專利名稱：一種新型抗癌藥物的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物及其提取物。特別涉及一種具有抗癌活性的化合物及衍生物。
現在已知有多種物質對腫瘤有抑制作用，也有許多從天然界分出抗腫瘤物質的報告。對于皂甙類化合物，主要分為甾體皂甙和三萜皂甙兩大類，它們在世界各國的傳統藥物中廣泛存在。截至目前，已有許多甾體皂甙從植物中分離得到并進行了結構鑒定。根據R.Tschesche和G.Wulff所著“天然有機化學的未來”(W.IIerz，II.Griesenbach，G.W.Kirby，Vienna--New York，Springer，1973，462--606頁)一文所述，甾體皂甙共分為四個類型，呋甾醇配糖體(furostand sapouin)是其中的一類。對于呋甾醇類甾體皂甙，官村等人從Paris Polyphylla SM(百合科)(Chem Pharm，Bull，30(2)，712--718，1982)，莊司等人從Chamaerops humilis L，Trachycarpus Waynerianus BECC以及Rhapis exelsa Henry和R humilis BL(棕櫚科)等的葉、莖、根部中分離得到，并測定了其結構。
關于皂甙的抗癌活性，除Tschesche等，三橋等，Kupchan等，莊司等有報道(化學領域，35(6),414,1981)，(日)特許公開專利平3--271224,4--230696中申請了含有薯蕷皂甙的螺甾醇配糖體的抗癌藥，4--41429中申請了經提取及精制得到的甾體皂甙作為抗癌藥，昭58--59921中申請了含有甘蔓茶皂甙的抗癌藥外，其他雖已確定化學結構，但多未發表其生物活性。
雖已開發出多種抗癌藥物，但由于抗癌效果及安全性等問題所以至今仍未有療效顯著的抗癌藥。將對腫瘤細胞生長有抑制作用的物質進一步開發，提供抗癌效果及安全性均較好的抗癌新型藥物就是本發明的目的。
為了實現上述目標，本發明者對中國的藥用植物的粗提物進行了廣泛的抗癌活性的篩選。從百合科植物丫蕊花(Ypsilandrathibetica)全草的粗提物中確認出有明顯的抗癌活性。對其有效成分進行分離得到具有顯著抗癌活性的呋甾醇類甾體皂甙。本發明是由結構式(1)所示的呋甾醇類甾體皂甙作為有效成份的新型抗癌藥物。
本發明以分布在中國西部的丫蕊花全草為原料，以通常的皂甙提取方法，即用乙醇抽提，提取液濃縮后，殘余物用柱層析等適當的分離方法進行精制，最后得到(1)式所示的呋甾醇類甾體皂甙。 (式中、(結合位置)R1 (結合位置)R2 結構式(1)中所示的甾體皂甙，其R3＝OCH3，R4＝H的化合物為前述莊司等人已分離并進行了結構鑒定為methylproto-pb的化合物，但未報道是否有抗癌活性。結構式(1)中R3＝OCH3，R4＝OH為一新化合物；R3＝R4＝OH也為一已知化合物，這兩個化合物也未見有抗癌活性的報道。
用(1)式所示的呋甾醇類甾體皂甙對腫瘤細胞，例如人體惡性黑色腫瘤細胞，人體結腸癌細胞，小鼠白血病細胞等進行試驗，結果表明(1)式呋甾醇甾體皂甙對上述腫瘤細胞的生長有顯著的抑制作用(見表1)，且不具溶血作用，有優良的治療藥物的特性。在實際治療時，可以使用含有前述的各個呋甾醇類甾體皂甙的制劑、或呋甾醇類甾體皂甙的混合物，或大量含有這些混合物的丫蕊花的有效部位或粗提物。
以大鼠經口投入提取物進行急性毒性試驗，LD50為903mg/kg，顯示出極低的毒性。呋甾醇類甾體皂甙，或這些化合物的混合物，或含有這些化合物的粗提物，可以制成經口的或不經口的多種類型的制劑，即可制成片劑、丸劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、注射液、軟膏劑等劑型。在制造方法上，可以將有效成份與乳糖、葡萄糖、淀粉、蔗糖、飴糖、糊精、纖維素類、瓊脂、硬脂酸鎂、滑石、阿拉伯橡膠、明膠、水、植物油、聚烷烯二醇、液體石蠟、蜂蜜、(含水)羊毛脂、凡士林等常用醫藥擔體混合，做成適當的劑型。必要時可加入保存劑、安定化劑、乳化劑等。另外，對腫瘤的種類和部位無特別限定，可在皮膚癌、子宮癌、肝癌、肺癌、胃癌、喉頭癌等均可應用。本發明中甾體皂甙的用量，依患者的年齡、病狀、體重而定，通常按成人計算，皂甙的投藥量為日0.1—200mg/kg體重的程度為宜。
實施例(1)呋甾醇類甾體皂甙的制備。
