專利名稱：降鈣素類似物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及降鈣素類似物多肽及其應用。
本發明的多肽可用于防止和/或治療鈣代謝性疾病，例如減輕骨質疏松癥的疼痛，防止骨形成不全骨質疏松癥的骨折，治療高鈣血和Paget氏病。
降鈣素作為一種肽激素由D.H.Copp等人于1961年在頸靜脈血中首次發現，它顯示出了降低血鈣濃度的活性。
現在已經由具有如下所示序列(實質上相應于SEQ IDNO1)的32個氨基酸殘基構建了降鈣素5 10 15Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-20 25 30Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro·NH2在上列氨基酸序列中，Pro.NH2表示脯氨酸酰胺殘基，第1和第7位上的兩個Cys殘基由一個二硫鍵相連。
此后，具有類似于降鈣素生物活性的肽激素已由多種動物如鮭、鰻鱺、雞、豬、大鼠、兔、羊、牛和Stingray中提取出來，這類天然降鈣素的氨基酸序列已被測定。
降鈣素的結構特點包括32個氨基酸的恒定鏈長，第1和第7位半胱氨酸殘基間的二硫橋，在N末端由7個氨基酸殘基形成的環，以及羧基末端的脯氨酸酰胺。然而，普遍存在于所有降鈣素中的氨基酸殘基僅是第1、第4—7、第28和第32位的氨基酸(共7個)。據認為，普遍存在于所有降鈣素(末端的脯氨酸酰胺是展現其生物活性所必不可少的〔J.T.Potts，Jr.et al.，“Calcium，ParathyroidHormone and the Calcitonins”，page 121 printed byExcerpta Medica，Amsterdam(1971)P.Sieber，“Calcitonin1969”，page 28，Proc.2nd Symp.，printed by MedicalBooks，London(1970)；and W.Rittel et al.，“Experientia”，Vo.，32，page＝246(1976)〕。
已經知道降鈣素顯出降低血鈣濃度〔P.F.Hirsch et al.，“Science”，Vol，146，page 412(1063)〕、抑制進食〔W.J.Freed etal.，“Science”，Vol.206，page 850(1979)〕和抑制胃分泌〔R.D.Hesch et al.，“Horm.Metab.Res.”，Vol.3，page 140(1971)〕的生物活性。
為了獲得降鈣素，首先嘗試了從哺乳動物血及組織樣品中提取，然后才應用化學合成法。前者的局限性來自原材料的可得性和純化操作過程的麻煩；而后者也有合成操作麻煩的不足，因為所有的降鈣素都由32個氨基酸殘基構成，合成本身及純化過程又需要較長的時間周期，以致于以合理的代價提供大量的降鈣素是極其困難的。
近年來，遺傳工程有了顯著的發展，并已提出了遺傳工程中的加工應用技術，包括以下步驟用DNA合成儀和單鏈cDNA合成編碼降鈣素之一的單鏈DNA片段；由單鏈cDAN制備雙鏈DAN片段；純化雙鏈DNA片段；將純化的雙鏈DAN片段插入載體；用重組載體轉化E.coli；培養轉化體以表達編碼降鈣素的多肽；分離純化所表達的多肽。然而，在這種情況下，具有C末端脯氨酸酰胺并表現出所需生物活性的多肽并不能由E.coli表達。因此，在分離一純化步驟中需要進行C末端酰胺化處理，而C末端酰胺化酶非常昂貴，該酶學處理過程需要專門的技術和技巧，并且酶學過程致使目的產物的得率低。因此，考慮到試劑的成本及產物的得率，不能認為上述常規方法是一種適于工業規模生產降鈣素的方法。
