編碼與白介素-1β轉換酶相關的人Tx和Ty蛋白的DNA序列的制作方法

專利名稱：編碼與白介素-1β轉換酶相關的人Tx和Ty蛋白的DNA序列的制作方法
技術領域：
本發明涉及編碼一種新的與白介素-1β轉換酶相關的人Tx蛋白的DNA序列，Tx蛋白，它們的生產方法，含有它的藥用組合物和它們做為藥物的用途。
白介素-1β(IL-1β)是一種包含在多種急性或慢性炎癥疾病如風濕性關節炎、腸炎或敗血性休克致病過程中的促炎癥細胞因子(Dinarello等.，1992免疫學評論，127，119-146)。
人單核細胞和巨噬細胞合成31kD(pIL-1β)的非活化前體形式的IL-1β。pIL-1β不含常規信號序列并且只有在116位和天冬氨酸117位丙氨酸之間斷裂之后才可由細胞有效地分泌。這個產生17kDa活性形式的IL-1β的斷裂，是由一種特定的稱為白介素-1β轉換酶(ICE)的特定酶進行的(Thornberry等.，1992自然，356，768-774；Cerretti等.，1992，科學，256，197-100)。該酶已在人和小鼠中被表征描述和克隆了(Nett等.，1992，免疫學雜志，149，3254-3259；Molineaux等.，美國國家科學院院刊，90，1809-1813)。它是一個與其它已知的硫羥基蛋白酶無同源性的單半胱氨酸蛋白酶。它還具有對一些pIL-1β的Asp-X肽鍵的特定的特異性。
該ICE酶由20kDa(p20)和10kDa(p10)的兩個亞基組成，它們的締合對于酶活是必需的。這些亞基來自45kDa(p45)酶原的蛋白裂解。ICE酶本身能裂解其p45前體或不含酶源的N末端119位氨基酸的30kDa的p30形式，成為p20加p10的活性形式。已對p45的cDNA以及氨基酸進行了全序列描述(Thornberry等，已被引用過)。人ICE基因的特征已有描述(Cerretti等.，1994，Genomic，120，468-473)。
最近的工作發現ICE可能在調節程序化細胞死亡或細胞凋亡中起作用(Yuan等.，1993，細胞，75，641-652)。事實上，ICE與Ced-3；一種包含于細胞凋亡中的C.elegans蛋白有28％的同源性并且在大鼠成纖維細胞中小鼠ICE的超表達引起細胞凋亡(Miura等.，1993，細胞，75，653-660)。而且，蛋白crm A，一種抑制病毒絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpine)在轉染小雞神經節細胞(ganglioneurons)中的表達可保護這些細胞免于由抑制生長因子(神經生長因子)誘導的細胞凋亡形式的死亡(Gahliardlin等.，1994，科學，263，826-828)。這些觀察結果表明ICE或其同源蛋白調節程序化細胞死亡中起作用，特別是在所觀察的退變性神經疾病如艾爾氏海默癥或帕金森氏癥以及大腦局部缺血中的程序化細胞死亡中有用(Barinaga，M，科學，259,762，1993)。
與在IL-1β的成熟或細胞凋亡中起作用的ICE相關的新的蛋白的發現有助于發展與IL-1β或細胞凋亡相關疾病的治療或診斷性新藥劑。
本發明涉及一種新的人Tx蛋白，它與人ICE前體p45有大約52％同源性并且不允許IL-1β前體成熟為活性細胞因子。Tx蛋白具有兩個預料之外的功能一方面，它是一種蛋白酶并特別可以將ICE前體p30裂解為p10和p20亞基，而另一方面它可在例如轉染的Cos細胞中誘導細胞凋亡。
這些生物特征使Tx蛋白可預期用于與IL-1β相應疾病時的治療或用于有細胞凋亡發生的病理時的治療。
本發明還涉及一種新的與Tx蛋白有大于70％同源性的人TY蛋白可在例如轉染的Cos細胞中誘導的細胞凋亡。TY蛋白是一種能以一種分子內方式自身斷裂的蛋白。
因此本發明的目標是一種DNA序列，它含有編碼一種具有蛋白酶活性的人多肽的DNA序列并具有序列SEQ ID No.1的核苷酸序列GCTCTTTCCA ACGCTGTAAA AAAGGACAGA GGCTGTTCCC T ATG GCA GAA GGC 53Met Ala Glu Gly1AAC CAC AGA AAA AAG CCA CTT AAG GTG TTG GAA TCC CTG GGC AAA GAT101Asn His Arg Lys Lys Pro Leu Lys Val Leu Glu Ser Leu Gly Lys Asp5 10 15 20TTC CTC ACT GGT GTT TTG GAT AAC TTG GTG GAA CAA AAT GTA CTG AAC149Phe Leu Thr Gly Val Leu Asp Asn Leu Val Glu Gln Asn Val Leu Asn25 30 35TGG AAG GAA GAG GAA AAA AAG AAA TAT TAC GAT GCT AAA ACT GAA GAC197Trp Lys Glu Glu Glu Lys Lys Lys Tyr Tyr Asp Ala Lys Thr Glu Asp40 45 50AAA GTT CGG GTC ATG GCA GAC TCT ATG CAA GAG AAG CAA CGT ATG GCA245Lys Val Arg Val Met Ala Asp Ser Met Gln Glu Lys Gln Arg Met Ala55 60 65GGA CAA ATG CTT CTT CAA ACC TTT TTT AAC ATA GAC CAA ATA TCC CCC293Gly Gln Met Leu Leu Gln Thr Phe Phe Asn Ile Asp Gln Ile Ser Pro70 75 80AAT AAA AAA GCT CAT CCG AAT ATG GAG GCT GGA CCA CCT GAG TCA GGA341Asn Lys Lys Ala His Pro Asn Met Glu Ala Gly Pro Pro Glu Ser Gly85 90 95 100GAA TCT ACA GAT GCC CTC AAG CTT TGT CCT CAT GAA GAA TTC CIG AGA389Glu Ser Thr Asp Ala Leu Lys Leu Cys Pro His Glu Glu Phe Leu Arg105 110 115CTA TGT AAA GAA AGA GCT GAA GAG ATC TAT CCA ATA AAG GAG AGA AAC437Leu Cys Lys Glu Arg Ala Glu Glu Ile Tyr Pro Ile Lys Glu Arg Asn120 125 130AAC CGC ACA CGC CTG GCT CTC ATC ATA TGC AAT ACA GAG TTT GAC CAT485Asn Arg Thr Arg Leu Ala Leu Ile Ile Cys Asn Thr Glu Phe Asp His135 140 145CTG CCT CCG AGG AAT GGA GCT GAC TTT GAC ATC ACA GGG ATG AAG GAG533Leu Pro Pro Arg Asn Gly Ala Asp Phe Asp Ile Thr Gly Met Lys Glu150 155 160CTA CTT GAG GGT CTG GAC TAT AGT GTA GAT GTA GAA GAG AAT CTG ACA581Leu Leu Glu Gly Leu Asp Tyr Ser Val Asp Val Glu Glu Asn Leu Thr165 170 175 180GCC AGG GAT ATG GAG TCA GCG CTG AGG GCA TTT GCT ACC AGA CCA GAG629Ala Arg Asp Met Glu Ser Ala Leu Arg Ala Phe Ala Thr Arg Pro Glu185 190 195CAC AAG TCC TCT GAC AGC ACA TTC TTG GTA CTC ATG TCT CAT GGC ATC677His Lys Ser Ser Asp Sar Thr Phe Leu Val Leu Met Ser His Gly Ile200 205 210CTG GAG GGA ATC TGC GGA ACT GTG CAT GAT GAG AAA AAA CCA GAT GTG725Leu Glu Gly Ile Cys Gly Thr Val His Asp Glu Lys Lys Pro Asp Val215 220 225CTG CTT TAT GAC ACC ATC TTC CAG ATA TTC AAC AAC CGC AAC TGC CTC773Leu Leu Tyr Asp Thr Ile Phe Gln Ile Phe Asn Asn Arg Asn Cys Leu230 235 240AGT CTG AAG GAC AAA CCC AAG GTC ATC ATT GTC CAG GCC TGC AGA GGT821Ser Leu Lys Asp Lys Pro Lys Val Ile Ile Val Gln Ala Cys Arg Gly245 250 255 260GCA AAC CGT GGG GAA CTG TGG GTC AGA GAC TCT CCA GCA TCC TTG GAA 869Ala Asn Arg Gly Glu Leu Trp Val Arg Asp Ser Pro Ala Ser Leu Glu265 270 275GTG GCC TCT TCA CAG TCA TCT GAG AAC CTG GAG GAA GAT GCT GTT TAC 917Val Ala Ser Ser Gln Ser Ser Glu Asn Leu Glu Glu Asp Ala Val Tyr280 285 290AAG ACC CAC GTG GAG AAG GAC TTC ATT GCT TTC TGC TCT TCA ACG CCA 965Lys Thr His Val Glu Lys Asp Phe Ile Ala Phe Cys Ser Ser Thr Pro295 300 305CAC AAC GTG TCC TGG AGA GAC AGC ACA ATG GGC TCT ATC TTC ATC ACA 1013His Asn Val Ser Trp Arg Asp Ser Thr Met Gly Ser Ile Phe Ile Thr310 315 320CAA CTC ATC ACA TGC TTC CAG AAA TAT TCT TGG TGC TGC CAC CTA GAG 1061Gln Leu Ile Thr Cys Phe Gln Lys Tyr Ser Trp Cys Cys His Leu Glu325 330 335 340GAA GTA TTT CGG AAG GTA CAG CAA TCA TTT GAA ACT CCA AGG GCC AAA 1109Glu Val Phe Arg Lys Val Gln Gln Ser Phe Glu Thr Pro Arg Ala Lys345 350 355GCT CAA ATG CCC ACC ATA GAA CGA CTG TCC ATG ACA AGA TAT TTC TAC 1157Ala Gln Met Pro Thr Ile Glu Arg Leu Ser Met Thr Arg Tyr Phe Tyr360 365 370CTC TTT CCT GGC AAT TGAAAATGGA AGCCACAAGC AGCCCAGCCC TCCTTAATCA 1212Leu Phe Pro Gly Asn375ACTTCAAGGA GCACCTTCAT TAGTACAGCT TGCATATTTA ACATTTTGTA TTTCAATAAA 1272AGTGAAGACA AAAAAAAAA1291以及一種包含編碼一種能誘導細胞凋亡的人多肽的DNA序列的并具有上述SEQ ID No.1序列的核苷酸序列的DNA序列。
本發明的具體目標是編碼一種具有蛋白酶活性并能誘導細胞凋亡的人多肽并具有上面序列SEQ ID No.1的核苷酸序列的DNA序列。
上述編碼具有377個氨基酸的蛋白質的DNA序列是一種cDNA序列，它可用PCR從LPS激活的單核細胞或人多核細胞或胎盤的RNA開始擴增而獲得，由于以前鑒定了ICE序列的寡核苷酸衍生物和同源基因的序列，根據操作條件進一步給出了詳細描述。
對蛋白酶活性的發現以及誘導細胞凋亡的能力在實驗部分進行了進一步描述。
本發明的更具體的目標是編碼一種具有蛋白酶活性并能誘導細胞凋亡的具有序列SEQ ID No.1從42位核苷酸開始到1172位核苷酸結束的序列的DNA序列以及可與之雜交并具有相同功能的DNA序列。
在可雜交的序列之中，包括可在嚴謹條件下雜交并編碼具有同樣活性的多肽的DNA序列。嚴謹雜交條件包括例如根據Maniatis等.，分子克隆，冷泉港實驗室出版社出版，1989，報道的雜交條件在5×SSPE，10×Denhardt；100μg/ml DNAss；1％SDS溶液中在65℃雜交18小時，接著用2×SSC；0.05％SDS洗3次，每次5分鐘，然后在65℃1×SSC；0.1％SDS中洗3次，每次15分鐘。
本發明的相當具體地目標是具有序列SEQ ID No.1從42位核苷酸開始到1172位核苷酸結束的序列的DNA序列。
序列SEQ ID No.1的知識可用例如已知的化學合成方法或用已知雜交技術用合成的寡核苷酸探針篩選基因文庫或cDNA文庫產生本發明。
