甲型鏈球菌多糖免疫原性組合物及方法

專利名稱：甲型鏈球菌多糖免疫原性組合物及方法
技術領域：
本發明涉及新的免疫原性組合物領域，生產它們的方法，以及使溫血動物，包括人，對甲型鏈球菌引起的感染和疫病免疫的方法。發明背景如依年齡組的感染率所示，甲型鏈球菌疾病是一種兒童期疾病(1-3)。與此類的其它疾病如腦膜炎球菌(4)和嗜血桿菌腦膜炎(5)、白喉(6)等(7，8)一樣，大部分病例發生在幼年，并且感染率隨年齡而降低。因此，到18歲，甲型鏈球菌感染發生率相對較低(1-3)。我們可以假設，與發現的其它兒童期感染一樣，對此類生物體的某些類型的自然免疫可能是隨時間發生的。
在連續幾十年的實驗中，Lancefield和同事們(9-11)證實了大部分感染人體的溶血性鏈球菌是甲型的。此特性是基于與甲型鏈球菌碳水化合物的血清學反應。之后的研究報道了免疫顯性決定簇是N-乙酰氨基葡糖(12，13)。用鼠保護試驗和沉淀素測定，根據存在于生物體表面的抗原性不同的M蛋白質的存在，將這些甲型鏈球菌進一步分為血清型。在一鼠感染模型中明顯表明，針對特異性M血清型的抗體有保護作用(14)。在人體中，早型鏈球菌感染的痊愈常常與對感染性生物體為類型特異性的長期持久性免疫有關(11)。但在這兩種情況下，該保護都是對M血清型特異的，并且不延及對其它血清型的保護。另外，許多研究中已表明，人體血清極少含有多種M蛋白血清型特異的抗體(11，15)。這些對人體和實驗動物的經典實驗證實了M蛋白在甲型鏈球菌毒力方面的重要作用，并且構成了許多研制鏈球菌疫苗的不成功償試的基礎，這些疫苗應該能誘發針對其中保留血清型特異性的M蛋白的氨基末端部分或更新近地針對分子的普通C-重復區域的保護性抗體(16)。
但是，考慮列表現出對這類細菌的自然免疫性升高的甲型感染與年齡相關的性質，問題在于這是否表示針對M蛋白上較普通區域的抗體的緩慢增加，或者是否其它不太被注意的表面抗原可能在這種自然獲得的非血清型特異性保護中起著作用。例如，透明質酸夾膜在豚鼠(17)丙型感染的毒力方面起著重要的作用，并且在動物(18，34)和人體(19)中檢測到了抗透明質酸鹽抗體。已有報道，有用形式化的、有夾膜的甲型鏈球菌免疫后或與脂質體結合后，來自甲型鏈球菌的透明質酸對家兔有致免疫作用(18)。對脂質體在疫苗中的應用也有過報道(31)。注射鏈球菌細胞壁粘肽組分導致了實驗動物體內短暫的保護(20)，但還不知道其在人體中的作用。
類型特異性碳水化合物由多聚-鼠李糖骨架組成，在甲型的情況下，N-乙酰氨基葡糖存在于骨架的非還原末端位置(

圖1a)。已對甲型變種鏈球菌進行了描述并鑒定了其特征(12，13)。在這些鏈球菌中，存在多聚-鼠李糖骨架，但其未被N-乙酰氨基葡糖修飾(圖1b)。在早期實驗中，給家兔注射缺少M蛋白的整個甲型鏈球菌，發現達誘發了針對甲型碳水化合物的沉淀的抗體。但是，在被動鼠保護研究中這些抗體對M蛋白陽性的甲型鏈球菌的攻擊不起被動保護作用(14)。此外，幾種用來說明類似的人體中的沉淀的抗體的早期嘗試是不成功的，這表明了沉淀的碳水化合物抗體在對鏈球菌感染的保護中不起顯著作用。
但是，由于許多早期檢測抗體升高的方法是依賴于這些抗體能與加入的抗原沉淀的性質，許多雖然在分析中與特異抗原反應但并不沉淀的抗體則不被檢測。能與甲型鏈球菌透明質酸莢膜反應的抗體就是一個很好的例子。在集中解決這一問題的研究中，始于1965年的一系列報道(21，22)使用了直接和間接凝集技術來檢測抗體。直接凝集作用檢測沉淀的抗體，而間接凝集作用則可以檢測沉淀性與非沉淀性抗體。令人感興趣的是Karakawa等人的報道(22)，在這些人血清中的直接凝集抗體，即沉淀的抗體，主要是針對甲型變種碳水化合物，多聚-鼠李糖骨架，而針對非沉淀性抗體的間接凝集技術檢測了針對N-乙酰氨基葡糖決定簇的高滴度抗體。
Zimmerman等人隨后的研究(23)使用了來自各種鏈球菌感染的人血清，其表明這些非沉淀性抗體的發生率從低至人數的30％(仔細追蹤并治療鏈球菌感染)到高達最近受甲型鏈球菌感染的人數的84％之間變化。他們還注意到甲型碳水化合物的抗體滴度在17歲時達到峰值，并且在有或沒有心臟病的風濕病患者中這種碳水化合物的抗體滴度沒有差別。這些結果與Dudding和Ayoub報道的結果不同，在Dudding和Ayoub的報道中，風濕性心臟病患者體內的抗-甲型碳水化合物抗體與沒有瓣膜損傷患者體內的抗體相比是持續升高的(24)。
是否這些抗體在保護中起作用這一問題尚難以確定。Lancefield的經典調理素細胞吞噬分析使用了所選擇的人全血(15，25，26)，向其中加入帶已知M蛋白血清型特異性抗體的高度免疫兔血清。人全血的選擇是基于兩個因素；(1)其不含有與M蛋白反應的抗體和/或(2)在缺少血清型特異的兔抗血清時其不會促進鏈球菌的吞噬作用。是否正常人血清本身能促進吞噬作用這一問題從未真正地加以論述。發明概述本發明提供了一種保護哺乳動物不受甲型鏈球菌感染的免疫原性組合物。該免疫原性組合物含有致免疫量的具有下列結構的甲型鏈球菌多糖(GASP)以及載體 其中R為末端還原性L-鼠李糖或D-GlcpNAc，而n是一個足夠大的數字來確定一個平均分子量足夠大的多糖，從而提供對與鼠李糖的3位配糖相連的β-D-GlcpNAc殘基的免疫原應答。GASP的這一區域確定了誘導殺菌抗體形成的表位。
存在于免疫原性組合物中的GASP可以是游離多糖的形式或作為綴合物的一個組分，在綴合物中GASP與能形成脂質體或蛋白質的磷脂共價相連。天然或重組細菌蛋白如破傷風類毒素、霍亂毒素、白喉素毒素、或CRM197都是可用作綴合物的適宜蛋白質的實例。在另一實施方案中，免疫原性蛋白質結合到了含有與磷脂共價相連的GASP的脂質體中。
該免疫原性組合物還可用作疫苗，并可進一步含有佐劑如氫氧化鋁、磷酸鋁、單磷酰基脂A、QS21或硬脂酰酷氨酸。本發明的免疫原性組合物能誘發對甲型鏈球菌感染的主動和被動保護。對于被動保護，免疫原性抗體是通過用本發明的免疫原性組合物制成的疫苗來免疫哺乳動物，然后從哺乳動物回收免疫原性抗體來生產的。
本發明還提供了通過給予致免疫量的本發明的組合物來免疫哺乳動物抵抗甲型鏈球菌感染的方法。
在另一實施方案中，本發明提供了一種制備免疫原性組合物的方法，該方法包括使GASP與脂質體共價相連；將脂質體溶于能溶解疏水性蛋白質的緩沖液中；將溶解的脂質體與溶于緩沖液中的蛋白質合并，從而形成脂質體與蛋白質的配合物。然后從緩沖液中分離蛋白質/脂質體配合物。