將生長在中國四川的百合科植物丫蕊花(Ypsilandra thibe-tica)的全草，用5％水—95％乙醇抽提后經減壓除去溶劑得到黑褐色固體。取100克這種提取物，用正丁醇在水中提取7次得到正丁醇提取部份40g，用反相柱層析進行分離得到各流份。按后述方法進行抗癌作用的藥理評價，得到12.5g活性部份。將這些活性部份用硅膠柱層析進行兩次層析，用同樣的藥理評價方法得1.5g活性部份。接著用液——液離心分配層析(CPC)分離得到三個活性部份FrB(88mg)，FrD(280mg)和Frb(251)mg，為單一成份)。FrB及FrD再分別用硅膠柱層析，各自得到單一的活性成分FrB′(44mg)和FrD′(132mg)。
FrB′，mp184—186℃，淡黃色粉末狀固體，[α]D18.5-90.4°質譜(負離子FAB/MS)測定出分子量為1208。由糖組分的分析得知存在2分子的葡萄糖和3分子的鼠李糖。經甲基化分析得知葡萄糖為3取代(1，2，4位)及1取代體。鼠李糖為2取代(1，4位)及1取代體。以NMR分析(′II，13DEPT，′II—13CCOSY，IIOIIAIIA，NOESY，ROE SY等)的綜合結果，確定分子式為C58II96O26，結構如(1)式中R3＝OCH3，R4＝H所示的化合物。此化合物即宮F等(Chem，Pharm，Bull，30，712，1982；32，259，1984；)莊司等(Chem，Pharm，Bull，Bull，34，82，1986；)官村等(Chem pharm，Bull30，712，1982；)所報道的化合物methyl proto—pb。
FrD′，mp.184-H96O27。白色粉末狀固體。[α]D19.5—94.3°負離子FAB/MS測定出分子量為1224NMR測定的譜圖與前述methylproto—pb的數據進行比較，得知分子式為C58H98O27。其結構式為(1)式中R3＝OCH3，R4＝OH所示的化合物。是一種新的化合物Frb，mp198--202℃，白色粉末狀固體。[α]D19—87.5°。負離子FAB/MS測得分子量為1210。根據NMR的測定，確定分子式為C58H96O27。其結構式為(1)式中R3＝R4＝OH所示的化合物亦為一已知化合物。上述各化合物的物理性質分析數見下表。
結構式(1)所示的呋甾醇類甾體皂甙的13C化學位移(CD3OD)和原子團及C上的1H化學位移(CD3OD)值。
δ(ppm)s單峰；d雙峰；t三重峰；q四重峰1.式(1)(R3＝OCH3，R4＝H)所示的化合物13C化學位移 原子團1H化學位移(J(H2))16.17-CH3 1.003d(J＝7.1)16.87-CH3 0.835s17.35-CH3 0.949d(J＝6.9)17.90-CH3 1.241d(J＝6.1)18.04-CH3 1.250d(J＝6.1)18.61-CH3 1.293d(J＝6.1)19.09-CH3 1.048s21.99-CH2- 1.45～1.6029.03-CH2- 1.16.1.5830.80-CH2- 1.60.1.9231.42-CH2- 1.62.1.8232.81-CH2- 1.26.1.9732.83-CH1＜ 1.6433.22-CH2- 1.55.2.0235.05-CH＜ 1.7338.09＞C＜ -38.62-CH2- 1.07.1.8739.57-CH2- 2.29.2.4440.89-CH2- 1.17.1.7741.22-CH＜ 2.17541.88＞C＜ -47.71-CH3 3.14251.77-CH＜ 0.9457.80-CH＜ 1.1262.00-CH2- 3.65.3.80(J＝11.5)62.90-CH2- 3.67.3.86(J＝11.8)65.09-CH＜ 1.7369.16-CH＜ 4.037(J＝6.1)69.83-CH＜ 4.115(J＝6.1)70.50-CH＜ 3.70(J＝6.1)71.79-CH＜ 3.285(J＝10.0)72.19-CH＜ 3.93(J＝3.5)72.45 3-CH＜ 3.93(J＝3.5)，3.60(J=9.3)3.67(J＝9.5)72.95-CH＜ 3.78(J＝3.5)72.98-CH＜ 3.78(J＝9.0)73.90-CH＜ 3.40(J＝9.5)74.00-CH＜ 3.40(J＝9.0)75.22-CH＜ 3.187(J＝9.3)76.08-CH2- 3.38.3.7276.72-CH＜ 3.32(J＝2.0.J＝4.1)77.93-CH＜. 3.26(J＝2.1.J＝5.6)78.02-CH＜ 3.57(J＝9.0)78.21-CH＜ 3.35(J＝9.0)79.37-CH＜ 3.6079.52-CH＜ 3.40(J＝8.5)79.63-CH＜ 3.53(J＝9.0)80.90-CH＜ 3.55(J＝9.0)82.50-CH＜ 4.365100.57 -CH＜ 4.493(J＝7.8)102.38 -CH＜ 5.188(J＝1.7)102.67 -CH＜ 4.636(J＝1.9)103.20 -CH＜ 5.175(J＝1.7)104.64 -CH＜ 4.239(J＝7.8)114.00 ＞C＜ -122.86 -CH＝ 5.375141.99 ＞C＝ -2.