專利名稱：Rb和p53基因的突變型及其應用的制作方法
背景技術：
發明領域本發明一般涉及細胞生長和增殖性疾病的調控領域，較具體地，本發明涉及RB-1和p53基因的突變型及其治療應用。
相關技術的描述細胞增殖的控制是一個復雜的過程，包括多個相互作用成分。一個細胞的生長與否依賴于起負向作用和起正向作用的生長調控基因表達的平衡。當起負向作用的生長調控基因在細胞中表達或將該基因提供給某一細胞時，將抑制細胞生長。當起正向作用的生長調控基因在細胞中表達或將該基因提供給某一細胞時，將促進細胞增殖。
最近，鑒定出一些起負向作用的生長調控基因即腫瘤抑制基因，它們對細胞的增殖具有負效應。這些基因包括(但不局限于)人成視網膜細胞瘤基因RB-1和p53基因。一些負生長調控基因的缺乏或失活與某些種類的癌腫相關。
人成視網膜細胞瘤基因RB-1是這類腫瘤抑制基因的原型。細胞中該基因的雙等位基因缺乏或基因表達受抑制或其基因產物的抑制將致瘤或引起異常的細胞增殖。在分子水平上，RB-1雙等位基因丟失或失活與成視網膜細胞瘤等腫瘤臨床表現以及如骨肉瘤、纖維肉瘤、軟組織肉瘤和黑素瘤等臨床上相關腫瘤有關。此外，RB-1功能丟失與其它一些原發性癌腫如原發性小細胞肺癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌和前列腺癌關聯。
腫瘤抑制基因Rb和p53抑制癌細胞和非癌細胞的增殖在許多不同的腫瘤細胞類型中，RB-1或p53野生型cDNA的再導入顯示能部分地恢復正常生長調控作用，因為重新導入的基因會誘導生長抑制或阻滯。Rb基因作為腫瘤抑制基因是因為Rb基因的一個等位基因失活會導致易發生癌腫。然而，Rb基因的生長抑制效應并不僅限于腫瘤細胞。正常的含有2份Rb基因拷貝的細胞在一定的生長條件下引入額外的Rb基因拷貝會導致生長抑制或阻滯。類似地，已有文獻報道野生型p53能抑制非癌細胞的生長。因此，由Rb和p53控制的步驟可能并非直接地影響致瘤性表型，而是影響控制腫瘤和正常細胞生長的步驟。
正常細胞病理性增殖的機理由于存在大量不同的病理性細胞增殖情況，因此，需要有一些新的針對這些情況的方法提供治療療效。這些病理性情況可以發生在幾乎所有能發生異常細胞增殖的細胞中。這些能表現病理的或異常生長的細胞類型有(1)成纖維細胞、(2)血管內皮細胞和(3)上皮細胞。由上述可見，需要有方法來治療個體的幾乎所有器官和組織系統中的局部或彌漫性病理情況。
例如單就眼睛而言，新的方法用于治療各種不同的由正常的、良好的或惡性的細胞或組織異常增殖引起的病理疾病情況，其中包括(但不局限于)眼睛的纖維增殖、血管增殖和/或致瘤性疾病早熟視網膜病、增殖性玻璃體視網膜病、增殖性糖尿病視網膜病、毛細血管瘤、脈絡膜新生血管網、視網膜下新生血管網、視網膜下新生血管化、角膜新生血管化引起的老年黃斑退化、上視網膜膜增殖引起的黃斑皺褶、核性硬化引起的成年人白內障、創傷或手術后的纖維性向內生長、視神經膠質瘤、多發性血管瘤視網膜、新生血管性表光眼、海綿狀血管瘤、虹膜發紅、鐮形細胞增殖視網膜病、眼手術或受傷后上皮細胞向下生長、后發性白內障膜、乳頭狀瘤、地中海貧血伴視網膜新生血管化、彈性假黃瘤引起的視網膜下新生血管化以及I型和II型多發性神經纖維瘤、成視網膜細胞瘤、眼色素層黑素瘤和眶假瘤。本發明應用到的其它良性細胞增殖疾病包括(但不局限于)牛皮癬、鱗癬、乳頭狀瘤、基底細胞癌、鱗狀上皮細胞癌和Stevens-Johnson綜合癥。
應該注意到，正常細胞具有兩個Rb和兩個p53正常等位基因，當在組織培養的生長條件下供給細胞生長因子時，這兩種基因的野生型蛋白質不能阻止細胞增殖。病理情況下靜止細胞的失控增殖也是由于細胞暴露于由病理狀態誘發的生長因子(見下述)。例如地中海貧血患者的眼睛中血管的失控增殖如果不停止，將導致視網膜脫離。將額外的Rb基因或p53基因拷貝導入這樣的細胞可能或不可能充分地抑制細胞生長。事實上，外源Rb基因導入許多腫瘤細胞只是滯緩細胞的生長率，而不是完全阻止。先前報道的細胞株如Saos-2和DU145是這種現象的良好例子。可能需要導入更多的基因拷貝，但是一方面很難控制需要被導入或能夠被導入的拷貝數目。另一方面，生長因子的暴露可能導致表達的Rb蛋白的失活。
通過磷酸化調控Rb蛋白的活性如果生長抑制基因的失活是去除針對細胞生長的限制因素中的一個基本步驟，那么一定存在一些機制來調控這些基因產物的活性以使細胞以可控方式增殖。可以設想，一個給定的生長抑制基因的表達可能在質量或數量方面受到調控。就Rb基因來說，處于穩態狀態的蛋白質水平與細胞體積之比在整個細胞周期中恒定。Rb蛋白濃度的無變化提示一定有其它一些機制使得一個細胞能調控這種蛋白的活性。有一些證據顯示Rb蛋白(pRb)的活性受到它的磷酸化狀況調控。各種生長促進和抑制因子通過微擾生長抑制基因產物如Rb蛋白的磷酸化而發揮它們的效應。在誘導Rb蛋白磷酸化中生長促進因子起作用的證據是，觀察到在靜態細胞中Rb蛋白以低磷酸化(underphosphorylated)形式存在。此外，當靜態細胞通過暴露于血清或生長因子如EGF以及胰島素和運鐵蛋白而受刺激增殖時，Rb蛋白的絕大多數形式在G1期的是低磷酸化的，但當細胞進入G1/S界相期時，則變成高磷酸化。這些數據表明，Rb蛋白是受到血清或生長因子誘導的信號轉導途徑中的靶目標。最后，不能對生長因子的增殖促進效應作出應答的衰老的人成纖維細胞，也不能使Rb蛋白磷酸化。
也有證據顯示生長抑制因子在Rb蛋白磷酸化的負調控中所起的作用。當用視黃酸或維生素D3、二甲基亞砜(DMSO)和其它分化誘導劑處理活躍生長的白血病或成神經細胞瘤細胞時，發現Rb蛋白在G1早期時細胞生長抑制開始前低磷酸化，并且誘導分化。此外，用旁分泌生長抑制轉多肽生長因子β1(TGFβ1)治療肺上皮細胞可導致Rb蛋白磷酸化的負調控并伴隨著G1后期中細胞生長的抑制。總之，這些數據提示Rb蛋白的低磷酸化形式活躍地抑制細胞跨越G1/S界相期，同時在G1期被激活的一種激酶(S)能失活Rb蛋白從而使細胞可以進入S期。
盡管在腫瘤細胞中通過缺失或突變永久性地去除Rb基因，可允許生長。在具有正常Rb基因表達的正常細胞中，都是通過Rb基因產物即Rb蛋白(pRb)的細胞周期依賴的轉譯后修飾來去除針對生長的限制因素。pRb以多磷酸化形式存在，有證據表明低磷酸化形式是活性形式。例如，SV40大T抗原優先與Rb蛋白的低磷酸化形式結合。Rb蛋白的磷酸化使它從SV40大T抗原中釋放出，只有pRb的低磷酸化形式結合著且抑制從E2啟動子處開始的轉錄。因此，Rb蛋白的低磷酸化形式活躍地抑制細胞生長，而細胞增殖與Rb蛋白的高磷酸化相關。各種生長促進和抑制因子可能通過微擾Rb蛋白的磷酸化而發揮它們的效應。雖然一個正常細胞可能正在表達Rb蛋白，但是當它暴露于適宜的生長因子時被誘導生長，就如同可能在各種生長狀況包括病理情況下所發現的那樣。在某些病理情況下，一個原本正常的細胞可能不利地被誘導增殖。糖尿病視網膜病患者眼睛中的正常靜態成纖維細胞的增殖是這種不期望的細胞生長誘導的一個例子。不加治療，增殖的成纖維細胞將最終與視網膜結合，導致視網膜的快速脫離。
