依賴外來的因素而能自行維持高的活性，這高活性促成癌細胞在分裂周期運轉不息，所以異常的甲基轉移復合酵素是癌癥的根本病因。
所有癌細胞都有這種異常的甲基轉移復合酵素，包括動物的初發癌、移殖癌，移殖在無胸線無毛老鼠的各種人類癌組織，外科手術和組織培養的人類癌細胞等(文獻21、22)。這種復合酵素活性的高低和癌組織的成長率有很明顯的對應關系。正常組織不管有無積極的進行細胞分裂，都沒有異常的甲基轉移復合酵素。所以異常的甲基轉移復合酵素可以說是構成正常生長和異常的癌生長之間很特殊的差別，我們可以利用這種顯著的差別探求藥物有選擇地抑制異常甲基轉移復合酵素。事實上早期的實驗也證實可以抑制癌細胞甲基轉移復合酵素的化合物，如寡核苷酸類，對正常酵素作用相對的很微弱，甚至毫無作用；相反地，可以促進正常復合酵素活性的化合物對異常癌復合酵素卻不能產生同樣的效果(文獻18、20)。這些實驗一再闡明癌細胞的異常的甲基轉移復合酵素是癌癥化學療法一個最恰當的醫療靶。
異常甲基轉移復合酵素作為醫療靶化學療法如上所述異常的甲基轉移復合酵素是癌癥的根本病因，如果消除這些異常酵素之后，癌細胞應該可以像正常細胞那樣被引導進行分化而變成不再分裂的終末分化細胞。事實證明這種假設是正確的，諾比可夫腹水肝癌經poly(I)(C)處理后，異常的甲基轉移復合酵素會變成正常酵素，經過一段時間的延遲后，核酸的合成迅速減低，終于細胞停止分裂(文獻17、18)。poly(I)(C)不能進入細胞內，因而poly(I)(C)的效果很可能是間接的，先由poly(I)(C)引導癌細胞產生寡異腺苷基酯(oligoisoadenylate)合成酵素(文獻9)，然后透過這個酵素的產物，寡異腺苷基酯把異常甲基轉移復合酵素改變成正常酵素。寡異腺苷基酯是分化細胞的產物。類似寡異腺苷基酯可以將異常甲基轉移復合酵素改變成正常酵素的，還有寡肽類和某些有機酸等(文獻27)。Burzynski把這些具有抗癌的天然人體產物命名為抗癌素(Antineoplastons)(文獻4)。這些抗癌物質大半是低分子量的代謝產物，所以在腎臟過濾后經過再吸收才能回歸血液維持一定濃度，再吸收往往不能完全，因此正常人也經常由尿排泄少量有用的抗癌物質，不過正常人能夠維持得失平衡，因此體內總有足夠量的抗癌物質來抑制癌細胞的形成，廖氏等人把這種天然的化學抗癌作用稱之為化學監察(文獻26)。正常人尿中的抗癌物質經過提煉精制后，有兩種主要成份對異常的MAT有顯著的抑制作用，主要是針對異常的癌蛋白質因子使其消失作用，藉此抑制的結果，異常酵素會變成正常酵素(文獻28)。這兩種主要成份之一是與色素結合的酸性肽類，另一則是有機酸(文獻27、29)。正常酵素因為沒有異常因子，所以絲毫不受這些抗癌物質的影響，這也是為什么天然的化學抗癌物質具有特異的選擇性，因為有選擇性，人類的健康才不致于受到影響。癌細胞經過這些精制的有效成分處理后，會被導引進行分化而變成終末分化細胞(文獻28)。從酵素的研究得知，異常的甲基轉移復合酵素變成正常酵素是引導癌細胞進行終末分化的一個轉折點。分析細胞內AdoMet和AdoHcy的量也證實酵素的變化在癌細胞分化所扮演的重要角色。癌細胞的AdoMet量遠比正常細胞為高(文獻11)，因為癌細胞的MATLT比正常細胞的MATLKm值高出許多。癌細胞一旦分化變成終末分化細胞，AdoMet和AdoHcy的量同時減低很多，正好說明MATLT和SAHHLT同時失去致癌因子而變成MATL和SAHHL。
