含有水溶性聚合物的bdnf與nt－3的結合物的制作方法

專利名稱：：含有水溶性聚合物的bdnf與nt－3的結合物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一類新的BDNF與NT-3的衍生物以及制備上述衍生物的方法，其中一種BDNF或NT-3的分子被連接到一種水溶性聚合物上。
背景技術：
：由于重組DNA技術發展的結果，目前作為治療用的蛋白質能夠以合適的形式足夠大量地得到。上述蛋白質的化學衍生物可能會有效地阻止蛋白酶與該蛋白質骨架自身發生接觸，從而防止降解。附加的優點可能包括在某種情況下提高該治療蛋白質的穩定性和循環時間以及降低免疫原性。但應當指出的是一種具體蛋白質的改性效果是無法預測的。有一篇描述蛋白質改性以及融合蛋白的綜述性文章，該文章發表在由英國倫敦Mediscript，MountviewCourt，FriemBarnetLane出版的FocusonGrowthFactors34-10(1992)上，作者為弗蘭西斯。聚乙二醇(“PEG”或“peg”)為一種如上所述的已經用于治療蛋白質產物(“聚乙二醇化的蛋白質”)的制備(“聚乙二醇化作用”)的化學部分(moiety)。例如，一種聚乙二醇化的腺苷脫氨酶Adagen現已獲準用于治療嚴重的組合免疫缺陷性疾病；聚乙二醇化的超氧物歧化酶已經用于治療頭部創傷的臨床試驗；聚乙二醇化的α干擾素已經用于治療肝炎的I期臨床試驗的測試；聚乙二醇化的葡糖腦苷脂酶以及聚乙二醇化的血紅蛋白現已報道正處于預臨床試驗。對于一些蛋白質而言，已經表明聚乙二醇的連接可以防止蛋白水解〔參見Sada等人，發酵生物工程雜志，71卷，137-139頁(1991)〕。對于某些聚乙二醇部分的連接方法而言，人們是可以得到的。上述方法可參見美國專利US4,179,337(Davies等人)以及美國專利US4,002,531(Royer)。而對于綜述性文章可以參見Abuchowski等人。其它水溶性聚合物也用于使蛋白質改性，諸如乙二醇/丙二醇的共聚物，羧甲基纖維素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1，3-二氧戊環，聚-1，3，6-三氧雜環己烷，乙烯/馬來酐共聚物，以及聚氨基酸(或者為均聚物，或者為隨機共聚物)。對于聚乙二醇而言，已經使用多種方法將聚乙二醇分子連接到蛋白質上。一般說來，聚乙二醇分子是通過在該蛋白質中發現的一個活性基團連接到蛋白質上的。氨基(諸如那些在賴氨酸殘基或N-末端處的氨基)對于這種連接是非常便利的。例如，上述Royer的專利指出采用還原性烷基化作用將聚乙二醇連接到一種酶上。公布于1993年4月28日的歐洲專利申請0539167指出采用PEG的imidate衍生物或同類的水溶性有機聚合物對帶有自由氨基的肽以及有機化合物進行改性。美國專利US4,904,584(Shaw)涉及通過活性氨基將聚乙二醇分子連接，從而對蛋白質的賴氨酸殘基進行改性。一種具體的已經經過化學改性的治療蛋白質為粒細胞集落刺激因子，例如G-CSF〔參見歐洲專利公開文本EP0401384，EP0473268以及EP0335423〕。另外一個例子為在美國專利US5,264,209(Mikayama等人)中所描述的聚乙二醇化的IL-6。公布于1985年9月11日的歐洲專利申請0154316也報道了將淋巴細胞因子與一種聚乙二醇的醛反應。蛋白質分子的聚乙二醇化作用通常會生成一種經化學改性的蛋白質分子的混合物。舉例說明，將含有五個賴氨酸殘基以及一個位于N-末端的自由氨基的蛋白質分子按上述方法反應時，可能會生成一種多相混合物，其中一些有六個聚乙二醇部分，一些有五個，一些有四個，一些有三個，一些有兩個，一些有一個，一些則一個聚乙二醇部分也沒有。在含有若干個聚乙二醇部分的蛋白質分子中，該聚乙二醇部分可能不會在不同分子中連接在相同的位置上。一般說來，上述方法在蛋白質與聚乙二醇分子間需要一個連接部分。由Delgado等人所描述的方法〔參見“通過Tresyl氯化物的活化作用偶聯PEG至蛋白質，及其在免疫親合細胞分配中的應用”，《使用液相體系分離，在細胞生物學與生物技術中的應用》，Plenum出版社，紐約，紐約州(1989)，211-213頁〕提及使用tresyl氯化物使得在聚乙二醇與蛋白質部分之間沒有連接基團。由于tresyl氯化物的使用可能會產生毒性副產物，所以這一方法可能很難用于生產治療產品中。Chamow等人〔參見BioconjugateChem.5133-140(1994)〕報道通過還原性烷基化作用采用單甲氧基聚乙二醇(“MePEG乙二醇”)的醛對CD4粘附素的改性。該作者報道經改性的CD4-IgG(至蛋白gp120)的體外結合量將按照與MePEG化程度的相應速度下降。目前已經知道腦衍生的生長因子(BDNF)與神經營養蛋白-3(NT-3)的屬于一類明顯的神經營養因子的多肽，該神經營養因子稱作神經營養蛋白，該神經營養蛋白包括神經生長因子(NGF)。上述因子促進神經元的存活及其功能的維持，并且是用于治療神經變性疾病的主要候選藥物〔參見Barde等人，《神經元》第2期1525-1534頁(1989)；Snider等人，《細胞》，第77期627-638頁(1994)〕。在專利文獻中已經描述了用于上述因子的鑒定以及重組生產的方法〔參見關于NGF的美國專利US5,169,762(Gray等人)，關于BDNF的美國專利US5,180,820(Barde等人)和美國專利US5,229,500(Barde等人)，以及關于NT-3的已經公開的PCT申請WO91/03569〕。發明概述簡而言之，本發明一方面提供一種BDNF與NT-3的衍生物，其中該BDNF或NT-3的多肽部分被連接到一種水溶性的聚合物上。更具體地講，本發明包括BDNF與NT-3的衍生物，其中該多肽與具反應活性的(即“經活化的”)水溶性聚合物部分反應，從而將該聚合物連接到多肽上。上述連接可能會通過此處所討論的反應，諸如酰基化作用或烷基化作用來實現。含有聚乙二醇或其它水溶性聚合物的酰基化作用或烷基化作用可能會在其主產物被單-或多-衍生化的條件下進行。多衍生作用通常涉及將聚乙二醇或其它水溶性聚合物連接至該多肽的賴氨酸殘基的ε-氨基上，并且還可能涉及將該聚合物連接到該多肽的N-末端上。單衍生作用優選涉及將該聚合物連接到一個BDNF或NT-3多肽部分的N-末端殘基的α-氨基上，從而保證選擇性地將一個水溶性聚合物部分連接到該多肽的N-末端上。