用作為免疫佐劑的磷腈聚電解質的制作方法

專利名稱：用作為免疫佐劑的磷腈聚電解質的制作方法
本申請是1993年7月12日提交的美國專利申請序列號08/090,841的部分繼續申請。
背景技術：
本申請涉及用于生物醫學的聚合物領域，具體地說，描述了可用作免疫佐劑的聚合物。
疫苗的開發各種抗原刺激動物中抗體的產生，從而對隨后的感染起到保護作用。然而，某些抗原不能刺激有效的免疫應答。
相對較弱的抗原的致免疫性常常是通過同時施用所述抗原與一種佐劑來增強的，所述佐劑是這樣一種物質，它在單獨施用時不產生致免疫性，而當與抗原結合時會誘發粘膜和/或系統免疫。人們習慣性地認為佐劑例如礦物油乳劑或氫氧化鋁在注射部位形成抗原儲存，并緩慢釋放抗原。Allison和Byars在“VaccinesNew Approachesto Immunological Problems，R.W.Ellis，ed.，P.431，Butterworth-Heinemann，Oxford(1992)中的最近的研究表明，佐劑通過釋放細胞因子從而刺激特異性的、有時是非常窄范圍的免疫應答來增強免疫應答。不幸的是，許多免疫佐劑例如弗氏完全佐劑是有毒的，因而僅可用于動物研究目的，而不能用于人的接種。弗氏完全佐劑含有經加熱滅活的結核分支桿菌在含有表面活性劑的礦物油中的懸浮液，并且在動物的免疫接種部位引起肉芽腫損傷。弗氏佐劑也可以使接種疫苗者對結核病的試驗呈陽性。
已發現某些合成的聚電解質當與抗原結合時會提供免疫刺激性。例如，Petrov等人在Jhurnal Vses.Khim.Ob-va im.D.I.Mendeleeva，3322-42(1988)中研究了聚丙烯酸(PAA)、丙烯酸與N-乙烯基吡咯烷酮的共聚物(CP-AAVPD)、聚-2-甲基-5-乙烯基吡啶(PMVP)、聚-4-乙烯基-N-乙基溴化吡啶鎓(PVP-R2)及類似化合物與抗原軛合時的佐劑活性。含有許多上述同樣的聚電解質的聚電解質復合物的免疫調節作用最近還由Petrov等人在Sov.Med.Rev.D.Immunol.，41-113(1992)中進行了綜述。然而，這些聚合物的毒性和生物降解性還無人研究，而且可能阻礙這些聚合物作為人用佐劑的應用。
具有刺激對非抗原性或弱抗原性分子的免疫應答能力的無毒佐劑或載體可用于開發和施用疫苗。
因此，本發明的一個目的是提供一種可以以最小的毒性安全地施用于人和動物的佐劑。
本發明的另一目的是提供一種可溶的并且可生物降解的佐劑。
本發明的另一目的是提供一種具有抗有機體例如流感病毒或破傷風棱狀芽胞桿菌的保護作用的疫苗。
本發明的再一目的是提供一種快速而有效的合成用作佐劑的聚合物例如聚磷腈(polyphosphazene)的方法。
本發明的概要本發明公開了用作佐劑的一種合成的水溶性聚磷腈(polyphosphazene)。在一個優選的實施方案中，所述磷腈是一種可生物降解的、并且當施用于動物例如人時具有最低毒性的聚電解質。
在一種實施方案中，所述聚合物佐劑是一種聚(有機磷腈)，它具有(i)電離的或可電離的側基，該側基含有例如羧酸、磺酸或羥基部分；和(ii)在使用條件下易于水解的側基以賦予聚合物以生物降解性。適宜的可水解基團包括例如氯、氨基酸、氨基酸酯、咪唑、甘油和葡糖基。
可用作免疫佐劑的聚磷腈的兩個例子有聚[二(羧基苯氧基)磷腈-共-二(羧甲氨基)(glycinato)磷腈-共(羧基苯氧基)(羧甲氨基)磷腈]和聚[二(羧基苯氧基)磷腈-共-二(氯)磷腈-共-(羧基苯氧基)-(氯)磷腈]。
疫苗組合物是通過在施用前使聚合物佐劑與抗原混合成軛合來制備的。另一種可選擇的方式是，聚合物和抗原可以分別施用到同一部位。
當用多價離子交聯時，聚合物的溶解性變小，導致聚合物從施用部位的較慢的釋放。
本發明的詳細描述本文所用術語氨基酸是指天然的及合成的氨基酸，并且包括但不限于丙氨酰基、纈氨酰基、亮氨酰基、異亮氨酰基、脯氨酰基、苯丙氨酰基、色氨酰基、甲硫氨酰基、甘氨酰基、絲氨酰基、蘇氨酰基、半胱氨酰基、酪氨酰基、天冬酰胺酰基、谷氨酰胺酰基、天冬氨酰基、谷氨酰基、賴氨酰基、精氨酰基和組氨酰基。術語氨基酸酯是指天然或合成的氨基酸的脂族、芳基或雜芳族羧酸酯。