天然化學監察與癌癥的形成既然人體內有天然的抗癌物質，為什么會有癌癥發生？分析一下癌癥患者，我們發現這些病人的絕大部分較正常人從尿排泄過多的低分子量代謝物質，持久的過量消失造成體內缺乏抗癌物質，因而無法抑制癌細胞的繁殖，終于出現臨床癥狀。越嚴重的病人缺乏得越厲害(文獻25、26)。很明顯的這是一種惡性循環，由于某種原因造成病人過度排泄抗癌物質，因此提供機會使癌細胞生根繁殖，癌細胞繁殖的結果更促使多量的排泄，到后來完全失去監察能力，這時癌細胞可以毫不受約束地繁殖下去。可見癌癥的臨床病害，異常的甲基轉移復合酵素是一個很重要的因素，但是天然化學監察能力的破壞也是一個很重要的因素。所以要有效的克服癌癥必須要同時顧及這兩種因素，即要抑制異常甲基轉移復合酵素，也得減低病人過度排泄天然抗癌化學物質，這樣才會收到事倍功半的效果。從尿精制的抗癌制劑，細胞分化劑[(Cell Differentia-tionAgent)簡稱CDA]很明顯兼顧到這兩種因素，病人過量排泄低分子量代謝物慢慢減少，等到病情好轉也就恢復到正常人的狀態(文獻25)。病人之所以排泄過量低分子量代謝物質可能是發炎的結果，有發炎的癥狀就有過度排泄現象(文獻2、3、10)。發炎的結果促使巨噬細胞產生惡病質素(cachectin)，惡病質素的生理作用導致病人過度排泄。急性發炎因為很快恢復正常，對癌癥的形成沒有很大關系。慢性發炎持久的影響才會幫助促成癌癥，愛滋病人及B型肝炎病人到后來往往會變成癌癥病人原因在此。癌細胞本身也構成慢性發炎的病源，癌細胞越繁殖，發炎的現象越厲害，過度排泄的結果也就明顯。有效控制過度排泄對癌癥的治療實際上是一個重要的課題，但是完全被忽略了。已知的細胞毒藥物本身會促進過度排泄(文獻26)，對天然監察沒有保護反而有破壞作用，不難想象細胞毒療法的成功需要依賴把所有癌細胞消除干凈，否則病人經長期細胞毒藥物的破壞，沒有自衛能力去抑制殘余的癌細胞。相反的，從尿精制的抗癌制劑其中有效成分可以改善癌癥病人的過度排泄，病人的天然化學監察能力恢復后，就可以依賴本身的自衛能力來消除殘余的癌細胞，不用清除所有的癌細胞即可痊愈。這種尿精制抗癌制劑中的苯基谷氨酰胺就有改善癌癥病人過度的排泄的功能。雖然這個化合物本身對異常甲基轉移酵素沒有作用，對癌細胞也沒有直接抑制作用，但是由于能夠防止過度排泄抗癌物質，對人或動物的天然化學監察能力起到保護作用，對癥狀較輕的癌癥病人也有醫療效果(文獻25)。另外，對動物的癌癥形成有顯著的預防作用(文獻16、35)。動物細胞的癌癥形成過程在細胞培養液比在動物體內容易完成(文獻36、39)，因為動物有天然的化學監察能力，要一段很長的促進時期消磨這種自衛能力，癌細胞才可以繁殖起來。一般來說，像巴豆油這種發炎促進物質可以縮短促進時期，像苯基谷氨酰胺可以保護化學監察的則可預防癌癥的發生。