本發明的一個目的是提供可用于增加具有預防和診斷目的用途的抗體的免疫原性組合物。本發明的另一個目的是提供一種通過給予致免疫量的GASP使哺乳動物對甲型鏈球菌免疫的方法。再一個目的是提供使GASP與蛋白質共價連接而形成免疫原綴合物的方法。在優選的實施例中，綴合物具有下式 其中R′是末端還原糖的還原和氧化產物。本發明的又一個目的是免疫原性組合物的用途，在那些最有危險患甲型鏈球菌感染和疾病的人群，即成人、孕婦和，特別是，嬰兒和兒童中，提供對甲型鏈球菌感染的保護。附圖簡要說明圖1用示意圖表示了甲型碳水化合物(圖1A)和甲型變種碳水化合物(圖1B)的結構圖。對甲型碳水化合物三維結構的描繪清楚地支持了觀察結果，即碳水化合物的血清學特異性是針對碳水化合物的N-乙酰氨基葡糖部分的。
圖2用圖解法表明了對來自特立尼達及紐約的5歲和10歲正常兒童體內甲型鏈球菌碳水化合物抗體的ELISA滴度測定。讀數是于405nm的終點測定結果為1.0 OD。
圖3用圖解法表明了用已知含有對甲型一脂質體有反應性的抗體的人血清的抑制ELISA研究。將血清大約稀釋到在405nm給出1.0 OD單位的值，并與各種濃度的不同抗原于37℃混合1小時，于10,000轉/分離心5分鐘。用上清液在實施例3所述的ELISA分析中測定反應性。數據表示所測血清的平均值。
圖4用圖解法表明了用洗滌后的人血進行的間接殺菌分析，如實施例1中簡要說明的向含RPMI和補體的試管中加入各種血清。初始9個CFU的是甲型6型鏈球菌。A圖顯示了含正常兔血清的旋轉試管中生物體的生長。B圖顯示了具有與甲型碳水化合物反應的高ELISA滴度的人血清的靜態試管中的生長。C圖顯示了用如B圖中一樣的人血清但在旋轉試管中的生長抑制。
圖5用圖解法表示了如圖4中所述的間接殺菌分析。生物體是血清型3(菌株D58/11/3)、血清型6(菌株S43)、血清型14(菌株S23/101/5)、和血清型28(菌株T28/isoA/5)。左軸描繪了旋轉試量對靜態試管的菌落形成單位的數目。右軸表示旋轉試管對靜態試管的生物體殺傷百分率。
圖6用圖解法表示了肝素對間接殺菌分析的作用。按所述方法進行間接殺傷分析，但平行作兩份。向一組靜態和旋轉的試管中加入肝素(5單位/ml)，而另一組試管作為正常殺菌分析對照。用于Lancefield所述的殺菌分析的肝素標準量通常是10單位/ml(33-35)。可以看出，肝素，在通常所述濃度的一半時，顯著降低了抗一甲型碳水化合物抗體依賴性殺傷的數量。
圖7用圖解法表示了如ELISA分析中所測定的抗-甲型分析碳水化合物滴度的殺菌分析。在使用血清型6生物體的兩種分析中測定了17個人的血清。注意到所有表現出CHO滴度大于200,000的血清(13/13)在殺菌分析中均表現出了大于80％的殺傷率。相反，滴度低于200,000的4個血清中只有一個促進了生物體的調理吞噬，并且吞噬程度比用高滴度血清觀察到的低得多。
圖8用圖解法表示了實施例1中所述的調理吞噬殺菌分析。用與靜態對照相比生物體的殺傷百分率描述生物體的吞噬。條塊表示用N-乙酰氨基葡糖親合柱吸附前、用親合柱吸附后的百分殺傷率，以及從柱中洗脫出的抗體的百分殺傷率。注意到用N-乙酰氨基葡糖親合柱吸附后所有血清的殺傷率全部消失，從親合柱洗脫抗體后調理吞噬的殺菌活性部分恢復。除完全沒有殺傷力的吸附后的血清以外，示出了各種情況下的標準誤差。
圖9用圖解法表示了已知在用甲型鏈球菌碳水化合物免疫后含有高滴度抗-甲型碳水化合物抗體的兔血清的調理吞噬指數。用與靜態對照相比生物體的殺傷百分率描述生物體的吞噬，注意到滴度＜50,000的生物體缺乏吞噬作用，滴度為75,000時殺傷率逐漸增加，而滴度大于100,000時吞噬作用完全。用于這些研究的生物體是甲型6類菌株，接種物是4個菌落形成單位。對發明的詳細描述由于已知測定人血清中碳水化合物抗體的血清學數據伴隨著與年齡相關的由其它碳水化合物抗原，即肺炎球菌(27)、腦膜炎雙球菌(4)、和嗜血桿菌多糖(5)，引起的保護的誘導，我們決定再檢測一下各種人體血清，即正常人群和受鏈球菌感染的人群血清中碳水化合物抗體的存在。這些研究還包括了鏈球菌感后遺癥的病人。將純化為甲型碳水化合物與合成的磷脂酰乙醇胺共價相連，結合到脂質體中，并用在基于ELISA的分析中。本發明表明在人體血清中易于檢測針對甲型碳水化合物抗原的抗體。另外，根據地區性人口和對鏈球菌疾病的接觸，這些抗體的量具有與年齡相關的依賴性。在已知鏈球菌感染之后，還觀察到了對甲型碳水化合物抗體滴度的升高。為了論述是否這些能與甲型碳水化合物反應的抗體或這些抗體的一部分能促進調理吞噬這一問題，我們使用了改進的Lancefield殺菌分析法。所得數據表明這些抗體是有調理作用，的并且這些調理性甲型碳水化合物抗體所針對的表位是非還原性末端N-乙酰氨基葡糖殘基。
本發明提供了一種免疫原性組合物以及保護哺乳動物，特別是人，抵抗甲型鏈球菌感染的免疫方法。本發明的免疫原性綴合物是通過將甲型鏈球菌多糖(GASP)與適宜的蛋白質或脂質體共價連接形成磷脂而構成的。
按照McCarty(28)和Dubois等人(31)所述的方法完成甲型鏈球菌的分離和生長以及甲型多糖的制備，這兩篇文獻作為參考文獻并入本發明。分離的GASP具有下列化學結構 其中R為末端還原性L-鼠李糖或D-GlcpNAc，n是重復單位的數目，其應足夠大，從而確定具有足夠平均分子量的多糖來致免疫。優選n是從約1至約50。更優選地，n是從約3至約30，最佳數目是約為20。此處所用的多糖一詞是指包括任何糖類多聚物，包括二糖、寡糖等。產生上述多糖結構的甲型變種鏈球菌的培養物被保藏在馬里蘭州Rockville的美國典型培養物保藏中心。GASP應具有足夠大小以誘導個體的免疫原應答。更優選的平均分子量是約為10,000千道爾頓。單一重復量的GASP分子量約為500千道爾頓。
在本發明優選的實施方案中，GASP與蛋白質共價相連形成綴合物。這樣的綴合物優選將T-細胞依賴性的對多糖的免疫原應答轉化為T-細胞依賴性的免疫原應答。因而，個體可接受的、并能誘導T-細胞依賴性應答的任何蛋白質或其片段都適宜與GASP綴合。基本上任何蛋白質都能作為綴合蛋白。特別是所選擇的蛋白質必須具有至少一個自由氨基，用于與甲型多糖的綴合。優選蛋白質是任何天然或重組細菌蛋白，并且其本身是誘導年輕和成年哺乳動物中T-細胞依賴性應答的免疫原。這樣的蛋白質的例子包括，但不限制于，破傷風類毒素、霍亂毒素、白喉類毒素和CRM197。其它綴合蛋白的候選物包括假單胞菌、葡萄球菌、鏈球菌、百日咳和包括大腸桿菌的產腸毒素細菌的毒素或類毒素。
在優選的實施方案中，本發明的綴合物分子含有一個蛋白質核心，GASP通過末端還原糖的修飾形式與之相連。因此這樣的綴合分子就會含有單官能化的GASP結合蛋白。優選多個GASP，特別是約1至12個GASP與每個蛋白相連。更優選至少約5個GASP與每個蛋白相連。