于是，受讓人公司的研究人員努力地研究并調查了加工利用遺傳重組技術，以發現勿需昂貴C末端酰胺化酶的各種降鈣素類似物，每一種類似物在其氨基酸序列中不含有甲硫氨酸(Met)，C末端結構為脯氨酸33—高絲氨酸3酰胺(Pro32—Hse33—NH2)，低級烷基，1—20碳原子，高絲氨酸33酰胺，或者可任意選擇的多肽鏈及在C末端含有高絲氨酸酰胺〔Jap.Pat.Hei4(A.D.1992)—59795(A)，相應于EP464549〕。在這些專利文獻中所描述的方法有些類似于受讓人公司對作為肽激素之一的胃動素類似物所提出的方法，公開于Jap.Pat.Hei3(A.D.1991)—80096(A)(相應于EP355720)。也就是說，根據上述專利文獻所描述的方法，每一種降鈣素的制備可以是合成單鏈DNA片段，該片段包括N末端的前導多肽及其C末端的Met殘基，編碼降鈣素類似物基因的多肽及其C末端Met殘基，在C末端有Met殘基的間隔肽，編碼降鈣素類似物基因且在其C末端有Met殘基的多肽(間隔肽與降鈣素類似物基因以復數形式排列)；合成互補于第一條單鏈DNA片段的單鏈DNA片段；由單鏈DNA片段制備雙鏈DNA片段；將雙鏈DNA片段插入載體(如質粒)得到重組載體；用重組載體轉化微生物(如E.coli)或哺乳動物細胞(如CHO細胞)；培養轉化體以表達在轉化體中作為包涵體或融合蛋白的多肽；用溴化氰處理包涵體以斷裂每一位置上的Met，并將C末端的Met殘基修飾為Hse或Hse—內酯殘基；用酸處理反應液，例如，用0.1N HCl溶液于30℃處理3小時，將所有的多肽轉變成在其C末端帶有Hse—內酯的那種形式；凍干所得多肽；然后用氨處理，或與低級烷基胺反應。
在所說專利文獻中公開的方法使得可能以合理的成本大量地制備各種降鈣素類似物，但這些類似物的生物活性，如鮭I降鈣素—Hse33—NH2基本上與天然鮭J降鈣素的相同。
本發明的目的之一是提供一種降鈣素類似物，它有如所說專利文獻中的極佳產率，同時顯示出較其基本天然型降鈣素明顯高的生物活性。
本發明另一個很重要的目的是提供防止和/或治療鈣代謝性疾病的藥物組合物，它含有作為有效成分的降鈣素類似物。
本發明人通過努力的研究發現，盡管普遍存在于所有天然降鈣素中的C末端Pro—NH2結構被認為是展示降鈣素生物活性所必需的，但用Hse32—NH2替代C末端的Pro32—NH2能顯著地增強其生物活性，因此本發明是成立的。
因此，根據本發明，降鈣素類似物的特征在于其氨基酸序列為(實質上相應于SEQ ID No2)5 10 15Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-20 25 30Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Hse·NH2
在上列氨基酸序列中，Hse·NH2表示高絲氨酸酰胺，1位和7位上的Cys殘基由二硫鍵相連。
該氨基酸序列與鰻鱺降鈣素的相同，但除了后者的C末端的氨基酸殘基為Pro·NH2。
用于防止和/或治療鈣代謝性疾病的本發明藥物組合物的特征在于含有作為有效成分的降鈣素類似物，該類似物具有所說的氨基酸序列。
本發明的降鈣素類似物的制備是通過用肽合成儀合成編碼所說氨基酸序列但在32位有Hse殘基的多肽，用鐵氰化鉀氧化1位和7位Cys中的硫羥基形成兩Cys之間的二硫連接，用酸處理多肽形成C末端有Hse—內酯的多肽，用氨處理多肽以使其C末端酰胺化。
為了大量地得到降鈣素類似物，應用了Jap.Pat.Hei 3(A.D.1991)—80096(A)(相應于EP355720)中所述方法。即，制備降鈣素類似物通過合成單鏈DNA片段，該片段包括在N末端的前導多肽及其C末端Met，編碼降鈣素類似物基因的多肽及其32位C末端Met，C末端帶Met的間隔肽，編碼降鈣素類似物基因且在其C末端有Met的多肽(間隔肽與降鈣素類似物基因以復數形式排列)；合成互補于第一條單鏈DNA片段的單鏈DNA片段；由單鏈DNA片段制備雙鏈DNA片段；將雙鏈DNA片段插入載體(如質粒)得到重組載體；用重組載體轉化微生物(如E.coli)或哺乳動物細胞(如CHO細胞)；培養轉化體以表達在轉化體中作為包涵體或融合蛋白的多肽；用溴化氰處理包涵體以斷裂每一位置上的Met，并將C末端的Met修飾為Hse或Hse—內酯，再參考上文用鐵氰化鉀、酸和氨處理反應液。