本發明還涉及具有蛋白酶活性并能誘導細胞凋亡并具有序列SEQID No.2的氨基酸序列的人多肽Met Ala Glu Gly Asn His Arg Lys Lys Pro Leu Lys Val Leu Glu Ser1 5 10 15Leu Gly Lys Asp Phe Leu Thr Gly Val Leu Asp Asn Leu Val Glu Gln20 25 30Asn Val Leu Asn Trp Lys Glu Glu Glu Lys Lys Lys Tyr Tyr Asp Ala35 40 45Lys Thr Glu Asp Lys Val Arg Val Met Ala Asp Ser Met Gln Glu Lys50 55 60Gln Arg Met Ala Gly Gln Met Leu Leu Gln Thr Phe Phe Asn Ile Asp65 70 75 80Gln Ile Ser Pro Asn Lys Lys Ala His Pro Asn Met Glu Ala Gly Pro85 90 95Pro Glu Ser Gly Glu Ser Thr Asp Ala Leu Lys Leu Cys Pro His Glu100 105 110Glu Phe Leu Arg Leu Cys Lys Glu Arg Ala Glu Glu Ile Tyr Pro Ile115 120 125Lys Glu Arg Asn Asn Arg Thr Arg Leu Ala Leu Ile Ile Cys Asn Thr130 135 140Glu Phe Asp His Leu Pro Pro Arg Asn Gly Ala Asp Phe Asp Ile Thr145 150 155 160Gly Met Lys Glu Leu Leu Glu Gly Leu Asp Tyr Ser Val Asp Val Glu165 170 175Glu Asn Leu Thr Ala Arg Asp Met Glu Ser Ala Leu Arg Ala Phe Ala180 185 190Thr Arg Pro Glu His Lys Ser Ser Asp Ser Thr Phe Leu Val Leu Met195 200 205Ser His Gly Ile Leu Glu Gly Ile Cys Gly Thr Val His Asp Glu Lys210 215 220Lys Pro Asp Val Leu Leu Tyr Asp Thr Ile Phe Gln Ile Phe Asn Asn225 230 235 240Arg Asn Cys Leu Ser Leu Lys Asp Lys Pro Lys Val Ile Ile Val Gln245 250 255Ala Cys Arg Gly Ala Asn Arg Gly Glu Leu Trp Val Arg Asp Ser Pro260 265 270Ala Ser Leu Glu Val Ala Ser Ser Gln Ser Ser Glu Asn Leu Glu Glu275 280 285Asp Ala Val Tyr Lys Thr His Val Glu Lys Asp Phe Ile Ala Phe Cys290 295 300Ser Ser Thr Pro His Asn Val Ser Trp Arg Asp Ser Thr Met Gly Ser305 310 315 320Ile Phe Ile Thr Gln Leu Ile Thr Cys Phe Gln Lys Tyr Ser Trp Cys325 330 335Cys His Leu Glu Glu Val Phe Arg Lys Val Gln Gln Ser Phe Glu Thr340 345 350Pro Arg Ala Lys Ala Gln Met Pro Thr Ile Glu Arg Leu Ser Met Thr355 360 365Arg Tyr Phe Tyr Leu Phe Pro Gly Asn370 375以及該序列的等位基因或其類似物。
在等位基因和類似物中，包括由替換，缺失或增加一個或多個氨基酸以使這些產物保留同樣的功能的修飾的序列。
本發明的具體目標是具有序列SEQ ID No.2的氨基酸序列并稱為Tx蛋白的多肽。
本發明的一個方面還涉及根據本發明在宿主細胞中表達編碼序列SEQ ID No.2的氨基酸序列的DNA而獲得的多肽。
當通過在宿主細胞中表達而獲得本發明的多肽時，可根據已知遺傳工程和細胞培養方法進行。
表達可在原核細胞例如大腸桿菌中進行或者在真核細胞例如Cos細胞中表達，該細胞包含編碼本發明多肽的由合適的啟動子啟始的DNA序列。
本發明特別涉及由在真核宿主細胞中表達而獲得的本發明的多肽。
本發明相當具體地涉及本發明的其蛋白酶活性相應于IL-1β轉換酶成熟能力的多肽。進一步描述了測定該特定蛋白酶活性的實施例。
本發明還有一個目的是一個表達載體以及用上面載體轉化的宿主細胞，其中表達載體含有編碼一種具有蛋白酶活性并能誘導細胞凋亡的人多肽的DNA序列。
表達載體是已知的允許在合適的啟動子的控制之下表達蛋白質的載體。對原核細胞來說，啟動子可以是例如是lac啟動子，trp啟動子，tac啟動子，β乳糖酶啟動子或pL啟動子。對酵母細胞來說，啟動子可以是例如pGK啟動子或AD啟動子。對哺乳動物來說，啟動子可以是例如SV40啟動子或腺病毒的啟動子。也可用桿狀病毒類型的載體在昆蟲細胞中進行表達。
宿主細胞是例如原核細胞或真核細胞。原核細胞有例如大腸桿菌、芽孢桿菌屬或鏈霉菌屬菌。真核宿主細胞包括酵母以及高等生物的細胞，如哺乳動物細胞或昆蟲細胞。哺乳動物細胞有例如倉鼠CHO或BHK細胞和猴Cos細胞等成纖維細胞。昆蟲細胞有例如SF9細胞。
本發明涉及包括在用編碼序列SEQ ID No.2的氨基酸序列的DNA轉化的宿主細胞中表達Tx蛋白的方法以及特別是其中宿主細胞是真核細胞的方法。
本發明的目標還有抗本發明的多肽的抗體。
可根據已知的方法制備本發明的多克隆或單克隆抗體并且可用于例如Tx蛋白的測試，例如在ELISA測試中，并可做為診斷劑。
如進一步所給出的結果所表明的，本發明的新Tx蛋白具有顯著地生物學特征，尤其是蛋白酶活性，值得注意地是成熟IL-1β轉換酶的能力以及誘導細胞凋亡的能力。
根據本發明的Tx蛋白的這些生物學特征使其可用于例如其中包含IL-1β的自身免疫疾病的治療，傷口愈合或對放射性治療副作用的減輕，或用于例如其中包含細胞凋亡的癌癥和感染領域。
因此本發明的一個目標即是將本發明的多肽用做藥物。
本發明涉及包含將上述的藥物用做活性組分的藥用組合物以及特別涉及調節IL-1β的產生或調節細胞凋亡的藥用組合物。
在上述藥用組合物的制備中活性組分可與常規賦形劑一起被摻入。該組合物可通過非胃腸道，口服或局部途徑給藥。
由本發明的多肽可以設想由這些多肽的抑制劑組成的新治療劑以及它們做為藥物的用途，例如用于治療自身免疫疾病相關的炎癥，敗血性休克或神經退變性疾病。
本發明還有一個目標是與從序列SEQ ID No.1的42位核苷酸開始到1172位核苷酸結束的DNA序列雜交并具有同樣功能的DNA序列。
雜交反應可在例如含1×SSC，0.1％SDS的緩沖液中60℃洗2次，每次30分鐘。
本發明特別涉及編碼具有蛋白酶活性并能誘導細胞凋亡的多肽以及具有序列SEQ ID No.22的核苷酸序列的DNA序列，和更特別涉及序列SEQ ID No.22從104核苷酸開始到1195位核苷酸結束的序列。
上面的編碼具有364個氨基酸的蛋白的DNA序列SEQ ID No.22，是一種可由例如在Tx cDNA序列(SEQ ID No.1)的寡核苷酸衍生物的基礎之上，從人脾臟或胎盤的cDNA用PCR擴增而來的cDNA序列。在實驗部分給出了詳細制備實例。序列SEQ ID No.22的知識使之可用例如已知的化學合成或通過使寡核苷酸探針的雜交技術篩選基因文庫或cDNA文庫的方法實現本發明。
本發明還有一個目的是一種人多肽，它具有蛋白酶活性并能誘導細胞凋亡并具有序列SEQ ID No.23的氨基酸序列并被稱為TY蛋白。
本發明的一個方面還涉及一種根據本發明的多肽，它是由在宿主細胞中表達編碼序列SEQ ID No.23的氨基酸序列的DNA而得到的。
本發明還包括為獲得TY蛋白而表達所需的宿主細胞和表達載體，以及已在上文出示的表達Tx蛋白的實施例。
本發明還涉及一種方法，它包括在用編碼序列SEQ ID No.23的氨基酸序列的DNA轉化的宿主細胞中表達TY蛋白。
本發明還包括抗TY蛋白的多克隆抗體或單克隆抗體。
本發明還涉及包含TY蛋白做為藥物的藥用組合物。
附圖出示本發明的一些方面

圖1代表用Southern印跡在來自用限制酶BglII(曲線A)；PstI(曲線B)；HindIII(曲線C)；BamHI(曲線D)消化的pBMC人基因組DNA中對ICE同源序列的檢測。檢測是通過與32P標記的ICE外顯子6探針的雜交而實現的。
圖2代表基因T2外顯子6的核苷酸序列(SEQ ID No.5)。
圖3代表Tx cDNA的核苷酸序列(SEQ ID No.1)和相應的氨基酸序列(SEQ ID No.5)。
圖4代表在如下組織中用Northern印跡對Tx mRNA的檢測脾臟(曲線A)；胸腺(曲線B)；前列腺(曲線C)；精巢(曲線D)；卵巢(曲線E)；小腸(曲線F)；結腸(曲線G)；外周白細胞(曲線H)。檢測是通過與32P標記的“Tx外顯子6”探針的雜交實現的。
圖5代表在Cos-1細胞中成熟IL-1β的分泌，其中該細胞組成性含有pIL-1β并與不含DNA的對照培養基相比(曲線1)被含ICE(曲線2)或Tx(曲線3)的載體pcDL-SRα296；單獨地載體pCD4-SRα296(曲線4)，載體pcDNA/Amp單用(曲線5)，載體pcDNAI/Amp含Tx(曲線6)或ICE p30(曲線7)轉化。用ELISA(A溫育16小時；B溫育24小時)測定細胞上清中成熟IL-1β的量(pg/ml)。
圖6代表ICE p30前體在Cos-1細胞中的裂解，其中Cos-1細胞被載體pcDL-SRα296單獨(曲線A)或含標記的突變T7-ICEp30C對5S(曲線B)的該載體轉染或被含標記的突變體T7-ICEp30C285S的載體pcDL-SRα296和含ICE p30(曲線C)或ICE p45(曲線D)或Tx(曲線E)的載體共轉染。以被含單獨的Tx的載體pcDL-SRα296轉染檢驗為對照，用抗T7抗體通過Western印跡進行檢測(曲線F)。
圖7代表在Cos-1細胞相對于不含DNA的對照培養(A)被載體pcDL-SRα296單獨(7B)或含Tx(7C)或含ICE p45(7D)轉染22小時培養后Tx蛋白在細胞中誘導的細胞凋亡(放大倍數×400)。
圖8代表相對于無DNA的對照培養物(A)被含ICE p45(曲線B)或Tx(曲線C)或載體自己(曲線D)的載體pcDL-SRα296轉染的Cos-1細胞的DNA。在瓊脂糖凝膠上遷移之后用BET染色后進行檢測，以HindIII消化的λ噬菌體(M1)DNA和HindIII消化的φx174噬菌體DNA(M2)為DNA大小標準。
圖9代表在Cos-2細胞中突變TY蛋白(T7TYΔ67C245S)的裂解，該細胞被載體pcDL-SRα296單獨(曲線B)或載體pcDNA I/Amp單用(曲線C)或載體p T7TYΔ67C245S(曲線F；23小時和曲線G；43小時)共轉染。相對無DNA的對照培養物(曲線A)和分子量標記(曲線D；不可檢測)通過Western印跡進行檢測。
下面的實施例用于說明但不限制本發明。實施例I序列Tx的鑒定A-人ICE同源基因的發現用相應于ICE基因外顯子6的DNA探針通過Southern印跡對ICE同源基因進行鑒定。a)外顯子6 ICE探針的制備人ICE外顯子6的界限以及完整的人ICE基因內含子/外顯子的構造已有描述(Cerretti等，已引用)。外顯子6(235bp)相應于所述ICEp45 cDNA序列G35-868位的核苷酸(Thornberry等，已引用)。
用下面的寡核苷酸通過PCR擴增法制備外顯子6 ICE探針。ICE 6.5ACATGACTAC AGAGCTGGAG (SEQ ID No.3)ICE 6.3CACCACGGCA GGCCTGGATG (SEQ ID No.4)該寡核苷酸是通過應用公開數據(Thornberry等，已引用)選擇，合成并用RT-PCR擴增用RNATM試劑盒提取和純化的來源自人血單核細胞的RNA，擴增條件如下酶Biotaq(Bioprobe)；30個循環(94℃，1mn；60℃，1mn；72℃，1mn)；PCR設備Perkin-Elmer(GeneAmp PCR System 9000)。
將得到的DNA外顯子6在Spin X柱(Costar)離心純化并用寡核苷酸標記試劑盒(Pharmacia Biotech)通過隨機引物技術用32P標記b)基因組DNA的雜交Southern印跡將得到的放射性標記外顯子6 ICE探針用做人基因組DNA的雜交探針。
用TurboGen試劑盒(Invitrogen)從外周血單核細胞(PBMC)出發制備的人基因組DNA，然后分別用限制酶BglII，PstI，HindIII或BamHI(Boenringer Mannheim)切割，遷移在1×TAE 0.9％瓊脂糖凝膠上，轉移到尼龍GeneScheen Plas膜上(NEN Dupont)，然后與外顯子6 ICE探針雜交。
雜交條件如Maniatis等所述(已引用過)在5×SSPE，10×Denhart，100μg/ml DNAss，1％SDS，65℃過夜，接著用連續在2×SSC，0.05％SDS，30分鐘環境溫度洗滌膜，然后是在1×SSC，0.1％SDS，30mn 65℃洗膜，這些是高度嚴謹的。用下面的貯液制備洗膜緩沖液。20×SSC；3M NaCl水溶液，0.3M檸檬酸鈉。10％SDS十二烷基磺酸鈉水溶液。洗過之后，將膜對Hyperfilm MP膠片(Amersham)曝光。