式(1)(R3＝OCH3，R4＝OH)所示的化合物13C化學位移 原子團1H化學位移(J(H2))9.77 -CH30.920(d.J＝7.1)17.28 -CH30.956(d.J＝6.6)17.63 -CH30.85317.88 -CH31.240(d.J＝6.1)18.02 -CH31.250(d.J＝6.1)18.60 -CH31.293(d.J＝6.1)19.88 -CH31.04921.72 -CH2- 1.53.1.6220.93 -CH2- 1.15.1.6230.80 -CH2- 1.62.1.9031.24 -CH2- 1.69.1.7332.11 -CH2- 1.25.2.0332.86 -CH2- 1.35.1.6933.24 -CH2- 1.55.2.0133.25 -CH＜ 1.6435.05 -CH＜ 1.7538.05 ＞C＜ -38.63 -CH2- 1.08.1.8939.55 -CH2- 2.292.2.44443.54 -CH＜ 2.357(q.J＝7.1)46.26 ＞C＜ -47.53 -CH33.17251.53 -CH＜ 0.9453.97 -CH＜ 1.7162.00 -CH2- 3.65.3.7962.90 -CH2- 3.66.3.8669.17 -CH＜ 4.038(d.q.J＝6.1.J＝9.5)69.83 -CH＜ 4.116(d.q.J＝6.1.J＝9.5)70.49 -CH＜ 3.7071.78 -CH＜ 3.2872.20 -CH＜ 3.92572.46 3-CH＜ 3.60.3.66.3.93
72.96 -CH＜ 3.7872.98 -CH＜ 3.7573.90 -CH＜ 3.3974.00 -CH＜ 3.3975.23 -CH＜ 3.184(d.d.J＝7.8.J＝9.0)76.06 -CH2- 3.38.3.7376.73 -CH＜ 3.3177.94 -CH＜ 3.2578.03 -CH＜ 3.5778.21 -CH＜ 3.3579.35 -CH＜ 3.5979.51 -CH＜ 3.3979.64 -CH＜ 3.5380.89 -CH＜ 3.5490.92 -CH＜ 3.958(t.J＝7.2)91.70 ＞C＜ -100.55 -CH＜ 4.494(d.J＝7.8)102.38 -CH＜ 5.188(d.J＝1.7)102.68 -CH＜ 4.834(d.J＝1.7)103.21 -CH＜ 5.174(d.J＝1.7)104.66 -CH＜ 4.238(d.J＝7.8)114.72 ＞C＜ -122.64 -CH＝ 5.379(d.J＝5.4)141.95 ＞C＝ -3.式(1)(R3＝R4＝OH)所示的化合物13C化學位移 原子團1H化學位移(J(H2))9.67 -CH30.920(d.J＝7.2)17.38 -CH30.941(d.J＝6.6)17.62 -CH30.84717.90 -CH31.249(d.J＝6.1)18.02 -CH31.238(d.J＝6.1)18.61 -CH31.292(d.J＝6.1)19.88 -CH31.049
21.77 -CH2- 1.52.1.6528.42 -CH2- 1.25.1.6730.81 -CH2- 1.60.1.9232.25 -CH2- 1.24.2.0232.96 -CH2- 1.37.1.6933.14 -CH＜ 1.6333.25 -CH2- 1.57.2.0134.95 -CH＜ 1.7536.77 -CH2- 1.70.1.7038.06 ＞C＜ -38.63 -CH2- 1.08.1.8939.55 -CH2- 2.28.2.4443.58 -CH＜ 2.255(q.J＝9.2)46.07 ＞C＜51.54 -CH＜ 0.9453.91 -CH＜ 1.6862.00 -CH2- 3.65.3.8062.85 -CH2- 3.67.3.8769.17 -CH＜ 4.036(d.d.J＝6.1.J＝9.5)69.82 -CH＜ 4.114(d.d.J＝6.1.J＝9.5)70.49 -CH＜ 3.7071.76 -CH＜ 3.2872.20 -CH＜ 3.922(d.q.J＝1.7.J＝3.4)72.463-CH＜ 3.60.3.66.3.932(d.q.