上述作用基本上可以保證制備均一的聚合物/BDNF或聚合物/NT-3的結合物分子以及(如果使用聚乙二醇的話)制備聚乙二醇化的BDNF或NT-3分子，其中該分子是將該聚乙二醇部分直接偶聯到該BDNF或NT-3部分上的。在與已知有用的營養因子BDNF和NT-3同樣的用途上，本發明的BDNF與NT-3的衍生物也是有用的，它們尤其對于促進體外與體內神經元的存活與維持非常有用，并且在其它藥劑當中也可以用作治療人類神經變性疾病(諸如帕金森氏病，肌萎縮外側早老性腦硬化(ALS)，杭廷頓氏病，視網膜變性，末梢神經病，以及阿耳茨海默氏病等等)的潛在的治療劑。正如在下面進一步的實例中所顯示的，與本發明相對應的衍生物也能夠造成該分子通過腦組織的遷移能力的提高，從而使之更易于傳遞到定位于大腦中的治療目標。在另一方面，也即下文將會進一步詳細描述的方面，本發明提供一種用于制備上述種類的BDNF與NT-3的衍生物，其中水溶性聚合物，尤其是聚乙二醇被連接至位于該多肽(BDNF或NT-3)的N-末端α-氨基上，從而獲得一組均一的衍生化的分子，即含有上述聚合物的該多肽的結合物。附圖簡要說明圖1顯示出一個BDNF(或NT-3)酰化的實例，其中采用單甲氧基聚乙二醇醛的N-羥基琥珀酰亞胺基(NHS)活性酯生成一種聚乙二醇化的產物。在該附圖中，k代表與一分子的BDNF或NT-3反應的MPEG分子的個數，n代表用于該反應(其中對于分子量為100kDa的MPEG而言n＝2000，而對于分子量為2kDa的MPEG而言n＝40)中的MPEG的聚合程度，而m代表每個BDNF或NT-3分子的伯胺基的總數。圖2顯示出一個BDNF(或NT-3)非特異性的還原性烷基化作用的實例，其中采用單甲氧基聚乙二醇的活性醛生成一種聚乙二醇化的產物。在該圖中，k，m和n與上述定義相同。圖3顯示出一個于該多肽N-末端殘基α-氨基上BDNF或NT-3的位點特異的還原性烷基化作用的實例，采用單甲氧基聚乙二醇的活性醛生成一種基本上被單聚乙二醇化的產物(在該N-末端上)。圖4顯示出在一個外周神經功能喪失的體內動物模型中軸突被切(axotomized)的面部運動神經元的膽堿乙酰轉移酶(ChAT)的免疫組織化學〔參見Yan等人，J.Neurosci.14(9)5281-5291(1994)〕。將成年雌性大鼠右側的面部神經制成切片，并且每天按如下方式皮下治療該動物共7天PBS(A)，每千克體重5毫克未聚乙二醇化的BDNF，毫克/千克(B)，0.3毫克/千克在N-末端聚乙二醇化的BDNF(C)，或0.3毫克/千克隨機聚乙二醇化的BDNF(D)。在經PBS治療的大鼠中，軸突被切(axotomy)造成損傷的面部核(A組為在右手側的面部核)中ChAT免疫活性大大地降低。可是，用未聚乙二醇化的BDNF與聚乙二醇化的BDNF同時治療(B組，C組與D組)會減弱由損傷引發的ChAT免疫活性的降低。符號如下所示FN，面部核；py，錐體束(pyrimidaltract)；Sp5，三叉神經脊束核。尺寸線(在D組中)代表1毫米。圖5顯示出隨測試動物治療的劑量-應答曲線，該治療是在與圖4相同的軸突被切的面部運動神經元的模型中用未聚乙二醇化的BDNF與聚乙二醇化的BDNF進行治療的。該動物每天在指示的劑量下接受僅有溶劑(○)，含有未聚乙二醇化的BDNF(□)，N-末端聚乙二醇化的BDNF(●)或隨機聚乙二醇化的BDNF(■)的皮下注射，持續這一階段超過7天。所得的值以平均值±SEM(n＝4)的形式列出。上述數據先經ANVOA分析，隨后經Dunnettt檢驗。*，p＜0.05；**，p＜0.01，p為BDNF治療與溶劑的比值。圖6是一幅條形圖，該圖表明在向右側紋狀體的中心單次注射以后，未聚乙二醇化的BDNF(“NAT-BDNF”)或聚乙二醇化的BDNF(“PEG-BDNF”)向活鼠大腦中的滲透。二十小時以后，該動物被灌注4％的多聚甲醛。移出該大腦并將其制成切片，隨后采用Yan等人在Soc.Neurosci.Abs.201306(1994)中所描述的方法用一種對BDNF有特異性的抗體進行染色。BDNF滲透到大腦中的總量是通過所有的BDNF免疫活性組織切片的積分來定量的。所得的值以平均值±SEM(n＝4)的形式列出。上述數據經過Studentt檢驗分析。*，p＜0.0001。圖7是一幅條形圖，該圖表明連續地局部注射超過7天以后，未聚乙二醇化的BDNF與聚乙二醇化的BDNF向活鼠大腦中的滲透。該BDNF的滲透總量的定量與圖6中的相同。所得的值以平均值±SEM(n＝4)的形式列出。上述數據經過Studentt檢驗分析。*，p＜0.0001。圖8顯示出采用圖7所述的方法，在向活鼠大腦中的紋狀體灌注之后，未聚乙二醇化的BDNF(A組與B組)與聚乙二醇化的BDNF(C組與D組)通過腦組織向內部定位的多巴胺能神經元的逆向運輸。B組與D組分別為A組與C組方形區域內的放大。A組中的符號有下述含義SNC，致密黑質；SNR，網狀黑質；以及VTA，腹蓋區。D組中的橫線對于A組與C組表示500微米，而對于B組與D組表示200微米。發明詳述考慮到本發明實際用途為天然(例如自然形成的)序列的BDNF與NT-3，及其片段、前體與相當于衍生于該天然序列的一個或多個氨基酸的取代、缺失或添加，而所顯示的生物學性質類似于該天然序列的多肽分子，例如嵌合體，類似物與同類物的分子。因此，除非另作特別聲明以外，此處使用的術語“BDNF”與“NT-3”意指這些以上述任意形式存在的多肽。已知用于制備BDNF與NT-3的方法，其中特別是通過重組的方法，而該重組方法通常是獲得大量產物的最實際的方法。在科學與專利文獻中描述了一些有用的方法，其中包括那些列在上文所提及的美國專利US5,180,820與US5,229,500以及公開的PCT申請WO91/03569，所有的文獻在此引入作為參考文獻。對于本發明的實際用途而言，特別優選天然序列的BDNF與NT-3在原核細胞與真核細胞中進行重組表達，其中包括從人類的核苷酸序列表達的重組多肽產物(“r-HuBDNF”與“r-HuNT-3”)，也包括那些在細菌細胞中表達的位于N-末端殘基處有一個蛋氨酸殘基的重組的多肽產物(例如，“r-metBDNF”與“r-metNT-3”)。上述多肽的實例為具有顯示在SEQIDNO1(“r-HuBDNF”)，SEQIDNO2(“r-metHuBDNF”)，SEQIDNO3(“r-HuNT-3”)與SEQIDNo4(“r-metHuNT-3”)的序列中的那些物質。