如圖1所示，對每種限制酶來說可看到對應于不同大小的DNA片段的3-4條帶，其中對它們當中的一些對應于ICE高度同源的基因但卻與后者不同，因為在與對應于單個外顯子的探針的雜交中，一個基因只能產生一條或至多兩條獨立的帶。B-ICE同源基因的克隆a)ICE同源的基因組序列的克隆為了對上述得到的不同的DNA片段進行鑒定，根據Maniatis等所描述的各種(已引用過)，將從外周血單核細胞(PBMC)提取而來的并用HindIII酶(Boehringer Monnheim)消化的人基因組DNA片段在1×TAE，1.5％瓊脂糖凝膠制備電泳上進行分離。將相應于分子量小于2.3kb的部分切成20等份，然后對從每一部分中洗脫下來的DNA用上述的寡核苷酸ICE 6.5(SEQ ID No.3)和ICE 0.3(SEQ ID No.4)進行擴增，擴增條件如下94℃，1mn；55℃，1mn；72℃，1mn；30個循環；BioTaq聚合酶。
在上面的20個部分當中，保留了用PCR進行最大擴增的8個部分。用7A克隆試劑盒(Invitrogen)根據生產商的說明用T4DNA連接酶在載體pCR II中對擴增物質進行克隆，并用Macrophor電泳設備材料(Pharmacia System)應用測序酶通過Sanger技術進行測序。將得到的序列用GCG軟件進行分析(Deveraux等，核酸研究12，387-395(1984))。
在得到的核苷酸序列中，已鑒定了一個與ICE外顯子6的序列有92％的核苷酸同源性的稱為T2的序列。
如圖2所示核苷酸序列T2具有覆蓋全部外顯子6(SEQ ID No.5)的開放可讀框，這就試圖編碼T2蛋白的信使RNA進行鑒定并試圖對對應于T2的cDNA進行克隆。b)ICE同源cDNA的克隆從LPS活化18小時的單核細胞，或胎盤，或從外周血分離的多核細胞中用RNATM試劑盒(Bioprobe)提取和純化RNA。根據生產商的說明應用Gene Amp RNA PCR試劑盒(Perkin Elmer)使用多聚dT聚核苷酸和反轉錄酶合成相應的cDNA并用下面的兩個寡核苷酸進行PCR擴增。T2.ACTACAGAGCTGGAGGCATTTGCT(SEQ ID No.6)選自編碼T2外顯子6的序列，以便特異地擴增T2類型的序列而不是ICE序列，和ICE45.3 TTAATGTCCTGGGAAGAGGTAGAA(SEQ ID No.7)選自ICE cDNA引端編碼區的序列(互補鏈)。
從3個RNA制品中分別得到了大約600堿基對的片段，擴增條件如下94℃，30s；60℃，30s；72℃，30s；30個循環，使用GeneAmpRNA PCR試劑盒(Perkin Elmer)。如上所示用7A克隆試劑盒(Invitrogen)對該片段進行克隆和測序。這樣確定的核苷酸序列不是對應于期望的T2cDNA而是我們稱為Tx的新的cDNA。C-Tx cDNA的鑒定a)Tx cDNA連續序列的確定使用來自胎盤的cDNA通過錨式PCR技術獲得Tx cDNA的5′和3′末端的核苷酸序列。
應用5′Race-Ready cDNA試劑盒(人快速克隆cDNA)(Clontech)和下面的寡核苷酸對Tx cDNA的5′端進行擴增。
TxPCR5AGAGGCAGTTG CGGTTGTTGA A(SEQ ID N°8)TxPCR5BCTCTGACCCA CAGTTCCCCA C(SEQ ID N°9)應用3′RACE System試劑盒(Gibco-BRL)和下面的擴增寡核苷酸對Tx cDNA引端進行擴增。
TxAAACTGTGCAT GATGAGA(SEQ ID N°10)TxBAGATGCTGTG TACAAGACC (SEQ ID N°11)這兩個獨立的引物對來自上面所得到的Tx的部分序列。
然后如上所述用7A克隆試劑盒(Invitrogen)對得到的入增片段進行克隆和測序。
由于使用了上面的TxA寡核苷酸(SEQ ID No.10)和TxB寡核苷酸(SEQ ID No.11)和下面的寡核苷酸而確定了該核苷酸序列TxCGCCTGGACAA TGATGAC(SEQ ID N°12)TxDTGATGAAGAT AGAGCCC(SEQ ID N°13)Tx1CGGGTCATGG CAGACTC(SEQ ID N°14)Tx2GTTTGAAGAA GCATTTG(SEQ ID N°15)Tx3CCTGAGTCAG GAGAATC(SEQ ID N°16)Tx4AGTCTCAGGA ATTCTTC(SEQ ID N°17)Tx5AGCTGACTTT GACATCA(SEQ ID N°18)Tx6GCGCTGACTC CATATCC(SEQ ID N°19)
這些寡核苷酸選自編碼Tx的序列(編碼鏈或互補鏈)。
將所有得到的序列排序即得到了如圖3所示的Tx cDNA的連續核苷酸序列。這樣確定的序列包括帶有多聚腺苷酸化尾部的1291個核苷酸。它具有一個從42位核苷酸甲硫氨酸啟動子開始到1172位核苷酸終止密碼子結束的開放可讀框。結果是一個編碼具有377氨基酸的蛋白的1131個核苷酸的開放可讀框。b.Tx cDNA編碼區的克隆用下面的寡核苷酸從單核細胞，或多核細胞或胎盤的總RNA出發通過RT-PCR擴增Tx cDNA的編碼區(SEQ ID No.1)TxP5CGCGGATCCACCATGGCAGAAGGCAACCACAGA (SEQ ID N°20)TxP3GGCTCTAGACTCGAGTTATCAATTGCCAGGAAAGAGGTA(SEQ ID N°21)根據前述確定的Tx cDNA連續序列(或互補鏈)而選擇和合成了這些擴增引物，并分別給寡核苷酸TxP5和XbaI添加了BamHI和NcoI克隆位點和給寡核苷酸TxP3添加了XhoI克隆位點。
將上面得到的約1150堿基對的擴增產物用BamHI和XbaI酶(Boehringer Mannheim)消化并應用Amersham連接試劑盒，在用同樣的限制酶BamHI和XbaI預先消化的載體pcDNAI/Amp(Invitrogen)中克隆。用上面的寡核苷酸TxA、TxB、TxC、TxD、Tx1、Tx2、Tx3、Tx4、Tx5和Tx6對兩條鏈的克隆產物全部測序。
對所用的每個起始RNA來說，所得到的寡核苷酸序列都與上面的編碼Tx cDNA連續序列的序列(SEQ ID No.1)相一致。因此在所用的來自不同個體的不同組織之間看不到差異。
Tx cDNA的編碼區編碼Tx蛋白，其所來源的氨基酸序列如圖3所示(SEQ ID No.2)。Tx蛋白包含377個氨基酸，計算分子量為43.26kDa。通過在序列的排列中導入不連續性，從氨基酸方面來說Tx蛋白的序列與ICE p45前體的序列在同源性上有最多52％一致性。在載體pcDNAI/Amp(Tx cDNA/pcDNAI·13/07/94)中包含編碼TxcDNA(SEQ ID No.1)的區域的大腸桿菌XL-1蘭(E.coli XL-1 blue)樣品被保藏在國立微生物保藏中心(CNCM)，日期1994年7月29日，保藏號I-1462。c-在不同人組織中Tx mRNA的表達對8個不同組織中編碼Tx蛋白的mRNA的表達進行了研究，這是通過應用相應于與ICE外顯子6(“Tx外顯子6”)相一致的Tx部分的DNA探針通過Northern印跡進行的。該探針對應于序列SEQ ID No.1的595～811位核苷酸。
通過從含Tx cDNA的質粒開始用上面的寡核苷酸T2A(SEQ IDNo.6)和TxC(SEQ ID No.12)為引物擴增該序列而制備探針“Tx外顯子6”。
通過隨機引物法用寡核苷酸標記(oligolabelling)試劑盒(Phermacia BioTech)進行32P標記，然后根據生產商提供的雜交條件對在Multiple Tissue Worthern B1ot II膜(Clontech)上的含不同人組織的2μg RNA poly At的Tx mRNA進行雜交檢測。
如圖4所示，在大多數用可變強度檢測的組織中檢測到了mRNA信號。外周血白細胞(H)產生了最強的信號。脾臟(A)，小腸(F)，胸腺(B)和卵巢(E)產生中等的信號。前列腺(C)和結腸(G)產生了很弱的信號并最后在精巢mRNA中(D)檢測不到任何信號。
因此編碼Tx蛋白的mRNA可在多種組織特別是血細胞中表達。實施例2對Tx蛋白功能的研究A-IL-1β前體的斷裂在帶有表達載體pcDNAI/Amp和pcDL-SRα296之一或其載體的真核細胞轉染系統中檢測Tx蛋白任意切割人IL-1β前體的能力。
首次在真核表達載體pcDNA/Amp(Invitrogen)的BamHI和XbaI位點對Tx cDNA的編碼區(SEQ ID No.1)進行了克隆。在用BamHI和XbaI消化之后，分離并純化了一個約1150堿基對的插入。用T4DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)將限制性末端補齊。將得到的cDNA用連接試劑盒(Amershem)在XbaI酶打開的載體pcDL-SRα296(Takebe等.，分子和細胞生物學， Vol.8，466，1988)中亞克隆并用T4DNA聚合酶末端補齊。在用質粒Maxi試劑盒(QIAGEN)純化之后，即得到了在兩個載體之中的Tx質粒DNA制品。
用于轉染的真核細胞是組成性表達pIL-1β的Cos-1細胞系，它是由含人pIL-1β的基因的質粒轉染得到的。通過將細胞培養在含0.5mg/ml G-418硫酸鹽，10％FCS，谷氨酰胺，P/S，丙酮酸，HEPES的DMEM培養基中，可維持在該細胞系中pIL-1β的合成。
將3×106Cos-1細胞在37℃潮濕空氣5％CO2下培養在佩特里培養碟中并用15μg質粒轉染，該質粒DNA在加入培養碟之前預先與200μl DEAE-DEXTRAN混合并用4ml PBS稀釋。在37℃培養30分鐘并向其中加入8ml 80μm的溶于不含血清的DMEM中的氯醌溶液之后，將細胞培養2.5小時。然后吸去上清液并將細胞在無血清DMEM中以10％DMSO處理2分鐘。在用無血清培養基洗滌之后，加入10ml上面的完全培養基。培養之后，在16到45小時之間不同時間點收集轉染細胞的上清液。
應用可對成熟IL-1β進行特異檢測的ELISA IL-1β測試(R&D Systems)對上清液中的成熟IL-1β進行測定。
將插入到上面兩個載體中之一的Tx cDNA編碼區的轉染與分別含ICE p45或ICE p30的cDNA編碼區的轉染以及做為對照的用不含質粒的只有對應載體的轉染相比較進行。
如圖5所示，ICE p45(柱2)或p30(柱7)cDNA的轉染賦予細胞分泌成熟IL-1β的能力。相反，當在相同條件下用Tx cDNA轉染時(柱3和6)，相對于對照轉染(柱1、4、5)未觀察到IL-1β的分泌。不管培養時間如何，用兩個載體轉染有類似的結果(16h圖5A；24h圖5B；29h和直到44h)。
蛋白質Tx不具有IL-1β轉換酶特征。B-Tx蛋白的蛋白酶活性ICE的30kDa前體的裂解對Tx蛋白的可任意裂解ICE的30kDa前體(ICE p30)的能力進行了測定，這是在同時導入了含Tx cDNA(SEQ ID No.1)編碼區的載體和含編碼修飾的ICE蛋白的DNA導入Cos-1細胞中共轉染系統進行的，每種DNA被分別插入到上面的表達載體pcDL-SRα296中。
蛋白ICE被兩次修飾一方面，為了可在Tx蛋白的存在下對蛋白ICE進行特異的檢測，將一個小的T7肽融合到蛋白ICE p30的N末端。因此該蛋白被標記了或者可用T7肽的單克隆抗體檢測其成熟產物(Tsui等.，美國國家科學院院刊.，89，8864，1992)。另一方面以一種不能誘導其自身成熟的形式表達該酶，使用了一種突變的ICE p30，活性位點的半胱氨酸，Cys 285被絲氨酸取代(Wilson，K.P.等，自然，370，1994年7月28日，270-275)。因此該酶是非活化的并且不能誘導其自身的成熟或pIL-1β的裂解。用TransformerTM定點突變試劑盒(Clontech)和合適的寡核苷酸通過定點突變制備突變體。對得到的序列進行徹底驗證。由此得到了標記的和突變的稱為T7-ICE p30C285S的ICE p30。
根據上面的操作條件，用含T7-ICE p30C285S的載體pcDL-SRα296或含Tx的載體pcDL-SRα296轉染Cos-1細胞轉染，或用上面兩個載體共轉染。在培養22小時之后，收集細胞并洗滌，以及在含10mM NaCl，10mM Hepes，pH7.4，1mM EDTA，50mM NaF，0.2％Triton X-100，1μg/ml Leupeptin，20U/μl aprotinin和1mMPMSF的緩沖液中溶解。將細胞溶解產物在400g 4℃離心，然后用SDS-PAGE 16％聚丙烯酰胺凝膠上對上清進行電泳。然后將凝膠上蛋白轉移到硝酸纖維素膜上并用抗T7小鼠單克隆抗體(Novagen)在環境溫度下溫育2小時。洗膜然后用偶聯了堿性磷酸酶的小鼠抗免疫球蛋白羊抗體溫育1小時。然后用堿性磷酸酶底物(promega)顯示固定于膜上的抗體。
用同樣的方式用含T7-ICE p30C285S的pcDL-SRα296載體和含用以代替Tx的ICE p30或ICE p45的載體pcDL-SRα296進行共轉染。
如圖6所示，當突變的蛋白ICE p30(T7-ICE p30C285S)單獨在轉染的Cos細胞中表達時，可檢測到T7-p30形式的酶(表觀分子量35kDa)(曲線B)。對于p20形式的帶的缺乏表明突變酶自身不能裂解。當細胞含ICE p30酶(曲線C)或p45酶(曲線D)的載體共轉染時，可觀察到對于由活性酶產生的T7-p20的裂解產物的表觀分子量為29kDa的帶。當細胞被含Tx(曲線E)的載體共轉染時，也觀察到了表觀分子量20kDa帶的出現并伴隨著兩條次要的約31和28kDa的帶。不同的帶對應于在細胞中表達的Tx蛋白對ICE p30形式的裂解產物。
這些結果表明，一方面Tx蛋白在轉染的Cos細胞中表達，而另一方面其具有蛋白酶活性。另外，Tx蛋白能裂解ICE 30kDa前體并因此可引起在體內ICE原酶的成熟并產生活性形式的酶。C-Tx蛋白對細胞凋亡的誘導通過在Cos細胞中的轉染以及培養細胞的形態檢驗對Tx蚤白誘導細胞凋亡的能力進行檢測。
對在不同細胞類型中ICE的轉染導致這些細胞以細胞凋亡形式死亡已有報道(Miura等，已引用)。
如上所述用含Tx cDNA(SEQ ID No.1)編碼區的載體以及含ICE p45的載體pcDL-SRα296對Cos-1細胞進行轉染。在培養22小時后對細胞的形態進行觀察。