分化輔助劑分化引導劑可以直接或間接將癌甲基轉移復合酵素的異常因素消除，因而引導癌細胞進行終末分化。甲基轉移復合酵素是由三個成員酵素結合而成的，我們發現各成員酵素的抑制劑往往可以增進分化引導劑消除異常因素的功能，雖然這些抑制劑本身沒有明顯的分化促進作用，廖氏等人把這種化合物命名為分化輔助劑(Helper Inducer)(文獻32)。MAT的競爭性抑制劑如正丁酸、苯丁酸、苯醋酸等都有明顯的分化幫助劑活性。一般來說分化輔助劑如苯醋酸是很容易得到，毒性又低，用于減低分化引導劑的需求量，是有醫療效益的，因為分化引導劑實在很珍貴且不容易大量制取。早期的癌癥患者體內原有的分化引導劑成份還未消失太多，單單用分化輔助劑也可達到醫療效果。用以治療腦癌尤其適當，腦部結構上比較特殊，有血腦障礙保護內在的分化引導劑成份的消失不致很快，所以單用苯醋酸這種容易通過血腦障礙的分化輔助劑就會有很好的醫療效果(文獻38)。分化輔助劑之用于治療腦癌值得推薦，因為細胞毒藥物大部分不能達到腦部。
分化療法的醫療效果由臨床經驗得知，分化療法是相當值得追求的療法。抗癌素(Antineoplastons)在1985年前，Burzynski曾經用來醫治晚期癌癥病人，60％的病人有好轉現象，其中三分之一生命期超出五年進入無病狀態(文獻5、6、7)，這類藥物最主要的優點是沒有不良的副作用。其實所有分化治療劑原始的醫療靶或許不盡相同，到后來仍然要透過修正異常甲基轉移復合酵素達到引導癌細胞分化的結果，比如干擾素和維生素甲酸就是依賴這些藥物引導癌細胞產生類似抗癌素產物來作用在異常甲基轉移復合酵素而達成癌細胞的終末分化，這種類似抗癌素之產物很可能是寡腺嘌呤核苷酸(oligoisoadenylate)。干擾素對多毛白血病(文獻37)和維生素甲酸對急性早幼粒細胞白血病(文獻)是公認這些癌癥的最好療劑，雖然復發的問題還沒有完全解決(文獻1、34)。
本發明的目的在于基于癌癥是一系列相當復雜的疾病，但其有一共同特征，即所有的癌細胞都具有持續不斷的分裂能力，且無法進行終末分化，本發明人已經發現異常甲基轉移復合酵素是構成癌癥這一共同特征的最主要病因。針對這病因尋求癌癥的治療與預防，即利用正常人體本能具有抗癌能力的物質制備抗癌、防癌的藥物，改變異常甲基轉移復合酵素之異常性達到引導癌細胞終末分化而不再繼續分裂直至死亡，且不具備不良的副作用。
本發明是這樣實現的，基于人類多年采取相對下策的辦法治療癌癥而效果不顯著，應該把治療的目標放在“甲基轉移復合酵素“這個治本的療法上。因為癌細胞是異常的甲基轉移復合酵素促成的，用藥物抑制這異常酵素，則對已發病的有治病的功效，末發病的有預防的功效，此療法兼具上醫和中醫的優良療法。由于正常人尿中具有并排泄少量可引導癌細胞進行終末分化的化學物質，本發明即是用正常人的尿進行提練精制成可以將癌細胞的異常甲基轉移復合酵素改正、能引導癌細胞進行終末分化而不再繼續分裂的細胞分化劑及其制劑，以達到醫療和預防的目的。本發明的制劑可以有選擇地抑制異常的甲基轉移復合酵素，結果癌細胞就和正常細胞一樣被引導進行分化，因為正常的甲基轉移復合酵素沒有異常因素，所以正常細胞的生長和功能不會受到這些抗癌物質的影響，在抗癌化學藥物中，這是唯一有特異選擇性的，是一種順乎自然治本療法，而且健康人本來也是依賴這些化學物質來對抗癌癥的發生。也就是說這是人類固有的抗癌方法。抗癌化學藥物中很難找出可以駕乎其上的藥物。
本發明的細胞分化劑的制備是首先收集具有一定肌酸酐濃度的正常人尿，經過吸附劑吸附和用有機溶劑進行萃取、回收純化而成制劑，本發明的制劑是一種針劑，亦可制成膠囊等劑型。
本發明與已有技術相比，其優點在于本發明利用人體本能的抗癌物質制造治療和預防癌癥的藥物，從根本上使癌細胞分化而不再繼續分裂以達到治療的目的，故本發明是一種治本的有效方法，而且本發明的藥物沒有任何不良的副作用。
