專利名稱：醫(yī)用膠原蛋白的無變性提取方法及變性應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及外科止血、愈傷材料的制備方法，具體地說是指醫(yī)用膠原蛋白的無變性提取方法及無變性應(yīng)用。
現(xiàn)有的膠原蛋白的提取多是采用蛋白酶的消化或化學(xué)交聯(lián)的方法制備，這些方法的應(yīng)用使膠原蛋白的組織相溶性降低，而且有的膠原經(jīng)變性提取后還引起人體的免疫反應(yīng)，使膠原蛋白在臨床上促使凝血和愈傷的功能受到了限制。
本發(fā)明的目的提供一種醫(yī)用膠原蛋白的無變性提取方法及無變性應(yīng)用，即從哺乳動物的結(jié)締組織中通過不變性的方法，提取分子結(jié)構(gòu)沒有破壞的膠原蛋白，以其作為原料制成凍干的海綿制劑，作為外科止血、愈傷的材料，提高了膠原蛋白的生物學(xué)作用、組織相溶性，可避免外傷或手術(shù)中過多血液的流失，同時促進傷口愈合。
實現(xiàn)本發(fā)明的目的是藉以下方式得以實施的選用新鮮哺乳動物的結(jié)締組織，用一定酸度的有機酸溶解，離心分離得沉淀A，于上清液加入NaCL，再離心分離得沉淀即膠原A；將沉淀A再溶于有機酸溶液中，離心上清液中再加入NaCL，離心得沉淀，即膠原B；將膠原A和膠原B按不同比例混勻，在相應(yīng)的酸溶液和PBS中透析至平衡即可。
所述的酸度為pH2-4；所述的有機酸包括檸檬酸、乳酸、蘋果酸、丙二酸或乙酸等；所述的NaCL的量為于上清液中濃度為5-20％(重量百分比)；所述的膠原蛋白A、B的混合比例為10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1或1∶1。
本發(fā)明的方法在實施中，首先將新鮮哺乳動物的結(jié)締組織(如牛皮、豬皮、豬腱、牛腱)用去離子水清洗，打碎后，在有機酸(檸檬酸、乳酸、蘋果酸或丙二酸或乙酸等)的溶液中(pH2-4)充分溶解，離心分離得沉淀A；于上清液中加入NaCL，使溶液中NaCL終濃度為5-20％(重量百分比)，靜置后，再離心分離得沉淀，即膠原A，將沉淀A再溶于pH2-4的上述有機酸中充分溶解，離心分離得沉淀即膠原B，膠原A和膠原B可按10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1或1∶1的比例混勻，在PH2-4的有機酸性溶液中和PH7.2的PBS緩沖液中交替進行透析致平衡。
整個過程要求在無菌條件下進行，溫度最好控制在0～4℃。
將0.5～1％膠原蛋白置入平底槽板內(nèi)，于-50℃下放置4小時后真空干燥機內(nèi)干燥48小時，最后升溫達40℃，凍干成片狀的海綿制劑，經(jīng)切割所需產(chǎn)品大小、包裝、密封，γ射線0.5-2.0Mrad無菌消毒后用于外科的止血、愈傷。
在膠原蛋白的提取和止血劑的制備過程中，不加酶和交聯(lián)劑的作用，也不加入任何使蛋白變性的化學(xué)試劑及滅菌而不變性是本發(fā)明的特點。
因此，在本發(fā)明中，通過以上所述的技術(shù)方案達到了本發(fā)明的目的之一即提供醫(yī)用膠原蛋白的無變性提取方法，籍用此方法得到的無變性膠原蛋白具有良好的止血作用，促進肉芽生長和傷口的愈合，且具有良好的組織相溶性，且無過敏反應(yīng)發(fā)生。
另外，通過以上所述的技術(shù)方案達到了本發(fā)明的目的之二即提供醫(yī)用膠原蛋白的無變性應(yīng)用，即對無變性提取方法得到的無變性膠原蛋白進行嚴格的物理處理，如在特定溫度、特定時間內(nèi)放置，干燥一定時間，升至特定溫度，并用特定強度的γ射線消毒處理，由此得到的是一種無變性膠原蛋白制劑，將通過無變性提取方法獲得的無變性膠原蛋白制成無變性膠原蛋白制劑，進而實現(xiàn)本發(fā)明的目的之二將此醫(yī)用膠原蛋白的無變性應(yīng)用，達到提高了膠原蛋白的生物學(xué)作用、組織相溶性，可避免外傷或手術(shù)中過多血液的流失和促進傷口愈合的作用。