在另一個實施方案中，GASP通過每個GASP上的兩個或多個位點與蛋白質相連。由于殺菌表位可能是出現在GASP重復單位的支鏈上，因此GASP的官能化以及與蛋白質的連接應該是以保持致免疫量的殺菌表位的方式來實現。
GASP與之綴合的蛋白質可以是天然毒素或去毒后的毒素(即類毒素)。另外，還可以使用蛋白毒素的非毒性突變形式。優選這樣的突變保留了天然毒素的表位。這些突變后的毒素被稱作“交叉反應物質”或CRMs。CRM17比活性白喉毒素有一個氨基酸不同并且與之在免疫學上不可區分，CRM17是流感嗜血桿菌綴合疫苗的一個組分，該疫苗已廣泛應用于嬰兒。
產生CRM197蛋白的白喉桿菌菌株C7培養物(β197)被保存在馬里蘭州Rockville的美國典型培養物保藏中心(保藏號ATCC53281)。
還可以用蛋白質片段與GASP綴合，其條件是這些片段應足夠長，即優選至少10個氨基酸以確定T-細胞表位。
可用許多綴合方法產生本發明的甲型多糖-蛋白質綴合物。所用的優選方法應當能保持與鼠李糖的3位配糖相連的β-D-GlcpNAc支鏈上存在的殺菌表位的免疫原性。當單個GASP連接兩個或多個蛋白分子時，所得綴合物對蛋白質來說是交叉連接的。可以通過綴合反應中所用條件的常規變化來調節交叉連接的程度和綴合物分子的整個大小，這對于本領域普通技術人員來說是已知的。這些變化包括，例如，綴合反應的速率以及反應混合物中存在的蛋白質與GASP的比值。
將多糖與蛋白質綴合的各種化學方法是已知的并在文獻中有所描述。例如，作為參考文獻引入本發明的美國專利4,644,059描述了用己二酸二酰肼(ADH)作為同雙功能連接物制備的綴合物。也作為參考文獻引入本發明的美國專利4,695,624描述了制備多糖以及用屬間間隔基制備綴合物的方法。在Dick、William E.和Michel Beurret的Contrib.Mrcrobil.Immunol.(1989)，Vol.10，pp.48-114中討論了對各種用于設計綴合物的制備方法和因素的概括性研究，其也作為參考文獻引入本發明。優選的綴合本發明GASP-蛋白質綴合物的方法是美國專利4,356,170所述的還原性氨基化法，其也作為參考文獻引入本發明。簡單地說，在優選的實施方案中，GASP的末端還原糖通過使用溫和的還原劑如硼氫化鈉或其等同物被還原成開環。
下面，用偏高碘酸鈉或其等同物的選擇性氧化反應來氧化先前還原糖部分的末端鄰位羥基而形成末端醛基。這形成了活化的GASP，其現在能與選擇的蛋白質載體共價相連。在本發明的另一個實施方案中該活化的GASP還可與磷脂，如脂質體形式的磷脂酰乙醇胺共價相連。活化的GASP的化學結構如下 其中R′是除形成醛基(CHO)的末端還原糖部分以外的末端還原糖的還原和氧化產物。在室溫，用約1ml約20mM的偏高碘酸鈉溶液適宜地氧化約10mg的多糖約10-15分鐘。反應時間可隨其它數量的高碘酸鹽而變化以得到同等的氧化。末端還原糖的還原和開環使得還原糖的鄰位羥基比存在于配糖連接的β-D-GlcpNAc支鏈上的羥基更活潑。但是，通過某些配糖連接的β-D-GlcpNAc殘基的氧化可以同樣產生其它連接位點。然后在氰基硼氫化物離子或另一種還原劑的存在下，通過將載體蛋白的氨基與GASP的末端醛基偶聯使活化的GASP與所選擇的綴合蛋白綴合。從而甲型多糖與蛋白質通過-CH2-NH-蛋白連接鍵相連，如式II 得自還原性氨基化過程的GASP-蛋白綴合物優選有極少的交聯，并優選能溶于水溶液。這使本發明的GASP-蛋白綴合物成為用作疫苗的優選候選物。
在本發明的另一個實施方案中，GASP被埋入脂質體，形成了免疫原性組合物。由于脂質體能誘導對B-淋巴細胞的“加帽”作用，因此它們經常用于綴合物中。沒有被理論束縛，我們認為GASP-脂質體綴合物通過加帽來提高抗體滴度，從而活化B-淋巴細胞。加帽現象是細胞生物學領域中已知的。簡單地說，由于脂質體結構上的特征，脂質體中能埋入抗原，從而形成多價免疫原結構。由于脂質體細胞膜中的受體分子是游動的，所以這些受體許多能通過二價試劑交聯從而形成片型沉淀區或“斑片”。這些斑片將在B-淋巴細胞的極性端凝聚或集結，在淋巴細胞的細胞膜中形成帽子。如果在T-輔助效應細胞存在下出現了抗原在B-淋巴細胞上的加帽作用，則這種作用將通過B-淋巴細胞活化抗體的產生。
已知各種使多糖與脂質體綴合的方法，并描述于文獻中。例如，作為參考文獻引入本發明的美國專利5,283,185描述了通過制備陽離子脂質與共脂質的混合脂質分散體、然后將核酸引入分散體而將核酸轉入到細胞中形成配合物的方法。然后用這種配合物處理細胞。在本發明優選的實施方案中，通過用細針注射或優選用聲處理的方法將脂質分散于水溶液中來制備脂質體，如Fillet，H.M.Milan Blake、ChristaMacDonald和Maclyn NcCarty(1988)，Immunogenicity ofLiposome-bond hyaluronate in mice，J.Exp.Med.168971-982中所述，其作為參考文獻引入本發明。
為了制備含與GASP成份共價相連的磷脂的脂質體，按已知方法形成脂質體。例如，在本發明的一個實施方案中將磷脂酰乙醇胺溶于如氯仿的溶劑中并加到容器里。除去氯仿溶劑從而使容器覆蓋上磷脂酰乙醇胺。向容器中加入含水緩沖液如水或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，將混合物用聲處理形成脂質體。向脂質體中加入等摩爾量的已活化的GASP，優選用還原法隨后用氧化法活化GASP，在任何適宜的緩沖液，如鹽水、林格溶液或最優選的磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)存在下，使兩種成份混合過夜。然后向混合物中加入氰基硼氫化鈉，在磷脂酰乙醇胺與GASP多糖之間形成穩定的共價鍵。可以用離心、分子篩色譜法或透析使式III所示的最終產物從氰基硼氫化鈉中分離出來。 式III中的R′和n如前面所述，R2為磷脂酰乙醇胺。
在優選的實施方案中GASP一脂質體與蛋白質結合從而將疏水性蛋白摻入脂質體。按照一種方法，將GASP一脂質體溶于β-辛基葡糖苷的5％溶液中。將待加入脂質體中的蛋白質也溶于5％β-辛基葡糖苷中，合并蛋白質和脂質體。經混合將蛋白質摻入到脂質體之后，透析除去β-辛基葡糖苷。所得GASP一脂質體一蛋白質配合物從而可用作免疫原或疫苗。