p53蛋白的激活類似于Rb基因，p53基因的失活或突變常見于腫瘤和非腫瘤細胞。與病毒抗原如SV40大T結合時，野生型p53蛋白也是負調控型的。p53蛋白作為轉錄因子發揮功能，它結合至特異的DNA序列。野生型p53蛋白與DNA結合的能力是其功能正常發揮的關鍵。在突變型p53中，丟失了蛋白質結合至特異的DNA靶序列或激活轉錄的能力，這暗示這些活性對蛋白質的抑制功能是重要的。然而，最近也有報道顯示p53蛋白的序列特異性DNA結合活性具有隱蔽性。新合成的p53蛋白沒有活性，除非該蛋白被修飾，否則它不能與其特異的DNA序列結合。一個修飾位點是C端的365-393氨基酸殘基。這一區域是RNA成分的附著位點，也是細菌熱休克蛋白dnaK的結合部位。當抗體Pab421與365-389氨基酸殘基結合后，蛋白質因構象改變被激活，從而能與其特異的DNA序列結合。
pRb和p53作用方式的差異雖然Rb和p53兩者被認為是腫瘤抑制基因，但是它們的作用方式非常不同。先前有證據表明兩種基因可能以不同的途徑發揮作用。沒有Rb基因的鼠呈胚胎致死，而沒有p53基因的鼠雖然對癌腫的發生具有較高的易感性，但是能夠正當發育。在細胞水平上，缺乏p53的癌細胞能通過甚至在沒有外源p53情況下的Rb基因的過量表達而受到生長抑制或阻滯。另一方面，缺乏Rb的細胞對p53基因的生長抑制效應易感。在分子水平上，p53和pRb(直接或間接地)與不同的蛋白質靶和DNA序列相互作用。
Rb和p53基因在治療中的應用雖然這兩種蛋白在作用方式上有差異，但是它們在一方面是相似的，即在實驗條件下，兩種蛋白活性形式的過量表達導致細胞生長的抑制或阻滯。已知細胞生長受到抑制基因如Rb和p53表達的控制，同時，它們的蛋白必須呈活性構象才能發揮功能，因此可將這些基因的活性形式用于基因治療。就pRb來說，新合成的蛋白是低磷酸化和具活性的。當細胞暴露于生長因子時可能發生失活。理想的是具有pRb的突變型形式，其維持活性形式，對磷酸化引起的失活具有抗性。就p53來說，新合成的蛋白沒有活性，除非其被修飾，否則不能結合DNA。在基因治療中，非常理想的是具有p53基因的突變型形式，它的蛋白質甚至無需進一步的修飾已呈活性。最后，因為兩種蛋白具有不同的作用方式，理想的是在治療中結合使用Rb和p53基因兩者，從而使細胞對一種基因的生長抑制效應產生抗性的突變或生長狀態可能對另一種基因易感。
已有技術的缺陷在于，缺少突變的腫瘤抑制基因，以致當細胞暴露于生長因子時，基因產物(蛋白質)永久地具有活性并發揮功能。更具體地，已有技術的缺陷在于沒有p53和Rb基因的有效和功能性的突變形式。已有技術的缺陷還在于，將Rb和p53基因的野生型和/或突變型形式同時應用于癌和非癌細胞增殖疾病。
發明概況一方面，本發明提供一種治療諸如存在于非癌細胞增殖疾病和癌細胞增殖疾病中的不適當的或病理性的細胞生長的通用方法。更具體地，本發明通過施用突變的生長抑制基因和/或基因產物來提供治療病理生理性細胞增殖疾病的方法。
在本發明的一個例子中，提供了一種分離的DNA分子，所述分子是在功能上有活性的突變的生長抑制基因形式或是不同突變生長抑制基因的組合。
在本發明的另一個例子中，提供了一種新的含有在功能上具有活性的成視網膜瘤或p53基因突變型的質粒。
在本發明的又一個例子中，提供了為達到治療目的，連續地或同時地施用Rb和p53基因的野生型和/或活性突變型的方法。
在本發明的其它例子中，提供了治療病理性細胞增殖疾病的方法，包括同時或連續地給非癌增殖細胞施用突變的Rb基因和突變的p53基因。
此外，還提供了治療個體惡性細胞疾病的方法，包括同時或連續地給增殖的癌細胞施用突變的Rb基因和突變的p53基因。
通過下面目前本發明的優選實施例，本發明的其它方面、特征和優越性將更明顯。這些實施例用于公開目的。
附圖簡述
圖1為應用多克隆抗Rb抗體RB1-Ab#18和#20，通過細胞蛋白的免疫沉淀作用發現pRb和p53之間的同源區域。
圖2為應用多克隆抗Rb抗體RB1-Ab#18和#20，通過細胞蛋白的免疫沉淀作用證實pRb和p53之間的同源區域。
圖3顯示無Pab421時，P1、P3、P5突變型p53蛋白與特異的DNA序列結合的能力。
圖4為與野生型蛋白即(A)體內標記蛋白和(B)體外標記蛋白的磷酸化格局(pattern)二維圖譜相比，顯示突變型Rb蛋白磷酸化格局的二維圖譜分析。
圖5顯示成視網膜細胞瘤蛋白與SV40大T抗原的結合以及磷酸化后該結合物的解離。
圖6顯示磷酸化的成視網膜細胞瘤蛋白的二種不同形式(與SV40大T抗原結合和不結合)的二維圖譜分析。
圖7顯示在不同的生長條件下成視網膜細胞瘤蛋白的磷酸化格局變化的二維圖譜分析。
圖8顯示m89 Rb突變型抑制正常細胞WS1生長的能力。
圖9顯示m89 Rb突變型抑制膀胱腫瘤細胞株TCCS UP生長的能力。
本發明的詳細描述定義術語“基因的功能表達”用于包括基因轉錄的抑制、基因轉錄產物(前信使RNA)的降解、拼接的抑制、信使RNA的消除、阻止信使RNA的翻譯、阻止蛋白質翻譯后修飾、蛋白質的消除或抑制蛋白質的正常功能。
術語“轉染的質粒”用于包括細菌質粒，其含有將被攜帶(轉染)進入所選擇細胞的突變的成視網膜瘤或p53基因。
術語“基因治療”用于包括為了調節基因表達和/或基因產物的功能，將部分或全部基因、DNA構建物、RNA或基因產物插入到一個細胞、一群細胞、組織、病理損傷處、器官或生物體中。
術語“預防性基因治療”用于包括可用于部分或完全抑制疾病或疾病蔓延的基因，也包括可用于補充或替代細胞、組織或種系中缺少的或有缺陷的負生長的基因。
術語“細胞增殖性疾病”用于包括任何人或動物的疾病，其影向器官、體腔或身體部分的任何一處或幾處，其特征是細胞、細胞群或組織的單個或多個局部的異常增殖，而不論良性還是惡性。
術語“原核生物”指包括所有細菌，可以用DNA進行轉化以使本發明的重組分子表達。
術語“真核生物”指包括所有酵母菌、真菌、動物和植物細胞，可以用DNA進行轉化以使本發明的重組分子表達。
用于本發明DNA構建物的DNA可以人工合成或來自任何哺乳動物。唯一要求是Rb和p53基因的遺傳序列可在原核和真核生物中進行功能性表達。較佳的是人工合成的DNA。
編碼本發明DNA構建物的重組DNA分子可用本領域的一般技術人員熟知的任何技術轉化宿主。
已知用于制備融合的、可操作連鎖的基因并在細菌中表達這些基因的方法。例如美國專利No.4,366,246，該專利在此引用作為參考，其中描述的遺傳構建物和方法可被用于構建本發明的DNA構建物和在原核或真核宿主中的轉染。
原核宿主可以包括革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌，例如大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌、粘質沙雷氏菌和枯草桿菌。真核宿主可以包括酵母菌例如畜牧畢赤氏酵母菌(Pichia pastoris)或哺乳動物細胞。
一般地，含有提高插入的DNA片段轉錄效率的啟動子序列的表達載體與宿主結合使用。典型地，表達載體含有復制起始點、啟動子、終止子以及能夠提供對轉化的細胞進行表型篩選的特異基因。可用本領域已知的方法發酵和培養轉化的細胞，獲得最適宜的細胞生長。