對圖7所示，在ICE cDNA(7D)轉染的Cos細胞培養物中觀察到了從支持物上脫離下來的圓形細胞的出現以及細胞凋亡的特征的細胞的形態初現。在Tx cDNA轉染的Cos細胞培養物(7C)中觀察到了同樣的形態改變。
當上面的載體pcDNAI/Amp被用于在轉染Cos-1細胞得到了同樣的形態結果。
這些結果由從轉染的Cos-1細胞在轉染后培養40小時的分離的DNA的觀察結果得到了確證。用micro TurboGen試劑盒(Invitrogen)制備細胞DNA，在1.5％瓊脂糖凝膠上遷移并用BET染色。
如圖8所示，在用ICE p45(曲線B)和Tx(曲線C)轉染細胞的DNA具有凋亡細胞“梯狀”特征表型出現。
用無DNA(7A和8A)或不含cDNA(7B和8D)的載體都不具有凋亡細胞的DNA形態。
這些結果表明Tx蛋白包含在細胞凋亡的誘導之中。實施例3TY序列的鑒定A-Tx同源基因的克隆將從外周血單核細胞提取的人基因組DNA用HindIII酶消化(Boehringer Mannbeim)，然后在1％瓊脂糖，1×TAE凝膠根據已引用過的Maniatis等所描述的條件進行制備電泳以分離片段。將對應于分子量大于1.9kb的克隆孔區域的凝膠切成24等份，然后用從每個部分洗脫下來的DNA應用已描述過的T2A(SEQ ID No.6)和TxC(SEQID No.12)寡核苷酸進行PCR擴增，擴增條件如下94℃，30秒；55℃，30秒；72℃，1mn；30個循環；BioTaq聚合酶(Bioproke)。
在上面的24部分之中，保留了用PCR產生最大擴增的10個部分。在瓊脂糖凝膠上對擴增物質進行純化并用7A克隆試劑盒(Invitrogen)在pCRII載體進行克隆并應用Macrophor電泳系統(PharmaciaSystem)使用測序酶通過Sanger技術(2.0版本DNA測序試劑盒)進行測序。如實施例1所指明的用GCG軟件對確定的序列進行分析。
將與Tx cDNA序列(SEQ ID No.1)的核苷酸有94.9％-致性的核苷酸序列稱為TY并試圖克隆其對應的TYcDNA。B-TYcDNA的克隆和鑒定a)TYcDNA連續序列的確定用錨式PCR技術分別從人脾臟和胎盤的cDNA獲得了TYcDNA的5′和3′末端核苷酸序列。
用3′RACE System試劑盒(Gibco-BRL)和下面的擴增寡核苷酸對TYcDNA的3′末端進行了擴增。
Ty 3.2CATGTCTCATGGCATCCTA (SEQ ID N°24)和Ty 3.1CTGCGGAACTGCGCATAAAA(SEQ ID N°25).
這兩個引物是從上面得到的TY序列外顯子6的部分序列出發確定。如上所述對擴增片段在瓊脂糖凝膠上進行純化，在載體pCRII中進行了克隆以及進行測序。將得到的序列進行排序使得可對TYcDNA 3′部分編碼區以及非編碼3′區進行了確定。
應用人脾臟5′-RACE-Ready cDNA試劑盒(Clontech)和下面的擴增寡核苷酸擴增了TYcDNA 5′末端Ty5A1GGCTCTAGACTCGAGGTGCTCTTTGATGTTGACAG (SEQ ID N°26)和Ty5A4CTTCTCCTCGTGGATCTTGC (SEQ ID N°27).
通過添加TY5A1的限制位點XbaI和XhoI而從上面得到的TYcDNA3′區確定了這兩個引物。如上所述應用7A克隆試劑盒(Invitrogen)對擴增片段進行克隆以及如上所述進行了測序。
應用上面的TY5A2(SEQ ID No.26)和Ty 3.1(SEQ ID No.25)寡核苷酸和下面的寡核苷酸進行了確證
Ty 2AGATGTTCTTCATGGT (SEQ ID N°28)Ty 4CTTCTCAATATGGACCA (SEQ ID N°29)Ty 5CCTGGCTCTCATCATAT (SEQ ID N°30)Ty 6ATTTGCTGCCAGACCAGA (SEQ ID N°31)Ty 7GCCTGCAGAGGTGAAAAAC(SEQ ID N°32)Ty 8GCTCCATCTTCATTACGGA(SEQ ID N°33)Ty 0GATTTCTGTACCTTCCG (SEQ ID N°34)Ty ATTTATGCGCAGTTCCG (SEQ ID N°35)Ty BGTCATAGTGAGCCCCATT (SEQ ID N°36)Ty CCTTCACGAGGACAAAGT (SEQ ID N°37)Ty DTCGCAAAGAGTCTACCA (SEQ ID N°38)這些寡核苷酸選自TY的編碼序列(編碼鏈或互補鏈)。
將所有得到的序列排序即產生了TYcDNA(SEQ ID No.22)的連續核苷酸序列。b)TYcDNA編碼區的克隆用相應的5′-RACE-Ready cDNA試劑盒(Clontech)，上面的寡核苷酸TY5A1(SEQ ID No.26)和下面的寡核苷酸從人脾臟或胎盤的cDNA開始用PCR擴增TYcDNA(SEQ ID No.22)的編碼區。TYP5CGCGGATCCAAGATGTTGGAATACCTGGGCAAA(SEQ ID No.39)這些擴增引物的選擇是根據上面確定的TYcDNA(SEQ ID No.22)連續序列為TYP5添力BamHI克隆位點而得到的。
如上所示將已被擴增并在瓊脂糖凝膠上純化的具有大約1100堿基對的產物用限制酶BamHI和XbaI消化，然后如實施例1所描述的載體pcDNAI/Amp中進行了克隆并如上指出那樣進行了測序。用上面所定義的寡核苷酸SEQ ID No.28到SEQ ID No.38對上面兩條鏈的克隆產物全部進行了測序。
獲得了一個與TYcDNA(SEQ ID No.22)連續序列的編碼序列的等同序列。TYcDNA的編碼與實施例1獲得的Tx cDNA的編碼序列有84％的核苷酸的一致性。
TYcDNA編碼區編碼具有衍生的SEQ ID No.23的氨基酸序列的TY蛋白。蛋白序列含304個氨基酸，計算分子量41.8kDa。
TY蛋白與實施例1獲得的Tx蛋白序列同源性有76％的氨基酸一致性。
在載體pcDNAI/Amp(TYcDNA/pcDNAI/Amp 30/6/95)中含TYcDNA的編碼區的大腸桿菌XL-1 blue樣品被于1994年7月5日保藏在國立微生物保藏中心，保藏號I-1068。實施例4TY蛋白的生物活性A-誘導細胞凋亡根據實施例2所表明的操作方法并應用由含TYcDNA(SEQ IDNo.22)的編碼區的稱為pcDL-TY的載體pcDL-SRα296轉染的Cos-1細胞檢測了TY蛋白誘導細胞凋亡的能力，并且根據實施例2描述的條件對Tx cDNA的亞克隆進行了制備。
在培養了23小時和43小時之后對細胞的形成形態進行了觀察并在培養43小時之后對其分離的DNA進行了觀察。
與用含Tx或ICE p45編碼區的載體轉染的細胞相比，所得到的結果與實施例2中圖7和圖8所示的結果相一致。
這些結果證明在誘導細胞凋亡中包含像Tx蛋白一樣的TY蛋白。B-TY蛋白的蛋白酶活性在真核細胞共轉染系統中對TY蛋白以分子內方式自身裂解的能力進行了測試，這是在如實施例2中Tx蛋白對ICE前體裂解的相似條件中，通過向Cos-1細胞中同時導入含TYcDNA(SEQ ID No.22)編碼區的載體和含修飾的TY蛋白的編碼DNA載體而進行的，其中如實施例2中所述每種DNA被分別導入表達載體pcDL-SRα296和載體pcDNAI/Amp中。
TY蛋白被修飾兩次，通過“重疊”PCR方法將Cys 245密碼子突變成Ser密碼子；另一方面表位標簽(Tag)T7(MASMTGGQQMG)被導入對應于序列SEQ ID No.23的68-304殘基的TY片段的N末端。
下面的引物對被用于擴增TYcDNA基體。a)一方面，T7TYCGCGGATCCACCATGGCTTCTATGACAGGAGGTCAACAAATGGGACAAAAGATCACCAGTGTAAAACC (SEQ ID N°40)
它們是選自TY的編碼序列并通過在編碼標簽T7的編碼序列之后添加Bam HI限制性位點而合成的。TYC245SRATGTTTTTCACCTCTGGAGGCCTGGACAATGATGAC (SEQ ID N°41)其選自帶有位點17C→G突變的TY編碼序列(互補鏈)，b)另一方面，TYC245SGTCATCATTGTCCAGGCCTCCAGAGGTGAAAAACAT (SEQ ID N°42)其選自帶有20位點G→C突變的TY編碼序列和上面的TY5A1(SEQ ID No.26)并應用下面的擴增條件94℃，1mn；60℃，1mn；72℃，1mn；30個循環；Vent聚合酶(Biolabs)。這兩個分別得到的擴增產物是分別用上面的擴增條件和用T7Ty和TY5A1引物通過PCR聯合和擴增。
將擴增產物用限制酶BamHI和XbaI消化，然后在預先用同樣的限制消化的載體pcDNAI/Amp中克隆。
如上所示制備的表達載體pcDL-SRα296在其中進行TYcDNA序列(SEQ ID No.22)的亞克隆，并被命名為質粒pcDL-TY。
將Cos-1細胞根據實施例2的操作條件用載體pT7TYΔ67C245S轉染，或該質粒和質粒pcDL-TY共轉染，然后培養23小時或43小時，裂解并在聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分析，用小鼠抗T7單克隆抗體進行Western印跡，但其中小鼠抗免疫球蛋白羊抗體是與辣根過氧化物酶偶聯的，而不是與堿性磷酸酶偶聯的。然后用放射自顯影通過Western檢測系統(Amershem)顯示與膜相連接的抗體。
以單獨用載體pcDL-SRα296和載體pcDNAI/Amp同樣的方式進行共轉染并將細胞培養23小時。
如圖9所示，當突變TY蛋白單獨在轉染的Cos細胞中表達時，可檢測到T7TY形式(表觀分子量30kDa)(曲線E)。低分子量的帶的缺乏表明突變TY蛋白不能自身裂解。當細胞被含TY(曲線F&G)的載體共轉染時，在表觀分子量20kDa的地方觀察到了主要帶的出現，這是與突變的TY蛋白的裂解產物相對應的。
這些結果表明一方面TY蛋白在轉染的Cos細胞中表達，并且另一方面其具有蛋白酶活性，以及特別是它能分子內方式自身裂解。
序列表(1)一般的信息(i)申請人(A)姓名ROUSSEL UCLAF(B)街道102，Route de Noisy(C)城市ROMSINVILLR(E)國家FRANCE(F)郵政編碼93230(G)電話49.91.49.91(H)傳真49.91.46.10(ii)發明題目編碼與白介素-1β轉換酶相關的人Tx蛋白的DNA序列，Tx蛋白，生產方法，藥用組合物及其用途(iii)序列數42(iv)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM 兼容PC(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatertIn Release #1.0版本#1.3(EPO)+Corrections in WORDPERFECT 5.1 forSEQ ID No.22(ix)(vi)在先申請數據(A)申請號FR 9409567(B)提交日02-AUG-1994(2)SEQ ID No.1的信息(i)序列特征(A)長度1201堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型cDNA(vi)來源(A)生物體人類(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)位置42..1172(xi)序列描述SEQ ID No.1GCTCTTTCCA ACGCTGTAAA AAAGGACAGA GGCTGTTCCC T ATG GCA GAA GGC 53Met Ala Glu Gly1AAC CAC AGA AAA AAG CCA CTT AAG GTG TTG GAA TCC CTG GGC AAA GAT 101Asn His Arg Lys Lys Pro Leu Lys Val Leu Glu Ser Leu Gly Lys Asp5 10 15 20TTC CTC ACT GGT GTT TTG GAT AAC TTG GTG GAA CAA AAT GTA CTG AAC 149Phe Leu Thr Gly Val Leu Asp Asn Leu Val Glu Gln Asn Val Leu Asn25 30 35TGG AAG GAA GAG GAA AAA AAG AAA TAT TAC GAT GCT AAA ACT GAA GAC 197Trp Lys Glu Glu Glu Lys Lys Lys Tyr Tyr Asp Ala Lys Thr Glu Asp40 45 50AAA GTT CGG GTC ATG GCA GAC TCT ATG CAA GAG AAG CAA CGT ATG GCA 245Lys Val Arg Val Met Ala Asp Ser Met Gln Glu Lys Gln Arg Met Ala55 60 65GGA CAA ATG CTT CTT CAA ACC TTT TTT AAC ATA GAC CAA ATA TCC CCC 293Gly Gln Met Leu Leu Gln Thr Phe Phe Asn Ile Asp Gln Ile Ser Pro70 75 80AAT AAA AAA GCT CAT CCG AAT ATG GAG GCT GGA CCA CCT GAG TCA GGA 341Asn Lys Lys Ala His Pro Asn Met Glu Ala Gly Pro Pro Glu Ser Gly85 90 95 100GAA TCT ACA GAT GCC CTC AAG CTT TGT CCT CAT GAA GAA TTC CTG AGA 389Glu Ser Thr Asp Ala Leu Lys Leu Cys Pro His Glu Glu Phe Leu Arg105 110 115CTA TGT AAA GAA AGA GCT GAA GAG ATC TAT CCA