專利名稱：吡咯類在生物活性蛋白溶液中作為殺病毒劑的用途的制作方法
總體上說，本發明涉及將生物學活性蛋白質溶液中病毒滅活的方法，具體地講，涉及使用唑類滅活生物學活性治療用蛋白質水溶液中病毒。
長期以來已經認識到消滅治療用產品中病毒感染的重要性。這一點對于來源于人血液或者更進一步說來源于用于制備生物技術產品(例如重組DNA產物和單克隆抗體)的細胞系的生物學活性產品顯得尤其正確。
就用于生物學活性蛋白的殺病毒劑而言，重要的目的是確保完滿的殺病毒作用而不有害地影響到蛋白質的生物學活性。這些目的要求我們考慮如蛋白質本身，其活性和/或活性位點的特點，殺病毒劑，使用后除去該殺病毒劑的重要性和/或容易程度，以及(滅活)處理本身的可變性如時間，溫度和濃度此類可變數。
單獨用熱處理的辦法可用于某些蛋白質的殺病毒處理(例如，在60℃進行的巴斯德滅菌)。但是，在許多情況下僅使用加熱處理要避免生物學活性或效用的損失是有困難的。
為了避免僅使用加熱處理而產生的某些缺點或活性損失，已經使用或計劃用各種各樣的化學試劑作為生物學活性蛋白的殺病毒劑。參見例如，M.Dobkin和M.Shearer的美國專利NO.5,071,650，該專利公開了在特定條件下使用酒精。
用于制備病毒疫苗的和更進一步，用于將來源于人血漿中的生物產品制劑中內源病素滅活的非爆發性有機溶劑/去污劑混合物的效用已受到了使用條件(例如PH)的限制。一種用于中性PH值的生物學活性蛋白的殺病毒劑化合物是磷酸三正丁酯(TNBP)。參見例如A.Neurath和B.Horowitz的美國專利NO.4,540,573，該專利公開了使用TNBP滅活脂類包被病毒。還可參見G.Tsay的美國專利N0.5,110,910，該專利公開了在受控的PH，導電性和蛋白質濃度條件下使用TNBP作為殺病毒劑。不幸的是，現行的殺病毒劑通常主要滅活脂類包被的病毒，并且還沒有證明這些殺病毒劑對失去脂類包被的更難對付的一類病毒有效。
已將各種各樣的吡咯化合物用作為殺真菌劑(例如，參見Hector等人的美國專利NO.5,006,513)，但我們并不知道任何將它們用作為生物學活性蛋白溶液的，尤其是抗不含脂類病毒的殺病毒劑的建議。現在我們已經發現唑類具有一種將水溶液中的包被和非包被病毒滅活，而且保留了蛋白質如免疫球蛋白的生物學活性的特殊能力。下文中詳細描述我們的方法。
本發明所述的是將具生物學活性，治療用蛋白質水溶液中的包被和非包被病毒滅活的方法包括在足以確保從本質上減少兩類病毒(每一種病毒降低2或更多log值的病毒效價)而不有害地影響蛋白質的生物學活性(即活性恢復率大于50％以上)的條件下，將該溶液與吡咯接觸。在去污劑存在下可加強殺病毒活性。擔負滅活作用的主要功能基團是五聚吡咯環，通過改變環結構或將其他功能基團連接到該環上可以調節滅活作用。優選的唑類是咪唑，優選的是使用一種下文中描述的去污劑。
實施例如下文中闡述的，已經證實唑類對包被和非包被病毒都具有殺病毒活性。如本文中使用的，術語吡咯或吡咯類似物或吡咯衍生物是指具有五聚吡咯環的化合物，并且其在不損害有用蛋白質如治療用蛋白質的生物學活性的溫度，PH和濃度的條件下具有殺病毒活性。
化學試劑所使用的唑類是咪唑，α-氨基-1H-咪唑-4-丙酸(組氨酸)，2-咪唑啉酮(亞乙基脲)，1H-咪唑-4-乙胺(I4EA)。唑類，去污劑(例如，多乙氧基醚；Triton X-100)，緩沖鹽是試劑級并且從Sigma Chemicals，St.Louis，Mo.得到的。
病毒包被病毒水瘡性口炎病毒(VSV)，印第安那株，從Finnish RedCross得到，是一種彈犬病毒(RNA)。痘苗病毒，Lederle株，ATCCVR-118，是一種痘病毒(DNA)。Sindbis是一種披蓋病毒(RNA)。唇瘡疹病毒1型(HSV-1)是一種瘡疹病毒(DNA)。