BDNF與NT-3的聚乙二醇化可以通過本領域公知的任意一種聚乙二醇化反應進行〔參見例如FocusonGrowthFactors3(2)4-10(1992)；EP0154316；EP0401384；及其它本文所引用的與聚乙二醇化作用有關的出版物〕。該聚乙二醇化作用優選是通過與一個具反應活性的聚乙二醇分子(或一種類似的活性水溶性聚合物)的酰化反應或烷基化反應來進行的。這些優選地用于聚乙二醇的衍生化作用的方法將在下面更為詳盡地描述。酰化作用通過酰化的聚乙二醇化作用通常涉及將一個聚乙二醇(PEG)的活性酯的衍生物與一個BDNF或NT-3的多肽反應。實際上，任何一種活性的PEG分子均可能被用于進行上述多肽的聚乙二醇化作用。一個優選的經活化的PEG的酯為將PEG酯化至N-羥基琥珀酰亞胺(“NHS”)上。正如此處所使用的，“酰化作用”打算不加限制地包括下列類型的在BDNF或NT-3與一種水溶性聚合物之間的連接諸如PEG酰胺，氨基甲酸酯，氨基甲酸乙酯及其同類物〔參見BioconjugateChem.5133-140(1994)〕。反應條件可以從任意一種本領域已知的或隨后有所發展的條件中選取，但是應當避免諸如使待改性的BDNF或NT-3的物質失活的溫度，溶劑以及pH值的條件。通常所使用的反應條件將在下面進行描述。圖6描述了用一種單甲氧基-PEG的NHS酯的典型反應。通過酰化的聚乙二醇化作用通常會生成一種聚乙二醇化的BDNF或NT-3產物，其中賴氨酸的ε-氨基是通過一個酰基連接基團聚乙二醇化的。優選該連接鍵為酰胺。也優選該生成產物基本上是被單-，雙-或三-聚乙二醇化的(例如≥95％)。但是具有較高聚乙二醇化程度(達到BDNF與NT-3的賴氨酸ε-氨基酸基團的最大數目加上在BDNF或NT-3的氨基末端處的一個α-氨基)的某些物質通常是在依賴于所使用的特殊反應條件的含量下生成的。如果有某些要求的話，可以通過標準的純化技術(包括尤其是透析，鹽析，超濾，離子交換色譜法，凝膠過濾色譜法以及電泳)從含有未反應物質的混合物中分離出更純的聚乙二醇化的物質。烷基化作用通過烷基化的聚乙二醇化作用通常涉及在有一種還原劑存在下將PEG的一種醛的衍生物與一種諸如BDNF或NT-3的多肽反應。通過烷基化的聚乙二醇化作用也能生成聚乙二醇化的BDNF或NT-3。圖7顯示出一個典型的生成一種聚乙二醇化產物的還原性烷基化作用。此外，人們可以如此處所述來控制該反應條件，從而基本上便于僅在BDNF或NT-3多肽的N-末端α-氨基上發生該聚乙二醇化反應(即一個單聚乙二醇化的物質)。圖8顯示出一個典型的與BDNF或NT-3生成一種單聚乙二醇化產物的還原性烷基化作用。在任意一種單聚乙二醇化作用或多聚乙二醇化作用的情況下，該PEG基團優選通過一個-CH2-NH-基團被連接在該多肽上。特別指出的是-CH2-基團，這種類型的鍵此處稱作一個“烷基”鍵。通過還原性烷基化作用生產一種單聚乙二醇化產物的衍生化作用利用了不同類型伯胺基的(賴氨酸與其N-末端的比值)不同的反應性能，該伯胺基是在BDNF或NT-3的衍生化作用中可以利用的基團。上述反應是在某一pH值(參見下文)下進行的，而該pH值可以讓人們利用賴氨酸殘基的ε-氨基與該多肽N-末端殘基α-氨基間pKa值的差異。通過這種選擇性的衍生化作用，向一種多肽上連接含有一個活性基團(諸如一個醛基)的一種水溶性聚合物是可以控制的。與該聚合物的結合作用主要地發生在該多肽的N-末端上，而且其它具反應活性的基團諸如賴氨酸側鏈氨基，不發生明顯的改性作用。在一個重要的方面，本發明提供了一種基本上均一的單聚合物/BDNF或單聚合物/NT-3的結合物的分子制劑，而這表明BDNF或NT-3僅在一個單一的位置上被連接到一個聚合物分子上(例如≥90％)。更具體地講，如果使用聚乙二醇的話，本發明也提供聚乙二醇化的BDNF或NT-3，其可能缺少抗原連接基團并且含有被直接耦聯到該BDNF或NT-3多肽上的聚乙二醇分子。于是在一個優選的方面，本發明涉及聚乙二醇化的BDNF與NT-3，其中該PEG基團通過酰基或烷基鍵連接至BDNF與NT-3上。正如上述所討論的，該產物可以被單聚乙二醇化或多聚乙二醇化(諸如含有2-6，優選2-5個PEG基團)。該PEG基團通常被連接到該多肽上，連接點位于該多肽鏈的α和/或ε氨基處，但是也應當預測到該PEG基團可以被連接至該多肽結構的任意一個氨基上，該結構在適宜的反應條件下，是具有足夠的反應活性的以被連接至一個PEG基團。在酰化作用與烷基化作用的方法中所使用的該聚合物分子可以選自水溶性聚合物或其混合物。所選擇的聚合物應當是水溶性的，以便于在液態環境下(諸如一個生理環境下)該聚合物所連接的多肽不發生沉降。所選擇的聚合物應當被改性至具有一個單一的反應活性基團，諸如優選對于酰化作用而言的活性酯或對于烷基化作用的醛，以便于該聚合程度能夠如本發明所提供的那樣得到控制。一個優選的具反應活性的PEG醛為聚乙二醇丙醛(該物質在水中是穩定的)，或其單Cl-C10的烷氧基或芳氧基的衍生物〔參見美國專利US5,252,714〕。該聚合物可以是有支鏈的或無支鏈的。對于治療用的最終產品的制備，優選該聚合物為可藥用的。該水溶性聚合物可以選自例如聚乙二醇(單甲氧基-聚乙二醇)，葡聚糖，聚-(N-乙烯吡咯烷酮)，聚丙二醇均聚物，聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化的多元醇(例如甘油)以及聚乙烯醇。對于酰化反應而言，所選擇的聚合物應當具有一個單一的反應活性酯基。對于本還原性烷基化作用而言，所選擇的聚合物應當具有一個單一的反應活性醛基。一般說來，該水溶性聚合物將不從自然形成的糖殘基中選擇，因為上述物質通常可以通過哺乳動物重組表達系統方便地制得。該聚合物可以是任意分子量的，并且可以是有支鏈的或無支鏈的。此處所使用的一種特別優選的水溶性聚合物為聚乙二醇。正如此處所使用的，聚乙二醇意指包括任意一種形式的已經用于使其它蛋白質衍生化的PEG，諸如單(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇。通常可以在任意一種適宜的條件下進行該衍生化作用，其中的條件為將具有生物學活性的物質與經活化的水溶性聚合物分子進行反應的條件。用于制備聚乙二醇化的BDNF或NT-3的方法通常包括如下步驟(a)在某一條件下，將一種BDNF或NT-3的多肽與聚乙二醇(諸如PEG的一種具有反應活性的酯或醛的衍生物)進行反應，從而BDNF或NT-3被連接到一個或多個PEG基團上，以及(b)獲得該反應產物。