能用于本發明的啟動子例子包括(但不局限于)人β肌動蛋白啟動子、金屬硫蛋白啟動子、SV40復制起始點、小鼠乳腺瘤病毒長末端重復序列啟動子(MMTV LTR啟動子)和鼠白血病病毒長末端重復序列啟動子(MuLV LTR啟動子)。能用于本發明的一些質粒和噬菌體例子列于Maniatis等人的《分子克隆》(Cold spring Har-bor Laboratories，1982)中。其它方面內容為本領域的技術人員所知道，能容易地確定。
一個基因是一段DNA序列，通過它的模板或信使RNA可編碼一段特定肽特有的氨基酸序列。術語cDNA包括去除間隔序列的基因。術語“重組DNA”(rDNA)指包括一種通過在體外拼接cDNA或基因組DNA序列而重組的分子。
克隆載體是質粒或噬菌體DNA或其它的DNA序列，它能夠在宿主細胞中復制，其特征在于具有一個或少部分內切酶識別位點，可以確定方式切割這樣的DNA序列，而不丟失DNA的基本生物學功能，并且這一克隆載體含有一個適用于鑒定轉化細胞的標志。例如這些標志是四環素抗性或氨芐青霉素抗性。“載體”一字有時就指克隆載體。
表達載體類似于克隆載體，但能夠在宿主中表達給定的結構基因，這通常是在一些調控序列的調控下進行。
術語“個體”指包括動物和人。
術語增殖細胞生長的“生物抑制”或“抑制”指包括部分或全部的生長抑制，同時也包括細胞增殖或生長速率的減慢。通過在組織培養中評估測試因子對惡性或異常增殖細胞生長的靶效應以及評估動物和細胞培養中的腫瘤生長或通過其它本領域的一般技術人員知道的方法，確定本發明中突變型的生物抑制劑量。
本文中所用術語“保守的同源區域”指Rb和p53之間同源的氨基酸區域，顯示于表1中。
施用本發明的蛋白質的途徑可以是皮膚表面的、眼內的、非腸道的、口服的、鼻內的、靜脈的、肌內的、皮下的或任何其它合適給藥的方法。治療眼疾的較佳施用方法是眼內或眼周的注射。治療皮膚細胞增殖疾病的較佳施用方法是皮膚表面施用或皮下注射。
在本發明的另一個例子中，本發明的DNA構建物可以直接到達增殖性疾病的病灶處。就眼增殖疾病來說，本發明的DNA構建物可直接注射入眼睛。本發明的DNA構建物可以直接到達內臟器官、體腔等疾病病灶部位，通過使用圖像儀直接跟蹤注射頭至疾病部位。本發明的DNA構建物也可以通過手術時施用至疾病部位。
施用的DNA劑量依賴于個體的年齡、臨床期、疾病程度、遺傳傾向、部位、體重、同時治療的類型，還有病理性或惡性情況的性質。在本發明方法中使用的有效的供給系統可以有這些形式，如用于口服的膠囊、藥片、液體溶液、懸浮液或酏劑，或無菌的液體形式如溶液、懸浮液或乳劑。較佳地使用惰性載體如鹽水、磷酸鹽緩沖液，或在其中本發明方法使用的化合物具有合適的溶解性能的任何載體。
較佳地，對于眼內供藥和供藥給其他局部病灶，本發明方法中使用的供給系統可以是無菌的液體形式如溶液、懸浮液或乳劑。對于皮膚表面施用，可以使用油膏劑、霜劑或噴霧劑、優選使用惰性載體如鹽水、磷酸鹽緩沖液、或在其中本發明方法所用的化合物有合適溶解性能的任何載體。
對細胞的局部施用，可以使用本領域的技術人員知道的方法，包括(但不局限于)細胞的轉染、電穿孔、微注射，或使用脂質體、脂質轉染試劑(lipofectin)或裸露的DNA或RNA之類的載體。本發明的DNA可通過已知的基因送遞系統進行供給，該系統有(但不局限于)反轉錄病毒載體(Gilboa(1982)J.Virology 44845；Hocke(1986)Nature 320275；Wilson et al.，Proc Natl Acad Sci USA 853014)、痘菌病素系統(Chakrabarty et al.，(1985)Mol.Cell Biol.53403)或其它有效的DNA送遞系統(Yates et al.，(1985)Na-ture 313812)，本領域的技術人員知道這些系統。這些參考文獻只是代表性的例子。為了特異性地送遞或轉染異常增殖和稀疏非分裂細胞，較佳地選用本領域技術人員知道的反轉錄病毒送遞系統，因為宿主DNA復制對反轉錄病毒DNA的整合是必需的。由于反轉錄病毒缺少該病毒生活史必需的反轉錄病毒基因，因此不能自身復制。使用這樣的反轉錄病毒送遞系統，本發明可將所謂的抗增殖元件導向異常增殖細胞，而不干擾分裂正常細胞。
本發明的突變型蛋白可用任何生物學上有效的載體進行施用。具有生物學效應的載體包括反轉錄病毒、脂質體和其它能將外源蛋白導入細胞基因組中的轉染機制。本領域技術人員知道這種轉染機制。載體也可以包括任何試劑或溶劑，它們與本發明的構建物相容，并且當進行一定量的施用時，對個體或細胞是無毒的。
治療病理性細胞增殖情況存在有廣泛不同的病理性癌和非癌細胞增殖情況，本發明的方法對這些增殖情況具有治療療效。這些病理性情況可以發生在幾乎所有能夠異常增殖的細胞類型中。這些能夠表現病理性或異常生長的細胞類型有(1)成纖維細胞、(2)血管內皮細胞和(3)上皮細胞。以上述可見，本發明的方法可用于治療個體的幾乎所有器官和組織系統中的局部或彌漫性病理情況。
例如，單就眼睛而言，本發明的方法可治療廣泛的病理性疾病，這些疾病由正常(良性)或惡性細胞或組織的異常增殖引起，其中包括(但不局限于)下述眼睛中纖維增殖、血管增殖和/或致瘤性疾病早熟視網膜病、增殖性玻璃體視網膜病、增殖性糖尿病視網膜病、毛細血管瘤、脈絡膜新生血管網、視網膜下新生血管網、視網膜下新生血管化、角膜新生血管化引起的老年黃斑退化、上視網膜膜增殖引起的黃斑皺褶、核性硬化引起的成年人白內障、創傷或手術后的纖維性向內生長、視神經膠質瘤、多發性血管瘤視網膜、新生血管性青光眼、海綿狀血管瘤、虹膜發紅、鐮形細胞增殖視網膜病、眼睛手術或受傷后上皮細胞向下生長、后發性白內障膜、乳頭狀瘤、地中海貧血伴視網膜新生血管化、彈性假黃瘤引起的視網膜下新生血管化以及I型和II型多發性神經纖維瘤、視網膜細胞瘤、眼色素層黑素瘤和眶假瘤。可應用本發明的其它良性細胞增殖疾病包括(但不局限于)牛皮癬、鱗癬、乳頭狀瘤、基底細胞癌、鱗狀上皮細胞癌和Stevens-John-son綜合。
一般地，本發明可應用于所有形式的癌腫，其中包括(但不局限于)涉及Rb基因和/或p53基因失活的癌腫，如骨肉瘤、軟組織肉瘤、黑素瘤、纖維肉瘤、成視網膜瘤、乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、肺癌、結腸癌、卵巢癌、腎癌、胰腺癌和前列腺癌。
發現決定著Rb和p53之間保守性結構域的構象本發明公開了一個保守性同源結構域，其控制二個腫瘤抑制基因產物Rb和p53的構象，因此，產生了這些基因的突變型及使用它們的方法。所以，本發明提供一種分離的DNA分子，所述分子是一個突變的生長抑制基因。本發明的突變生長抑制基因可以是任何抑制細胞增殖的基因。在本發明一個較佳的例子中，突變的生長抑制基因是突變的Rb基因。在本發明另一個較佳的例子中，突變的生長抑制基因是突變的p53基因。