ATA AAG GAG AGA AAC 437Leu Cys Lys Glu Arg Ala Glu Glu Ile Tyr Pro Ile Lys Glu Arg Asn120 125 130AAC CGC ACA CGC CTG GCT CTC ATC ATA TGC AAT ACA GAG TTT GAC CAT 485Asn Arg Thr Arg Leu Ala Leu Ile Ile Cys Asn Thr Glu Phe Asp His135 140 145CTG CCT CCG AGG AAT GGA GCT GAC TTT GAC ATC ACA GGG ATG AAG GAG 533Leu Pro Pro Arg Asn Gly Ala Asp Phe Asp Ile Thr Gly Met Lys Glu150 155 160CTA CTT GAG GGT CTG GAC TAT AGT GTA GAT GTA GAA GAG AAT CTG ACA 581Leu Leu Glu Gly Leu Asp Tyr Ser Val Asp Val Glu Glu Asn Leu Thr165 170 175 180GCC AGG GAT ATG GAG TCA GCG CTG AGG GCA TTT GCT ACC AGA CCA GAG 629Ala Arg Asp Met Glu Ser Ala Leu Arg Ala Phe Ala Thr Arg Pro Glu185 190 195CAC AAG TCC TCT GAC AGC ACA TTC TTG GTA CTC ATG TCT CAT GGC ATC 677His Lys Ser Ser Asp Ser Thr Phe Leu Val Leu Met Ser His Gly Ile200 205 210CTG GAG GGA ATC TGC GGA ACT GTG CAT GAT GAG AAA AAA CCA GAT GTG 725Leu Glu Gly Ile Cys Gly Thr Val His Asp Glu Lys Lys Pro Asp Val215 220 225CTG CTT TAT GAC ACC ATC TTC CAG ATA TTC AAC AAC CGC AAC TGC CTC 773Leu Leu Tyr Asp Thr Ile Phe Gln Ile Phe Asn Asn Arg Asn Cys Leu230 235 240AGT CTG AAG GAC AAA CCC AAG GTC ATC ATT GTC CAG GCC TGC AGA GGT 821Ser Leu Lys Asp Lys Pro Lys Val Ile Ile Val Gln Ala Cys Arg Gly245 250 255 260GCA AAC CGT GGG GAA CTG TGG GTC AGA GAC TCT CCA GCA TCC TTG GAA 869Ala Asn Arg Gly Glu Leu Trp Val Arg Asp Ser Pro Ala Ser Leu Glu265 270 275GTG GCC TCT TCA CAG TCA TCT GAG AAC CTG GAG GAA GAT GCT GTT TAC 917Val Ala Ser Ser Gln Ser Ser Glu Asn Leu Glu Glu Asp Ala Val Tyr280 285 290AAG ACC CAC GTG GAG AAG GAC TTC ATT GCT TTC TGC TCT TCA ACG CCA 965Lys Thr His Val Glu Lys Asp Phe Ile Ala Phe Cys Ser Ser Thr Pro295 300 305CAC AAC GTG TCC TGG AGA GAC AGC ACA ATG GGC TCT ATC TTC ATC ACA 1013His Asn Val Ser Trp Arg Asp Ser Thr Met Gly Ser Ile Phe Ile Thr310 315320CAA CTC ATC ACA TGC TTC CAG AAA TAT TCT TGG TGC TGC CAC CTA GAG1061Gln Leu Ile Thr Cys Phe Gln Lys Tyr Ser Trp Cys Cys His Leu Glu325 330 335 340GAA GTA TTT CGG AAG GTA CAG CAA TCA TTT GAA ACT CCA AGG GCC AAA1109Glu Val Phe Arg Lys Val Gln Gln Ser Phe Glu Thr Pro Arg Ala Lys345 350 355GCT CAA ATG CCC ACC ATA GAA CGA CTG TCC ATG ACA AGA TAT TTC TAC1157Ala Gln Met Pro Thr Ile Glu Arg Leu Ser Met Thr Arg Tyr Phe Tyr360 365 370CTC TTT CCT GGC AAT TGAAAATGGA AGCCACAAGC AGCCCAGCCC TCCTTAATCA1212Leu Phe Pro Gly Asn375ACTTCAAGGA GCACCTTCAT TAGTACAGCT TGCATATTTA ACATTTTGTA TTTCAATAAA 1272AGTGAAGACA AAAAAAAAA 1291(2)SEQ ID No.2的信息(i)序列特征(A)長度377氨基酸(B)類型氨基酸(D)構型線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID No.2Met Ala Glu Gly Asn His Arg Lys Lys Pro Lau Lys Val Leu Glu Ser1 5 10 15Leu Gly Lys Asp Phe Leu Thr Gly Val Leu Asp Asn Leu Val Glu Gln20 25 30Asn Val Leu Asn Trp Lys Glu Glu Glu Lys Lys Lys Tyr Tyr Asp Ala35 40 45Lys Thr Glu Asp Lys Val Arg Val Met Ala Asp Ser Met Gln Glu Lys50 55 60Gln Arg Met Ala Gly Gln Met Leu Leu Gln Thr Phe Phe Asn Ile Asp65 70 75 80Gln Ile Ser Pro Asn Lys Lys Ala His Pro Asn Met Glu Ala Gly Pro85 90 95Pro Glu Ser Gly Glu Ser Thr Asp Ala Leu Lys Leu Cys Pro His Glu100 105 l10Glu Phe Leu Arg Leu Cys Lys Glu Arg Ala Glu Glu Ile Tyr Pro Ile115 120 125Lys Glu Arg Asn Asn Arg Thr Arg Leu Ala Leu Ile Ile Cys Asn Thr130 135 140Glu Phe Asp His Leu Pro Pro Arg Asn Gly Ala Asp Phe Asp Ile Thr145 150 155 160Gly Met Lys Glu Leu Leu Glu Gly Leu Asp Tyr Ser Val Asp Val Glu165 170 175Glu Asn Leu Thr Ala Arg Asp Met Glu Ser Ala Leu Arg Ala Phe Ala180 185 190Thr Arg Pro Glu His Lys Ser Ser Asp Ser Thr Phe Leu Val Leu Met195 200 205Ser His Gly Ile Leu Glu Gly Ile Cys Gly Thr Val His Asp Glu Lys210 215 220Lys Pro Asp Val Leu Leu Tyr Asp Thr Ile Phe Gln Ile Phe Asn Asn225 230 235 240Arg Asn Cys Leu Ser Leu Lys Asp Lys Pro Lys Val Ile Ile Val Gln245 250 255Ala Cys Arg Gly Ala Asn Arg Gly Glu Leu Trp Val Arg Asp Ser Pro260 265 270Ala Ser Leu Glu Val Ala Ser Ser Gln Ser Ser Glu Asn Leu Glu Glu275 280 285Asp Ala Val Tyr Lys Thr His Val Glu Lys Asp Phe Ile Ala Phe Cys290 295 300Ser Ser Thr Pro His Asn Val Ser Trp Arg Asp Ser Thr Met Gly Ser305 310 315 320Ile Phe Ile Thr Gln Leu Ile Thr Cys Phe Gln Lys Tyr Ser Trp Cys325 330 335Cys His Leu Glu Glu Val Phe Arg Lys Val Gln Gln Ser Phe Glu Thr340 345 350Pro Arg Ala Lys Ala Gln Met Pro Thr Ile Glu Arg Leu Ser Met Thr355 360 365Arg Tyr Phe Tyr Leu Phe Pro Gly Asn370 375(2)SEQ ID No.3的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(x)公開信息(A)作者Thornberry，Nancy A.
Bull，Herbert G.
Calaycay，Jimmy R.
Chapman，Kevin T.
Howard，Andrew D.
Kostura，Matthew J.
Miller，Douglas K.
Molineaux，Susan M.
Weidner，Jeffrey R.
Aunins，John(B)題目在單核細胞的白介素-1β加工過程中需要一種新的異二聚體半胱氨酸蛋白酶(C)雜志自然(D)卷356(F)頁碼768-774(G)日期30-APRIL-1992(K)SEQ ID No.3 1到20中相關殘基(xi)序列描述SEQ ID No.3ACATGACTAC AGAGCTGGAG 20(2)SEQ ID No.4的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(A)位置互補鏈(1..20)(x)公開信息(A)作者Thorbberry，Nancy A.
Bull，Herbert G.
Calaycay，Jimmy R.
Chapman，Kevin T.
Howard，Andrew D.
Kostura，Matthew J.
Miller，Douglas K.
Molineaux，Susan M.
Weidner，Jeffrey R.
Aunins，John(B)題目在單核細胞的白介素-1β加工過程中需要一種新的異二聚體半胱氨酸蛋白酶
(C)雜志自然(D)卷356(F)頁碼768-774(G)日期30一APRIL-1992(xi)序列描述SEQ ID No.4CACCACGGCA GGCCTGGATG20(2)SEQ ID No.5的信息(i)序列特征(A)長度235堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型雙(D)構型線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來源(A)生物體人類(xi)序列描述SEQ ID No 5GAAATGACTA CAGAGCTGGA GGCATTTGG TCACCGCCCAG AGCACAAGAC CTCTGACAGC60ACCTTCCCGG TCTTCTTGTC TCATGGTGTT CGGGAAGGCA TTTGTGGGAA GAAATACTCT120GAACAAGTCC CTGATATATT ACAATTCAAT GAAATATTTA AAATGTTGAA TAGCAAGAAC180TGCCCAAGTT TGAAGGACAA ACCCAAGGTG ATCATCTTCG AGGCCTGCTG TGGTG 235(2)SEQ ID No.6的信息(i)序列特征(A)長度23堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置互補(1..23)
(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.5從8到30”(xi)序列描述SEQ ID No.6CTACAGAGCT GGAGGCATTT GCT 23(2)SEQ ID No.7的信息(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/dese＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(A)位置互補鏈(1..24)(x)公開信息(A)作者Thornberry，Nancy A.
Bull，Herbert G.
Calaycay，Jimmy R.
Chapman，Kevin THoward，Andrew D.
Kostura，Matthew J.
Miller，Douglas K.
Molineaux，Susan M.
Weidner，Jeffrey R.