一般說來，酰化反應的最佳反應條件將在已知參數與所需結果的基礎上逐個情況地進行測定。例如，PEG蛋白質的比值越大，聚乙二醇化產物的百分比也越大。在本發明的方法中，為了生成基本上為一組均一的單聚物/多肽的結合物分子，還原性烷基化作用通常包括如下步驟(a)在還原性烷基化反應的條件下、且在其pH值適于在該多肽的氨基末端α-氨基處進行選擇性地改性的條件下，將一種BDNF或NT-3的多肽與一種具有反應活性的PEG分子進行反應，以及(b)獲得該反應產物。對于基本上為一組均一的單聚物/BDNF或單聚物/NT-3結合物分子而言，該還原性烷基化作用的反應條件為那些允許該水溶性聚合物部分選擇性地連接至該多肽N-末端上的條件。上述反應條件通常保證在該賴氨酸ε-氨基與N-末端α-氨基之間pKa值的差異(該pKa值為在50％的氨基被質子化、而50％未質子化的pH值)。該pH值也影響待用的聚合物與多肽之間的比值。一般說來，如果pH值較低，則需要聚合物與多肽的比值過量較大(即N-末端α-氨基的反應活性較差，則需要更多的聚合物來實現最佳反應條件)。如果該pH值較高，則聚合物多肽的比值不需要如此之大(即有較多的反應活性基團可以利用，于是需要較少的聚合物分子)。對于本發明的目的而言，該pH值通常落在3-9的范圍內，優選3-6。另外一個重要的考慮為該聚合物的分子量。一般說來，該聚合物的分子量越高，可以連接到該多肽上的聚合物分子的數目越少。與此相仿，當優化上述參數時，該聚合物的分枝也應當考慮。通常分子量越高(或支鏈越多)，聚合物多肽的比值也越高。一般說來，對于此處所計劃的聚乙二醇化反應而言，該聚合物優選的平均分子量為從大約2kDa至大約100kDa(該術語“大約”表示±1kDa)。一個更為優選的平均分子量為從大約5kDa至大約50kDa，并且特別優選從大約12kDa至大約25kDa。水溶性聚合物與BDNF或NT-3的比值通常在1∶1至100∶1的范圍內，優選(對于多聚乙二醇化作用)1∶1至20∶1以及(對于單聚乙二醇化作用)1∶1至5∶1。通過采用如上所指示的條件，按照本發明的還原性烷基化作用提供了一種連接方法，其中該連接為將該聚合物選擇性地連接到任意一種在氨基末端處具有一個α-氨基的BDNF或NT-3的多肽蛋白質上，并且提供了制備一種基本上為均一的單聚物/多肽的蛋白質的結合物。此處所使用的術語“單聚物/多肽結合物”意指一種組合物，該組合物由被連接到一個BDNF或NT-3分子上的單一聚合物分子所組成。該單聚物/多肽結合物含有一個在N-末端定位的聚合物分子，但該分子并非位于賴氨酸的側鏈基團上。上述制劑優選為生產出大于80％的單聚合物/多肽結合物，并且更優選生產出大于90％的單聚合物/多肽結合物，同時還伴有可觀測到的未反應分子的剩余物(即缺少該聚合物部分的多肽)。下面的實施例提供了一種至少有大約90％的單聚合物/多肽結合物與大約10％的未反應的多肽的制劑。該單聚合物/多肽結合物是具有生物學活性的。對于本還原性烷基化作用而言，還原劑在液體狀態下應當是穩定的，并且優選該還原劑能夠僅還原在還原性烷基化作用的初期步驟中所形成的席夫堿。優選的還原劑可以選自硼氫化鈉，氰基硼氫鈉，二甲胺甲硼烷三甲胺甲硼烷與吡啶甲硼烷所組成。一種特別優選的還原劑為氰基硼氫鈉。其它的反應參數(諸如溶劑，反應時間，溫度等)以及產物的純化方法可以在已出版的，與含有水溶性聚合物的蛋白質的衍生化作用有關信息的基礎上逐個情況地進行測定(參見本文所引用的出版物)。在以下的實施例中將給出典型的說明。通過酰化作用和/或烷基化作用的方法，人們可以選擇制備一種聚合物/多肽的結合物分子的混合物，并且此處所提供的優點在于人們可以選擇包含在該混合物中的單聚合物/多肽結合物的比例。因此如果需要的話，人們可以制備出與不同數目的聚合物分子(例如，雙-，三-，四-，等等)相連接的不同多肽的混合物并且與采用本方法制備的該單聚合物/多肽結合物的材料化合，從而得到一種事先已確定好比例的單聚合物/多肽結合物的混合物。如上述所提及的，與本發明相應的聚合物/多肽結合物能夠用于與已知有用的BDNF和NT-3相同的用途。從前已經表明上述多肽是有效的，例如可以用作促進體外神經元存活與維持的營養因子，從而可以進行研究并且在研究中使用神經元。上述細胞通常在培養中是很難保持其活性的。對于動物體神經學的研究而言，這些相同的生物學活性可以協助上述因子在體內的使用，并且也提供了一種潛在的治療用劑，該治療用劑用于治療與神經元功能喪失有關的神經變性疾病。對于治療用途而言，本發明的聚合物/多肽結合物可以配制于并且可以溶在任意一種無菌的生物相容的藥用載體包括鹽水，緩沖鹽水，葡萄糖與水中進行施用。在治療特殊的疾病或狀況中發揮效用的BDNF/聚合物或NT-3/聚合物的結合物的用量依賴于上述疾病或狀況的實質，并且該用量可以通過標準的臨床技術進行測定。當有可能的時候，人們希望首先測定本發明的藥物組合物在體外(例如在文獻中所描述的BDNF與NT-3的生物測定系統)的劑量-應答曲線，并且隨后在人體測定之前先在有用的動物體模型內進行測定。注射的方法包括皮內，肌內，腹膜內，靜脈，皮下，鼻內，肺部與口腔給藥。此外，人們可能想通過任意一種適宜的方式(包括心室內或鞘內注射)將該藥物組合物引入到中央神經系統中。人們進一步可能還想在局部施用該藥物組合物至需要治療的區域。而上述要求是可以實現的，例如可以通過在外科手術期間借助導管通過注射進行局部灌注，或通過使用一種多孔的，無孔的，膠狀的，纖維狀的或薄膜狀材料的植入物來實現。具體實施的描述根據本發明的具體的BDNF與NT-3衍生物的制備及其生理學與生物學特性顯示在下文中。所給出的這些實施例更為詳盡地描述了本發明，但是并不打算用于限制本發明。在這些實施例中，除非另作聲明的以外，均使用在大腸桿菌中重組制備的人類的BDNF與NT-3(即r-metHuBDNF與r-metHuNT-3)。實施例1連接位點在N-末端α-氨基處的單MPEG(6kDa)-BDNF結合物的制備向溶于100mM磷酸鈉(該溶液pH為4.0且含有20mMNaCNBH3)的r-metHuBDNF(2.5毫克/毫升)的一個冷卻(4℃)并攪拌的溶液中加入兩倍摩爾的過量的活化甲氧基聚乙二醇(MPEG)的醛，該醛的平均分子量為6,000道爾頓(即6kDa)。在該反應過程中，蛋白質改性的程度受尺寸排阻色譜的監測，該色譜使用一個Superose6HR10/30柱(Pharmacia)，用含有0.5M氯化鈉、pH為6.9的100mM磷酸鈉在0.4毫升/分鐘的流速下進行洗脫。