圖1為本發明的細胞分化劑制造流程2為本發明的細胞分化劑的凝膠過濾分析3為尿紅素和維生素B2作為分化輔助劑濃度與減低指數的關系4為尿紅素和維生素B2對TRNA甲基轉移酵素抑制能力與其濃度的關系5為尿紅素和維生素B2對分化引導劑的增進作用6為本發明的CDA-II和胸苷配合使用的抗癌作用圖結合實施例進一步說明附圖A.制備本發明包括尿的收集、過濾、吸附、溶劑萃取和干燥，用無熱原水溶解作為CDA-II的原料藥。
1.細胞分化劑的制備利用桶收集人尿，桶內放入鹽酸，約每20kg人尿用1kg 1N鹽酸，上述促進分化的活性至少可保持一個月不受破壞，PH值調整到2后，尿液先用尼龍布粗濾，再經常規細濾將分子量大于10000道耳者的物質除去。萃取時使用不銹鋼濾斗，濾斗上放置裝有吸附劑XAD-16的布袋，使用前先用2倍(v/w)的乙醇沖洗，再用2倍(v/w)的去離子水沖洗掉乙醇，重復二次。被吸附在XAD-16的物質用4倍溶量(v/w)的去離子水沖洗后，再用2倍溶量(v/w)的乙醇溶解出來。中和乙醇抽取液后，用干燥機把乙醇蒸發干凈，干燥桶內溫度保持在50℃以下。干燥后的物質用無熱原水溶解出來作為CDA-II的原料藥。
乙醇抽取后的吸附劑用2倍溶量(v/w)的去離子水沖洗后，可重復使用，一直到吸附能力減低至新吸附劑吸附能力的70％左右再更換新吸附劑，一般說，XAD-16約可重復使用200次以上。
由于人體每天排泄的肌酸酐(crcatinine)有一定量，尿中的固體濃度大約與肌酸酐成正比，故尿中有效化學物質的定量總是以肌酸酐作基礎較為可靠。作為原料所收集的尿液，其肌酸酐濃度在1.2-3.7克/公升間，平均為2.4±0.6克/公升。CDA-II產率在通過吸附劑的首一百次約為0.51±0.17克/克肌酸酐，而尿的固體成分約為46.7克/克肌酸酐，所以所制得的CDA原料藥之產率是固體成分的1.1％左右。
2.細胞分化劑注射液的制備CDA-II注射液的最后濃度約為50±2克/毫升，而原料藥的濃度一般在250毫克/毫升以上。故原料藥需進行稀釋，首先將原料藥用去熱原水稀釋后，經一系列的過濾，先用慢速濾紙過濾，再依序經1μm和0.45μm濾孔的微孔濾膜過濾，濾液用去熱原水調到適當濃度，在8小時內經0.22μm濾孔的過濾器，在無菌操作室(100級凈化間)內完成過濾去菌。去菌后馬上灌裝制成100毫升或250毫升分化劑注射液制劑。
3.細胞分化劑膠囊的制備CDA-II可以用來制成膠囊制劑，即將上述原料藥經微孔濾膜過濾的過濾液再用冷凍干燥方法干燥成固體。干燥固體研成粉末后，用自動膠囊機裝成膠囊制劑，并裝入鋁箔密封，最后用放射線滅菌。
B.本發明之細胞分化劑分析4.細胞分化劑抗癌活性分析細胞分化劑的抗癌效力乃是根據有效成分對癌細胞異常甲基轉移復合酵素的抑制，因而引導癌細胞進行終末分化以至停止細胞分裂，即細胞分化劑的活性具有抑制癌異常酵素MATLT的作用，可引導HL-60癌細胞的分化，以及抑制人類乳癌細胞群的形成，這些活性的測定方法已發表(文獻19，27，29)。本發明取三批CDA-II制劑分析其抗癌活性，其操作如后使用CDA-II之注射液制劑，所用劑量為1毫克/毫升。MATLT是由HL-60癌細胞制取，首先將沉淀的細胞懸浮于0.05M Tris，PH7，0.5mM MgCl2，然后用攪勻器將細胞膜打碎。