Aunins，John(B)題目在單核細胞的白介素-1β加工過程中需要一種新的異二聚體半胱氨酸蛋白酶(C)雜志自然(D)卷356(F)頁碼768-774(G)日期30-APRIL-1992(xi)序列描述SEQ ID No.7
TTAATGTCCT GGGAAGAGGT AGAA 24(2)SEQ ID No.8的信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置互補(1..21)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.1從753到773”(xi)序列描述SEQ ID No.8GAGGCAGTTG CGGTTGTTGA A21(2)SEQ ID No.9的信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/dese＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置互補(1..21)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.1從829到849”(xi)序列描述SEQ ID No.9CTCTGACCCA CAGTTCCCCA C 21(2)SEQ ID No.10的信息(i)序列特征(A)長度17堿基對
(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置1..17(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.1從659到711”(xi)序列描述SEQ ID No.10AACTGTGCAT GATGAGA 17(2)SEQ ID No.11的信息(i)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置1..9(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.1從905到913”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置11..19(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.1從915到923”(xi)序列描述SEQ ID No.11AGATGCTGTG TACAAGACC 19(2)SEQ ID No.12的信息(i)序列特征(A)長度17堿基對
(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置互補(1..17)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.1從795到811”(xi)序列描述SEQ ID No.12GCCTGGACAA TGATGAC 17(2)SEQ ID No.13的信息(i)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置互補(1..17)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.1從995到1011”(xi)序列描述SEQ ID No.13TGATGAAGAT AGAGCCC 17(2)SEQ ID No.14的信息(i)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸
(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置1..17(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.1從204到220”(xi)序列描述SEQ ID No.14CGGGTCATGG CAGACTC 17(2)SEQ ID No.15的信息(i)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置互補(1..17)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.1從249到265”(xi)序列描述SEQ ID No.15GTTTGAAGAA GCATTTG 17(2)SEQ ID No.16的信息(i)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置1..17
(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.1從330到346”(xi)序列描述SEQ ID No.16CCTGAGTCAG GAGAATC 17(2)SEQ ID No.17的信息(i)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置互補(1..17)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.1從375到391”(xi)序列描述SEQ ID No.17AGTCTCAGGA ATTCTTC 17(2)SEQ ID No.18的信息(i)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置1..17(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.1從503到519”(xi)序列描述SEQ ID No.18AGCTGACTTT GACATCA 17(2)SEQ ID No.19的信息(i)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/dese＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置互補(1..17)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.1從587到603”(xi)序列描述SEQ ID No.19GCGCTGACTC CATATCC 17(2)SEQ ID No.20的信息(i)序列特征(A)長度33堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/dese＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置13..33(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.1從42到62”(xi)序列描述SEQ ID No.20CGCGGATCCA CCATGGCAGA AGGCAACCAC AGA 33(2)SEQ ID No.21的信息(i)序列特征(A)長度39堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單
(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置互補(19..39)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.1從1155到1175”(xi)序列描述 SEQ ID No.21GGCTCTAGAC TCGAGTTATC AATTGCCAGG AAAGAGGTA39(2)SEQ ID No.22的信息(i)序列特征(A)長度1310堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)位置104..1195(xi)序列描述SEQ ID No.22GAACAACGTG GCTGGACAAA CATCTATCCA GACCCTAGTA CCTAATACGG ATCAAAAGTC60GACCAGTGTA AAAAAAGACA ACCACAAAAA AAAAACAGTT AAG ATG TTG GAA TAC 115Met Leu Glu Tyr1CTG GGC AAA GAT GTT CTT CAT GGT GTT TTT AAT TAT TTG GCA AAA CAC 163Leu Gly Lys Asp Val Leu His Gly Val Phe Asn Tyr Leu Ala Lys His5 10 15 20GAT GTT CTG ACA TTG AAG GAA GAG GAA AAG AAA AAA TAT TAT GAT GCC 211Asp Val Leu Thr Leu Lys Glu Glu Glu Lys Lys Lys Tyr Tyr Asp Ala25 30 35AAA ATT GAA GAC AAG GCC CTG ATC TTG GTA GAC TCT TTG CGA AAG AAT 259Lys Ile Glu Asp Lys Ala Leu Ile Leu Val Asp Ser Leu Arg Lys Asn40 45 50CGC GTG GCT CAT CAA ATG TTT ACC CAA ACA CTT CTC AAT ATG GAC CAA 307Arg Val Ala His Gln Met Phe Thr Gln Thr Leu Leu Asn Met Asp Gln55 60 65AAG ATC ACC AGT GTA AAA CCT CTT CTG CAA ATC GAG GCT GGA CCA CCT 355Lys Ile Thr Ser Val Lys Pro Leu Leu Gln Ile Glu Ala Gly Pro Pro70 75 80GAG TCA GCA GAA TCT ACA AAT ATA CTC AAA CTT TGT CCT CGT GAA GAA 403Glu Ser Ala Glu Ser Thr Asn Ile Leu Lys Leu Cys Pro Arg Glu Glu85 90 95 100TTC CTG AGA CTG TGT AAA AAA AAT CAT GAT GAG ATC TAT CCA ATA AAA 451Phe Leu Arg Leu Cys Lys Lys Asn His Asp Glu Ile Tyr Pro Ile Lys105 110 115AAG AGA GAG GAC CGC AGA CGC CTG GCT CTC ATC ATA TGC AAT ACA AAG 499Lys Arg Glu Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Ile Ile Cys Asn Thr Lys120 125 130TTT GAT CAC CTG CCT GCA AGG AAT GGG GCT CAC TAT GAC ATC GTG GGG 547Phe Asp His Leu Pro Ala Arg Asn Gly Ala His Tyr Asp Ile Val Gly135 140 145ATG AAA AGG CTG CTT CAA GGC CTG GGC TAC ACT GTG GTT GAC GAA AAG 595Met Lys Arg Leu Leu Gln Gly Leu Gly Tyr Thr Val Val Asp Glu Lys150 155 160AAT CTC ACA GCC AGG GAT ATG GAG TCA GTG CTG AGG GCA TTT GCT GCC 643Asn Leu Thr Ala Arg Asp Met Glu Ser Val Leu Arg Ala Phe Ala Ala165 170 175 180AGA CCA GAG CAC AAG TCC TCT GAC AGC ACG TTC TTG GTA CTC ATG TCT 691Arg Pro Glu His Lys Ser Ser Asp Ser Thr Phe Leu Val Leu Met Ser185 190 195CAT GGC ATC CTA GAG GGA ATC TGC GGA ACT GCG CAT AAA AAG AAA AAA 739His Gly Ile Leu Glu Gly Ile Cys Gly Thr Ala His Lys Lys Lys Lys200 205 210CCG GAT GTG CTG CTT TAT GAC ACC ATC TTC CAG ATA TTC AAC AAC CGC 787Pro Asp Val Leu Leu Tyr Asp Thr Ile Phe Gln Ile Phe Asn Asn Arg215 220 225AAC TGC CTC AGT CTA AAG GAC AAA CCC AAG GTC ATC ATT GTC CAG GCC 835Asn Cys Leu Ser Leu Lys Asp Lys Pro Lys Val Ile Ile Val Gln Ala230 235 240TGC ACA GGT GAA AAA CAT GGG GAA CTC TGG GTC AGA GAC TCT CCA GCA 883Cys Arg Gly Glu Lys His Gly Glu Leu Trp Val Arg Asp Ser Pro Ala245 250 255 260TCC TTG GCA CTC ATC TCT TCA CAG TCA TCT GAG AAC CTG GAG GCA GAT 931Ser Leu Ala Leu Ile Ser Ser Gln Ser Ser Glu Asn Leu Glu Ala Asp265 270 275TCT GTT TGC AAG ATC CAC GAG GAG AAG GAC TTC ATT GCT TTC TGT TCT 979Ser Val Cys Lys Ile His Glu Glu Lys Asp Phe Ile Ala Phe Cys Ser280 285 290TCA ACA CCA CAT AAC GTG TCC TGG AGA GAC CGC ACA AGG GGC TCC ATC1027Ser Thr Pro His Asn Val Ser Trp Arg Asp Arg Thr Arg Gly Ser Ile295 300 305TTC ATT ACG GAA CTC ATC ACA TGC TTC CAG AAA TAT TCT TGC TGC TGC1075Phe Ile Thr Glu Leu Ile Thr Cys Phe Gln Lys Tyr Ser Cys Cys Cys310 315 320CAC CTA ATG GAA ATA TTT CGG AAG GTA CAG AAA TCA TTT GAA GTT CCA1123His Leu Met Glu Ile Phe Arg Lys Val Gln Lys Ser Phe Glu Val Pro325 330 335 340CAG GCT AAA GCC CAG ATG CCC ACC ATA GAA CGA GCA ACC TTG ACA AGA1171Gln Ala Lys Ala Gln Met Pro Thr Ile Glu Arg Ala Thr Leu Thr Arg345 350 355GAT TTC TAC CTC TTT CCT GGC AAT TGAAAATGAA ACCACAGGCA GCCCAGCCCT 1225Asp Phe Tyr Leu Phe Pro Gly Asn360CCTCTGTCAA CATCAAAGAG CACATTTACC AGTATAGCTT GCATAGTCAA TATTTGGTAT 1285TTCAATAAAA GTAAAGACTG TATCT1310(2)SEQ ID No.23的信息(i)序列特征(A)長度364氨基酸(B)類型氨基酸(D)構型線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID No.23Met Leu Glu Tyr Leu Gly Lys Asp Val Leu His Gly Val Phe Asn Tyr1 5 10 15Leu Ala Lys His Asp Val Leu Thr Leu Lys Glu Glu Glu Lys Lys Lys20 25 30Tyr Tyr Asp Ala Lys Ile Glu Asp Lys Ala Leu Ile Leu Val Asp Ser25 40 45Leu Arg Lys Asn Arg Val Ala His Gln Met Phe Thr Gln Thr Leu Leu50 55 60Asn Met Asp Gln Lys Ile Thr Ser Val Lys Pro Leu Leu Gln Ile Glu65 70 75 80Ala Gly Pro Pro Glu Ser Ala Glu Ser Thr Asn Ile Leu Lys Leu Cys85 90 95Pro Arg Glu Glu Phe Leu Arg Leu Cys Lys Lys Asn His Asp Glu Ile100 105 110Tyr Pro Ile Lys Lys Arg Glu Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Ile Ile115 120 125Cys Asn Thr Lys Phe Asp His Leu Pro Ala Arg Asn Gly Ala His Tyr130 135 140Asp Ile Val Gly Met Lys Arg Leu Leu Gln Gly Leu Gly Tyr Thr Val145 150 155 160Val Asp Glu Lys Asn Leu Thr Ala Arg Asp Met Glu Ser Val Leu Arg165 170 175Ala Phe Ala Ala Arg Pro Glu His Lys Ser Ser Asp Ser Thr Phe Leu180 185 190Val Leu Met Ser His Gly Ile Leu Glu Gly Ile Cys Gly Thr Ala His195 200 205Lys Lys Lys Lys Pro Asp Val Leu Leu Tyr Asp Thr Ile Phe Gln Ile210 215 220Phe Asn Asn Arg Asn Cys Leu Ser Leu Lys Asp Lys Pro Lys Val Ile225 230 235 240Ile Val Gln Ala Cys Arg Gly Glu Lys His Gly Glu Leu Trp Val Arg245 250 255Asp Ser Pro Ala Ser Leu Ala Leu Ile Ser Ser Gln Ser Ser Glu Asn260 265 270Leu Glu Ala Asp Ser Val Cys Lys Ile His Glu Glu Lys Asp Phe Ile275 280 285Ala Phe Cys Ser Ser Thr Pro His Asn Val Ser Trp Arg Asp Arg Thr290 295 300Arg Gly Ser Ile Phe Ile Thr Glu Leu Ile Thr Cys Phe Gln Lys Tyr305 310 315 320Ser Cys Cys Cys His Leu Met Glu Ile Phe Arg Lys Val Gln Lys Ser325 330 335Phe Glu Val Pro Gln Ala Lys Ala Gln Met Pro Thr Ile Glu Arg Ala340 345 350Thr Leu Thr Arg Asp Phe Tyr Leu Phe Pro Gly Asn355 360(2)SEQ ID No.24的信息(i)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置1..19(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22從685到703”(xi)序列描述SEQ ID No.24CATGTCTCAT GGCATCCTA19(2)SEQ ID No.25的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置1..20(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22從712到731”(xi)序列描述SEQ ID No.25CTGCGGAACT GCGCATAAAA20(2)SEQ ID No.26的信息(i)序列特征(A)長度35堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置互補(16.35)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22從1229到1248”(xi)序列描述SEQ ID No.26GGCTCTAGAC TCGAGGTGCT CTTGATGTT GACAG35(2)SEQ ID No.27的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征