還可以用其它不太優選的技術使GASP與磷脂連接，例如使用苯醌，如Fillit，H.M.、M.Mc Carty、和M.S.Blake(1986)，the inductionof antibodies to hyalurouic acid by immunization of rabbits withencapsulated streptococci.J.Exp.Med.164762-776中所述，其作為參考文獻引入本發明。但是，如果組合物要用作疫苗，那么使用這些試劑可能不太理想。
本發明的免疫原性組合物可用作增加用于預防和診斷目的的抗體的手段。診斷尤其適用于監視和檢測各種由甲型鏈球菌引起的感染和疾病。本發明的另一個實施方案用免疫原性組合物作為免疫原，用于對有危險患甲型鏈球菌感染或疾病的個體進行主動的和被動的免疫原性保護。用于被動保護的免疫原性抗體是這樣產生的用本發明的任意免疫原性組合物免疫哺乳動物，然后從哺乳動物回收γ-球蛋白部分中的殺菌抗體，或者作為血清或作為特異性抗體。此處所用的本發明的疫苗能誘導用于提供對甲型鏈球菌感染的保護的抗體。
另外，甲型多糖本身可以用作免疫劑，優選與佐劑如氫氧化鋁、磷酸鋁、單磷酰基脂A、QS21或硬脂酰酪氨酸締合。本發明進一步的實施方案是用免疫原性組合物作為對抗甲型鏈球菌感染的免疫原性保護。具體地說，本發明將對那些最有危險患甲型鏈球菌感染或疾病的人群，即成人、孕婦和、特別是嬰兒和兒童，提供保護。
本發明的免疫原性組合物和疫苗可通過將GASP或綴合物分散到適宜的藥物上可接受的載體，例如生理鹽水、磷酸鹽緩沖的鹽水或其它可注射的液體中而典型地形成。疫苗可胃腸外給藥，例如皮下、腹膜內、或肌內給藥。也可以存在疫苗中常用的添加劑，例如穩定劑如乳糖或山梨糖醇和佐劑如磷酸鋁、氫氧化鋁、硫酸鋁、單磷酰基脂A、QS21或硬脂酰酪氨酸。
免疫原性組合物的劑量應是能達到致免疫作用效果的劑量。劑量通常在每千克體重約0.01μg至約10μg之間的范圍。可以給出一系列最佳免疫劑量。單位劑型的疫苗可含有與約0.01μg至約10μg相當量的GASP或綴合物。
用下列非限制性實施例來說明來發明。實施例1使甲型鏈球菌生長、制備和測定甲型鏈球菌碳水化合物抗體的方法以及它們作為新的用于成人和兒童的疫苗的應用列舉如下甲型鏈球菌的生長將-70℃的甲型鏈球菌種子貯存物涂布在含3克/升Todd Hewitt肉湯和3克/升酵母萃(GAS培養基)的培養基平板上。將平板在37℃溫育48小時，然后，將菌落(8-9)轉移到200ml的GAS培養基搖瓶中，于37℃和120轉/分鐘生長18小時。將種子培養物(150ml)轉移到15L發酵罐(New Brunswick，BioHo4)的Todd Hewitt肉湯中。使培養物在pH7.0和37℃生長7-8小時。當培養物達到靜止期(在600nm的光密度為1.5左右)時加入3g/L的葡萄糖。使培養物再生長8小時并收集培養物。最后的光密度在600nm處約為2.7。甲型鏈球菌多糖的制備將于600ml水中的60克甲型鏈球菌細胞與75ml 4N亞硝酸鈉和75ml冰乙酸合并。使溶液混合15分鐘并在SS34轉子中于11,000轉/分鐘離心10分鐘。分出上清液，對水透析并冷凍干燥。用PBS作洗脫劑通過Sphadex G-50柱(Pharmacia)凝膠過濾從粗品冷凍干燥提取物純化甲型多糖。用Dubois的苯酚硫酸酯測定法(31)監測從柱中洗脫出的各部分中碳水化合物的存在。合并碳水化合物陽性的各部分，在4℃對水透析并冷凍干燥。多糖制品(240mg)含有少于1％(重量/重量)的蛋白質和核酸。用AM-500 BRUKER分光計在500Hz通過1H-NMR進一步確認其純度。脂質體的制備用McCarty先前所述的方法(28)分離甲型鏈球菌碳水化合物。將冷凍干燥物重新懸浮，調節到10mg/ml，用苯醌作為鏈球菌透明質酸鹽連接劑的Fillit等人先前所述的方法(18)與脂質體共價連接，該文獻作為參考文獻引入本發明。簡單地說，GASP與苯醌反應形成被活化的中間體。然后該中間體進一步與脂質體形式的磷脂酰乙醇胺反應，形成免疫原性GASP一脂質體綴合物。ELISA分析基本上按照Fillit等人所述的ELISA法(18)，作了以下改進。使用人血清的預備試驗表明用在PBS中的0.5μgCHO/ml、pH7.2的脂質體制品來敏化微量滴定板給出了最好的結果，脂質體對照品的背景讀數最低。因此，將100μl制品放置于微量滴定板(Dynatech板，美國)的每個孔中，于37℃保溫過夜。然后將平板在ELISA洗滌緩沖液(10mM醋酸鈉、100mM NaCl、0.1％Brij35，pH8.0)中洗滌3次。將人血清稀釋到同樣的ELISA緩沖液中，并將得到的血清稀釋液100μl放入平板中，于37℃保溫1小時。所有血清都一式二份操作。適當洗滌后，用1∶1,000的山羊F(ab′) 2抗-人IgG(γ鏈特異性)或IgM(Mu鏈特異性)、堿性磷酸酯酶綴合物(Tago，Inc，美國)稀釋液作為次生抗體，再于37℃保溫1小時。再于ELISA緩沖液中洗滌3次后，向孔中加入于0.1M二乙醇胺(pH9.6)中的磷酸酯酶底物(Sigma104)，將平板于37℃保溫1小時，在ElidaV(Physica Co.)儀器上于405nm讀數。用給出讀數為1.0的稀釋度記作滴度。殺菌測定按下列步驟進行Lancefield所述的間接殺菌測定(15，25，26)使各種菌株的生物體在Todd Hewitt肉湯中于37℃生長18小時。先將過夜培養物的樣品以1∶2稀釋到新鮮Todd Hewitt肉湯中，再于37℃生長2小時。將懸浮液稀釋至1∶100，然后進行連續二倍法稀釋，使5-15個菌落分配在50μlTodd Hewitt肉湯中。用加肝素的血液作為人吞噬細胞的來源。為了避免吞噬細胞懸浮液中存在自體血漿，將血液在2000轉/分鐘離心10分鐘，除去血漿，將沉淀團塊在PBS(pH7.2)中洗滌3次，最后再懸浮于RPMI(Gibco-BRL，Co.，Rockville，MD)中至與初始血樣相同的體積。使用新從已知含少量抗碳水化合物抗體的正常獻血者分離的血清(其已用甲型鏈球菌在0℃被反復吸附，以等分試樣保存于-70℃)(29)向測定體系供應補體。使用之前，分析該補體來源的補體活性和甲型碳水化合物抗體的缺乏。在密封的試管中一式兩份進行殺菌測定。反應混合物如下懸浮于RPMI中的人吞噬細胞300μl，人補體100μl，待測血清200μl，稀釋的鏈球菌培養物50μl。同Lancefield測定一樣，兩個試管中的一個于37℃立式旋轉3小時，另一個作為對照的試管在同樣溫度下保持靜態。3小時后，從每個試管中取100μl涂布在血瓊脂培養傾注平板上， 并于37℃保溫過夜。然后計數每個平板上的菌落數。