下面將根據參照實施例、實施例、生物學試驗實施例和藥品制備實施例進一步解釋本發明。參照實施例(合成天然型鰻鱺降鈣素)使用肽合成儀(Model 431A，Applied Biosystems Co.)合成具有下列氨基酸序列的多肽，然后用三氟甲磺酸(TFMSA)法去除保護基和裂斷多肽和樹脂肽間的連接。在上述合成過程中，利用methylbenzhydrylamine樹脂提供C末端酰胺肽。Cys—Ser—Asn—Leu—Ser—Thr—Cys—Val—Leu—Gly—Lys—Leu—Ser—Gln—Glu—Leu—His—Lys—Leu—Gln—Thr—Tyr—Pro—Arg—Thr—Asp—Val—Gly—Ala—Gly—Thr—Pro被合成的多肽經反相高效液相色譜(rp—HPLC)純化，該過程用μ—bondasphere(Waters Co.)C—18柱(19×150mm)在下列條件下完成。
洗脫溶于0.012N HCl中的20—40％乙腈線性梯度(45分鐘)流速7.0ml/min檢測波長220nm回收主峰處的餾分，凍干。
取一部分凍干多肽(60mg)溶解于0.05％乙酸溶液中(60ml)。在用3M氨水溶液將pH值調至8.5后，加入0.1M鐵氰化鉀(1.8ml)，將混合物于室溫下攪拌30分鐘，以使1位和7位Cys殘基間形成二硫橋。向反應液中加入50％乙酸溶液調pH值至5.0，再用Sephadex(Pharmacia AB)G—15柱進行凝膠過濾以除去多余的鐵氰化鉀，然后將肽餾分凍干。
所得的凍干多肽再一次用μ—bondasphere(Waters Co.)C—18柱(19×150mm)在上述相同條件下進行HPLC，得到所需的天然型鰻鱺降鈣素。
用FAB—MS分析法鑒定多肽，以證實多肽是正確合成的。實施例(合成〔Hse32—NH2〕鰻鱺降鈣素)使用肽合成儀(Model 431A，Applied Biosystems Co.)合成具有下列氨基序列的多肽，然后用TFMSA法除去保護基并裂斷多肽與村脂肽間的連接。在上述合成過程中應用了氨甲基化的聚苯乙烯鹽酸樹脂，并利用N—Boc—O—芐基—L—高絲氨酰基—4—(甲氧基)苯乙酸作為高絲氨酸源(Boc四—丁氧羰基)。Cys—Ser—Asn—Len—Ser—Thr—Cys—Val—Leu—Gly—Lys—Leu—Ser—Gln—Glu—Leu—His—Lys—Leu—Gln—Thr—Tyr—Pro—Arg—Thr—Asp—ValGly—Ala—Gly—Thr—Hse·OHC—18柱(19×150mm)〕在下列條件下純化，回收主峰的餾分，凍干。
洗脫溶入0.012N HCl的20—40％線性梯度的乙腈(45分鐘)流速7.0ml/min檢測波長220nm取一部分凍干多肽(60mg)溶解于0.05％乙酸溶液中(60ml)。在用3M氨水溶液將溶液pH值調至8.5后，加入1.8ml 0.1M鐵氰化鉀，將混合物于室溫下攪拌30分鐘，以使1位和7位Cys殘基間形成二硫橋。向反應液中加入50％乙酸溶液調pH值至5.0，再用Sephadex(Pharmacia AB)G—15柱進行凝膠過濾，除去剩余的鐵氰化鉀，然后凍干肽餾分。
利用反相高效液相色譜在上述相同條件下純化所得的凍干多肽。凍干具有C末端Hse殘基的純多肽，用0.1N HCl于30℃處理3小時進行內酯化，然后再凍干。
氨溶液(Adrich Co.，2.0M的甲醇溶液)以0.5ml氨溶液/1g多肽的量加入到凍干多肽中，于37℃攪拌1小時，Hse—內酯轉變為相應的低級酰胺，然后于真空中干燥，得到所需的〔Hse32—NH2〕鰻鱺降鈣素。
用FAB—MS分析法鑒定多肽，以證實所得多肽是正確合成的。藥理學試驗實施例(檢測生物學活性)由實施例和參照實施例所得的多肽分別溶于含0.1％牛血清白蛋白(BSA)的1％乙酸鈉緩沖液(pH4)中，經頸靜脈向Wister雄性大鼠(6周齡，試驗前一天禁食)給藥。利用市售的檢測試劑盒(“Cal-cium C—Test Wako”，Vako Pure Pharmaceuticals Co.Ltd.，Japan)經OCPC法檢測給藥1小時后的血清鈣濃度。通過利用鰻鱺降鈣素(Penisula Lab.Inc.，Lot No.015405，4500IU/mg)作標準和借助2—2平行劑量檢測法得到表示為單位數的樣品降鈣素活性。所得的每毫克每種樣品多肽的活性單位數作為比活性。