酵素抽取液用高速離心法分離出來，再經纖維素層析法以KCl梯度溶液將MATLT溶解出來并予以精制(文獻19)。MATLT活性的測定是在0.05毫升的反應液包括0.05M Tris，PH8.2，0.15M KCl，15mM MgCl2，5mMDTT，2mM ATP及1μM3H-CH3]甲硫胺酸，37℃反應30分鐘。將反應液酸化，然后全部移至1平方英寸的磷酸纖維紙上，這些紙一起在燒杯內多次用5mM磷酸緩沖液，PH7，沖洗掉未反應的[3H-CH3]甲硫胺酸，最后測定被吸附之[3H-CH3]AdoMet的放射線，籍此決定MATLT的活性(結果見表1)。
HL-60癌細胞的終末分化按照NBT+測定方法(文獻27)進行。先將HL-60細胞稀釋培養，每一培養瓶置入10毫升起始細胞，其濃度為1.5×105細胞/毫升，對比樣品及含CDA-II的培養瓶均經過96小時培養后，取出一小部分將細胞用離心楊沉淀下來，這些細胞用NBT試劑在37℃作用半小時后，取出一小滴放置在細胞計數器并在顯微鏡下計數全部細胞數及染成黑色(NBT+)的細胞數。NBT+所占的百分比即CDA-II引導分化的活性(表1)。
CDA-II抗癌活性的另一指標是對HBL-100乳癌細胞群的抑制，先將等比級數增加的乳癌細胞用生理鹽水沖洗一次，然后加入約2毫升的0.05％胰蛋白酶-0.53mM EDTA培養液，在37℃下培養10分鐘。先測定細胞濃度，再取部分稀釋成3×103細胞/毫升，取0.5毫升稀釋液加入4.5毫升對比液或含有CDA-II的培養液在37℃下培養。五天后，將培養液倒出，用生理鹽水沖洗一次，然后用甲醇固定15分鐘，固定后的細胞群用20倍稀釋的Giemsa染色液浸泡30分鐘。倒出染色液，經水洗烘干后，在解剖鏡下計數細胞群數目，籍此決定CDA-II的抗癌活性(表1)。
表1細胞分化制(CDA-II)的抗癌活性％MAT抑制％NBT+ ％乳癌細胞群抑制制劑批號0149 58 1000255 53 1000350 54 100注CDA-II制劑為注射液制劑，所用劑量濃度為1毫克/毫升。MATLT由HL-60癌細胞如前述方法經DEAE-cellulose純化制備，活性測定也按前法(文獻(19，PH60癌細胞的終末分化乃根據NBT+測定方法測定(文獻27)。至于癌細胞群形成的抑制作用則采用人類HBL-100乳癌細胞的培養方法(文獻29)。
5.細胞分化劑的有效成分分析將本實施例之2制得的CDA-II細胞分化劑注射液冷凍干燥，濃縮成200毫克/毫升。取5毫升濃縮液加入Bio-Gel P2的層析管柱(4.1厘米×44厘米)，然后用蒸餾水溶離，每7分鐘自動收集一管，每管10毫升。完成分離后，從每支管取出25微升，加水稀釋至1毫升，測定A255的吸光度。另外也從每支管取出25微升作MATLT活性抑制的測定，MATLT活性的測定是根據本實施例4所述方法。然后根據A255的吸光值把收集管分割成如圖2所示的8個部分，將每一部分籍冷凍干燥把水分完全蒸干，測定干燥量以決定重量百分比分布。干燥固體則重新溶解于蒸餾水，用以測定HL-60癌細胞的分化活性，這活性用％NBT+來表示，分化活性的測定是根據本實施例4所述方法進行，其結果如圖2所示。