按下式計算調理吞噬活性，以特定血清的鏈球菌殺傷百分數表示(1-旋轉血清試驗中的cfu/靜態試管中的cfu)×100。來自人血清的N-乙酰氨基葡糖抗體的吸附將與瓊脂糖珠粒(SigmaChemical Co.)偶聯的N-乙酰氨基葡糖于PBS中的50％懸浮液600μl放置于無菌eppendorf試管中并在4℃于14000轉/分鐘離心10分鐘。除去上清液并向珠粒中加入300μl血清。將懸浮液于37℃立式旋轉1小時。在同樣條件下再次離心后，分出吸收過的血清并用于前面所述的殺菌測定中。半含有被吸附抗體的珠粒裝入1ml結核菌素注射器中，使于0.15MNaCl中的0.58％(v/v)的冰乙酸溶液(pH2.2)流過，從而從親合柱中分出N-乙酰氨基葡糖抗體。通過測定280nm的吸收度來監測洗脫液，收集峰值部分，對pH7.2的PBS透析，并用Amicon centriprep 30濃縮儀(Amicon，Bererly，MA)將其濃縮到初始的血清體積。人血清本研究中的受試者來自特立尼達、紐約、和大湖海軍培養基地。它們的年齡范圍是5-20歲。用靜脈穿刺術獲得血液，并用標準無菌技術收集血清。所有血清的年齡、來源和健康狀況示于表1。
表1人數分布
殺菌測定我們已經證實了人血清確實含有甲型碳水化合物抗體，并且這些抗體的滴度在個體中的確有所變化，下面論述的問題是是否這些抗體在體外測定體系中也能促進調理吞噬。基本上按照Dr.Lancefield(15，25，26)使用的殺菌測定法測定人血清，進行了上面簡述的改進。圖4說明了吞噬測定的結果。使用了甲型鏈球菌菌株血清型6的9個菌落形成單位的接種物，在正常兔血清存在下在旋轉的試管中菌落數目明顯增多(圖A)。圖B顯示了使用人血清的靜態試管中有略微增多。明顯相反，含人血清的旋轉試管(圖C)完全消除了生物體的生長(比較圖B和C)。
為了確定觀察到的甲型鏈球菌調理吞噬作用并不限于一種血清型，用另外三種不同M蛋白血清型的甲型菌株重復這些實驗。從圖5可見，與觀察6型菌株的情況類似，在人血清存在下，另外三種菌株都被吞噬了。比較旋轉為與靜態的試管，殺傷百分率變化為80-100％。血清型3、14、28菌株與Dr.Lance field在其細胞吞噬測定(15，25，26)中所用的菌株一致。抗-CHO滴度與人血清調理吞噬之間的關系吞噬測定清楚地表明了各種人血清促進甲型鏈球菌吞噬的能力有所不同。通常所給血清的吞噬特性與抗甲型碳水化合物抗體的滴度相關。從圖6可見，顯示出大于200,000滴度的所有血清都顯示出了大于80％的殺傷率，而4種滴度小于200,000的血清中的3種未顯示出殺傷率。一種CHO滴度為40,000的血清也促進了吞噬作用，但殺傷程度比用高滴度抗-CHO血清觀察到的殺傷程度低得多。在加肝素的血中與無肝素的測定中人血清吞噬作用的研究由于已知肝素能結合并鈍化多種補體成份并能使我們的吞噬測定與先前用過的那些測定相關，所以在存在和不存在肝素的情況下在吞噬測定中測試了上述正常人血清調理吞噬的能力。用靜脈穿刺法抽取肝素化的人血，如上所述在PBS中充分洗滌并分成兩等份。一份加RPMI再懸浮至初始體積，如上所述進行調理測定。同樣處理第二等份，但加入每ml5單位的肝素，然后同另一份一樣用同樣方法進行測定。
結果描繪于圖6，其表明不存在肝素時被人血清吞噬的甲型鏈球菌平均為94％。但是，存在肝素時，同樣的血清只能達到平均12％的同樣接種物的吞噬。
吸附實驗為了確定鏈球菌碳水化合物組成成分中哪一部分導致殺菌活性，如方法學部分所述用N-乙酰氨基葡糖偶聯的瓊脂糖珠粒吸附人血清。然后將吸附的和未吸附的血清用于標準殺菌測定。圖7示出了這些實驗的結果。未吸附的血清明顯促進了鏈球菌的吞噬作用。相反，用N-乙酰氨基葡糖偶聯的珠粒吸附過的血清去除了調理性抗體。作為存活對照，正常兔血清沒有促進吞噬作用。這些實驗表明，在我們的殺菌測定中，針對甲型碳水化合物上非還原性末端N-乙酰氨基葡糖殘基的抗體對甲型鏈球菌的調理吞噬作用非常重要。為了證實這些結果，洗脫來自選擇血清的抗體，這些血清已被吸附在N-乙酰氨基葡糖親合柱上，然后將這些抗體用于殺菌測定。也如圖9所示，這些實驗表明，從親合柱洗脫出的N-乙酰氨基葡糖特異性抗體能部分恢復血清的調理吞噬殺菌活性。
使用所設計的用來測定與甲型鏈球菌碳水化合物起反應的沉淀性和非沉淀性抗體的方法，使該碳水化合物與磷脂酰乙醇胺共價連接并將其摻入能與微量滴定板結合的脂質體中。該方法清楚地表明，大部分人血清含有對抗甲型鏈球菌多糖的抗體。
令人驚奇的是我們發現來自不同地理區域的兒童表現出他們對抗甲型碳水化合物的滴度明顯不同。雖然在特立尼達接觸鏈球菌(膿皰和咽炎)的量比紐約高。但鏈球菌感染在紐約也很普遍。關于這一點，Zimmerman等人(23)確實注意到被細心監測并治療甲型鏈球菌感染的病人與不被監測組相比甲型碳水化合物抗體滴度較低。另外，通常碳水化合物抗原是T細胞非依賴性的，因此可以想到需要反復接觸抗原來誘導抗體應答。
使用從猩紅熱急性期和恢復期病人獲得的血清進行的研究表明，在疾病發作時已經存在對抗甲型鏈球菌碳水化合物的抗全滴度，但在恢復期抗體滴度確實升高2倍。與無并發癥的猩紅熱血清相比，當出現猩紅熱發作時測定急性鏈球菌感染的ARF血清，針對甲型碳水化合物的滴度較低，但當ARF出現時滴度升高4倍，這表明，與無并發癥的猩紅熱患者相比，其對抗原的免疫應答可能較強。針對甲型碳水化合物的抗體滴度明顯低于在未產生ARF的猩紅熱患者中看到的抗體滴度。對甲型和甲型變種碳水化合物的抑制研究清楚地表明，這些抗體大部分是針對甲型碳水化合物上的特異性非還原性末端N-乙酰氨基葡糖殘基，而不是針對鼠李糖骨架。
是否這些碳水化合物抗體促進甲型鏈球菌的調理吞噬這一問題已經得到了肯定的答案，并且調理程度與抗一碳水化合物抗體的水平完全相關。通常小于100,000的ELISA滴度沒有作用，而大部分滴度大于200,000的血清促進了吞噬作用。一項重要的發現是該調理吞噬作用并非僅限于甲型鏈球菌的一種血清型，因為至少三種不同血清型的其它菌株也被吞噬了。可與N-乙酰氨基葡糖反應的抗體在調理中的重要作用通過事實得以證明從人血清中吸附這些抗體完全消除了血清的殺菌活性，而當洗脫這些抗體并加回到殺菌測定中時，又恢復了殺菌力。