J＝1.7.J＝3.4)72.96 -CH＜ 3.7872.99 -CH＜ 3.7473.90 -CH＜ 3.3974.01 -CH＜ 3.3975.24 -CH＜ 3.181(d.d.J＝7.8.J＝9.0)76.06 -CH2- 3.39.3.7376.73 -CH＜ 3.3177.94 -CH＜ 3.2578.04 -CH＜ 3.5778.18 -CH＜ 3.3479.35 -CH＜ 3.5879.50-CH＜3.3979.65-CH＜3.5380.91-CH＜3.5490.95-CH＜4.152(t.J＝7.2)91.59＞C＜-100.55-CH＜4.493(d.J＝7.8)102.38-CH＜5.187(d.J＝1.7)102.68-CH＜4.832(d.J＝1.7)103.21-CH＜5.174(d.J＝1.7)104.65-CH＜4.233(d.J＝7.8)112.44＞C＜-122.64-CH＝5.377141.95＞C＜-(2)抗癌活性的測定。
在加入了上記(1)式中的甾體皂甙的培養基中進行腫瘤細胞的培養，由于甾體皂甙具良好的水溶性，故直接將樣品加入培養基中。培養基內含10％牛胎兒血清。腫瘤細胞分別為人體惡性黑色腫瘤細胞HMV--1，人體結腸腺癌細胞LS180，小鼠白血病細胞L1210，培養器為美國產24孔培養過濾器。甾體皂甙在加進孔穴的培養基后直接加入腫瘤細胞。在37℃、5％的CO2培養箱中培養6天，在第6天時用計數器測定細胞數目，其結果如表1所示。三種呋甾醇類甾體皂甙均顯示很強的抗癌活性。
表1呋甾醇類甾體皂甙抗癌活性試驗結構(1)所示化合物IC50(μg/ml)R3R4HMV- LS-180 L1210OCH3H 0.3 0.3 0.3OCH3OH 3.3 0.7 2.6OHOH 0.9 0.3 2.6(3)溶血作用紅血球為羊紅血球(綿羊血，日本SLC公司制)以Sigma公司市售的皂甙為對照品，在0.85％緩沖液的食鹽水中加入羊紅血球后，分別加入上記(1)式中的甾體皂甙及對照品，室溫中放置30分鐘，于700GF離心5分鐘，取出上清液于500nm(L-2000型，日立公司制)F測定吸光度，其結果，溶血作用的IC50值，市售皂甙對照品為20μg/ml。上記(1)式中的三種皂甙，即R3＝OCH3，R4＝H；R3＝OCH3，R4＝OH；R3＝R4＝OH的化合物均未發現溶血作用。
甾體皂甙的抗腫瘤制劑仍未商品化，但實踐證明本發明的呋甾醇類甾體皂甙作為新的抗癌藥物將是有效的。
權利要求
1.一種新型的抗癌藥物，其特征是，其有效成分呋甾醇類型的甾體皂甙結構式為 (式中、(結合位置)R1 (結合位置)R2 式中的R3＝OH，OCH3，R4＝H，OH。
2.權利要求1所述的抗癌藥物，其特征是結構式中的R3＝OCH3，R4＝OH。
3.權利要求1或2所述的抗癌藥物，其特征是其有效成分為呋甾醇甾體皂甙一種化合物，或這些化合物的混合物，或含有這些化合物的粗提物；可以做成經口或非經口的多種類型制劑。
全文摘要
從藥用植物丫蕊花中提取的呋甾醇類甾體皂甙作為有效成分的新型抗癌藥能對人體的惡性黑色腫瘤細胞，人體結腸癌腺細胞，小鼠白血病細胞等有顯著的抑制作用，無溶血作用，毒性較低。
文檔編號A61K31/70GK1115643SQ9511123
公開日1996年1月31日 申請日期1995年1月27日 優先權日1994年7月29日
發明者李宏, 陳新民, 川邊紀雄, 戶上泰彥, 上西憲明 申請人:中國科學院成都生物研究所, 東麗株式會社