為了了解pRb和其細胞靶目標之間的相互作用，產生了針對Rb蛋白各親水性區域的抗體。因為Rb蛋白的不同區域可以與不同的蛋白質相互作用，所以必需產生針對許多不同區域的抗體，這樣，才能使一些抗體可以與Rb蛋白和其靶之間形成的蛋白復合體結合而不干擾它們的相互作用。在一組針對相應于各種親水性區域的人工合成肽的多克隆抗Rb抗體中，有兩種抗體(Rb1-Ab18和Ab20)除了與Rb蛋白結合以外，始終與一個分子量為53KD的蛋白結合(圖1A，道1、2、8和9)。這兩種抗體被證實是針對同一種人工合成肽p5。53KD蛋白的出現對針對p5的抗血清是特異的。針對其它區域的抗血清，例如Rb1-AbB(圖1，道4-5)和Rb1-AbC(圖1，道6-7)盡管能識別Rb蛋白，但不與53KD蛋白發生免疫沉淀作用。因為53KD蛋白的分子量與p53相似，這表明它就是p53蛋白本身。細胞株與針對p53的單克隆抗體Pab122發生免疫沉淀顯示p53的確與53KD蛋白具有完全相同的分子量(道10)。進一步地，如果p53先用Pab122從細胞裂解物中去除，則Rb1-Ab18或Rb1-Ab20都不能免疫沉淀出，雖然它們仍能與Rb蛋白發生沉淀反應(道11)。為了進一步證實53KD蛋白的確就是p53，用無外源p53和/或Rb蛋白表達的一些細胞株進行免疫沉淀反應。在所有的例子中(道12-20)，抗體能識別p53蛋白的情況與這些細胞株中有無p53基因狀況確實相符合。進一步地，p53的免疫沉淀作用不依賴于有無Rb蛋白，這暗示沒有形成一種復合物，并且p53蛋白是被抗體直接識別的。
為了確切地顯示p53蛋白與Rb蛋白具有共同的抗原結構域，便開始尋找相應于Rb蛋白p5區域的p53蛋白氨基酸序列。如果在這兩種蛋白質和P5肽中保留有三維結構信息，則可能在p53蛋白中有一個相應區域。進一步地，含有這一保守性抗原區域的肽會阻止RB1-Ab18或RB1-Ab20與p53的免疫沉淀反應。在有不同量的這些肽的存在下進行Rb1-Ab18與Rb和p53蛋白的免疫沉淀反應(圖2A)。一種p53肽F19，在測試的最低濃度(10μg/ml)下，完全阻止Rb1-Ab18與p53的免疫沉淀反應(圖2A，道12-14)。這也就是用于阻止沉淀作用的Rb肽p5的同樣濃度(道1和2)。相反地，甚至在比使用的濃度高50至100倍時(道3-11)，所有其它的p53肽也不能阻止Rb1-Ab18與p53的免疫沉淀反應。
p5和F19區域不是顯示Rb和p53蛋白之間結構同源性的唯一區域。根據目測和計算機尋找，至少鑒定出另外二個區域。Rb和p53同源區域的比較見表I表I
(P1區域) (67％同源)Rb…EINSALVLK(184-192)P53… ELNEALELK(343-351)(P3區域) (67％同源)Rb…RRGONRSAR(245-262)P53… KKGOSTSRH(372-380)(P5區域) (62％同源)Rb…KKLRFDIEG--SD(873-886)P53… KKLMFKTEGPDSD(381-393)雖然這些區域可能顯得較短，但是在pRb和p53之間同源的這些氨基酸也是p53中進化上最保守的(沒有得到不同物種中Rb序列的數據)。這兩種生長抑制蛋白之間高度的同源性揭示這些區域在功能上的重要性。pRb和p5同源區域位置的示意圖顯示在圖2B中。在p53中，所有三個區域位于蛋白的C末端。在pRb中，區域1和3位于N末端的一半處，而p5區域位于C末端的一半處。然而，在p53和pRb中，這三個區域都位于已知對蛋白質的抑制功能具有重要性的結構域外側。如果這些區域不負責與其抑制靶目標之間的物理相互作用，則可能它們擔負著相互作用過程中的調控作用。正如要有活性R6和p53蛋自來抑制不期望的細胞生長一樣，也需要有一種方式來負調控它們的活性以使細胞可以增殖，這也是同樣重要的。這兩種生長抑制基因產物中保守性結構域的存在保證了它們的協同調控。下述可見，其實這些同源區域會形成一個決定兩種蛋白質構象的結構域。具體地，通過在這三個區域任一區域中的保守性氨基酸殘基(上述表I下劃線處)的突變，使這一結構域破壞，則會賦于兩種蛋白一種活躍的構象。相反地，這些區域的非保守性氨基酸的突變不產生效應。
P1、P3、P5區域控制p53的構象及其結合DNA的能力p53激活轉錄的能力與結合DNA能力緊密相關。在癌細胞株中發現的突變型p53不能結合DNA也不能激活轉錄。p53蛋白在有抗體Pab421存在時能與特異的DNA序列結合。仔細檢查Pab421的表位，發現它與P3區域重疊。被Pab421識別的表位(見圖3)是P3區域中最后四個氨基酸殘基。用抗體(Pab421)封閉整個P3區域足以改變的蛋白質構象，使p53蛋白能結合特異DNA序列。DNA的結合測定提供一種方便地測試P3和其它同源區域P1和P5在控制p53蛋白構象中所起作用的手段。如圖3顯示，盡管野生型p53不能結合特異的DNA序列(道1)，但在抗體Pab421存在下卻能結合(道2)。當p53的P1(道3)、P3(道5和7)或P5(道9)區域中保守性氨基酸突變時，產生的p53突變型蛋白甚至在無Pab421時也能結合DNA。一旦與Pab421的結合形成的復合物便高遷移(P1、P3和P5分別為道4、8和10)。這種高遷移(Supershift)表明這些突變型中的P3區域仍能與抗體結合，并且在無Pab421時，突變型能與DNA結合并非由于P3區域的突變。事實上，位于這些C末端結構域之外的抗體Pab1801的結合也產生高遷移的復合物。道7和8中的突變型是P3區域前面4個氨基酸殘基的突變，明顯不影響Pab421與蛋白質的結合。道5和6中的突變型是P3區域最后4個保守性氨基酸殘基的突變，則Pab421不能與蛋白質的結合。非保守性氨基酸的突變顯示無改變的效應，其蛋白質行為基本上類似野生型。因此，當同源區域通過突變而破壞時，突變型p53蛋白質的構象使轉變成活性形式。
同源區域突變的Rb蛋白的磷酸化控制的改變有幾種方法可區分pRb蛋白的活性和非活性構象。活性Rb蛋白低磷酸化，能抑制細胞的生長。非活性Rb蛋白高磷酸化。如果同源結構域影響pRb的活性和非活性構象，則P1、P3、P5區域的突變會影響蛋白質抑制細胞生長和其磷酸化的能力。分別地在pRb的P1、P3和P5區域中的保守性氨基酸殘基處突變，然后檢測突變型抑制細胞生長的能力。所有的突變型能抑制轉染細胞的生長。在P5區域保守性氨基酸處突變的Rb突變型m89-0抑制正常和癌細胞生長的能力顯示在下述的二個實施例中，因為pRb的活性由磷酸化調控，如果保守區域用于維持pRb的非活性構象，則P5區域的突變將對突變型pRb的磷酸化有抑制效應，從而使該蛋白具有活性。有一些缺乏pRb表達的細胞株，這是由于RB-1的雙等位基因突變引起，這些細胞株同時也引起其它的突變，而這些突變使得它們對轉染的Rb基因的抑制效應具有抗性。宮頸癌細胞株C33A和Saos-2亞群是二種這樣的細胞株。因此，這些細胞株能表達突變型蛋白且細胞仍能生存，從而可以提取豐富量的蛋白質以檢測磷酸化狀況。在P5區域保守性氨基酸殘基處突變的將P5突變型HuβAcPr-1-neo-P5C轉染入這些細胞，并且通過單細胞純化獲得穩定的細胞株。將從純化的突變型細胞株Saos-2#89中分離到的突變型pRb的磷酸化格局與從野生型Rb轉染和純化的細胞株Saso-2#84中分離到的野生型pRb的磷酸化格局相比較，來自S期Ssao-2#84(野生型)和Saos-2#89(突變型)的pRb免疫沉淀反應顯示，野生型pRb高磷酸化，而突變型pRb則低磷酸化。這提示P5突變型pRb甚至在細胞處于S期時，仍呈活性構象。因此，P5突變型呈現出能抵抗特定位置磷酸化的構象。應注意到，該蛋白在其它功能上不重要的位置仍是磷酸化的。