幾個有關人血清殺菌測定動力學的觀察結果值得一提。首先，在殺菌測定中只有少量鏈球菌接種物是有效的，而大量接種物經常壓倒人血清調理生物體的能力。第二，殺菌活性主要以未稀釋的血清起作用，其方式與Dr.Lancefield在其對人血清和類型特異性抗體的研究(15，25，26)中觀察到的方式類似。相反，用所給類型特異性蛋白質免疫的動物血清，即使在稀釋度為1∶20或更多時仍有作用。實施例2比較正常兒童中與甲型碳水化合物起反應的抗體的滴度我們首先致力于測定是否正常兒童產生了針對甲型鏈球菌碳水化合物的抗體，以及是否這些抗體的滴度隨個體的年齡和個體生活的地理區域而改變。因此，我們用材料與方法部分中所述的ELISA測定法對從特立尼達(高鍵球菌接觸區)5歲和10歲正常兒童獲得的血清進行了與甲型碳水化合物起反應的抗體的滴度的測定，并與紐約(低鏈球菌接觸區)年齡相當的兒童進行比較，圖2表明對于5歲兒童，來自特立尼達的兒童的94％表現出小于1∶10,000的抗體滴度，平均抗體滴度為1∶158,472。這些抗體滴度與所測定的10歲兒童血清的滴度設有明顯區別。相反，在紐約的5歲兒童表現出了明顯較低的滴度，平均為1∶6,100，10歲兒童的平均滴度增長到1∶25,500。69％的紐約兒童的滴度大于1∶10,000，這一事實表明兩個年齡組中紐約地區兒童的滴度明顯低于特立尼龍地區兒童的相應滴度。
為了確定對甲型碳水化合物的免疫應答是IgG類還是IgM類，進行了下列實驗。適當稀釋對甲型碳水化合物表現出高滴度的選擇血清，使每種血清在ELISA測定中于405nm給出的讀數為1.0。然后用親合純化的人抗-IgG或抗-IgM堿性磷酸酯酶綴合物次生抗體測定每種血清。如表II中所見，針對鏈球菌碳水化合物檢測的抗體中大部分是IgG類的，而只有少數反應見于IgM類中。
表II針對鏈球菌CHO-脂質體配合物的IgG和IgM抗體滴度的ELISA測定
每種血清被大約稀釋到在ELIDA V顯示器中于405nm的讀數為1.0光密度。實施例3早型反應性抗體的部分結構確定Zimmerman等人(23)先前已經闡明某些人血清含有與從甲型變種鏈球菌分離的碳水化合物起反應的抗體，因此其是針對甲型多糖分子的聚-鼠李糖骨架部分的。為了確定跟與末端N-乙酰氨基葡糖甲型決定簇起反應的抗體相比這些鼠李糖骨架反應性抗體的量，用甲型和甲型變種純化碳水化合物進行了正常血清的抑制研究。同前面一樣，用甲型碳水化合物脂質體配合物敏化微量滴定板。將100μl的適宜血清與不同濃度的碳水化合物混合，并在37℃水浴中保溫1小時。然后將混合物于10,000轉/分鐘離心5分鐘，上清液在ELISA測定中起反應。對照物包括與鹽水混合的血清。如圖3中所示，正常血清中大部分抗甲型碳水化合物反應性抗體是針對甲型碳水化合物部分，即N-乙酰氨基葡糖決定簇的。對于甲型變種碳水化合物觀察到了某些抑制作用，但達到同樣抑制程度需要的量比甲型碳水化合物高1,000-5,000倍。由于甲型變種碳水化合物摻雜了約4％N-乙酰氨基葡糖(與甲型碳水化合物的36％相比)，所以某些檢測到的抑制作用可能是與殘余的N-乙酰氨基葡糖的反應。這表明大部分的血清免疫反應活性是針對N-乙酰氨基葡糖部分的，這可以通過在ELISA測定中加入純化的N-乙酰氨基葡糖(Sigma)則甲型抗體活性喪失來看出。這可以直接與加入密切相關的單糖N-乙酰氨基葡糖而缺乏任何抑制作用相比較。實施例4ARF與APSGN病人的抗一甲型碳水化合物抗體滴度的比較為了確定是否抗甲型碳水化合物抗體的滴度在充分證實患有鏈球菌感染后的后遺癥病人中不同，將得自急性風濕熱病人(ARF)的血清樣品與得自急性鏈球菌感染后的腎小球性腎炎患者(APSGN)的血清相比較。所有血清均得自在特立尼達住院的充分確證的ARF和AGN患者，并且在疾病急性期治療之前取血。表III總結了結果，可以看出，與疾病發作時的ARF病人相比，在APSGN患者血清中與甲型碳水化合物的反應性有所增加。當與特立尼達的正常兒童比較時，這些病人的滴度與特立尼達正常兒童的滴度也明顯不同(見圖2)。
表III患APSGN、ARF和無并發癥的猩紅熱病人的血清中抗-碳水化合物抗體的平均滴度
實施例5無并發癥的鏈球菌感染病人與ARF病人中抗-甲型碳水化合物抗體滴度的確定我們收集的大湖地區的血清均得自在大湖海軍培養基地于1946年感染了猩紅熱的病人。這些病從中一部分進一步發展為典型的ARF。因而，從這些患者中如下選擇血清1)猩紅熱急性發作期間，2)猩紅熱恢復階段(4周之后)，或3)急性鏈球菌感染后(3-4周)ARF發作期。表III表明，在少量的病例中，與發作期相比(按出現猩紅熱的時間來劃分)，對甲型碳水化合物的反應性在疾病恢復階段有所增加。在無并發癥的猩紅熱組以及在猩紅熱發作4周后發展為ARF的那些病人中均見到了對甲型碳水化合物的抗體滴度的升高。雖然研究的病例數量很少，但令人感興趣的是，與無并發癥的猩紅熱病例相比，在猩紅熱發作以及4周后風濕病發作的ARF病人中，對甲型碳水化合物的滴度較低。實施例6甲型多糖-蛋白質綴合物A.甲型多糖還原性末端的NaBH4還原將純化的甲型多糖(GASP)(100mg)溶于10ml水中，并用0.5NNaOH調節溶液pH至10。向溶液中加入固體NaBH4(100mg)，然后將反應混合物在室溫保溫2小時，用1M AcOH破壞過剩的硼氫化物。在冷處將溶液對水透析并冷凍干燥，得到91mg還原的GASP。B.用受控制的過碘酸鹽氧化反應將末端醛基引入甲型多糖將還原的GASP(90mg)溶于4.5ml水中，然后與4.5ml的50mMNaIO4合并。在室溫下30分鐘后，加入1ml乙二醇破壞過剩的過碘酸鹽，并在冷處將溶液對水透析并冷凍干燥，得到73mg氧化的GASP。C.GASP-TT和GASP-HSA綴合物通過NaBH3CN的還原性氨基化反應使氧化的GASP與單體破傷風類毒素(TT)(SSI，Copenhagen，丹麥)或人血清白蛋白(HSA)(Sigma)相連。
將氧化的GASP(40mg)與單體TT(20mg)或HSA(20mg)溶于0.2M pH7.4的磷酸鹽緩沖液中(0.7ml)。加入NaBH3CN(20mg)后，將反應混合物于37℃保溫4天。通過對小量反應混合物在Superose-12(Pharmacia)上的HPLC分析監測綴合過程。用PBS作洗脫劑在SuperdexG-200(Pharmacia)柱上層析來純化綴合物。用WatersR403示差折光儀和紫外光譜學在280nm監測從柱中洗脫出的各部分。合并含有甲型多糖一綴合物的部分，透析并冷凍干燥。用Bradford的方法(Bradford，M.M.，1976，Anal.Bio chem.72248-254)用人血清白蛋白作標準品估算綴合物的蛋白質含量。用Dubois等人的方法(31)用純化的GASP作標準品測定碳水化合物含量。TT綴合物含有39％(w/w)碳水化合物和61％(w/w)蛋白質。假設多糖平均分子量為10,000千道爾頓(通過用葡聚糖作為分子量標記物在Superose-12上進行HPLC，并用激光散射法測定分子量標記物而測得)，單體TT的分子量為150,000千道爾，GASP-TT綴合物的多糖與TT的摩爾比分別為9-10∶1。