專利名稱：：腸配質的藥物劑型的制作方法
技術領域：
：本發明涉及“腸配質-粉劑和安瓿”制劑、其工業水平的分離方法、藥物劑型的生產方法及該制劑藥理學作用的研究方法。“腸配質-粉劑和安瓿”的活性成分是從腸粘膜分離的生物活性物質。已有文獻報道在腸粘膜內存在著可抑制細胞增殖(1，2，3)的物質。文獻中沒有報道可對形態發生產生刺激作用的物質的分離。我們曾申請了一種從溫血動物的腸粘膜分離生物刺激性物質的方法(4，5)。該方法存在著一些缺點復雜的工藝過程使該物質的生產成本相對昂貴，并且該方法不能生產最終的藥理學試驗的劑型。本發明的目的是1)改善所述的分離“腸配質-粉劑和安瓿”制劑的生物活性成分的方法；2)發展“腸配質-粉劑和安瓿”制劑的藥物劑型；3)在對生物活性成分的效果進行了實驗性研究后，在獸醫和動物馴養的實踐中測試“腸配質-粉劑和安瓿”制劑的藥理學作用。第一個目的通過從豬的腸粘膜中分離生物合成過程刺激質的方法來完成。生產方案主要包括以下步驟1)從動物腸粘膜中分離特定的細胞群，該腸粘膜為肉類包裝廠的腸衣清洗車間的廢棄物；2)將高分子量聚合物沉降后得到醇性酸提取物；在該步驟中應防止任何與起始生物量有關的污染；3)分批進行離子交換分級分離；4)將分級分離得到的洗脫液進行超過濾。技術方案在實施例1.1中進行描述。與專利BG49927MPKA61K37/02中記載的方法相比，具有如下改進試劑的用量較小；對基本技術方案中的一些步驟進行了改變，減少了步驟數；對超過濾的參數進行了改變并進行了進一步的確定。其結果是，分離出了兩種而不是一種生物活性核肽(nucleopeptide)，我們將其命名為“刺激性腸細胞配質”。第二個目的通過制備兩種藥物劑型來完成1)用于口服給藥的“腸配質粉”的腸溶顆粒包裝；2)含有純化的儲備形式的生物活性制劑的“腸配質安瓿”瓶。在2至6℃保存時，該藥物劑型可在3年內有效。對上述藥物劑型的分析已得到獸醫制劑控制實驗室和國家獸藥局的官方證實(6)。該分析包括“腸配質”中的生物活性核肽的化學和生物學的鑒別反應。另外，還給出了制劑中載體成分的分析方法。第三個目的通過實驗室和臨床實驗以及在獸醫實踐中的應用來完成。“腸配質-粉和安瓿”中所含的生物活性核肽在分子水平起作用；它們使腸粘膜細胞的生理性再生的增殖周期縮短，從而導致小腸吸收表面的增加；對于非增殖性細胞，它們刺激特定蛋白質的合成橫紋肌內的肌纖凝蛋白，肝臟內的解毒蛋白，脾臟內的致免疫蛋白；以及胃腸道內的消化酶。在平滑肌細胞中，這些核肽通過刺激Ca2+-流入來誘導去極化(7)。在小的實驗動物中，每日使用該制劑可使它們的體重增加200％以上。在豬及家畜飼養場應用“腸配質”20天可產生持續六個月的長期的刺激效果。該效果的特點是，可使豬的重量每日增加125g，牛每日增加110g。對于小雞，從孵化后的第3天至第45天添加于飲用水中，“腸配質”刺激DNA和蛋白質的生物合成，使它們體重增加118％。“腸配質”還在動物模型中表現出治療效果在實驗性胃潰瘍中、肝中毒后、通過刺激免疫發生來預防感染性疾病。經國家腫瘤中心和國家藥物管理研究所的試驗證實，“腸配質”無毒、無致畸作用、對胚胎無毒，并且無遺傳毒性。現在通過以下實施例對本發明進行說明。實施例1.任務1(圖1).在屠宰廠腸衣清洗間內的biterling機器上，收集從3號腸衣擠壓輪上擠出的富集細胞的物質，并同時在恒定的攪拌下加入20％的冷乙酸，使乙酸的最終濃度為2％(相對于總體積)。對生物量的處理過程可以繼續進行，也可以將生物量儲存于-40℃的冰箱內。如果采取后一種方法，隨后需要進行部分解凍。接著用絞肉機處理。向絞碎的物質中加入95％的乙醇(總量的0.2倍體積)。然后將生物量迅速加熱至70℃并立即冷卻至室溫。通過分離和過濾分出液體提取液。棄掉高分子量的碎屑。將酸性pH值調至6.5-7.0。將醇及脂質混合物轉移至玻璃反應器的醚中。在恒定的鹽濃度下將提取物吸附到DEAE纖維素上并用堿性鹽水溶液分批洗脫。有活性的部分通過穿透超過濾器進行純化，收集0.5-2.0kDa范圍內的部分。第二次過濾在無菌的條件下進行。測定核肽的濃度，該濃度為確定藥物劑型的劑量所必需。實施例1.任務2.“腸配質-粉劑和安瓿”藥物劑型的制備通過為鑒定核肽所設計的化學和生物學方法進行a)紫外吸收光譜-最大值260nm，最小值237nm；A260/A237＝1.21-1.19；b)肽的特征反應，例如，Reichelt的茚三酮反應；c)分子量的測定通過使用由分子量已知的肽預先校準過的SephadexG-25細柱；對于Kav，兩種活性核肽的參考極限分別是1.1-1.3kDa和0.6-0.65kDa；d)氨基酸組成通過紙色譜上的“指紋”分析，或更精確地，通過在氨基酸分析儀上的定量測定。在低分子量的核肽中測得了甘氨酸和色氨酸；另一個核肽中含有精氨酸、絲氨酸、亮氨酸、組氨酸、甘氨酸和酪氨酸；e)定量分析分光光度分析A260，以標準的0.01mmol硫酸腺嘌呤為對照；計算公式f)生物活性通過測量3H-亮氨酸(腹膜內注射，劑量為0.04MBp/20g小鼠體重)的摻入量來測定。