因為SDS-PAGE的一維格局分析只顯示蛋白質的低磷酸化，而不能顯示低磷酸化的性質，所以用二種蛋白水解酶胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶對23P標記的pRb進行二維磷酸肽分析。二維圖譜比較顯示，與野生型相比，突變型中有二個始終處于未磷酸化的位點S10a和S10b(圖4A)。為了表明磷酸化格局的差異是由于蛋白質構象中內在的差異而不是體內酶特異性的變異造成的，比較蛋白質的體外磷酸化格局。用含有細胞周期蛋白(cyclin)關聯激酶的激酶制劑對野生型和突變型pRb進行磷酸化。體外標記依賴于細胞周期蛋白關聯激酶，而針對激酶的抗體會阻止磷酸化，通過二維肽圖分析體外磷酸化的pRb，結果見圖4B，沒有在突變型中使用同樣的磷酸化位點。因而，甚至在提供充足量的酶和在適宜的磷酸化條件下，在該條件下野生型pRB磷酸化完全，而突變型pRb完全抵抗在S10a和S10b位點的磷酸化。因此S10a和S10b磷酸化的變異是由于野生型和突變型蛋白構象中內在的差異、而不是體內酶特異性的變異造成的。
揭示在同源區域突變的Rb蛋白呈活性形式(A)S10a和S10b位點的磷酸化與pRb活性的相關性下述數據揭示，S10a和S10b位點的磷酸化變異與pRb與SV40大T抗原的結合能力相關。為了體外研究磷酸化作用，從用重組Rb-桿狀病毒感染的Sf9細胞中分離Rb蛋白，該重組Rb-桿狀病毒中的多角體蛋白基因部分地被Rb基因替代。在高感染滴度條件下，雖然大多數提取的Rb蛋白通過磷酸化不能結合SV40大T抗原，但小部分Rb蛋白仍能結合大T抗原。該結合顯示在圖5中。從用相應的桿狀病毒感染的35S標記的SF9細胞中得到Rb蛋白和SV40大T抗原并體外磷酸化。道1顯示提取的Rb蛋白由低磷酸化和高磷酸化形式組成，和一些蛋白與大T抗原結合。大T抗原僅與RB蛋白的低磷酸化形式結合(道2和3)。用不同量的Rb激酶對大T抗原Rb復合物進行磷酸化(道3至6)，可使大多數Rb蛋白從與大T抗原的結合中釋放下來。這種RB蛋白形式被稱為RB-E(E＝暴露關鍵位點)。然而，約20-30％Rb蛋白(稱為RB-H)(H＝隱蔽關鍵位點)仍緊密地與大T抗原結合，并且整個復合物能與抗大T抗原的抗體結合。最重要的是，雖然增量的Rb激酶能使Rb蛋白磷酸化，使之成為最慢的遷移形式(比較道4至6和道8至10)，但是高磷酸化的Rb蛋白仍結合著大T抗原。這些Rb蛋白的沉淀作用不是由于對蛋白A瓊脂糖的非特異吸附造成的，這可以比較道6和道2而得出。約70％和Rb蛋白從大T抗原上釋放下來。釋放的Rb蛋白不是由于蛋白的非特異降解造成的。這可以通過一事實來說明，即如果反應是與抗Rb抗體的沉淀反應，則所有的Rb蛋白都應沉淀(見道8、9和10)。Rb蛋白的各種形式與大T抗原的結合能力見道8、9和10，其中較少量的大T抗原與Rb蛋白結合。
這些結果與Rb蛋白存在有二類磷酸化位點一致，一類對Rb蛋白的失活是關鍵的，因此不能結合大T抗原，另一類能被磷酸化而不影響其結合。對Rb激酶復合物來說，存在有17個潛在的磷酸化位點(S/TPXX)。為了揭示這些磷酸化位點對Rb蛋白失活的重要性，對仍能結合SV40大T抗原的Rb蛋白(RB-H)以及磷酸化后從SV40大T抗原上游離出的Rb蛋白(RB-H)進行二維圖譜分析。如果Rb從大T抗原上的解離是磷酸化造成的。那么在Rb蛋白的這二種形式之間一定存在著磷酸化位點的差異。如圖6所示，仍結合著大T抗原的pRb的S10a和S10b沒有被磷酸化。
P5區域保守性氨基酸的突變使得蛋白質具有活性構象。在S10a和S10b位點的磷酸化是細胞周期中一個功能步驟，與細胞能夠增殖相關。
(B)pRb S10a和S10b位點的磷酸化與細胞生長狀況相關下述數據揭示，S10a和S10b位點磷酸化的變異受到一種依賴細胞周期的方式的調控。
已有充分報道揭示，正常的或癌細胞暴露于TGFβ常導致生長抑制。前面已描述過的細胞生長抑制中pRb的作用。為了了解TGFβ在pRb的磷酸化中的作用，運用能通過TGFβ處理而產生生長抑制的乳腺癌細胞株MDAMB31。通過含氚胸腺嘧啶的攝入以及由二維肽圖進行分析的32P標記的pRb磷酸化格局，監測該細胞的增殖狀況。有意義的是，來自因TGFβ處理而生長抑制的細胞中pRb在S10a和S10b位點未磷酸化(圖7)。然而，當細胞從TGFβ釋放時，S10a和S10b重新磷酸化。因此，生長抑制的細胞中具有活性的pRb蛋白在S10a和S10b位點未磷酸化。這種可逆的磷酸化并不是特異地針對TGFβ的生長抑制效應。這是因為在從因缺少血清而生長抑制的細胞中分離的pRb具有相似的S10a和S10b磷酸化格局。重新供給血清或生長因子，S10a和S10a便重新磷酸化。此外，從因視黃酸處理而生長抑制的細胞中分離的pRb中S10a和S10b未磷酸化。因此，pRb蛋白中功能性關鍵的S10a和S10b位點在不同的生長條件下經歷可逆的磷酸化。
Rb基因和p53基因的突變型對pRb和p53來說，同源區域的突變導致蛋白質呈現出使其具有活性的構象。Rb和p53在構象上呈現活性的突變型例子以及它們在細胞生長抑制中的應用在下面給出。就Rb蛋白而言，有二類突變型(1)在調控或同源區域的突變型和(2)在磷酸化位點的突變型。就p53蛋白而言，描述了同源區域的突變型。
Rb基因的突變型高磷酸化的Rb蛋白的磷酸氨基酸分析顯示，絲氨酸和蘇氨酸被磷酸化。Rb蛋白中有79個絲氨酸和55個蘇氨酸殘基。在這些殘基中，發現17個呈(S/TPXX)模式(motif)，這是cdc2激酶的潛在磷酸化位點。已知cdc2激酶和相關的激酶能對Rb蛋白進行磷酸化。
Rb蛋白有二類磷酸化位點，一類對Rb蛋白的失活是關鍵的，因此不能結合大T抗原，另一類能被磷酸化而不影響其結合。對Rb激酶復合物來說，因為存在至少17個潛在磷酸化位點(S/TPXX)，所以有一些可能對Rb蛋白的失活是重要的。這17個磷酸化位點是T005、S230、S249、T252、T356、T373、S567、S608、S612、T773、S780、S788、S795、S807、S811、T821、T826，其中T和S分別表示蘇氨酸和絲氨酸，其后數字表示Rb蛋白中氨基酸殘基位置。
突變的成視網膜細胞瘤基因較佳地由二種不同方法中的一種進行突變。二種方法都能影響蛋白質被磷酸化的能力。第一種方法是改變Rb基因保守同源區域中的氨基酸而突變基因。較佳地，Rb基因保守同源區域選自本文描述的由P1、P3和P5組成的組。編碼突變Rb蛋白的突變Rb基因的代表例顯示在Seq.ID.No.1和2中。了解保守同源結構域對蛋白質磷酸化起重要作用后，本領域普通技術人員能容易地構建其它編碼所需突變Rb蛋白的突變Rb基因。
第二種方法能阻止Rb蛋白的磷酸化和失活，這是通過改變所述基因磷酸化位點處氨基酸而突變。較佳地，磷酸化位點選自由T005、S230、S249、T252、T373、S567、S608、S612、T773、S780、S788、S795、S807、S811、T821和T826組成的組。在上述磷酸化位點的縮寫中，S指絲氨酸，T指蘇氨酸，數字指Rb蛋白序列中氨基酸的位置。在本文公開的磷酸化突變型中，每一蘇氨酸或絲氨酸在各個質粒中被突變成丙氨酸。如前所述，至少存在二類磷酸化位點，一類在功能上對pRb的失活是重要的。上述產生的一種或多種突變型能阻止突變型pRb的磷酸化和并防止失活。