非包被病毒腦心肌炎病毒(EMC)是一種鼠細小核糖核酸病毒(RNA)。脊髓灰質炎病毒2型是一種人脊髓灰質炎病毒(RNA)。呼吸道腸道病毒3型是一種呼吸道腸道病毒(RNA)。以前曾報道過病毒的衍生(參見，Lembach，et al.，Current Studies in Hematology andBlood Transfusion.Basel，Karger，1989；56.97-108)。
病毒分析在標準條件下，使用于24孔平板上生長好的VERO細胞單層上，測定除Sindbis外的所有病毒的效價，每個稀釋度測4個孔。效價以組織培養物感染劑量表示50％終點估/ml(TCID50/ml)。以同樣方式在BHK-21細胞單層上，標準條件估測細胞病變效應而測定Sindbis病毒的效價。
蛋白質因子VIII(FVIII)，給血友病給藥的一種凝結因子，來自于懸浮培養生長的重組體倉鼠腎細胞。該重組FVIII.產物(rFVIII)描述于以D.J.Capon等人名譽申請的EP160,457中。
G類單克隆抗體(人)(m-IgG.抗腫瘤壞死因子，細胞系ATCCNO.HB9736)來源于以懸浮培養生長的埃-巴二氏病毒轉化的人B淋巴細胞。通過離子交換和大小排阻層析(size exclusionchromatography)將IgG純化到98％以上。這些抗體描述于H.Kuo的EP351,789中。
采用Cohn-Oncley方法從人血漿中純化出纖維蛋白原。采用Cohn-Oncley方法從人血漿中純化出人血清白蛋白(餾分V)。參見，例如，Cohn，E.J.，L.E.Strong，W.L.Hughes，D.J.Mulford，J.N.Ashworth，M.Melin和H.L.Taylor。“Preparationand Properties of Serum and Plasma Proteins.IV.A System for the Separation into Fractions ofthe Protein and Lipoprotein Components ofBiological Tissues and Fluid.”J.Am.Chem.Soc.68，459(1946)。
采用A280，放射性免疫擴散，以及FPLC-Superose 6(Pharmacia的快速蛋白質液相大小排阻層折)測算蛋白質回收率。采用基于活化的部分組織促凝血酶原激酶時間(APTT)以及經修改的Langdell的方法(Langdell，R.D.，Wagner，R.H.，Brinkhouse，A.“Effect of anti-hemophiliac Factoron one-Stage clotting Test，”J.Lab.Clin.Med.41637-647，1953)，測定FVIII。
處理方案將1/100稀釋的病毒原液接種到蛋白質溶液中以最大程度地降低含病毒介質的作用。加入1倍體積的吡咯溶液達到最終所需濃度。在限定的條件(時間，溫度)周期性地緩慢混合而培養經處理和對照樣本。以適當的時間間隔取出樣品并立即測出殘留的感染病毒的效價。
進行一些測定顯示有殺病毒活性的唑類型的研究。如表1所示，各種各樣的唑類物質都能有效地降低VSV效價。導致病毒失活的主要功能基團是五聚吡咯環，通過改變環結構或者將其他功能基團連接到該環上可以調節該環功能。
表1VSV在含有FVIII的各種各樣的唑類中，40℃時的失活動力學唑類 咪唑 咪唑組氨酸 2-咪唑啉酮I4EA濃度 0.02M 0.2M 0.2M 0.2M 0.2M時間(小時) 殘留的病毒效價0 (7.5＊)(7.75) (8.25) (7.75) (8.25)1-- 6.25 7.0 ＞7.5 7.253-- 3.75 4.5 7.05.54-- 2.5 3.0 5.75 5.05-- ＜1.52.5 5.75 4.2565.75＜1.5 2.75 5.25 3.5()未處理＊LOG10TCID50/ML--未檢測進行一些測定易于受唑類滅活的病毒類型的研究。表2列舉了對于各種各樣的包被和非包被病毒，從本質上減少病毒(降低2或多個logs值)必需的條件。