結果如下表1所示，由此可顯而易見，本發明降鈣素類似物(〔Hse32—NH2〕—鰻鱺降鈣素)的生物活性顯著高于其中的32位氨基酸為Pro—NH2的天然型鰻鱺降鈣素。
表1樣品 比活性(IU/mg)參照實施例4500實施例6800藥品制備實施例將得自實施例并溶于精制水中的降鈣素類似物水溶液(100IU)無菌裝入小瓶。凍干后密封小瓶，得到干粉狀藥品。當需要用時，將藥粉溶于鹽水等進行注射。
藥品中降鈣素類似物的活性單位可在大約10—200IU范圍內變化。
為肽類激素制劑所廣泛接受的添加劑或穩定劑，如血清白蛋白或類似的肽和蛋白質可加入降鈣素類似物溶液中。
序列表SEQ ID NO1序列類型氨基酸序列長度32個氨基酸鏈數單拓撲結構兩者兼有分子類型肽假設的無反義無Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe5 10 15Asn Lys Phe His Thr Phe Pro Gln Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro20 25 30SEQ ID NO2序列類型氨基酸序列長度32個氨基酸鏈數單拓撲結構兩者兼有分子類型肽假設的無反義無Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu5 10 15His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asp Val Gly Ala Gly Thr Xaa20 25 30SEQ ID NO3序列類型氨基酸序列長度32個氨基酸鏈數單拓撲結構線性分子類型肽假設的無反義無Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu5 10 15His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asp Val Gly Ala Gly Thr Pro20 25 30SEQ ID NO4序列類型氨基酸序列長度32個氨基酸鏈數單拓撲結構線性分子類型肽假設的無反義無Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu5 10 15His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asp Val Gly Ala Gly Thr Xaa20 25 30
權利要求
1.一種具有下列氨基酸序列(實質上相應于SEQ IDNO2)的降鈣素類似物5 10 15Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-20 25 30Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Hse·NH2其中，Hse·NH2表示高絲氨酸酰胺，1位和7位Cys殘基由二硫鍵相連。
2.降低血鈣濃度的藥物組合物，包括有效量的具有權利要求1所示氨基酸序列的降鈣素類似物，以及非毒性藥物載體或賦形劑。
3.降低血鈣濃度的方法，包括給需要這類治療的病人施用有效量的、具有權利要求1所示氨基酸序列的降鈣素類似物和非毒性藥物載體或賦形劑。
全文摘要
本發明涉及降鈣素類似物多肽及其應用。所說多肽具有的氨基酸序列是用高絲氨基酸殘基(Hse·NH
文檔編號A61P5/00GK1120549SQ9510703
公開日1996年4月17日 申請日期1995年6月20日 優先權日1994年6月21日
發明者野田倫, 吉名重亮, 石田力, 富谷升 申請人:株式會社三和化學研究所