(B)位置互補(1..20)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22從939到958”(xi)序列描述SEQ ID No.27CTTCTCCTCG TGGATCTTGC20(2)SEQ ID No.28的信息(i)序列特征(A)長度16堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置1..16(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22從124到139”(xi)序列描述SEQ ID No.28AGATGTTCTT CATGGT 16(2)SEQ ID No.29的信息(i)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置1..17(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22從290到306”(xi)序列描述SEQ ID No.29CTTCTCAATA TGGACCA 17(2)SEQ ID No.30的信息(i)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置1..17(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22從427到488”(xi)序列描述SEQ ID No.30CCTGGCTCTC ATCATAT 17(2)SEQ ID No.31的信息(i)序列特征(A)長度18堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置1..18(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22從634到651”(xi)序列描述SEQ ID No.31ATTTGCTGCC AGACCAGA18(2)SEQ ID No.32的信息(i)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核苷酸
(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置1..19(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22從813到851”(xi)序列描述SEQ ID No.32GCCTGCAGAG GTGAAAAAC19(2)SEQ ID No.33的信息(i)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置1..19(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22從1020到1038”(xi)序列描述SEQ ID No.33GCTCCATCTT CATTACGGA 19(2)SEQ ID No.34的信息(i)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置互補(1..17)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22從1094到1110”(xi)序列描述SEQ ID No.34GATTTCTGTA CCTTCCG 17(2)SEQ ID No.35的信息(i)序列特征(A)長度16堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置互補(1..16)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22從715到730”(xi)序列描述SEQ ID No.35TTTATGCGCA GTTCCG16(2)SEQ ID No.36的信息(i)序列特征(A)長度18堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置互補(1..18)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22從521到538”(xi)序列描述SEQ ID No.36GTCTTAGTGA GCCCCATT 18(2)SEQ ID No.37的信息(i)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置互補(1..17)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22從385到401”(xi)序列描述SEQ ID No.37CTTCACGAGG ACAAAGT17(2)SEQ ID No.38的信息(i)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置互補(1..17)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22從237到253”(xi)序列描述SEQ ID No.38TCGCAAAGAG TCTACCA 17(2)SEQ ID No.39的信息(i)序列特征
(A)長度33堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置10..33(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22從101到124”(xi)序列描述SEQ ID No.39CGCGGATCCA AGATGTTGGA ATACCTGGGC AAA 33(2)SEQ ID No.40的信息(i)序列特征(A)長度68堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/dese＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置46..68(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22從305到327”(xi)序列描述SEQ ID No.40CGCGGATCCA CCATGGCTTC TATGACAGGA GGTCAACAAA TGGGACAAAA 50GATCACCAGT GTAAAACC 68(2)SEQ ID No.41的信息(i)序列特征(A)長度36堿基對(B)類型核苷酸
(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置互補(1..16)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22從838到853”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置互補(18..36)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22從818到836”(xi)序列描述SEQ ID No.41ATGTTTTTCACCTCTGGAGG CCTGGACAAT GATGAC36(2)SEQ ID No.42的信息(i)序列特征(A)長度36堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置1..19(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22從818到836”(ix)特征(A)名稱/鍵misc特征(B)位置21..36(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22從838到853”(xi)序列描述SEQ ID No.42GTCATCATTG TCCAGGCCTC CAGAGGTGAA AAACAT 3權利要求
1.包含編碼一種具有蛋白酶活性的人多肽具有序列SEQ ID No.1的核苷酸序列的DNA序列。GCTCTTTCCA ACGCTGTAAA AAAGGACAGA GGCTGTTCCC T ATG GCA GAA GGC53Met Ala Glu Gly1AAC CAC AGA AAA AAG CCA CTT AAG GTG TTG GAA TCC CTG GGC AAA GAT 101Asn His Arg Lys Lys Pro Leu Lys Val Leu Glu Ser Leu Gly Lys Asp5 10 15 20TTC CTC ACT GGT GTT TTG GAT AAC TTG GTG GAA CAA AAT GTA CTG AAC 149Phe Leu Thr Gly Val Leu Asp Asn Leu Val Glu Gln Asn Val Leu Asn25 30 35TGG AAG GAA GAG GAA AAA AAG AAA TAT TAC GAT GCT AAA ACT GAA GAC 197Trp Lys Glu Glu Glu Lys Lys Lys Tyr Tyr Asp Ala Lys Thr Glu Asp40 45 50AAA GTT CGG GTC ATG GCA GAC TCT ATG CAA GAG AAG CAA CGT ATG GCA 245Lys Val Arg Val Met Ala Asp Ser Met Gln Glu Lys Gln Arg Met Ala55 60 65GGA CAA ATG CTT CTT CAA ACC TTT TTT AAC ATA GAC CAA ATA TCC CCC 293Gly Gln Met Leu Leu Gln Thr Phe Phe Asn Ile Asp Gln Ile Ser Pro70 75 80AAT AAA AAA GCT CAT CCG AAT ATG GAG GCT GGA CCA CCT GAG TCA GGA 341Asn Lys Lys Ala His Pro Asn Met Glu Ala Gly Pro Pro Glu Ser Gly85 90 95 100GAA TCT ACA GAT GCC CTC AAG CTT TGT CCT CAT GAA GAA TTC CTG AGA 389Glu Ser Thr Asp Ala Leu Lys Leu Cys Pro His Glu Glu Phe Leu Arg105 110 115CTA TGT AAA GAA AGA GCT GAA GAG ATC TAT CCA ATA AAG GAG AGA AAC 437Leu Cys Lys Glu Arg Ala Glu Glu Ile Tyr Pro Ile Lys Glu Arg Asn120 125 130AAC CGC ACA CGC CTG GCT CTC ATC ATA TGC AAT ACA GAG TTT GAC CAT 485Asn Arg Thr Arg Leu Ala Leu Ile Ile Cys Asn Thr Glu Phe Asp His135 140 145CTG CCT CCG AGG AAT GGA GCT GAC TTT GAC ATC ACA GGG ATG AAG GAG 533Leu Pro Pro Arg Asn Gly Ala Asp Phe Asp Ile Thr Gly Met Lys Glu150 155 160CTA CTT GAG GGT CTG GAC TAT AGT GTA GAT GTA GAA GAG AAT CTG ACA 581Leu Leu Glu Gly Leu Asp Tyr Ser Val Asp Val Glu Glu Asn Leu Thr165 170 175 180GCC AGG GAT ATG GAG TCA GCG CTG AGG GCA TTT GCT ACC AGA CCA GAG 629Ala Arg Asp Met Glu Ser Ala Leu Arg Ala Phe Ala Thr Arg Pro Glu185 190 195CAC AAG TCC TCT GAC AGC ACA TTC TTG GTA CTC ATG TCT CAT GGC ATC 677His Lys Ser Ser Asp Ser Thr Phe Leu Val Leu Met Ser His Gly Ile200 205 210CTG GAG GGA ATC TGC GGA ACT GTG CAT GAT GAG AAA AAA CCA GAT GTG 725Leu Glu Gly Ile Cys Gly Thr Val His Asp Glu Lys Lys Pro Asp Val215 220 225CTG CTT TAT GAC ACC ATC TTC CAG ATA TTC AAC AAC CGC AAC TGC CTC 773Leu Leu Tyr Asp Thr Ile Phe Gln Ile Phe Asn Asn Arg Asn Cys Leu230 235 240AGT CTG AAG GAC AAA CCC AAG GTC ATC ATT GTC CAG GCC TGC AGA GGT 821Ser Leu Lys Asp Lys Pro Lys Val Ile Ile Val Gln Ala Cys Arg Gly245 250 255 260GCA AAC CGT GGG GAA CTG TGG GTC AGA GAC TCT CCA GCA TCC TTG GAA 869Ala Asn Arg Gly Glu Leu Trp Val Arg Asp Ser Pro Ala Ser Leu Glu265 270 275GTG GCC TCT TCA CAG TCA TCT GAG AAC CTG GAG GAA GAT GCT GTT TAC 917Val Ala Ser Ser Gln Ser Ser Glu Asn Leu Glu Glu Asp Ala Val Tyr280 285 290AAG ACC CAC GTG GAG AAG GAC TTC ATT GCT TTC TGC TCT TCA ACG CCA 965Lys Thr His Val Glu Lys Asp Phe Ile Ala Phe Cys Ser Ser Thr Pro295 300 305CAC AAC GTG TCC TGG AGA GAC AGC ACA ATG GGC TCT ATC TTC ATC ACA1013His Asn Val Ser Trp Arg Asp Ser Thr Met Gly Ser Ile Phe Ile Thr310 315 320CAA CTC ATC ACA TGC TTC CAG AAA TAT TCT TGG TGC TGC CAC CTA GAG 1061Gln Leu Ile Thr Cys Phe Gln Lys Tyr Ser Trp Cys Cys His Leu Glu325 330 335 340GAA GTA TTT CGG AAG GTA CAG CAA TCA TTT GAA ACT CCA AGG GCC AAA 1109Glu Val Phe Arg Lys Val Gln Gln Ser Phe Glu Thr Pro Arg Ala Lys345 350 355GCT CAA ATG CCC ACC ATA GAA CGA CTG TCC ATG ACA AGA TAT TTC TAC 1157Ala Gln Met Pro Thr Ile Glu Arg Leu Ser Met Thr Arg Tyr Phe Tyr360 365 370CTC TTT CCT GGC AAT TGAAAATGGA AGCCACAAGC AGCCCAGCCC TCCTTAATCA 1212Leu Phe Pro Gly Asn375ACTTCAAGGA GCACCTTCAT TAGTACAGCT TGCATATTTA ACATTTTGTA TTTCAATAAA 1272AGTGAAGACA AAAAAAAAA 1291