實施例7免疫與免疫測定A.免疫步驟用10mcg未偶聯的天然甲型多糖或-TT綴合物，總體積為0.5ml，在背部兩個部位皮下接種一組五只新西蘭白色雌性家兔(7-8周齡)(接種三次，間隔三周)。所給予的疫苗可以9被或者不被氫氧化鋁(Alhydrogel；Superfos，丹麥)或硬脂酰酪氨酸(ST)吸附，在明礬或ST/ml鹽水中的濃度均為1.0mg。在疫苗中加入乙基汞硫代水楊酸鈉至最終濃度為1/10,000。一組五只兔子接受了用乳化于完全弗洛因德佐劑(Sigma Laboratories)中的綴合疫苗進行的第一次注射，并接受了用乳化于不完全弗洛因德佐劑中的綴合疫苗進行的后續加強劑量注射。在0、21、42和52天從每只動物收集血清。B.ELISA使微量滴定板(Nunc Polysorb ELISA板)覆蓋上在PBS中稀釋至1.0mcg/ml的100ng GASP-HSA的綴合物，并將平板于37℃保溫1小時。覆蓋之后，用含0.05％吐溫20的PBS(PBS-T)洗滌平板，并用于PBS中的0.5％BSA在室溫封閉1小時。然后向孔中注滿100μl連續2-倍稀釋于PBS-T中的兔抗血清，并將平板于室溫保溫1小時。用PBS-T洗滌后，將平板與100μl過氧化物酶標記的山羊抗-兔IgG(H&L)(Kirkegaard & Perry Laboratories)在室溫保溫30分鐘，然后用PBS-T洗滌5次。最后，向每個孔中加入50μlTMB過氧化物酶底物(Kirkegaard & Perry Laboratories)，然后在室溫使平板保溫10分鐘，加入50μl 1M H3PO4停止反應。用Molecular Devices Emax微板讀數器在450nm對平板讀數，用650nm作為能比波長(見表IV)。
雖然我們在此已描述了本發明的一些實施方案，但顯而易見，可以改變這些基本結構而提供使用本發明方法的其它實施方案。因此，應當理解，本發明的范圍應被后面所附的權利要求書限定而不是被以實施例方式在此之前給出的特定實施方案所限制。
表IV用各種制劑形式的GAS多糖或GAS多糖一破傷風毒素綴合物免疫的家免的GAS多糖一特異性抗體的滴度疫苗 各天ELISA中的抗體滴度*0214252GASP (鹽水) 100 100 100 100GASP-TT 100 100 4,130 7,600(鹽水) (900-12,000) (2,600-13,500)GASP-TT 100 10,60081,800141,800(Al(OH)3) (4,800-21,000)(51,000-129,000) (76,700-287,500)GASP-TT 100 6,200 21,10059,600(ST) (2,300-12,700)(8,300-31,000)(21,300-95,500)GASP-TT 100 188,000 1,664,000 1,760,000(CFA，IFA) (2,200-428,500)(1,000,000-2,299,000)(1,100,000-2,370,000)*幾何平均滴度(范圍)值為100的表示抗體滴度≤100。數值是兩份測定的平均值。在第0、21和42天給家兔(5個NZW一組)皮下注射100mcg多糖(天然的或綴合的)。參考文獻1.Powers，G.F.和P.L.Boisvert(1944)。壽命作為鏈球菌中的一種因子。J.Pediat 25481。
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權利要求
1.一種免疫原性組合物，其含有致免疫量的下列式I的甲型多糖以及載體 其中R為末端還原性L-鼠李糖或D-GlcpNAc；其中n為一個足夠大的數字使得免疫原性組合物足夠大且具有足夠的平均分子量以致免疫，其中所述組合物為哺乳動物提供對抗甲型鏈球菌感染的保護。
2.根據權利要求1的免疫原性組合物，其中n為從約1至約50。
3.根據權利要求2的免疫原性組合物，其中甲型多糖的分子量為約10,000Kd。
4.根據權利要求1的免疫原性組合物，其中將所述免疫原性組合物給予個體的劑量約為每千克體重0.01μg至約10μg。
5.根據權利要求1的免疫原性組合物，其中的載體選自包括鹽水、林格氏溶液、和磷酸鹽緩沖鹽水的一組物質。
6.根據權利要求5的免疫原性組合物，其中免疫原性組合物進一步含有估劑。
7.根據權利要求6的免疫原性組合物，其中的佐劑選自包括氫氧化鋁、磷酸鋁、單磷酰基脂A、QS21和硬脂酰酪氨酸的一組物質。
8.一種免疫原性多糖一蛋白質綴合物分子，其含有式(I)的甲型多糖 其中R為末端還原性L-鼠李糖或D-GlcpNAc，而n為一個足夠大的數字，從而提供對與式(I)中所示的鼠李糖的3位配糖相連的β-D-GlcpNAc殘基的免疫原性反應，該殘基確定了誘導殺菌抗體形成的表位，并且其中多糖與蛋白質共價相連。
9.根據權利要求8的免疫原性多糖-蛋白質綴合物，其中多糖通過仲胺鍵與蛋白質相連，而形成式(II)的綴合物 其中R′ 為末端還原糖的還原和氧化產物，該還原糖未出現在式II的-CH2-NH-蛋白質仲胺鍵中。
10.根據權利要求9的免疫原性多糖-蛋白質綴合物，其中蛋白質是任何天然的或重組的細菌蛋白。
11.根據權利要求10的免疫原性多糖蛋白質綴合物，其中的蛋白質選自由破傷風類毒素、霍亂毒素、白喉類毒素或CRM197組成的一組物質。
12.根據權利要求11的免疫原性多糖-蛋白質綴合物，其中的蛋白質是破傷風類毒素。
13.根據權利要求12的免疫原性多糖-蛋白質綴合物，其中n為約1至約50。
14.根據權利要求13的免疫原性多糖-蛋白質綴合物，其中n為約3至約30。
15.根據權利要求14的免疫原性多糖-蛋白質綴合物，其中多糖的分子量為約10,000Kd。
16.根據權利要求8的蛋白質-多糖綴合物，其中綴合物的蛋白質含有T-細胞表位，并且長度至少約為10個氨基酸。
17.一種提供對抗甲型鏈球菌感染的保護的疫苗，其含有致免疫量的式(I)的甲型多糖以及載體 其中R為末端還原性L-鼠李糖或D-GlcpNAc，而n為一個足夠大的數字，從而提供對與式(I)中所示的鼠李糖的3位配糖相連的β-D-GlcpNAc殘基的免疫原應答，該殘基確定了誘導殺菌抗體形成的表位，并且其中所述組合物為哺乳動物提供對抗甲型鏈球菌感染的保護。
18.根據權利要求17的疫苗，其中的免疫原性組合物含有式(I)的甲型多糖 其中R為末端還原性L-鼠李糖或D-GlcpNAc，而n為1至50的數字，并且其中多糖與蛋白質共價相連。