在本發明的其它例子中，也提供了含有編碼突變Rb蛋白的DNA的質粒。此外，也提供了適合于在重組細胞中表達的質粒，其含有編碼Seq.ID.No.1突變Rb蛋白的DNA和在細胞中cDNA表達所必需的調控元件，同時提供了另一種適合在重組細胞中表達的質粒，其含有編碼Seq.ID.N 0.2突變Rb蛋白的DNA和在細胞中cDNA表達所必需的調控元件。
p53基因的突變型在本發明的另一例子中，突變的生長抑制基因是突變p53基因。較佳地，p53基因通過改變其保守同源區域的氨基酸而突變(上述表1中帶下劃線的氨基酸)。類似地，p53基因的保守同源區域選自由P1、P3和P5組成的組。突變型可以是P1、P3或P5的單獨突變或任何組合突變(包括所有三個區域的突變)。此外，C末端氨基酸殘基295-393缺失的突變型在結合特異DNA序列方面仍具有活性。
運用pRb和p53突變型抑制細胞生長本發明也提供新的轉染細胞，例如含有權利要求1所述的能編碼突變Rb蛋白的分離DNA分子的轉染細胞。也提供了穩定轉染的細胞，其表達編碼突變Rb蛋白的突變Rb基因。較佳地，本發明的轉染細胞含有突變的Rb基因，該基因含有一段編碼顯示于Seq.ID.No.1或Seq.ID.No.2中的突變Rb蛋白的核酸序列。此外，本發明也提供一種穩定轉染的細胞，其表達編碼突變p53蛋白的突變p53基因。
本發明也提供了一種治療病理性細胞增殖疾病的方法，包括對非癌增殖細胞施用突變生長抑制基因的DNA分子。在一個例子中，施用的分子是突變的Rb或p53基因。Rb基因通過改變其保守同源區域氨基酸而突變或所述基因通過改變磷酸化位點處氨基酸而突變。保守同源區域和磷酸化位點同上所述。
一般地，這一方法可用于治療任何細胞增殖性疾病。非癌細胞增殖性疾病包括牛皮癬、良性增殖的皮膚疾病、鱗癬、乳頭狀瘤、基底細胞癌、鱗狀上皮細胞癌、纖維增殖疾病、血管增殖疾病和皮膚增殖疾病。
本發明也提供了治療個體惡性細胞疾病的方法，包括施用突變Rb或p53基因的DNA分子進入增殖的癌細胞中。這些突變基因如上構建。
一般地，治療惡性細胞疾病的方法類似于治療非癌細胞增殖性疾病。由增殖的癌細胞引起的疾病，其代表性例子包括(但不局限于)骨肉瘤、纖維肉瘤、成視網膜細胞瘤、乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、肺癌、結腸癌、卵巢癌、腎癌、胰腺癌和前列腺癌。
根據本發明的方法，人們能通過導入突變的Rb或p53蛋白來調控細胞增殖過程以阻止或抑制許多細胞增殖性疾病中的異常*P1319×增殖。控制增殖過程可以通過向靶增殖細胞導入編碼突變Rb和p53蛋白的DNA構建物來達到。
本發明也提供了治療病灶性細胞增殖疾病的方法，包括對增殖的細胞施用突變的Rb或p53基因。一般地，增殖的細胞可以引起這些代表性的疾病如眼睛中的纖維增殖、血管增殖和致瘤性疾病。
在另一個例子中，Rb基因的磷酸化位點在導入細胞前被誘導突變。在Rb蛋白中存在17個潛在磷酸化位點。Rb cDNA編碼序列中的絲氨酸或蘇氨酸突變成丙氨酸或纈氨酸或其它氨基酸，將導致產生具有永久活性的Rb蛋白，其不能通過磷酸化而失活。也就是說，宿主細胞不能通過磷酸化來失活Rb蛋白。將突變的Rb基因導入細胞會導致生長抑制。所有這些突變型已亞克隆至人β-肌動蛋白啟動子載體中。為了亞克隆Rb cDNA，將整個開放閱讀框在5′端與含有Bam HI位點的人工合成接頭(CGGATCCGCGTC)連接，在3′端與含有ATTAAA和BamHI位點的人工合成接頭連接，產生的BamHI片段亞克隆至載體的BamHI位點，并且挑選出具有方向正確的克隆。
實施例1
制備p5突變型m89-0和m88-0為了制備m89-0突變型，合成一對包含有要被突變的‘P5’區域的DNA寡核苷酸引物(Pm1和Qm1)和一對位于‘P5’區域兩側的寡核苷酸(P3和Q3)，合成是根據制造商的說明，在AB1 PCR-mate寡核苷酸合成儀上進行。以野生型Rb cDNA作為模板，用P3和Qm1引物進行40次循環的聚合酶鏈反應(PCR)。在第二個管中，用Pm1和Q3引物進行40次循環的PCR。反應完成后，從第一個管中取出少量反應產物在過量P3引物存在下進行80次循環的PCR。類似地，從第二個管中取出少量反應產物在過量Q3引物存在下進行80次循環的PCR。混合從該二管中獲得的大量單鏈反應產物，再進行20次循環的鏈延伸。產生的雙鏈產物含有突變的P5區域，被亞克隆至Rb表達質粒HuBAcpr-1-neo-PQ(m89-0)的MIul和Hind3位點。產生的質粒有一個突變的P5區域，下圖顯示突變的氨基酸(下劃線部分)。K870和H890分別指Rb蛋白中870和890位置的賴氨酸和組氨酸殘基。m88-0以類似方法產生。野生型Rb- K870PLKKLRFDIEGSDEADGSKH890突變型m89-o Rb- K870PLKKLRFDIEASAEVDASIH890突變型m88-o Rb- K870LLIKPRYDTEGSDEADGSKH890實施例2轉染的質粒對人成纖維細胞株的影響當突變型m89-o轉染入正常人成纖維細胞株WS1時，觀察RbcDNA對細胞生長的影響。SV40大T抗原基因被用作轉染的對照。用含有SV40大T抗原基因和新霉素基因的質粒pPVUO-Neo進行轉染以監測轉染效率。此外，一種非活性的Rb基因突變型形式“HuBAcpr-1-neo-P16”被用作對照。轉染時，將100μg的每一種質粒DNA與107個指數生長的WS1細胞混合，該混合是在含有RPM1 1640培養基(Gibco)和10％FCS、終體積為0.8ml的電穿孔槽裝置Cell-PoratorTM(BRL)中進行。電穿孔條件為200伏特和1180微法。電穿孔的細胞在室溫復蘇10分鐘，用RPM1 1640和10％胎牛血清(FCS)稀釋，涂布在60毫米培養皿上，細胞密度為2×104細胞/平方厘米。細胞在同樣的培養基中附著并生長兩天。然后，培養基換成RPM1 1640＋10％FCS＋15微克/毫升G418(G1BCO)。每三天取相同培養皿，用兔多克隆抗Rb蛋白抗體RB1-ABA1(圖8A)或鼠單克隆抗SV40大T抗原抗體Pab101(圖8B)進行組織免疫化學染色。從圖8A看到，轉染后13天并用G418培養基選擇，表達轉染的Rb cDNA質粒m89-0的WS1細胞可高強度地結合抗Rb蛋白抗體。然而，表達Rb蛋白的細胞仍為單個的細胞，沒有分裂。相反地，表達轉染的SV40大T抗原(SVLT)的細胞繼續分裂形成集落，如同圖8B中與鼠抗SVLT抗體陽性結合的細胞群所示。因此，細胞中m89-0 Rb cDNA的過量表達導致正常細胞WS1生長的完全抑制。用非活性的Rb HuβAcpr-1-neo-P16形成轉染的細胞沒有受到抑制而分裂形成集落。
實施例3轉染的質粒對人膀胱癌細胞株TCCSUP的影響用上述描述的同樣程序，將突變型m89-0和HuβAcpr-1-neo-P16質粒轉染至無外源Rb蛋白的人膀胱癌細胞TCCSUP中。使用的質粒、轉染的方法和免疫染色方法與上述描寫的一致。
圖9A顯示，表達轉染的m89-0cDNA的細胞不能分裂。相反地，表達轉染的HuBA cpr-1-neo-P16的細胞分裂形成集落(圖9B)。m89-0RbcDNA的過量表達導致體外腫瘤細胞生長的嚴重阻滯。