10小時后，經尺寸排阻色譜法的分析表明所有的多肽(該多肽在溶液中是以二聚物存在的)已經基本上轉化成為兩種可能的N-末端聚乙二醇化的衍生物的形式MPEG被結合到BDNF二聚物的一個或兩個N-末端上。隨后用無菌水將該反應混合物總共稀釋五倍，并且將其加到一個HiLoad16/10SSepharoseHP離子交換柱(Pharmacia)上，再用pH為7.5的20mM磷酸鈉緩沖溶液飽和該柱。在1毫升/分鐘的流速下向該柱中裝填反應混合物，并且用三倍柱體積的同樣的緩沖溶液洗脫未反應的MPEG的醛。采用線性梯度洗脫兩種形式的N-末端聚乙二醇化的BDNF二聚物，該線性梯度采用從0％至100％的20mM磷酸鈉(其pH為7.5、含有0.75M氯化鈉)，進行了五百分鐘。含有該BDNF衍生物的部分被合并、濃縮并且無菌過濾。實施例2連接位點在N-末端α-氨基處的單MPEG(20kDa)-BDNF結合物的制備除了采用一種20,000道爾頓(20kDa)的甲氧基聚乙二醇(MPEG)的醛與pH值為5.0以外，重復實施例1的步驟。實施例3通過還原性烷基化作用采用MPEG的醛進行多MPEG(6kDa)-BDNF結合物的制備向溶于100mMBICINE(該溶液pH為8且含有20mMNaCNBH3)的r-metHuBDNF(10毫克/毫升)的一個冷卻(4℃)并攪拌的溶液中加入四倍摩爾的過量的甲氧基聚乙二醇(MPEG)的活化醛，該醛的平均分子量為6kDa。在該反應過程中，蛋白質改性的程度受尺寸排阻色譜的監測，該色譜使用一個Superose6HR10/30柱(Pharmacia)，用含有0.5M氯化鈉、pH為6.9的100mM磷酸鈉在0.4毫升/分鐘下進行洗脫。10小時后，經尺寸排阻色譜法的分析表明所有的多肽均已被MPEG進行了改性。隨后用無菌水將該反應混合物稀釋五倍、調整其pH值為7(使用磷酸)，并且將該混合物加到一個HiLoad16/10SSepharoseHP離子交換柱(Pharmacia)上，再用pH為7.5的20mM磷酸鈉緩沖溶液飽和該柱。在1毫升/分鐘的流速下向該柱中裝填反應混合物，并且用三倍柱體積的同樣的緩沖溶液洗脫未反應的MPEG的醛。采用線性梯度洗脫該MPEG-BDNF結合物，該線性梯度為500分鐘內，從0％至100％的20mM磷酸鈉，其pH為7.5、含有0.75M氯化鈉。含有該MPEG-BDNF結合物的部分被合并、濃縮并且無菌過濾。實施例4通過還原性酰化作用采用MPEG的醛進行多MPEG(6kDa)-BDNF結合物的制備除了采用六倍摩爾的過量的MPEG的醛以外，重復實施例3的步驟。實施例5通過酰化作用采用活化的MPEG的衍生物進行多MPEG(6kDa)-BDNF結合物的制備向溶解在0.1MBICINE緩沖溶液(pH值為8)的r-metHuBDNF(6毫克/毫升)的一個冷卻(4℃)并攪拌的溶液中加入四倍摩爾的過量的羧甲基MPEG的琥珀酰亞胺基酯，其平均分子量為6kDa。輕輕地攪拌使該聚合物溶解并且在同樣的溫度下維持該反應。在該反應過程中，蛋白質改性的程度受尺寸排阻色譜的監測，該色譜使用一個Superose6HR10/30柱(Pharmacia)，用含有0.5M氯化鈉、pH為6.9的100mM磷酸鈉在0.4毫升/分鐘下進行洗脫。3小時后，尺寸排阻色譜表明所有的BDNF的二聚物均已被MPEG進行了改性。隨后用無菌水將該反應混合物稀釋四倍并且將該混合物的pH值調至7(使用0.5M磷酸)。將該溶液加到一個HiLoad16/10SSepharoseHP離子交換柱(Pharmacia)上，再用pH為7.5的20mM磷酸鈉緩沖溶液飽和該柱。用三倍柱體積的同樣的緩沖溶液洗脫未反應的MPEG的醛。采用線性梯度洗脫該MPEG-BDNF結合物，該線性梯度500分鐘內從0％至100％的20mM磷酸鈉其pH為7.5、含有0.75M氯化鈉。含有MPEG-BDNF結合物的部分被收集、濃縮并且無菌過濾。實施例6通過酰化作用采用活化的MPEG的衍生物進行多MPEG(6kDa)-BDNF結合物的制備除了采用等摩爾比的反應劑以外，重復實施例5的步驟。實施例7通過酰化作用采用活化的MPEG的衍生物進行多MPEG(20kDa)-BDNF結合物的制備除了采用平均分子量為20kDa的MPEG的琥珀酰亞胺基丙酸酯以及為BDNF二聚物的六倍摩爾的過量的MPEG以外，重復實施例5的步驟。實施例8連接位點在N-末端α-氨基殘基處的單MPEG(20kDa)-NT-3結合物的制備向溶于20mM醋酸鈉(該溶液pH為4.0，含有150mM氯化鈉與20mMNaCNBH3)的r-metHuNT-3(4.77毫克/毫升)的一個冷卻(4℃)并攪拌的溶液中加入三倍摩爾的過量的活化MPEG，其平均分子量為20kDa。在該反應過程中，蛋白質改性的程度受尺寸排阻色譜的監測，該色譜使用一個Superose6HR10/30柱(Pharmacia)，用含有150mM氯化鈉、pH為7.1的10mM磷酸鈉在0.4毫升/分鐘的流速下進行洗脫。10小時后，尺寸排阻色譜表明所有的蛋白質(該蛋白質在溶液中是以二聚物存在的)已經轉化成為兩種可能的N-末端聚乙二醇化的衍生物的形式MPEG被結合到NT-3二聚物的一個或兩個N-末端上。隨后用pH為7.1的20mM磷酸鈉將該反應混合物總共稀釋五倍，并且將其加到一個HiLoad16/10SSepharoseHP離子交換柱(Pharmacia)上，再用pH為7.1的20mM磷酸鈉緩沖溶液飽和該柱。在1毫升/分鐘的流速下向該柱中裝填反應混合物，并且用三倍柱體積的同樣的緩沖溶液洗脫未反應的MPEG的醛。采用線性梯度洗脫上述兩種形式的N-末端聚乙二醇化的NT-3的二聚物，該線性梯度采用從0％至100％的20mM磷酸鈉(其pH為7.1、含有0.4M氯化鈉)。含有該MPEG-NT-3衍生物的部分被合并、濃縮并且無菌過濾。此外，MPEG-BDNF或MPEG-NT-3的結合物也可以通過采用不同平均分子量(例如在5kDa至50kDa的范圍內)的MPEG的醛對BDNF或NT-3進行改性而獲得，并且可以按照類似的方法進行制備。通過十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定所生成的聚乙二醇化的BDNF或NT-3結合物的均一性，其中該電泳使用10-20％或4-20％的預制的梯度凝膠(組合型分離系統)。