實施例1選取新鮮的豬皮，去除脂肪、表面筋膜和其它雜質(zhì)，用去離子水清洗2-3次，用粉碎機碎成小塊，在0.02ml/l檸檬酸溶液中充分攪拌48-72小時，以20000轉(zhuǎn)/分的速度離心分離30分鐘，得沉淀A，留用；上清液中加入NaCL使其終濃度為20％，靜置后再離心離得沉淀此為膠原A，再將沉淀A溶解在0.02ml/l的檸檬酸溶液中，充分攪拌24小時，以20000轉(zhuǎn)/分的速度離心分離30分鐘，上清液中加入NaCL使終濃度為20％，靜置8小時后離心分離得沉淀—此為膠原B。
將膠原A和B按10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1 1∶1的比例混勻，將凍膠狀膠原裝入透析袋，分別在0.02％mol/l檸檬酸溶液中和pH7.2的PBS中反復(fù)透析至平衡。
整個過程在無菌條件下在0-4℃進行。
將0.5～1％上述膠原蛋白置入平底槽板內(nèi)，于-50℃下放置4小時后真空干燥空干燥機內(nèi)干燥48小時，最后升溫達40℃。
經(jīng)切割所需產(chǎn)品大小、包裝、密封，γ射線0.5-2.0Mrad無菌消毒后即可使用。
實施例2選取新鮮牛腱，去除脂肪，表面筋膜和其它雜質(zhì)后，用去離子水洗滌2次，打碎成小塊，在1.0％蘋果酸溶液中攪拌4小時，用20000轉(zhuǎn)/分的速度離心分離30分鐘得沉淀A，留用。在上清液中加入NaCL使終濃度為15％，靜置8小時，離心(20000轉(zhuǎn)/分)得沉淀—此為膠原B。
以下處理方法與實施例1相同。
權(quán)利要求
1，醫(yī)用膠原蛋白的無變性提取方法，其中，選用新鮮哺乳動物的結(jié)締組織，用一定濃度的有機酸溶解，離心分離得沉淀A，于上清液中加入一定量的NaCL；離心分離得沉淀，即膠原A；將沉淀A再溶于有機酸溶液中，離心分離，上清液中再加入一定量的NaCL，離心得沉淀，即膠原B；將膠原A和膠原B按不同比例混勻，在有機酸溶液和PBS溶液中透析至平衡即可。
2，權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的有機酸是檸檬酸、乳酸、蘋果酸、丙二酸或乙酸，pH值控制在2-4范圍內(nèi)。
3，權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的NaCL的加入量為在上清液中終濃度為5-20％(重量百分比)。
4，權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的膠原蛋白A、B的混合比例為10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1或1∶1。
5，權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的PBS溶液為pH值7.2的PBS溶液。
6，醫(yī)用膠原蛋白的無變性應(yīng)用，其中，將無變性提取方法得到的無變性膠原蛋白進行嚴格的物理處理，如在特定溫度、特定時間內(nèi)放置，干燥一定時間，升至特定溫度，并用特定強度的γ射線消毒處理，由此得到的是一種無變性膠原蛋白制劑。
7，權(quán)利要求6所述的醫(yī)用膠原蛋白的無變性應(yīng)用，其中，所述的特定溫度、特定時間為于-50℃下放置4小時。
8，權(quán)利要求6所述的醫(yī)用膠原蛋白的無變性應(yīng)用，其中，所述的干燥時間為于真空干燥機內(nèi)干燥48小時。
9，權(quán)利要求6所述的醫(yī)用膠原蛋白的無變性應(yīng)用，其中，所述的γ射線的特定強度為0.5-2.0Mrad。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種醫(yī)用膠原蛋白的無變性提取方法及無變性應(yīng)用，首先，選用新鮮哺乳動物的結(jié)締組織，用一定濃度的有機酸溶解，離心分離得沉淀A，于上清液中加入一定量的NaCl，離心分離得沉淀即膠原A；將沉淀A再溶于有機酸溶液中，離心分離，上清液中加入一定量的NaCl，離心得沉淀，即膠原B，將膠原A和膠原B按不同比例混勻，在有機酸溶液和PBS溶液中透析至平衡即可；其次，將無變性提取方法得到的無變性膠原蛋白進行嚴格的物理處理，由此得到的是一種無變性膠原蛋白制劑。
文檔編號A61K38/39GK1155549SQ9610033
公開日1997年7月30日 申請日期1996年1月23日 優(yōu)先權(quán)日1996年1月23日
發(fā)明者孫書臣 申請人:孫書臣