專利名稱：神經細胞分化促進劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及新的神經細胞分化促進劑，它包含生理學活性物質NK175203或其可藥用的鹽作為活性組分并且預計例如，它可用作治療癡呆的藥物，神經細胞保護性藥物或治療外周神經病的藥物。
生理學活性物質NK175203是在國際專利公開號WO94/05679中所描述的，公開的已知化合物。
據報道，該化合物具有作為骨髓細胞增殖促進劑的活性。
體外證明，神經生長因子(下文稱NGF)延長軸突，調節神經遞質的產生并對年老動物神經細胞的再生發揮作用〔Age，8，19(1985)〕。另一方面，已知，當將NGF加到已從鼠嗜鉻細胞瘤上克隆化的新建立的細胞至PC12中時，PC12細胞停止增殖和分化成具有軸突的神經元細胞。由于這些作用，近來，NGF作為一種治療癡呆的藥物已引起人們的注意。通過使用這些細胞，已弄清楚，與NGF類似，成纖維細胞生長因子和白細胞介素6引起軸突的延長。近來，據報道，由微生物衍生的低分子量物質、Staurosporine也引起軸突的延長〔Shinkei Kagaku，26，200-220(1987)〕。
上述Stuurosporine在內科治療中是非常有價值的，因為它與NGF不同，是低分子量物質。然而，令人遺憾的是，由于具有較高的毒性，它的實際應用受到限制。
在這種情況下，在內科治療中，提供在低濃度下具有較低毒性并表現延長軸突作用的低分子量物質是非常重要的。
作為廣泛研究的結果，本發明者發現，生理學活性物質NK175203或其可藥用鹽具有促進神經細胞分化的活性。
在此發現基礎上已完成了本發明。
因此，本發明涉及神經細胞分化促進劑，它包含作為活性組分的生理活性物質NK175203或其可藥用鹽以及可藥用賦形劑或載體。本發明進一步涉及治療癡呆的藥物，神經細胞保護性藥物和治療外周神經病的藥物，它包含作為活性組分的生理活性物質NK175203或其可藥用鹽以及可藥用賦形劑或載體。
簡要說明繪1顯示NK175203對改善由給予抗癌劑增加的尾神經潛伏期的作用。
圖2顯示NK175203對改善由給予何霉素(ADM)抑制的感覺神經功能(熱敏感性)的作用。
圖2a顯示實驗開始后第72天的試驗結果，而圖2b顯示實驗開始后第85天的試驗結果。
實現本發明的最佳方法按照國際專利公開號WO94/05679中所描述的方法可制備和獲得本發明中所使用的生理活性物質NK175203。
尤其，可通過培養屬于鏈霉菌屬的微生物并在介質中制備上述生理活性物質NK175203(例如，FERM BP-4372)，在培養基中聚積生理活性物質NK175203，然后收集它們來獲得。
本發明中所使用的化合物，生理活性物質NK175203可以是其藥用鹽的形式。該鹽的實例包括與堿金屬如納和鉀的鹽和與堿土金屬如鈣的鹽。
包含生理活性物質NK175203作為活性組分的本發明神經細胞分化促進劑促進神經細胞的分化，并因此有效地用于修復和治療神經細胞的各種損傷。因此預計，例如，該促進劑可用作治療癡呆的藥物，治療由抗癌劑，糖尿病等所引起的外周神經病的藥物或神經細胞保護性藥物。
當本發明化合物用作神經細胞分化促進劑時，單獨或作為與賦形劑或載體的混合物，以注射劑，口服制劑，栓劑等的形式給予。就賦形劑和載體而言，選擇可藥用的賦形劑和載體，并且根據給藥途徑和給藥方法來確定其種類和組成。例如，就液體載體而言，可使用水，醇，動物和植物油如豆油，花生油，芝麻油和礦物油，以及合成的油。例如，就固體載體而言，可使用糖如麥芽糖和蔗糖，氨基酸，纖維素衍生物如羥丙基纖維素，和有機酸鹽如硬脂酸鎂。