為了描述每一種MPEG-BDNF或MPEG-NT-3物質的有效尺寸(流體動力學半徑)，使用一個Superose6HR10/30(Pharmacia)凝膠過濾柱。在280納米下通過紫外吸收檢測該蛋白質。該BIO-RAD凝膠過濾標準物充當球蛋白分子重量的標記物。通過沉降平衡分析超離心法以及輔助基質激光吸收質譜分析法測定上述結合物的分子量。采用N-末端蛋白質序列與肽的譜圖驗證每一種N-末端MPEG-BDNF或MPEG-NT-3結合物的結構。實施例1-7中所制備的MPEG-BDNF結合物的體外生物學活性是通過該結合物對PC12/pcDneo-trk#18細胞的3-(4，5-二甲基噻唑基-2-基)-5-(3-羧甲氧苯基)-2-(4-磺苯基)2H-四唑的內鹽攝取量的影響進行測定的。表1中總結了在制備該結合物中所使用的上述結果與基本的反應參數。表1MPEG-BDNF共軛物的特性與制備反應的主要參數的總結</tables>a-摩爾/BDNF二聚體的摩爾b-通過凝膠過濾測定的表觀分子量n/a-不可應用的實施例9單MPEG(20kDa)-BDNF結合物對成年大鼠運動神經元的體內生物學活性的評定以前曾表明BDNF可以從自然發生的以及由軸突被切所引發的細胞死亡中救助正在發育的運動神經元〔參見Yan等人，《自然》360753-755(1992)；Oppenheim等人，《自然》360755-757(1992)；Sendtner等人，《自然》360757-759(1992)〕。現已表明軸突被切的成熟的運動神經元對外源BDNF的應答，并且更具體地講，由不同的給藥方式施用的BDNF減弱了成年大鼠面部運動神經中由軸突被切引發的乙酰膽堿轉移酶(ChAT)免疫活性的降低。〔參見Yan等人，J.Neurosci.14(9)5281-5291(1994)〕。ChAT活性的降低表示運動神經元功能的喪失，這是因為ChAT是由運動神經元所產生的一種重要的神經遞質。因此，上述研究表明BDNF可以作為一種成熟運動神經元疾病的潛在的治療劑。在本研究當中評價了BDNF的N-末端聚乙二醇化與隨機聚乙二醇化的物質對于體內損傷的成熟運動神經元的生物學活性。方法A.動物外科與治療采用一種混合物(43毫克/毫升克他命鹽酸化物，8.6毫克/毫升甲苯噻嗪與1.43毫克/毫升乙酰丙嗪)在0.7毫升/千克體重的劑量下麻醉成年的雌性Sprague-Dawley大鼠(總共有52只大鼠，每組n＝4)。在靠近莖突乳突孔的位置做右側面部神經元的切片。從外科手術當天開始(0天)皮下治療上述動物每天一次，共治療七天。所使用的劑量為每千克體重0.1，0.3，1.0與5.0毫克的未聚乙二醇化的BDNF，N-末端單MPEG(20kDa)-BDNF結合物，或者隨機多MPEG-BDNF結合物，上述物質均溶于PBS中。有一組大鼠僅用PBS治療以作對照。每天測量動物的體重。B.ChAT免疫組織化學采用過量的麻醉劑殺死大鼠并且用PBS、再用溶于0.1M磷酸鈉緩沖溶液(pH為7.2)中的4％的多聚甲醛經心室(transcardially)灌注上述大鼠。移取其腦干，用溶于PBS的30％的蔗糖對腦干進行冷凍保護，在滑動切片機夾盤上冷凍該腦干，并且通過面部神經核區切割80微米連續的冠狀切片。隨后采用大鼠抗ChAT的單克隆抗體(腹水，1∶500，Chemicon，Temecula，CA)、再通過Yan與Johnson在J.Neurosci.8(9)3481-3498(1988)中所描述的ABC方法(Vector實驗室，Burlingame，CA)采用2微克/毫升第二生物素馬抗鼠抗體進行免疫組織化學處理上述切片。C.免疫組織化學切片的定量使用一臺偶聯到NikonOptiphot-FXA顯微鏡上的定量電視顯微鏡520圖象分析儀來定量ChAT染色的相對強度。使用一臺配有Nikon-PlanApochromatic2X物鏡的510納米的窄頻帶過濾器(OrielCorp.，Stratford，CT)產生組織切片中面部核區的高對比圖象。ChAT免疫反應活性的相對強度通過獲得平均灰度強度進行測定，其中該強度為每一組圈出的核減去與ChAT底片(negative)的灰質相連的背景的染色。對于每一種動物而言，采用含有該面部核的三至四個切片進行定量。由于BDNF的治療并不影響未損傷的面部核的ChAT的免疫染色，所以上述數據采用同一切片面部核損傷的與未損傷的相對光學密度的比值來表達。上述數據先通過ANVOA、再用Dunnettt檢驗進行統計分析。D.結果成年大鼠中的軸突被切會造成運動神經元中ChAT免疫反應活性的快速的且可再生的降低〔參見Lams等人，BrainRes.475401-406(1988)與Armstrong等人，J.Comp.Neurol.304596-607(1991)〕。為了評價未聚乙二醇化的BDNF與聚乙二醇化的BDNF對成熟運動神經元的影響，采用上述面部神經切片的示例來研究這些多肽對運動神經元中ChAT的表達的影響。在右側面部神經切片七天后，ChAT的免疫反應活性從接受PBS治療的損傷的面部核中大量消失(圖4，A組，位于右手側的面部核)。采用天然的BDNF(5毫克/千克，圖4，B組)，N-末端單MPEG-BDNF結合物(0.3毫克/千克，圖4，C組)與隨機的多MPEG-BDNF結合物(0.3毫克/千克，圖4，D組)進行的皮下治療將隨由損傷所引發的ChAT免疫反應活性的降低而發生顯著地衰減。為了定量描述上述現象，測量了經ChAT免疫染色的切片的損傷與未損傷的面部核的平均光學密度。在與劑量有關的形式下，天然的，N-末端單MPEG-BDNF結合物與隨機多MPEG-BDNF結合物均減少了由損傷所引發的ChAT免疫反應活性的降低(圖5)。與載體對照相比，劑量為5毫克/千克的天然BDNF顯示出由損傷所引發的ChAT免疫反應活性降低的顯著衰減(p＜0.01)。在所檢驗的每一劑量下與載體對照相比以及在所檢驗的較低的最接近的劑量下與天然的BDNF相比，采用N-末端單MPEG-BDNF結合物或隨機多MPEG-BDNF結合物的治療會造成顯著的提高(p＜0.01)。通過估算，比起天然的BDNF來，用聚乙二醇化的BDNF進行治療使得劑量-應答曲線向左移動了大約二十倍(圖5)，這表明聚乙二醇化的BDNF對于損傷運動神經元的效能的提高。實施例10在雞胚DRG生物檢定中N-末端單MPEG-NT-3結合物的體外生物學活性的評定采用Lindsay等人在Dev.Biol.112319-328(1985)中所描述的雞胚后根神經節(DRG)驗定法測量未聚乙二醇化的NT-3與N-末端單MPEG(20kDa)-NT-3結合物的比較生物學活性。