19.根據權利要求18的疫苗，其中多糖通過仲胺鍵與蛋白質相連從而形成綴合物式(II) 其中R′為末端還原糖的還原和氧化產物，該還原糖未出現在式II的-CH2-NH-蛋白質仲胺鍵中。
20.根據權利要求19的疫苗，其中的蛋白質是任何天然的或重組的細菌蛋白。
21.根據權利要求20的疫苗，其中的蛋白質選自由破傷風類毒素、霍亂毒素、白喉類毒素、和CRM197組成的一組物質。
22.根據權利要求12的疫苗，其中多糖-蛋白質綴合物中的蛋白質是破傷風類毒素。
23.根據權利要求22的疫苗，其中多糖-蛋白質綴合物中的n是從約3至約30。
24.根據權利要求23的疫苗，其中疫苗軛合物中的多糖分子量為約10,000Kd。
25.根據權利要求24的疫苗，其中將疫苗給予個體的劑量約為每千克體重0.01μg至約10μg。
26.一種免疫哺乳動物對抗甲型鏈球菌感染的方法，該方法包括給予個體致免疫量的式(I)多糖 其中R為末端還原性L-鼠李糖或D-GlcpNAc；n為一個足夠大的數字而使甲型多糖足夠大并且其平均分子量能致免疫。
27.根據權利要求26的方法，其中n為從約1至約50。
28.根據權利要求27的方法，其中n為從約3至約30。
29.根據權利要求28的免疫方法，其中甲型多糖的分子量為約10,000Kd。
30.根據權利要求29的免疫方法，其中給予甲型多糖的劑量為每千克體重約0.10μg至約10μg。
31.根據權利要求30的免疫方法，其中多糖與載體一起給藥；載體選自包括鹽水、林格氏溶液和磷酸鹽緩沖鹽水的一組物質。
32.根據權利要求31的免疫方法，其中多糖進一步含有佐劑。
33.根據權利要求32的免疫方法，其中佐劑選自包括氫氧化鋁、磷酸鋁、單磷酰基脂A、QS21和硬脂酰酪氨酸的一組物質。
34.根據權利要求26的免疫方法，其中哺乳動物是人。
35.根據權利要求34的免疫方法，其中的人是兒童。
36.一種免疫原性綴合物分子，其含有式(I)的甲型多糖 其中R為末端還原性L-鼠李糖或D-GlcpNAc，而n為一個足夠大的數字，從而提供對與式(I)中所示的鼠李糖的3位配糖相連的β-D-GlcpNAc殘基的免疫原應答，該殘基確定了誘導殺菌抗體形成的表位，該多糖與脂質體共價相連形成綴合分子。
37.根據權利要求36的多糖-脂質體綴合物，其中的脂質體是由陽離子脂質構成的。
38.根據權利要求37的多糖-脂質體綴合物，其中的脂質體是由磷脂酰乙醇胺構成的。
39.根據權利要求38的多糖-脂質體綴合物，其中甲型多糖的分子量為約10,000Kd。
40.根據權利要求39的多糖-脂質體綴合物，其中免疫原性配合物所給予個體的劑量為每千克體重約0.01μg至約10μg。
41.根據權利要求36的綴合物，其中多糖-脂質體綴合物進一步含有埋入所述脂質體中的蛋白質。
42.一種通過給予致免疫量的根據權利要求37的組合物來對抗甲型鏈球菌感染的免疫方法。
43.根據權利要求42的免疫方法，其中的脂質體是由磷脂酰乙醇胺構成的并且多糖通過仲胺鍵與磷脂酰乙醇胺相連，從而形成式III的綴合物 式中R′為除與式III中仲胺鍵NH基團相連的末端還原糖部分之外的末端還原糖的還原和氧化產物，并且R2為磷脂酰乙醇胺。
44.根據權利要求43的免疫方法，其中n約從1至約50。
45.根據權利要求44的免疫方法，其中多糖的分子量約為10,000Kd。
46.根據權利要求45的免疫方法，其中多糖-脂質體綴合物所給予個體的劑量為每千克體重約0.01μg至約10μg。
47.根據權利要求46的免疫方法，其中多糖-脂質體綴合物與載體一起給藥，載體選自包括鹽水、林格氏溶液和磷酸鹽緩沖鹽水的一組物質。
48.根據權利要求46的免疫方法，其中多糖一脂質體組合物進一步含有佐劑。
49.根據權利要求48的免疫方法，其中佐劑選自包括氫氧化鋁、磷酸鋁、單磷酰基脂A、QS21和硬脂酰酪氨酸的一組物質。
50.根據權利要求49的免疫方法，其中佐劑選自包括氫氧化鋁、磷酸鋁、單磷酰基脂A、QS21和硬脂酰酪氨酸的一組物質。
51.根據權利要求18的疫苗，其中免疫原性組合物含有式(I)的甲型多糖 其中R為末端還還性L-鼠李糖或D-GlcpNAc，而n為一個足夠大的數字，以提供對與式(I)中所示的鼠李糖的3位配糖相連的β-D-GlcpNAc殘基的免疫原應答，該殘基確定了誘導殺菌抗體形成的表位，其中的多糖與脂質體共價相連。
52.根據權利要求51的疫苗，進一步含有包埋于脂質體中的天然的或重組的細菌蛋白。
53.根據權利要求52的疫苗，其中的細菌蛋白是破傷風類毒素；
54.根據權利要求53的疫苗，其中多糖-脂質體綴合物中的n為約1和50之間。
55.根據權利要求54的疫苗，其中疫苗的多糖-脂質體組合物分子量約為10,000Kd。
56.根據權利要求55的疫苗，其中疫苗給予個體的劑量為每千克體重約0.01μg至約10μg。
57.一種導致被動免疫的免疫組合物，包括來自甲型鏈球菌的殺菌抗體，其中所述抗體是通過用權利要求1、8、37和42任何一項中的任何一種免疫原性組合物來免疫個體而生成的。
58.根據權利要求57的免疫組合物，其中殺菌抗體存在于血清、γ球蛋白部分或純化的抗體制劑中。
59.一種導致被動免疫的方法，包括給予個體致免疫量的根據權利要求57的免疫組合物。
60.共價連接式(I)的甲型多糖與包含磷脂酰乙醇胺的脂質體的方法 其中R為末端還原性L-鼠李糖或D-GlcpNAc，而n為重復單位的數目，其足夠大，從而確定平均分子量足夠大的多糖以致免疫，該方法包括a)形成磷脂酰乙醇胺脂質體；b)通過還原末端糖并氧化還原的糖而形成末端醛來活化甲型多糖；c)合并活化的甲型多糖和脂質體，使甲型多糖通過還原性氨基化與脂質體共價相連，從而形成甲型多糖-脂質體綴合物；和d)回收甲型多糖-脂質體綴合物。
全文摘要
本發明提供了一種新的對抗由甲型鏈球菌引起的感染和疾病的免疫原性組合物和疫苗、生產它們的方法以及免疫方法。該組合物包括與蛋白質或脂質體共價相連而形成免疫原性綴合物的甲型鏈球菌多糖。本發明的免疫方法包括給予個體致免疫量的甲型多糖。甲型多糖可以作為基于其本身、與蛋白質綴合或與脂質體綴合的疫苗來給藥。另外，甲型多糖可以與佐劑結合。本發明特別適用于為那些最有危險患甲型鏈球菌感染和疾病的人群即成年人、孕婦并且特別是嬰兒和兒童提供主動的和被動的免疫原性保護。
文檔編號A61P31/04GK1149835SQ95193413
公開日1997年5月14日 申請日期1995年4月20日 優先權日1994年4月21日
發明者M·S·布萊克, J·B·扎布里斯凱, J·Y·泰, F·米瓊 申請人:洛克菲勒大學, 北美疫苗公司