實施例4除了Rb和p53同源區域的突變型外，還有在p53蛋白中的突變。表II列出野生型p53和制備的保守氨基酸突變型的部分氨基酸序列。此外，表II列出對應于突變型氨基酸序列的DNA序列。為了制備突變型，合成二條引物，與模板鏈一起退火。PCR反應同上。如上所述，P1、P3和P5區域的改變導致p53蛋白的構象改變，從而能直接結合其靶DNA序列。
表IIp53突變型P1野生型ELNEALELK保守氨基酸突變型(P53-ConP1)KLYEDFEIE(1)5′GC TCC GAG ATG TTC CGA AAG CTG TAT GAG GACTTG GAA ATC GAG GAT GCC CAG GCT GGG 3′(2)3′CG AGG CTC TAC AAG GCT TTC GAC ATA CTC CTGAAC CTT TAG CTC CTA CGG GTC CGA CCC 5′P3 野生型 KKGQSTSRH保守氨基酸突變型(P53-ConP3)NEWFSTARD(1)5′AGC CAC CTG AAG TCC AAC GAG TGG TTC TCT ACCGCC CGC GAT AAA AAA CTC ATG TTC AAG AC 3′(2)3′TCG GTG GAC TTC AGG TTG CTC AGG AAG AGATGG CGG GCG CTA TTT TTT GAG TAC AAG TTC TG 5′P5 野生型 KKLMFKTEGPDSD保守氨基酸突變型(P53-ConP5)NEVMWKTKWPDAH(1)5′GTCTACCTCCCGCCAT AACGAA GTCATG TGGAAGACAAAA TGGCCT GACGCA CAC TGACATTCTC-CACTTCTT 3′(2)3′CAGATGGAGGGCGGTA TTGCTT CAGTAC ACCTTCTGTTTT ACCGGA CTGCGT GTG ACTGTAAGAGGT-GAAGAA5′實施例5產生含有突變型Rb基因的重組反轉錄病毒將含有整個突變型Rb#89編碼區域的HindIII/BamHI片段亞克隆入反轉錄病毒載體的HindIII/BgIII位點。將重組質粒載體轉染入細胞株Psi-2。用培養轉染細胞的培養基去感染另一細胞株PA317。產生重組病毒的細胞用G418選擇，并且從培養基中收集到的反轉錄病毒濃縮后通過蔗糖梯度純化。p53基因的突變型以同樣方式測試。
實施例6G1NaSvRb89病毒對眼睛中細胞增殖的影響通過注射兔成纖維細胞以及產生局部損傷來誘導兔實驗增殖性玻璃體視網膜病(PVR)。這一程序包括在緣處誘導一損傷以及在全身麻醉下向玻璃體注射2×105的兔成纖維細胞。術后，兔接收含有抗生素的局部軟膏。
突變型Rb或p53基因重組反轉錄病毒在動物全身麻醉下注射入玻璃體(2×105細胞/兔)。起初，通過評估病毒的最大劑量(使用的病毒濃度和注射病毒的體積)測試病毒的局部耐受程度。反轉錄病毒已用于在鼠中進行視網膜下注射，未報道有副作用(Turner和Cep-ko，Nature 328132,1987)。不會產生副作用的最大劑量將用于所有隨后的治療。
通過照相透視來監測體內細胞的生長。視網膜脫離的程度要與對照相比較，對照只注射含有1-半乳糖苷酶基因的反轉錄病毒。此外，通過用溴脫氧尿苷(BrdU)標記活體來監測體內細胞的生長。在兔安死術前一小時，靜脈注射50毫克/千克BrdU以標記增殖細胞。安死術后，通過用針對BrdU的抗體的免疫染色，分析細胞中BrdU摻入DNA情況。同時，用抗Rb或p53蛋白或1-半乳糖苷酶蛋白的抗體對細胞進行免疫染色以評估感染效率。
PVR誘導后，在不同時間內注射病毒來評估反轉錄病毒抑制注射的細胞生長的最適時間。也測定玻璃體對感染兔成纖維細胞效率的影向。也測定對兔成纖維細胞增加這些病毒的時間延遲。還測定對用成纖維細胞生長因子刺激以增加生長速率的兔成纖維細胞增加這些病毒的時間延遲。
本說明書中提及的現有專利和出版物表示與本發明相關的領域中技術人員的水平。所有的專利和出版物在此以同等程度引用作為參考，如同每篇出版物特定地和單獨地被指明作為參考文獻一樣。
本領域的技術人員將容易地知道本發明非常適合實現其目標，并且獲得上述的結果和優越性及其內在的其他好處。此處描述的實施例及其中的方法、程序、治療、分子和特殊的化合物是目前較佳例子的代表性體現，也是示范性的，并不用于限定本發明的范圍。本領域中技術人員所想到的圍繞本發明精神的改變和其它用途，落于權利要求書所限定范圍。
權利要求書按照條約第19條的修改根據條約第19條修改時的聲明這是對1994年12月14日發出的國際檢索報告的答復。
所附的是替換頁第41頁，用于替換上述國際申請的權利要求書中的相應部分。
權利要求1、3、5、6、和8被修改。
權利要求4和7未改動。
權利要求2被刪去。
按權利要求修改格式，下面列出了被修改的
權利要求
1.(修改)一種分離的DNA分子，其特征在于，所述分子是合成的突變〔生長抑制〕Rb基因，該基因編碼一種突變的有活性功能的成視網膜瘤蛋白。
3.(修改)如權利要求〔2〕1所述的分子，其特征在于，該基因通過改變編碼Rb基因保守同源區域中氨基酸的核苷酸而突變。
5.(修改)如權利要求〔2〕1所述的分子，其特征在于，所述基因編碼一種氨基酸序列，該序列選自由在Seq.ID.Nos.1和2中顯示的序列組成的組。
6.(修改)如權利要求〔2〕1所述的分子，其特征在于，所述基因通過改變編碼Rb蛋白磷酸化位點處氨基酸的核苷酸序列而突變。
8.(修改)〔如權利要求1所述的分子〕一種分離的DNA分子，其特征在于，所述〔基因〕分子是合成的突變p53基因，該基因編碼一種突變的有活性功能的p53蛋白。
1.一種分離的DNA分子，其特征在于，所述分子是合成的突變Rb基因，該基因編碼一種突變的有活性功能的成視網膜瘤蛋白。
2.(取消)3.如權利要求1所述的分子，其特征在于，該基因通過改變編碼Rb基因保守同源區域中氨基酸的核苷酸而突變。
4.如權利要求3所述的分子，其特征在于，所述Rb蛋白的保守同源區域選自由P1、P3和P5組成的組。
5.如權利要求1所述的分子，其特征在于，所述基因編碼一種氨基酸序列，該序列選自由在Seq.ID.Nos.1和2中顯示的序列組成的組。
6.如權利要求1所述的分子，其特征在于，所述基因通過改變編碼Rb蛋白磷酸化位點處氨基酸的核苷酸序列而突變。
7.如權利要求6所述的分子，其特征在于，所述磷酸化位點選自由T005、S230、S249、T252、T373、S567、S608、S612、T773、S780、S788、S795、S807、S811、T821和T826組成的組。
8.一種分離的DNA分子，其特征在于，所述分子是合成的突變p53基因，該基因編碼一種突變的有活性功能的p53蛋白。
9.如權利要求8所述的分子，其特征在于，該基因通過改變編碼p53基因保守同源區域中氨基酸的核苷酸而突變。
l0.如權利要求9所述的分子，其特征在于，所述p53蛋白的保守同源區域選自由P1、P3和P5組成的組。
11.一種質粒，其特征在于，含有如權利要求2所述的DNA。
12.一種質粒，其特征在于，含有如權利要求8所述的DNA。
13.一種適合在重組細胞中表達的質粒，其特征在于，含有編碼
權利要求
1.一種分離的DNA分子，其特征在于，所述分子是合成的生長抑制基因。
2.如權利要求1所述的分子，其特征在于，該基因是突變的Rb基因，它編碼突變的成視網膜細胞瘤蛋白。