簡而言之，將每個儲槽內的五個雞胚(E8)后根神經節作為外植體在膠原基質內進行培養，該基質含有2毫升F14培養基，培養基中含有5％的標準的馬血清。在相差顯微鏡下用肉眼評價該神經營養因子(包括未聚乙二醇化的與聚乙二醇化的)的效果，并且在0-5的程度內記錄上述效果(0＝沒有軸突的生長，5＝最大的軸突的生長)。在下表2中所報道的結果表明與未聚乙二醇化的NT-3相比，聚乙二醇化的NT-3可以允許無活性損失。鑒于經驗的觀點認為采用其它經體外分析的聚乙二醇化的蛋白質會產生生物活性的極大下降，本發明則給出了一個令人吃驚的結果。表2E8雞DRG的體外生物檢定樣品濃度因子(納克/毫軸突生長升)NT-30.51，2，2，3，354，4，5，-，-100.5，1，1，1，2500.5，0.5，0.5，1，1聚乙二醇化的54，4，4，2，2，NT-3503，3，2，2，15000，0.5，0.5，1，210003，3，2，1，0.5實施例11N-末端單PEG(20kDa)-BDNF結合物對成年大鼠體內生物學效應-通過腦組織滲透的進一步評價1.紋狀體的單次注射將1微升未聚乙二醇化的BDNF或N-末端單MPEG(20kDa)-BDNF結合物(溶于磷酸緩沖鹽水中濃度為1毫克/毫升)在體內注射到成年雌性大鼠大腦(n＝4)右側的紋狀體中心達18-20小時。二十小時后，采用過量的麻醉劑殺死上述動物，并且用PBS、再用溶于0.1M磷酸鈉緩沖溶液(pH為7.2)中的4％的多聚甲醛經心室灌注上述大鼠。移取該大腦，用溶于PBS的30％的蔗糖對其進行冷凍保護，在滑動切片機夾盤上冷凍該大腦，并且切割成60微米連續的冠狀切片。對于其免疫組織化學而言，隨后采用1微克/毫升的兔的抗-BDNF的抗體、再通過如上所指出的ABC方法采用2微克/毫升第二生物素羊抗BDNF的抗體處理上述切片。當采用未聚乙二醇化與聚乙二醇化的BDNF的樣品時，在紋狀體的注射位點處均能看到非常強烈的染色。與未聚乙二醇化的BDNF相比，觀測到聚乙二醇化的BDNF擴散到一個更大的組織區域，在圖6中看到大約為前者的2.4倍。有許多位于黑質的神經元被標記為陽性(未顯示出)。2.紋狀體七天的灌注在超過七天的時間段內，成年雌性大鼠(n＝4)在紋狀體處每天接受12微克或是未聚乙二醇化的BDNF或是N-末端單MPEG(20kDa)-BDNF結合物的灌注。在本研究中，所有兩種形式的BDNF的滲透均比上述單一的注射方式要好。如圖7所示，與天然的BDNF相比，聚乙二醇化的BDNF擴散到一個更大的區域，大約為前者的6.1倍。與采用未聚乙二醇化的BDNF相比(圖8，A組與B組)，隨著用聚乙二醇化的BDNF(圖8，C組與D組)進行灌注，在致密黑質(“SNC”)與腹蓋區(“VTH”)的許多神經元將更多地被陽性標記。在高能放大倍率下，BDNF-免疫反應活性呈點狀并且位于節周神經原內，上述表明BDNF已經從神經末端被逆向運輸到細胞體。在網狀黑質(“SNR”)的中腹部所觀測到的陽性染色位于神經網織內并且與任何細胞體均無關。上述染色是由于非特異性地擴散，而并非受體介導的逆向運輸〔參見Ferguson等人，J.Comp.Neurol.313680-692(1991)〕。上述結果是非常顯著的。一般說來，經實質施用到動物大腦后會發現BDNF穿過腦組織的擴散非常差。而本數據表明當采用一種聚乙二醇化的BDNF時，可以實現上述擴散能力的顯著提高，從而暗示出至少對于上述注射方式而言，聚乙二醇化的BDNF具有潛在的較大的治療效能。序列一覽表(1)一般信息(i)申請人愛姆根公司(ii)發明名稱BDNF與NT-3的衍生物(iii)序列數4(iv)聯系地址(A)地址愛姆根公司(B)街道德哈威蘭德巷1840(C)城市薩奧桑德奧克斯(D)州加利弗尼亞(E)國家美國(F)郵政編碼91320-1789(v)計算機可讀形式(A)存儲媒體類型軟磁盤(B)計算機IBMPC兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件帕特汀瑞利斯#1.0，版本#1.25(vi)當前申請數據(A)申請號(B)申請日(C)分類(viii)律師/代理人信息(A)名稱麻匝，理查德J.(C)委托/文件(docket)號A-298(2)第一號序列鑒定信息(i)序列特征(A)長度119個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述第一號序列鑒定HisSerAspProAlaArgArgGlyGluLeuSerValCysAspSerIle151015SerGluTrpValThrAlaAlaAspLysLysThrAlaValAspMetSer202530GlyGlyThrValThrValLeuGluLysValProGluSerLysGlyGln354045LeuLysGlnTyrPheTyrGluThrLysCysAsnProMetGlyTyrThr505560LysGluGlyCysArgGlyIleAsxLysArgHisTrpAsnSerGlnCys65707580ArgThrThrGlnSerTyrValArgAlaLeuThrMetAspSerLysLys859095ArgIleGlyTrpArgPheIleArgIleAspThrSerCysValCysThr100105110LeuThrIleLysArgGlyArg115(3)第二號序列鑒定信息(i)序列特征(A)長度120個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述第二號序列鑒定MetHisSerAspProAlaArgArgGlyGluLeuSerValCysAspSer151015IleSerGluTrpValThrAlaAlaAspLysLysThrAlaValAspMet202530SerGlyGlyThrValThrValLeuGluLysValProValSerLysGly354045GlnLeuLysGlnTyrPheTyrGluThrLysCysAsnProMetGlyTyr505560ThrLysGluGlyCysArgGlyIleAspLysArgHisTrpAsnSerGln65707580CysArgThrThrGlnSerTyrAsxArgAlaLeuThrMetAspSerLys859095LysArgIleGlyTrpArgPheIleArgIleAspThrSerCysAsxCys100105110ThrLeuThrIleLysArgGlyArg115120(4)第三號序列鑒定信息(i)序列特征(A)長度119個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述第三號序列鑒定TyrAlaGluHisLysSerHisArgGlyGluTyrSerValCysAspSer151015GluSerLeuTrpValThrAspLysSerSerAlaIleAspIleArgGly202530HisGlnValThrValLeuGlyGluIleLysThrGlyAsnSerProVal354045LysGlnTyrPheTyrGluThrArgCysLysGluAlaArgProValLys505560AsnGlyCysArgGlyIleAspAspLysHisTrpAsnSerGlnCysLys65707580ThrSerGlnThrTyrValArgAlaLeuThrSerGluAsnAsnLysLeu859095ValGlyTrpArgTrpIleArgIleAspThrSerCysValCysAlaLeu100105110SerArgLysIleGlyArgThr115(5)第四號序列鑒定信息(i)序列特征(A)長度120個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述第四號序列鑒定MetTyrAlaGluHisLysSerHisArgGlyGluTyrSerValCysAsp151015SerGluSerLeuTrpValThrAspLysSerSerAlaIleAspIleArg202530GlyHisGinValThrValLeuGlyGluIleLysThrGlyAsnSerPro354045ValLysGlnTyrPheTyrGluThrArgCysLysGluAlaArgProVal505560LysAsnGlyCysArgGlyIleAspAspLysHisTrpAsnSerGlnCys65707580LysThrSerGlnThrTyrValArgAlaLeuThrSerGluAsnAsnLys859095LeuValGlyTrpArgTrpIleArgIleAspThrSerCysValCysAla100105110LeuSerArgLysIleGlyArgThr115120權利要求1.一種BDNF的衍生物，包含一種被連接到至少一種水溶性聚合物上的BDNF多肽。2.一種NT-3的衍生物，包含一種被連接到至少一種水溶性聚合物上的NT-3多肽。3.一種根據權利要求1或2的衍生物，其中所說的多肽是在細菌細胞中重組生產的。4.一種根據權利要求1或2的衍生物，其中所說的水溶性聚合物選自葡聚糖，聚(N-乙烯吡咯烷酮)，聚乙二醇，聚丙二醇，聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化的多元醇以及聚乙烯醇。5.一種根據權利要求4的衍生物，其中所說的水溶性聚合物為聚乙二醇。6.一種根據權利要求5的衍生物，其中所說的聚乙二醇為一種單甲氧基-聚乙二醇。7.一種根據權利要求5的衍生物，其中所說的聚乙二醇通過一個酰基或烷基鍵被連接到上述多肽上。8.一種根據權利要求5的衍生物，其中所說的聚乙二醇具有分子量為大約2kDa至大約100kDa。9.一種根據權利要求8的衍生物，其中所說的聚乙二醇具有分子量為大約5kDa至50kDa。10.一種將水溶性聚合物連接到一種選自BDNF與NT-3的多肽的方法，其中所說的水溶性聚合物有一個單一的具反應活性的醛基，所說的方法包括(a)在還原性烷基化作用條件下、且在pH值呈足夠酸性可以使得位于所說多肽的氨基末端處的α-氨基具有反應活性的條件下，將所說的多肽與一種水溶性聚合物進行反應；和(b)分離所說的被連接到至少一種水溶性聚合物上的多肽。11.一種根據權利要求10的將水溶性聚合物連接到一種多肽上的方法，其中該方法進一步包括步驟(c)；將所說的被連接到至少為一種水溶性聚合物上的多肽從未反應的分子中分離出來。12.一種根據權利要求10的方法，其中所說的聚合物為可藥用的。13.一種根據權利要求10的方法，其中所說的水溶性聚合物選自葡聚糖，聚(N-乙烯吡咯烷酮)，聚乙二醇，聚丙二醇，均聚物，聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化的多元醇以及聚乙烯醇。14.一種根據權利要求13的方法，其中所說的水溶性聚合物為聚乙二醇。15.一種根據權利要求10的方法，其中所說的pH值在大約3與大約9之間。16.一種根據權利要求10的方法，其中所說的還原性烷基化作用的條件涉及采用氰基硼氫鈉作為還原劑。17.一種將聚乙二醇分子連接到一種選自BDNF與NT-3的多肽上的方法，其中所說的聚乙二醇有一個單一的具反應活性的醛基，所說的方法包括(a)在還原性烷基化作用條件下、且在pH值呈足夠酸性可以使得位于所說多肽的氨基末端處的α-氨基具有反應活性的條件下，將所說的多肽與所說的聚乙二醇分子進行反應；(b)分離所說的被連接到聚乙二醇分子上的多肽。18.一種根據權利要求17的將聚乙二醇分子連接到一種多肽上的方法，其中該方法進一步包括步驟(c)將所說的反應產物從未反應的分子中分離出來。19.一種根據權利要求17的方法，其中所說的聚乙二醇分子具有分子量為大約2kDa至100kDa。20.一種水溶性聚合物與多肽的結合物，該結合物通過權利要求17的方法制備。21.一種基本上為均相的BDNF的制備，其中在所說的BDNF的N-末端α-氨基處進行單聚乙二醇化反應。22.一種基本上為均相的NT-3的制備，其中在所說的NT-3的N-末端α-氨基處進行單聚乙二醇化反應。23.一種提高BDNF的體內效能以治療受損傷的運動神經元的方法，該方法包括使用一種BDNF的聚乙二醇化的衍生物。24.一種提高BDNF或NT-3穿過腦組織的遷移的方法，該方法包括使用聚乙二醇化的BDNF或NT-3。全文摘要神經營養性因子BDNF與NT－3的衍生物。已經通過將這些多肽連接到一種水溶性聚合物,例如聚乙二醇上制備而成。文檔編號A61K38/22GK1173183SQ95197321公開日1998年2月11日申請日期1995年11月13日優先權日1994年11月14日發明者O·F·金斯特勒,Q·嚴申請人:安姆根有限公司