在注射劑中，通常需要使用生理鹽水，各種緩沖劑，糖溶液如葡萄糖，肌醇和甘露糖醇溶液或醇如乙二醇，丙二醇和聚乙二醇。也可能在給藥前，將本發明化合物與賦形劑如糖，例如肌醇，甘露糖醇，葡萄糖，甘露糖，麥芽糖或蔗糖，或者氨基酸，例如苯丙氨酸一起溶解在適宜的注射用溶劑(例如，靜脈給藥的液體如滅菌注射用水，生理鹽水，葡萄糖溶液，電解質溶液或氨基酸溶液)中。
通常，在制劑中，該化合物的含量為重量的0.1-100％，優選為重量的1-98％，盡管在每個制劑中，該含量廣泛變化。例如，在注射劑中，活性組分的含量通常為重量的0.1-30％，優選為重量的1-10％。當口服給藥時，將化合物與上述固體或液體載體一起配制成片劑，膠囊劑、粉劑，顆粒劑，溶液，干糖漿等。通常膠囊劑，片劑，顆粒劑和粉劑含有的活性組分為重量的5-100％，優選為重量的25-98％。
根據病人的年令，體重和狀況，治療的目的等，可以確定劑量。通常當非腸道給藥時，治療劑量為1-100mg/kg·天，并且當口服給藥時，治療劑量為5-500mg/kg·天。
本發明化合物的特點為具有較低的毒性并且當連續給藥時，只顯示較小的蓄積毒性。當以500mg/kg的劑量，一次腹膜內給小鼠該藥時，本發明化合物未顯示毒性癥狀。
為了進一步更詳細地說明本發明，給出下列實施例。然而，應該知道，本發明并非只限制于此，只要不遠離本發明的精神和范圍都包括在本發明范圍內。實施例1由生理活性物質NK175203引起的PC12細胞的軸突延長試驗按照Green等，Ann.Rev.Neurosi.，3，353(1980)的方法，根據形態的改變來判斷結果。
尤其，在該方法中，將PC12細胞接種到含10％胎兒牛血清和10％馬血清的Dulbecco改良的Eagle培養基中，以便提供1×104/ml的細胞密度，并且在37℃和5％CO2存在下，在膠原蛋覆蓋的96孔多孔板中孵育過夜。接著，加入樣品，并在一天后通過顯微鏡觀察形態的改變。
結果，引起PC12細胞軸突延長的生理活性物質NK175203的有效濃度在20-2.0μg/ml范圍內廣泛變化。
在上述方法中，由于生理活性物質在50μg/ml下的細胞毒性，一天后，消滅PC12細胞。該濃度比促進神經細胞分化的物質的濃度高2.5-25倍，這意味著生理活性物質NK175203具有相對低的毒性。實施例2生理活性物質NK175203對抗癌劑引起的外周神經病模型作用的試驗測定生理活性物質NK175203對改善由抗癌劑引起的外周神經病模型的作用。用五周大小的雄性CDF1鼠作為試驗動物。由順鉑(下文簡稱CDDP)或阿霉素(下文簡稱ADM)誘導神經病。在實驗開始的0，第7，14，21，28和32天，以5mg/kg的劑量經腹膜內給予CDDP，同時，在實驗開始的0，第4，和14天，以10mg/kg的劑量，經尾靜脈給予ADM。用NK175203作為一種藥物來檢測改善作用。每周給予NK175203三次(周一，三和五)共六周。實驗開始的那天(即第0天)為周一。在使用前，將藥物各自溶解在生理鹽水中，表1概括了每組的劑量和給藥途徑。在實驗開始的第0-42天，測定尾神經潛伏期。在第72和85天，進行擺尾試驗(tail-flick test)(熱敏感性檢測)。
表1CDDP-或ADM-誘導的外周神經病模型組
(i)尾神經潛伏期的測定用下列方法測定尾神經潛伏期。將小鼠輕度乙醚化并且面朝上固定在軟木板上。作為記錄電極，將同心電極插入尾部距離根部2cm處的外側。進一步，將兩個針狀電極插入相距4cm的部位作為刺激電極。通過刺激裝置(SEN-7203型，由Nippon Konden Corporation生產)和絕緣體(SS-320丁型，由Nippon Kohden Corporation生產)在5-10V電壓下，通過刺激電極輸入刺激，持續時間0.05秒。將通過記錄電極和放大器(EI-601G型，由Nippon Kohden Corporation)得到的20-50次刺激的作用電壓加起來。然后計算平均值并用X-Y記錄儀(WX-2400型，由Graphtec Corp生產)記錄。將由此得到的作用電位的潛伏時間被刺激部位和記錄部位之間的距離除，得到傳導速度。