3.如權利要求2所述的分子，其特征在于，該基因通過改變編碼Rb基因保守同源區域中氨基酸的核苷酸而突變。
4.如權利要求3所述的分子，其特征在于，所述Rb蛋白的保守同源區域選自由P1、P3和P5組成的組。
5.如權利要求2所述的分子，其特征在于，所述基因編碼一種氨基酸序列，該序列選自在Seq.ID.Nos.1和2中顯示的序列。
6.如權利要求2所述的分子，其特征在于，所述基因通過改變編碼Rb蛋白磷酸化位點處氨基酸的核苷酸序列而突變。
7.如權利要求6所述的分子，其特征在于，所述磷酸化位點選自由T005、S230、S249、T252、T373、5567、S608、S612、T773、S780、S788、S795、S807、S811、T821和T826組成的組。
8.如權利要求6所述的分子，其特征在于，所述分子是突變的p53基因。
9.如權利要求8所述的分子，其特征在于，該基因通過改變編碼p53基因保守同源區域中氨基酸的核苷酸而突變。
10.如權利要求9所述的分子，其特征在于，所述p53蛋白的保守同源區域選自由P1、P3和P5組成的組。
11.一種質粒，其特征在于，含有如權利要求2所述的DNA。
12.一種質粒，其特征在于，含有如權利要求8所述的DNA。
13.一種適合在重組細胞中表達的質粒，其特征在于，含有編碼Seq.ID.No.1氨基酸序列的cDNA和在細胞中表達cDAN所必需的調控元件。
14.一種適合在重組細胞中表達的質粒，其特征在于，含有編碼Seq.ID.No.2氨基酸序列的cDNA和在細胞中表達cDNA所必需的調控元件。
15.一種治療病理性細胞增殖疾病的方法，其特征在于，包括對非癌增殖細胞施用如權利要求1所述的DNA分子。
16.如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述分子是一個突變Rb基因。
17.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述基因通過改變編碼Rb基因保守同源區域中氨基酸的核苷酸序列而突變。
18.如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述Rb基因的保守同源區域選自由P1、P3和P5組成的組。
19.如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述基因編碼一種氨基酸序列，該序列選自在Seq.ID.No.1和2中顯示的序列組成的組。
20.如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述基因通過改變編碼Rb蛋白磷酸化位點處氨基酸的核苷酸序列而突變。
21.如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述磷酸化位點選自由T005、S230、S249、T252、T373、S567、S608、S612、T773、S780、S788、S795、S807、S811、T821和T826組成的組。
22.如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述基因是一個突變p53基因。
23.如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述基因通過改變編碼p53蛋白保守同源區域氨基酸的核苷酸序列而突變。
24.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述p53蛋白的保守同源區域選自由P1、P3和P5組成的組。
25.如權利要求1 5所述的方法，其特征在于，所述非癌增殖細胞疾病選自由牛皮癬、良性增殖皮膚疾病、鱗癬、乳頭狀瘤、基底細胞癌、鱗狀上皮細胞癌、纖維增殖疾病、血管增殖疾病和皮膚增殖疾病組成的組。
26.一種治療個體惡性細胞疾病的方法，其特征在于，包括施用如權利要求1所述的DNA分子進入增殖的癌細胞。
27.如權利要求26所述的方法，其特征在于，所述分子是一個突變Rb基因。
28.如權利要求26所述的方法，其特征在于，所述基因通過改變編碼Rb基因保守同源區域氨基酸的核苷酸序列而突變。
29.如權利要求28所述的方法，其特征在于，所述Rb基因的保守同源區域選自由P1、P3和P5組成的組。
30.如權利要求29所述的方法，其特征在于，所述基因編碼一種氨基酸序列，該序列選自由在Seq.ID.No.1和2中顯示的序列組成的組。
31.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述基因通過改變編碼Rb蛋白磷酸化位點處氨基酸的核苷酸序列而突變。
32.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述磷酸化點選自由T005、S230、S249、T252、T373、S567、S608、S612、T773、8780、S788、S795、S807、S811、T821和T826組成的組。
33.如權利要求26所述的方法，其特征在于，所述分子是一個突變p53基因。
34.如權利要求33所述的方法，其特征在于，所述基因通過改變編碼p53蛋白保守同源區域氨基酸的核苷酸序列而突變。
35.如權利要求34所述的方法，其特征在于，所述p53保守同源區域選自由P1、P3和P5組成的組。
36.如權利要求26所述的方法，其特征在于，所述增殖性癌細胞引起了某一種疾病，該疾病選自由卵巢癌、膀胱癌、肺癌、宮頸癌、乳腺癌、前列腺癌、神經膠質瘤、纖維肉瘤、成視網膜瘤、黑素瘤、軟組織肉瘤、骨內瘤、結腸癌、腎癌和胰腺癌組成的組。
37.一種治療病灶性細胞增殖疾病的方法，其特征在于，包括對增殖細胞施用突變Rb基因。
38.如權利要求37所述的方法，其特征在于，所述增殖細胞引起某一種疾病，該疾病選自由眼睛中纖維增殖、血管增殖和瘤形成疾病組成的組。
39.一種治療病灶性細胞增殖疾病的方法，其特征在于，包括對增殖細胞施用突變p53基因。
40.如權利要求39所述的方法，其特征在于，所述增殖細胞引起某一種疾病，該疾病選自由眼睛中纖維增殖、血管增殖和瘤形成疾病組成的組。
41.一種突變的成視網膜瘤蛋白，其特征在于，由如權利要求2所述的基因產生。
42.一種突變的p53蛋白，其特征在于，由如權利要求8所述的 基因產生。
43.一種治療病理性細胞增殖疾病的方法，其特征在于，包括對非癌增殖細胞同時或連續地施用突變Rb基因和突變p53基因。
44.一種治療個體惡性細胞疾病的方法，其特征在于，包括同時或連續地施用突變Rb基因和突變p53基因進入增殖的癌細胞。
全文摘要
本發明提供Rb和p53基因的突變型以及運用這些突變型進行治療的方法。與突變Rb基因和p53基因一起，本發明提供含有突變的Rb基因或p53基因的質粒。此外，本發明提供用本發明中的質粒轉染的細胞。而且，本發明提供治療一系列病理生理性細胞增殖疾病的方法。
文檔編號A61K48/00GK1133595SQ94193949
公開日1996年10月16日 申請日期1994年9月1日 優先權日1993年9月3日
發明者惲凱峰 申請人:研究發展基金會