2.包含編碼一種能誘導細胞凋亡的人多肽并具有序列SEQ IDNo.1的核苷酸序列的DNA序列。GCTCTTTCCA ACGCTGTAAA AAAAGGACAGA GGCTGTTCCC T ATG GCA GAA GGC 53Met Ala Glu Gly1AAC CAC AGA AAA AAG CCA CTT AAG GTG TTG GAA TCC CTG GGC AAA GAT101Asn His Arg Lys Lys Pro Leu Lys Val Leu Glu Ser Leu Gly Lys Asp5 10 15 20TTC CTC ACT GGT GTT TTG GAT AAC TTG GTG GAA CAA AAT GTA CTG AAC149Phe Leu Thr Gly Val Leu Asp Asn Leu Val Glu Gln Asn Val Leu Asn25 30 35TGG AAG GAA GAG GAA AAA AAG AAA TAT TAC GAT GCT AAA ACT GAA GAC197Trp Lys Glu Glu Glu Lys Lys Lys Tyr Tyr Asp Ala Lys Thr Glu Asp40 45 50AAA GTT CGG GTC ATG GCA GAC TCT ATG CAA GAG AAG CAA CGT ATG GCA245Lys Val Arg Val Met Ala Asp Ser Met Gln Glu Lys Gln Arg Met Ala55 60 65GGA CAA ATG CTT CTT CAA ACC TTT TTT AAC ATA GAC CAA ATA TCC CCC293Gly Gln Met Leu Leu Gln Thr Phe Phe Asn Ile Asp Gln Ile Ser Pro70 75 80AAT AAA AAA GCT CAT CCG AAT ATG GAG GCT GGA CCA CCT GAG TCA GGA341Asn Lys Lys Ala His Pro Asn Met Glu Ala Gly Pro Pro Glu Ser Gly85 90 95 100GAA TCT ACA GAT GCC CTC AAG CTT TGT CCT CAT GAA GAA TTC CTG AGA389Glu Ser Thr Asp Ala Leu Lys Leu Cys Pro His Glu Glu Phe Leu Arg105 110 115CTA TGT AAA GAA AGA GCT GAA GAG ATC TAT CCA ATA AAG GAG AGA AAC437Leu Cys Lys Glu Arg Ala Glu Glu Ile Tyr Pro Ile Lys Glu Arg Asn120 125 130AAC CGC ACA CGC CTG GCT CTC ATC ATA TGC AAT ACA GAG TTT GAC CAT485Asn Arg Thr Arg Leu Ala Leu Ile Ile Cys Asn Thr Glu Phe Asp His135 140 145CTG CCT CCG AGG AAT GGA GCT GAC TTT GAC ATC ACA GGG ATG AAG GAG533Leu Pro Pro Arg Asn Gly Ala Asp Phe Asp Ile Thr Gly Met Lys Glu150 155 160CTA CTT GAG GGT CTG GAC TAT AGT GTA GAT GTA GAA GAG AAT CTG ACA581Leu Leu Glu Gly Leu Asp Tyr Ser Val Asp Val Glu Glu Asn Leu Thr165 170 175 180GCC AGG GAT ATG GAG TCA GCG CTG AGG GCA TTT GCT ACC AGA CCA GAG629Ala Arg Asp Met Glu Ser Ala Leu Arg Ala Phe Ala Thr Arg Pro Glu185 190195CAC AAG TCC TCT GAC AGC ACA TTC TTG GTA CTC ATG TCT CAT GGC ATC677His Lys Ser Ser Asp Ser Thr Phe Leu Val Leu Met Ser His Gly Ile200 205 210CTG GAG GGA ATC TGC GGA ACT GTG CAT GAT GAG AAA AAA CCA GAT GTG725Leu Glu Gly Ile Cys Gly Thr Val His Asp Glu Lys Lys Pro Asp Val215 220 225CTG CTT TAT GAC ACC ATC TTC CAG ATA TTC AAC AAC CGC AAC TGC CTC773Leu Leu Tyr Asp Thr Ile Phe Gln Ile Phe Asn Asn Arg Asn Cys Leu230 235 240AGT CTG AAG GAC AAA CCC AAG GTC ATC ATT GTC CAG GCC TGC AGA GGT 821Ser Leu Lys Asp Lys Pro Lys Val Ile Ile Val Gln Ala Cys Arg Gly245 250 255 260GCA AAC CGT GGG GAA CTG TGG GTC AGA GAC TCT CCA GCA TCC TTG GAA 869Ala Asn Arg Gly Glu Leu Trp Val Arg Asp Ser Pro Ala Ser Leu Glu265 270 275GTG GCC TCT TCA CAG TCA TCT GAG AAC CTG GAG GAA GAT GCT GTT TAC 917Val Ala Ser Ser Gln Ser Ser Glu Asn Leu Glu Glu Asp Ala Val Tyr280 285 290AAG ACC CAC GTG GAG AAG GAC TTC ATT GCT TTC TGC TCT TCA ACG CCA 965Lys Thr His Val Glu Lys Asp Phe Ile Ala Phe Cys Ser Ser Thr Pro295 300 305CAC AAC GTG TCC TGG AGA GAC AGC ACA ATG GGC TCT ATC TTC ATC ACA 1013His Asn Val Ser Trp Arg Asp Ser Thr Met Gly Ser Ile Phe Ile Thr310 315 320CAA CTC ATC ACA TGC TTC CAG AAA TAT TCT TGG TGC TGC CAC CTA GAG 1061Gln Leu Ile Thr Cys Phe Gln Lys Tyr Ser Trp Cys Cys His Leu Glu325 330 335 340GAA GTA TTT CGG AAG GTA CAG CAA TCA TTT GAA ACT CCA AGG GCC AAA 1109Glu Val Phe Arg Lys Val Gln Gln Ser Phe Glu Thr Pro Arg Ala Lys345 350 355GCT CAA ATG CCC ACC ATA GAA CGA CTG TCC ATG ACA AGA TAT TTC TAC 1157Ala Gln Met Pro Thr Ile Glu Arg Leu Ser Met Thr Arg Tyr Phe Tyr360 365 370CTC TTT CCT GGC AAT TGAAAATGGA AGCCACAAGC AGCCCAGCCC TCCTTAATCA 1212Leu Phe Pro Gly Asn375ACTTCAAGGA GCACCTTCAT TAGTACAGCT TGCATATTTA ACATTTTGTA TTTCAATAAA1272AGTGAAGACA AAAAAAAAA1291
3.DNA序列，它含有編碼一種具有蛋白酶活性并可誘導細胞凋亡的人多肽的DNA序列以及具有序列SEQ ID No.1的核苷酸序列。GCTCTTTCCA ACGCTGTAAA AAAGGACAGA GGCTGTTCCC T ATG GCA GAA GGC 53Met Ala Glu Gly1AAC CAC AGA AAA AAG CCA CTT AAG GTG TTG GAA TCC CTG GGC AAA GAT101Asn His Arg Lys Lys Pro Leu Lys Val Leu Glu Ser Leu Gly Lys Asp5 10 15 20TTC CTC ACT GGT GTT TTG GAT AAC TTG GTG GAA CAA AAT GTA CTG AAC149Phe Leu Thr Gly Val Leu Asp Asn Leu Val Glu Gln Asn Val Leu Asn25 30 35TGG AAG GAA GAG GAA AAA AAG AAA TAT TAC GAT GCT AAA ACT GAA GAC197Trp Lys Glu Glu Glu Lys Lys Lys Tyr Tyr Asp Ala Lys Thr Glu Asp40 45 50AAA GTT CGG GTC ATG GCA GAC TCT ATG CAA GAG AAG CAA CGT ATG GCA245Lys Val Arg Val Met Ala Asp Ser Met Gln Glu Lys Gln Arg Met Ala55 60 65GGA CAA ATG CTT CTT CAA ACC TTT TTT AAC ATA GAC CAA ATA TCC CCC293Gly Gln Met Leu Leu Gln Thr Phe Phe Asn Ile Asp Gln Ile Ser Pro70 75 80AAT AAA AAA GCT CAT CCG AAT ATG GAG GCT GGA CCA CCT GAG TCA GGA341Asn Lys Lys Ala His Pro Asn Met Glu Ala Gly Pro Pro Glu Ser Gly85 90 95 100GAA TCT ACA GAT GCC CTC AAG CTT TGT CCT CAT GAA GAA TTC CTG AGA389Glu Ser Thr Asp Ala Leu Lys Leu Cys Pro His Glu Glu Phe Leu Arg105 110115CTA TGT AAA GAA AGA GCT GAA GAG ATC TAT CCA ATA AAG GAG AGA AAC437Leu Cys Lys Glu Arg Ala Glu Glu Ile Tyr Pro Ile Lys Glu Arg Asn120 125 130AAC CGC ACA CGC CTG GCT CTC ATC ATA TGC AAT ACA GAG TTT GAC CAT485Asn Arg Thr Arg Leu Ala Leu Ile Ile Cys Asn Thr Glu Phe Asp His135 140 145CTG CCT CCG AGG AAT GGA GCT GAC TTT GAC ATC ACA GGG ATG AAG GAG533Leu Pro Pro Arg Asn Gly Ala Asp Phe Asp Ile Thr Gly Met Lys Glu150 155 160CTA CTT GAG GGT CTG GAC TAT AGT GTA GAT GTA GAA GAG AAT CTG ACA 581Leu Leu Glu Gly Leu Asp Tyr Ser Val Asp Val Glu Glu Asn Leu Thr165 170 175 180GCC AGG GAT ATG GAG TCA GCG CTG AGG GCA TTT GCT ACC AGA CCA GAG 629Ala Arg Asp Met Glu Ser Ala Leu Arg Ala Phe Ala Thr Arg Pro Glu185 190 195CAC AAG TCC TCT GAC AGC ACA TTC TTG GTA CTC ATG TCT CAT GGC ATC 677His Lys Ser Ser Asp Ser Thr Phe Leu Val Leu Met Ser His Gly Ile200 205 210CTG GAG GGA ATC TGC GGA ACT GTG CAT GAT GAG AAA AAA CCA GAT GTG 725Leu Glu Gly Ile Cys Gly Thr Val His Asp Glu Lys Lys Pro Asp Val215 220 225CTG CTT TAT GAC ACC ATC TTC CAG ATA TTC AAC AAC CGC AAC TGC CTC 773Leu Leu Tyr Asp Thr Ile Phe Gln Ile Phe Asn Asn Arg Asn Cys Leu230 235 240AGT CTG AAG GAC AAA CCC AAG GTC ATC ATT GTC CAG GCC TGC AGA GGT 821Ser Leu Lys Asp Lys Pro Lys Val Ile Ile Val Gln Ala Cys Arg Gly245 250 255 260GCA AAC CGT GGG GAA CTG TGG GTC AGA GAC TCT CCA GCA TCC TTG GAA 869Ala Asn Arg Gly Glu Leu Trp Val Arg Asp Ser Pro Ala Ser Leu Glu265 270 275GTG GCC TCT TCA CAG TCA TCT GAG AAC CTG GAG GAA GAT GCT GTT TAC 917Val Ala Ser Ser Gln Ser Ser Glu Asn Leu Glu Glu Asp Ala Val Tyr280 285 290AAG ACC CAC GTG GAG AAG GAC TTC ATT GCT TTC TGC TCT TCA ACG CCA 965Lys Thr His Val Glu Lys Asp Phe Ile Ala Phe Cys Ser Ser Thr Pro295 300 305CAC AAC GTG TCC TGG AGA GAC AGC ACA ATG GGC TCT ATC TTC ATC ACA 1013His Asn Val Ser Trp Arg Asp Ser Thr Met Gly Ser Ile Phe Ile Thr310 315 320CAA CTC ATC ACA TGC TTC CAG AAA TAT TCT TGG TGC TGC CAC CTA GAG 1061Gln Leu Ile Thr Cys Phe Gln Lys Tyr Ser Trp Cys Cys His Leu Glu325 330 335 340GAA GTA TTT CGG AAG GTA CAG CAA TCA TTT GAA ACT CCA AGG GCC AAA1109Glu Val Phe Arg Lys Val Gln Gln Ser Phe Glu Thr Pro Arg Ala Lys345 350 355GCT CAA ATG CCC ACC ATA CAA CGA CTG TCC ATG ACA AGA TAT TTC TAC1157Ala Gln Met Pro Thr Ile Glu Arg Leu Ser Met Thr Arg Tyr Phe Tyr360 365 370CTC TTT CCT GGC AAT TGAAAAATGGA AGCCACAAGC AGCCCAGCCC TCCTTAATCA 1212Leu Phe Pro Gly Asn375ACTTCAAGGA GCACCTTCAT TAGTACAGCT TGCATATTTA ACATTTTGTA TTTCAATAAA 1272AGTGAAGACA AAAAAAAAA 1291
4.DNA序列以及與之雜交并且具有相同功能的DNA序列，其中該DNA序列編碼一種具有蛋白酶活性并能誘導細胞凋亡的人多肽并且它具有序列SEQ ID No.1從42位核苷酸開始并在1172位核苷酸終止的序列。
5.權利要求4的DNA序列，它具有序列SEQ ID No.1的從42位核苷酸開始并在1172位核苷酸終止的序列。
6.人多肽，它具有蛋白酶活性并能誘導細胞凋亡并且具有序列SEQID No.2以及該序列的單位基因和類似物的氨基酸序列。Met Ala Glu Gly Asn His Arg Lys Lys Pro Leu Lys Val Leu Glu Ser1 5 10 15Leu Gly Lys Asp Phe Leu Thr Gly Val Leu Asp Asn Leu Val Glu Gln20 25 30Asn Val Leu Asn Trp Lys Glu Glu Glu Lys Lys Lys Tyr Tyr Asp Ala35 40 45Lys Thr Glu Asp Lys Val Arg Val Met Ala Asp Ser Met Gln Glu Lys50 55 60Gln Arg Met Ala Gly Gln Met Leu Leu Gln Thr Phe Phe Asn Ile Asp65 70 75 80Gln Ile Ser Pro Asn Lys Lys Ala His Pro Asn Met Glu Ala Gly Pro85 90 95Pro Glu Ser Gly Glu Ser Thr Asp Ala Leu Lys Leu Cys Pro His Glu100 105 110Glu Phe Leu Arg Leu Cys Lys Glu Arg Ala Glu Glu Ile Tyr Pro Ile115 120125Lys Glu Arg Asn Asn Arg Thr Arg Leu Ala Leu Ile Ile Cys Asn Thr130 135 140Glu Phe Asp His Leu Pro Pro Arg Asn Gly Ala Asp Phe Asp Ile Thr145 150 155 160Gly Met Lys Glu Leu Leu Glu Gly Leu Asp Tyr Ser Val Asp Val Glu165 170 175Glu Asn Leu Thr Ala Arg Asp Met Glu Ser Ala Leu Arg Ala Phe Ala180 185 190Thr Arg Pro Glu His Lys Ser Ser Asp Ser Thr Phe Leu Val Leu Met195 200 205Ser His Gly Ile Leu Glu Gly Ile Cys Gly Thr Val His Asp Glu Lys210 215 220Lys Pro Asp Val Leu Leu Tyr Asp Thr Ile Phe Gln Ile Phe Asn Asn225 230 235 240Arg Ash Cys Leu Ser Leu Lys Asp Lys Pro Lys Val Ile Ile Val Gln245 250 255Ala Cys Arg Gly Ala Asn Arg Gly Glu Leu Trp Val Arg Asp Ser Pro260 265 270Ala Ser Leu Glu Val Ala Ser Ser Gln Ser Ser Glu Asn Leu Glu Glu275 280 285Asp Ala Val Tyr Lys Thr His Val Glu Lys Asp Phe Ile Ala Phe Cys290 295 300Ser Ser Thr Pro His Asn Val Ser Trp Arg Asp Ser Thr Met Gly Ser305 310 315 320Ile Phe Ile Thr Gln Leu Ile Thr Cys Phe Gln Lys Tyr Ser Trp Cys325 330 335Cys His Leu Glu Glu Val Phe Arg Lys Val Gln Gln Ser Phe Glu Thr340 345 350Pro Arg Ala Lys Ala Gln Met Pro Thr Ile Glu Arg Leu Ser Met Thr355 360 365Arg Tyr Phe Tyr Leu Phe Pro Gly Asn370 375
7.權利要求6的多肽，它具有序列SEQ ID No.2的氨基酸序列并被稱為Tx蛋白。
8.具有蛋白酶活性并能誘導細胞凋亡的人多肽，它是由編碼SEQID No.2的氨基酸序列的DNA在宿主細胞內的表達而獲得的。
9.由在真核宿主細胞內的表達而獲得的權利要求8的多肽。
10.權利要求6-9任一項的多肽，其蛋白酶活性對應于IL-1β轉換酶的成熟程度。
11.含權利要求1到5任一項的DNA序列的表達載體。
12.用權利要求11的載體轉化的宿主細胞。
13.包括在宿主細胞中表達Tx蛋白的方法，其中宿主細胞是用編碼序列SEQ ID No.2的氨基酸序列的DNA轉化的。
14.權利要求13的方法，其中宿主細胞是真核細胞。
15.抗權利要求6到10任一項的多肽的抗體。
16.用做藥物的權利要求6到10任一項的多肽。
17.包含權利要求16的藥物做為活性組分的藥用組合物。
18.權利要求17的調節IL-1β的產生的藥用組合物。
19.權利要求17的調節細胞凋亡的藥用組合物。
20.根據權利要求4的DNA序列，它與SEQ ID No.2序列的42位核苷酸開始并在1172位核苷酸終止的DNA序列雜交并具有相同功能。
21.DNA序列，它編碼一種具有蛋白酶活性并能誘導細胞凋亡的多肽并具有SEQ ID No.22的核苷酸序列。
22.根據權利要求21的DNA序列，該序列從SEQ ID No.22序列的104位核苷酸開始并在1195位核苷酸終止。
23.人多肽，它具有蛋白酶活性并能誘導細胞凋亡并具有SEQ IDNo.23的氨基酸序列并被稱為TY蛋白。
24.由在宿主細胞中表達編碼序列SEQ ID No.23的氨基酸序列的DNA而獲得的人多肽。
25.包括在宿主細胞中表達TY蛋白的方法，其中宿主細胞是用編碼序列SEQ ID No.23的氨基酸序列的DNA轉化的。
全文摘要
發明公開了與白介素-1β轉換酶相關的為具有蛋白酶活性并能誘導細胞凋亡的人多肽編碼的DNA序列。
文檔編號A61P25/28GK1158639SQ9519520
公開日1997年9月3日 申請日期1995年8月1日 優先權日1994年8月2日
發明者A·迪奧, C·浮喬, T·埃森特, J·L·拉拉尼, D·J·利溫斯頓, M·S·-S·蘇 申請人:魯索-艾克勒夫公司