表2各種各樣的包被和非包被病毒在FVIII中的失活參數包被病毒 非包被病毒病毒 VSVHSV-1 Sindbis 痘菌病毒 Polio-2 EMCREO-3處理時間(hr) 0.25 0.25 ＜1 ＜17 4 7溫度(C) 15 15 15 4040 40 40咪唑(M) 0.02 0.02 0.02 0.2 0.2 0.20.2Triton 0.05 0.05 0.05 0.1 0.1 0.10.1X-100(％)效價(起始) 8.0＊ 6.75 8.25 6.25 6.5 6.57.75效價(最終) ＜1.5 ＜1.5＜1.5＜1.5 4.5 1.54.25減少 ＞6.5 ＞5.25 ＞6.75 ＞4.752.0 5.03.5*LOG10TCID50/ML
去污劑可以加強殺病毒活性。表3列舉了幾個例子，證明增加或喪失活性的特定條件。
表3去污劑和溫度對咪唑的殺病毒活性的作用病毒 Sindbis EMC溫度(C)15 15 40咪唑濃度(M)0.02 0.2 0.2Triton X-100濃度(％) 沒有0.05沒有 0.1 沒有時間(hr) 殘留病毒效價0 8.25＊ 8.25＊ 6.5 6.5 6.50.5 -- 2.0 --6.0 5.71 8.0 ＜1.5 6.25 5.75 5.72 5.75 6.25 3.255 6.25 6.25 ＜1.5*IOG10TCID50/ML--未檢測用唑類處理基本上不能影響水溶液中的各種各樣的蛋白質。回收率依據不同的蛋白質而變化。例如FVIII是一種非常大的，不穩定的蛋白質。使病毒基本上失活但不喪失活性的條件是不明顯的。表4定義了FVIII的動力學。
表4有咪唑存在的各種各樣條件下蛋白質的回收率蛋白質FVIIIFVIIIFVIII IgG纖維蛋白原咪唑濃度(M) 0.02 0.2 0.2 0.5 0.2溫度(C) 40 30 40 4040時間 蛋白質回收率(起始％)0 100 100 100 100 1001 91 852 923 83 864 83 795 84 786 86 777＞95 81 7524 ＞95 ＞95 ＞95
對咪唑如何起作用的推測如下每個病毒粒子是由具有許多蛋白質亞單位來的蛋白質外膜組成。這些亞單位在金屬離子溶液中是穩定的，并且當金屬離子的濃度降低時這些亞單位裂解。能夠提供電子的側鏈殘基如組氨酸可促進蛋白質亞單位結合到金屬離子上。一種金屬離子和蛋白質上組氨酸殘基的咪唑環的ε-氮之間形成一種復合物。在含有病毒的溶液中，游離的咪唑與蛋白質亞單位上的咪唑基相競爭。當金屬離子與游離的咪唑基相結合時，該蛋白質亞單位變得不穩定，并且病毒外膜打開，從而破壞了病毒粒子的天然結構。這種現象也依賴于溶液中蛋白質(例如FVIII)的濃度，并且進一步支持了溶液中咪唑與蛋白質上咪唑相競爭的觀點。
對本領域內技術人員而言上面描述的發明顯然可以發生變化。因而上述實施例應僅是作為舉證，本文公開的發明不應僅僅受下列權利要求的限制。
權利要求
1.一種將治療用的，生物學活性蛋白質水溶液中的病毒滅活的方法，包括在足于使病毒從本質上失活而基本上不損害蛋白質的條件下將該溶液與一種唑接觸。
2.權利要求1所述的方法，其中唑選自由咪唑，組氨酸，2-咪唑啉酮，1H-咪唑-4-乙胺組成的組。
3.權利要求2所述的方法，其中所述唑是咪唑。
4.權利要求3所述的方法，其中所述唑是一種咪唑類似物。
5.權利要求1所述的方法，包括包住去污劑的其他步驟。
6.權利要求5所述的方法，其中去污劑是Triton X-100。
7.權利要求1所述的方法，其中所述蛋白質選自凝結因子和抗體組。
8.權利要求1所述的方法，其中病毒減少至少2logs。
9.權利要求1所述的方法，其中所述蛋白質的生物學活性的恢復率大于50％。
全文摘要
在水溶液中利用可溶性吡咯作為生物學活性蛋白制劑的殺病毒劑。
文檔編號A61K38/36GK1129139SQ9510515
公開日1996年8月21日 申請日期1995年4月10日 優先權日1994年4月11日
發明者M·B·多布金, P·K·吳, G·B·達夫 申請人:美國拜爾公司