在開始實驗的第42天，測定尾神經潛伏期。
圖1顯示結果。與未受損組比較，單獨給予CDDP組顯示出明顯減少傳導速度，這表明已誘發神經病。另一方面，合并使用CDDP和NK175203的組顯示出，與單獨給予CDDP的組相比，每個試驗對象都明顯增加傳導速度。當所記錄的由于給予CDDP而相起的傳導速度的減小為100％時，合并使用CDDP與10和40mg/kg NK175203的組顯示，改善作用以劑量依賴方式分別為45和60％。(ii)擺尾試驗(熱敏感性測定)用下列方法進行擺尾試驗。用6V的Natsume Thermal Counter(由Natsume生產)熱燈照射。通過用燈照射30秒，將測定木板預熱后，將燈關閉。然后，用相距大約10cm高的熱燈照射鼠尾，并測定小鼠感受到熱并擺尾時所需要的時間。
在開始實驗的第72天，用ADM誘導組進行第一次擺尾試驗。用熱燈照射距離尾根部4cm部位。圖2a顯示結果。與單獨給予ADM組比較，聯合給予ADM與40mg/kg NK175203的組顯示出明顯縮短的擺尾時間，由此表明改善了對熱刺激的反應。
接著，在第85天，進行第二次試驗。用熱燈照射距離尾根部3cm的部位。圖2b顯示結果。與未受損組比較，給予ADM的組顯示出明顯延遲的擺尾時間，由此表明通過給予ADM，抑制了對熱刺激的反應。進一步，聯合給予ADM和NK175203的組顯示出與未受損組類似的擺尾時間，由此表明，明顯改善了由給予ADM所抑制的感覺神經功能。
根據這些結果證明，NK175203具有改善由鼠抗癌劑誘導的外周神經病模型的作用。實施例3(實施例1的制劑)制備顆粒將50份重的生理活性物質NK175203的鈉鹽，600份重的乳糖，300份重的結晶纖維素和20份重的羥丙基纖維素充分混合。然后，通過使用滾動壓片機(Roller CompactorTM)將得到的混合物壓片，經16目和19目篩研磨并包裹，得到顆粒。實施例4(實施例2的制劑)制備片劑在V形混合器中，將100份重的生理活性物質NK175203的鈉鹽，90份重的結晶乳糖，107份重的結晶纖維素和3份重的硬脂酸鎂混合并將得到的混合物成型為片劑，每片重300mg，實施例5(實施例3的制劑)制備注射劑向50份重的生理活性物質NK175203的鈉鹽和120份重的甘露糖醇中加入蒸餾水，得到總體積為2000份。溶解后，通過GS型毫孔濾器，將溶液無菌過濾。將濾液引入10ml小瓶中并冷凍干燥，得到每小瓶含50mg本發明化合物鹽的凍干注射粉針。
如上所述，生理活性物質NK175203或其可藥用鹽具有促進PC12細胞軸突延長的活性和相對低的毒性。因此用作細胞分化促進劑并預計，例如可用作治療癡呆的藥物，治療由抗癌劑，糖尿病等引起的外周神經病的藥物或神經細胞保護性藥物。
權利要求
1.神經細胞分化促進劑，它包含作為活性組分的生理活性物質NK175203或其可藥用鹽以及可藥用賦形劑或載體。
2.治療癡呆的藥物，它包含作為活性組分的權利要求1物質或其鹽以及賦形劑或載體。
3.神經細胞保護性藥物，它包含作為性組分的權利要求1物質或其鹽以及賦形劑或載體。
4.治療外周神經病的藥物，它包含作為活性組分的權利要求1的物質以及賦形劑或載體。
全文摘要
本發明提供神經細胞分化促進劑，它包含作為活性組分的生理活性物質NK175 203或其可藥用鹽。預計本發明神經細胞分化促進劑可用作治療癡呆的藥物，神經細胞保護性藥物或治療由抗癌劑所引起的外周神經病的藥物。
文檔編號A61K35/74GK1149256SQ95193237
公開日1997年5月7日 申請日期1995年5月15日 優先權日1994年5月23日
發明者駒形大介, 森野富夫 申請人:日本化藥株式會社