細胞分化劑抗癌的有效成分中，最重要的當然是可以引導癌細胞分化的引導劑。其分離純化及作用機制已發表(文獻27、28、29和30)。分化引導劑有兩種主要的化學成分；一為與色素結合的酸性肽類，簡稱PP-O，一為有機酸類，簡稱OA-0.79。PP-O是在如圖2所示分割之第一部分，OA-0.79則在第5和第6部分。要特別說明的是細胞分化劑之分化活性的表現并不是分化引導劑單獨作用所致，而往往是由于和分化輔助劑協同所表現出來的活性。分化輔助劑是細胞分化劑的主要化學成分，因分化引導劑的含量極少，且其化學結構仍屬未知，因為還沒有精純到可以決定的程度。就如圖2所示分化引導的活性和MATLT抑制的活性非常吻合，不過有些部分如圖2的第2和第3部分，雖有明顯的MATLT抑制活性，但并沒有引導癌細胞分化的活性。這部分可能只有分化輔助劑而沒有分化引導劑，所以不具有引導癌細胞分化的活性。
分化輔助劑是甲基轉移復合酵素的單獨成員酵素的抑制劑(文獻32，可以協助分化引導劑將異常甲基轉移復合酵素改正為正常酵素，因而促進分化引導劑的分化功能。
CDA制劑中已知為MAT抑制劑的有苯醋酸，吲噌醋酸和馬尿酸。苯醋酸很可能是苯基谷氨醯胺在干燥過程時的水解產物，是分布在第6和第7部分，用C18HPLC可以測定出來，吲噌醋酸也在這部分。馬尿酸則是第5部分的主要成分。這些MAT抑制劑要達到0.5減低指數(即分化引導劑有效劑量減半)的濃度各為4mM苯醋酸，8mM馬尿酸和0.95mM引噌醋酸。作為分化輔助劑甲基轉移酵素的抑制劑比MAT的抑制劑有效得多，前者往往只要有后者千分之一或更少的量即可達到同樣的效果。CDA制劑中已知有兩種甲基轉移酵素的抑制劑，都具有很好的分化輔助劑活性。這兩個成分是維生素B2和尿紅素。維生素B2分布在圖2第8部分的后半部分(文獻31)，該成分再經C18HPC，可得很精純的維生素B2，含量約為0.04％左右，尿紅素是在第6和第7部分，含有尿紅素的流分再經Sephadex SH管柱層析法和矽膠薄層層析法可以獲得很精純的尿紅素，含量為CDA-II制劑的0.5％。
6.尿紅素和維生素B2的分化輔助劑活性的測定分化輔助劑活性的測定是依據本發明人等所設計的方法(文獻32)。用培養的HL-60白血癌細胞，以NBT的定量方法來測定癌細胞的分化程度。開始是將HL-60細胞稀釋培養，每一培養瓶含有10毫升起始細胞液，其濃度為1.5×105細胞/毫升，每組四個培養瓶作對比，只添加維生素甲酸分化引導劑，劑量調節到可引導15％至60％之間的NBT+細胞，另加一個只加溶劑的對比瓶。維生素甲酸是溶于甲醇，但甲醇的總加入量不得超過2％，這對癌細胞的分化不會有影響。其它每組同樣有四個培養瓶，但用比較低劑量的維生素甲酸，另加一個只有溶劑的對比瓶，每一組再加不同劑量的分化輔助劑。經96小時培養后，測定每一瓶的細胞數目，并按本實施例4所述方法，進行NBT測定。一般說，HL-60細胞的自然分化(即沒有任何添加劑)總是低于4％。在只有分化輔助劑組的劑量范圍內，細胞分化多半不會超過10％。每一瓶的NBT+數值都需要減除對比值的基數。
將劑量與NBT+之相對關系劃出曲線，籍此可獲得ED50值，即NBT+50％所需的分化引導劑劑量。從這些ED50值可計算出分化輔助劑的減低指數，減低指數＝有分化輔助劑的ED50/單獨引導劑ED50。減低指數越低，分化輔助劑的功能越高。其結果如圖3所示，維生素B2和尿紅素要達到0.5減低指數的濃度分別為3.0M和1.8M，比上述的MAT抑制劑活性高出許多。