在注射同位素(對照組)和同位素加0.02mg“腸配質”(實驗組)18小時后，測量取自小鼠后腿內收肌的50mg肌肉組織中的同位素的摻入量。流程圖刺激性腸配質的分離實施例1.任務3.對“腸配質-粉劑和安瓿”制劑的生物學活性的迅速評價方法是通過相應的同位素標記的前體的摻入量來測定DNA、RNA和蛋白質的生物合成。平均活化作用大于200％(表1)。用“腸配質”反復處理的動物中出現長期的形態學改變(表2)。腸的吸收表面增加，從而在攝取少量食物時使食物的效能增加2.56倍，并且使蛋白質的效能系數比對照組增加2.5倍。在橫紋肌中也發生了形態學的改變，收縮肌蛋白質相對增加。對小牛注射6次該制劑；每日在豬和淡水魚的食物中加入該制劑20天；以及在小雞的飲用水中加入該制劑45天，可使它們的生長動力學得到改善。在大鼠中觀察到“腸配質”對兩種實驗性潰瘍模型(利血平和緊張-組胺模型)的顯著的治療效果。在大鼠四氯化碳中毒后研究了肝腎綜合癥的代謝和恢復過程的動力學。“腸配質”制劑表現出保護和修復作用。表1“腸配質”對DNA(3H-胸腺嘧啶的摻入量)、RNA(14C-尿嘧啶的摻入量)、和蛋白質(3H-亮氨酸的摻入量)的生物合成的影響[相對于未給予“腸配質”的對照組動物的百分數]</tables>表2用“腸配質”多次處理后的形態學改變[相對于未給予“腸配質”的對照組動物的百分數]參考文獻1.Skraastad0，ReiceltKI.內源性結腸有絲分裂抑制劑在血清有限介質內減少結腸癌細胞(HT29)增生。VirchowsArchB，50，(1989)，393-390。2.Skraastad0，ReicheltKI.內源性結腸有絲分裂抑制劑及食用鈣抑制由膽酸誘導的結腸細胞增生。JGastroent23(1986)，801-807。3.TriffonovB，RoussevGK，ArgirovC，DraganovM，KamberovB.一種新腸肽的生物學作用-抑制培養的3T3鼠成纖維細胞和L5178Y鼠淋巴細胞的腸細胞配基。RegulatoryPeptides，51(1994)，111-119。4.TriffonovB，RoussevGK，BoshevH，TyanevG.分離生物刺激物的方法。Patent49927，BG49927MPKA61K37/02，Vol3，March16，1992，1-3(Bulgarian)。5.RoussevGK，TriffonovB，PetrovM，boshevH.分離有成形活性物質的方法。Inventionpatent37396MPK-A61K35/38，Vol6，June14，1985，1-6。6.證書號XIII-33/10.02.1995，農業部國家獸醫辦許可在獸醫行業生產和使用“腸配基”制劑的許可。7.TriffonovB，KristevA，ZaprianovG，LukanovJ，KostadinovaI.一種新腸肽(腸配基)對大鼠和豚鼠腸平滑肌的收縮和生物電活性的作用。JGastrointestMotil4，(1992)，193-l99。權利要求1.生物合成過程刺激質的藥物劑型，包括含有0.0125％儲備形式的生物活性核肽和0.2％的藻酸鈉生理鹽水溶液的“腸配質安瓿”瓶，和含有0.125％吸附于淀粉之上并且與水化脂肪形成腸溶顆粒的生物活性核肽的“腸配質粉劑”。2.生產權利要求1的劑型中的生物活性成分的方法，包括如下步驟將廢棄的腸生物量進行分級分離、用乙酸提取、用低濃度的乙醇沉降、離子交換色譜和0.5-2.0kDa范圍內的超過濾，分離得到兩種生物活性核肽。3.“腸配質-粉劑和安瓿”在獸醫實踐中的應用a)對于豬，將劑量為100g/200kg體重/天的“腸配質粉劑”與飼料混合，使用20-30天；b)對于反芻動物，每隔三天肌內注射0.5ml/100kg體重的“腸配質安瓿”，共6至8次；c)對于雞，每日將0.5ml/10kg體重的“腸配質安瓿”與飲用水混合，共45天；d)對于淡水魚，在飼養期內將100g“腸配質粉劑”與5kg飼料混合。全文摘要本發明涉及獸用藥“腸配質”的兩種劑型——粉劑和安瓿的生產方法。該制劑的生物活性成分是通過豬小腸粘膜細胞的分級分離、乙酸提取、乙醇沉降、離子交換色譜和0.5-2kDa范圍內的穿透超過濾而分離得到。該制劑的生物活性成分為兩種生物活性核肽；鳥苷三肽和腺苷七肽。對“腸配質”粉劑和安瓿的生物學作用的基本評價方法是對肌肉、肝臟、腸和胰臟內的核酸和特定蛋白質的生物合成的活化作用。文檔編號A61K9/14GK1163564SQ95195713公開日1997年10月29日申請日期1995年10月9日優先權日1995年10月9日發明者B·特里福諾夫,J·K·羅瑟夫,N·A·伯施夫,M·S·派特羅夫申請人:C·A·阿萊克桑德羅夫