7.尿紅素和維生素B3對tRNA甲基轉移酵素的抑制活性
tRNA甲基轉移酵素是由HL-60癌細胞制備，根據本實施例4所示的高速細胞抽取液。先將細胞抽取液調到PH5，沉淀的蛋白質用離心機分離出來，再溶于0.05M Tris，PH7.8，0.5mM MgCl2與5mM HSCH2CH2OH組成的混合液。再經過DEAD-cellulose層析法，以KCl梯度沖提液將tRNA甲基轉移酵素溶離出來精制(文獻20)。tRNA甲基轉移酵素活性的測定在0.25毫升反應液內進行，其中包括0.05M Tris，PH7.8，0.1M，NH4Cl，0.04M NH4F，0.5mM MgCl2，5mM DTT，20微克大腸桿菌BtRNA，0.25μCi[3H-CH3]AdoMet，以及25微克酵素。反應在37℃進行3鐘。其結果如圖4所示，尿紅素和維生素B2具有抑制tRNA甲基轉移酵素的活性，不過抑制甲基轉移活性的有效劑量要比分化輔助劑的有效劑量高出很多，這可能和測這些不同活性的理化環境有關，因不同的理化環境(比如鹽的濃度)會影響化學物質和酵素的有效接觸。盡管敏感度有相當差異，不同的甲基轉移酵素的抑制劑和分有效的分化輔助劑。還發現其它甲基轉移酵素的抑制劑，例如溴化乙錠和海康松(文獻20)，它們和尿紅素及維生素B2一樣有很好的分化輔助劑活性。這兩種甲基轉移酵素的抑制劑要達到0.5減低指數的濃度各為0.95μM溴化乙錠和2μM海康松(文獻20)，它們和尿紅素及維生素B2一樣有很好的分化輔助劑活性。這兩種甲基轉移酵素的抑制劑要達到0.5減低指數的濃度各為0.95μM溴化乙錠和2μM海康松。所以甲基轉移酵素的抑制劑當作有效的分化輔助劑應該不容置疑的。
8.分化輔助劑的促進分化作用的分析分化輔助劑不但可以降低分化引導劑的有效劑量，又可促進分化程度的完全。
培養HL-60癌細胞，其培養的起始濃度為1.5×105細胞/毫升。培養瓶分成三組，每組4至5瓶，其中一瓶作為無添加劑的對比。一組加入維生素甲酸0.025到0.15μM作為對比組；另外兩組加入4μM的尿紅素和維生素B2。培養96小時后，作NBT測定。每個測定值均需減除無添加劑的對比基數。
其結果如圖5所示，單用分化引導劑分化程度最高只能達到85％左右，如有尿紅素或維生素B2幫助，則分化程度可達100％。促進分化程度的完全在醫療上可能比降低分化引導劑的有效劑量更為重要。
已知維生素甲酸作為抗癌劑，雖其療效極佳(文獻14、42)，可是不久癌細胞又會復發(文獻34、1)。復發和單用分化引導劑分化不完全有關，其原因是單用分化引導劑會造成傷害，使細胞不能完成分化程序。由于分化的程度需要經過漫長的兩個細胞分裂周期(文獻43、44、45)，如細胞受到傷害而停頓就不能完成終末分化。異常甲基轉移酵素一旦被分化引導劑修正去掉癌蛋白因素，復合酵素會分解成單獨三個成員酵素，有些甲基轉移酵素成單體的時候會表現分解核酸的活性而造成傷害細胞(文獻18)，如傷害嚴重則細胞死亡，若傷害不夠嚴重，經過一段長時間的停頓和修復且臨床的維生素甲酸無法維持有效濃度時，這些修復復活的細胞就會回復原狀造成復發的結果。所以分化輔助劑是分化療法不可缺的成分，雖其重要性或許比不上分化引導劑。
細胞分化劑除了必要的分化引導劑和輔助劑外，還有另一種成分對癌癥醫療也相當有幫助，即抗惡病質劑。發現苯基谷氨醯胺可以對抗癌癥病人惡病質癥引起的過渡排泄(文獻26)；這化合物可以恢復病人化學監察本能，對早期的病人確實有醫療效果(文獻26)，尤其對癌癥的預防效果更明顯(文獻16、35)。苯基谷氨醯胺是圖2第4部分的主要成分。總之，細胞分化劑有許多必要的化學成分，互相協助來達到良好的醫療作用。
9.細胞分化劑與其它抗癌化學療劑的協助抗癌作用癌癥致病的因素有多種，當然異常甲基轉移復合酵素是其中很重要的病因，其它癌基因的表現也是促成癥狀的重要因素，雖然我們相信解決異常甲基轉移復合酵素已除去了一個大害，但更相信多方面的夾擊會取得更好的療效。
癌細胞有非常活躍的甲基轉移復合酵素，如單用化學藥物抑制DNA合成會引起過度甲基轉移，這是促成基因重復合成的原因。基因重復合成會導致抗藥物細胞的形成(文獻33)，這是化學療法失敗的一個很重要因素。用細胞分化劑抑制甲基轉移復合酵素可以減低抗藥細胞的形成，有助于癌癥的治療，事實亦證明細胞分化劑對某些抗癌藥物確實有協助的治療效果。如本發明利用CDA-II和胸苷的組合用藥(圖6)。
附錄專業名詞縮寫(1)AdoHcyS-腺苷高胱胺酸(S-adenosylhomocysteine)(2)AdoMetS-腺苷甲硫胺酸(S-adenosylmethionine)(3)CDA細胞分化劑(cell diffentiation agent)(4)DTT二硫蘇糖醇(dithiothreitol)(5)HPLC高效液相層析(high performance liquid chromatography)(6)MAT甲硫胺酸腺苷轉移酵素(methionine adenosyltransferase)(7)NBT硝基蘭四唑(nitroblue tetrazoliun)(8)SAHHS-腺苷高胱胺酸水解酵素(S-adenosylhomocysteine hydrolase)(9)XAD吸附劑
權利要求
1.一種引導癌細胞分化之藥物劑的制備方法，其特征在于用于治療與預防癌癥，以癌細胞中異常甲基轉移復合酵素為藥靶的細胞分化劑及其載劑是從人尿提練精制而成。
2.根據權利要求1所說的一種引導癌細胞分化之藥劑的制備方法，其特征在于藥物是制成針劑、膠囊等劑型。
3.根據權利要求1所說的一種引導癌細胞分化之藥劑的制備方法，其特征在于(1)收集新鮮人尿，其中肌酸酐濃度在1.2-3.7克/分升間；(2)通過吸附劑XAD-6或類似功能的吸附劑；(3)經乙醇或類似功能的有機溶劑萃取；(4)回收和純化細胞分化劑。
4.根據權利要求1所說的一種引導癌細胞分化之藥劑的制備方法，其特征在于細胞分化劑最好與胸苷合并使用。
全文摘要
本發明涉及一種治療癌癥藥劑的制備。本發明是由新鮮人尿提練純化的細胞分化劑CDA－Ⅱ。本發明揭示CDA－Ⅱ可以解除癌細胞甲基轉移酵素異常狀態,本發明是一種抗癌新方法,旨在去除病因,可促進癌細胞的終末分化而達醫療的顯著效果。本發明藥劑在治療上有特異的選擇性,且無不良副作用,其有效成分包括分化引導劑、分化輔助劑和抗惡病質劑,這些有效成分的相互協助可達最有效的療效。CDA－Ⅱ和其它抗癌藥物如胸苷聯合使用,其抗癌效果更佳。
文檔編號A61K9/48GK1172650SQ9610904
公開日1998年2月11日 申請日期1996年8月2日 優先權日1996年8月2日
發明者廖明征 申請人:張銘烈