本文所用術語烷基是指飽和的直鏈、支鏈或環狀烴基或其混合物，典型的是C1-C20的飽和的直鏈、支鏈或環狀烴基，具體地講，包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、環戊基、異戊基、新戊基、己基、異己基、環己基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、庚基、辛基、壬基和癸基。
術語(烷基或二烷基)氨基分別指具有一個或兩個烷基取代基的氨基。
本文所用術語鏈烯基和炔基分別指具有至少一個雙鍵或三鍵的C2-C20直鏈或支鏈烴基。
本文所用術語芳基是指苯基或取代的苯基，其中的取代基為鹵素、烷基、烷氧基、烷硫基、鹵代烷基、羥基烷基、烷氧基烷基、亞甲二氧基、氰基、C(O)(低級烷基)、-CO2H、-SO3H、-PO3H、-CO2烷基、酰氨基、氨基、烷氨基和二烷基氨基，而且其中的芳基可以最多具有3個取代基。
術語脂族基是指烴基，典型的是C1-C20烴基，所述烴基可以含有可以為直鏈、支鏈或環狀或這三種形式的結合的一種或混合的烷基、鏈烯基或炔基。
本文所用術語鹵素包括氟、氯、溴和碘。
術語芳烷基是指具有烷基取代基的芳基。
術語烷芳基是指具有芳基取代基的烷基，包括芐基、取代的芐基、苯乙基或取代的苯乙基，其中所述取代基為如上對芳基所定義者。
本文所用術語雜芳基或雜芳族基是指在芳環上包括至少一個硫、氧或氮的、并且任選被如上對于芳基所定義的取代基取代的芳族基。上述芳族基的非限制性實例為呋喃基、吡啶基、嘧啶基、噻吩基、異噻唑基、咪唑基、四唑基、吡嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、喹啉基、異喹啉基、苯并噻吩基、異苯并呋喃基、吡唑基、吲哚基、異吲哚基、苯并咪唑基、嘌呤基、carbozolyl、噁唑基、噻唑基、異噻唑基、1，2，4-噻二唑基、異噁唑基、吡咯基、吡唑基、喹唑啉基、噠嗪基、吡嗪基、噌啉基、2，3-二氨雜萘基、喹喔啉基、黃嘌呤基、次黃嘌呤基、喋啶基、5-氮雜胞嘧啶核苷基、5-氮雜尿嘧啶基、三唑并吡啶基、咪唑并吡啶基、吡咯并嘧啶基和吡唑并嘧啶基。
術語“可藥用陽離子”是指帶有正電荷并且可以作為抗衡離子施用到磷腈聚電解質中的有機或無機部分。
本文所用術語雜烷基是指在碳鏈中或在碳鏈末端包含一個雜原子例如氧、硫或氮(其價鍵由氫或氧來滿足)的烷基。
提供了用作免疫佐劑的合成聚合物。所述聚合物佐劑是一種至少部分可溶于水(典型的溶解度至少為0.001％(重量))、含水緩沖鹽溶液或含水醇溶液的聚磷腈。所述聚磷腈優選含有帶電荷的側基，該帶電荷的側基或者以與其抗衡離子處于平衡狀態的酸或堿的形式存在、或以其離子型鹽的形式存在。
所述聚合物優選為生物降解性的，并且當給動物(包括人)施用時具有最低毒性。
聚磷腈聚電解質的選擇聚磷腈類化合物是這樣的聚合物，其骨架由交替的磷和氮組成，所述的磷和氮由交替的單鍵和雙鍵分開。每個磷原子與兩個側基(“R”)共價鍵合。聚磷腈類化合物中的重復單元具有下列通式 其中n為整數。
取代基(“R”)可以是在聚合物內可以變化的各種部分的任何一種，包括但不限于脂族基、芳基、芳烷基、烷芳基、羧酸基、雜芳族基、碳水化合物(包括葡萄糖)基、雜烷基、鹵素、(脂族基)氨基(包括烷基氨基)、雜芳烷基、二(脂族基)氨基(包括二烷基氨基)、芳基氨基、二芳基氨基、烷基芳基氨基，-氧基芳基，包括但不限于-氧基苯基CO2H、-氧基苯基SO3H、-氧基苯基羥基和-氧基苯基PO3H；-氧基脂族基，包括-氧基烷基、-氧基(脂族基)CO2H、-氧基(脂族基)SO3H、-氧基(脂族基)PO3H和-氧基(脂族基)羥基(包括-氧基(烷基)羥基)-氧基烷芳基、-氧基芳烷基、-硫基芳基、-硫基脂族基(包括-硫基烷基)、-硫基烷芳基、-硫基芳烷基、-NHC(O)O-(芳基或脂族基)、-O-[(CH2)xO]y-CH2)-O-[(CH2)xO]y(CH2)xNH(CH2)xSO3H和-O-[(CH2)xO]y-(芳基或脂族基)，其中x為1-8，并且y為1-20的整數。所述基團可以通過例如氧、硫、氮或碳原子鍵合到磷原子上。
一般而言，當聚磷腈具有一種以上類型的側基時，所述基團會在整個聚合物中無規則地變化，因而該聚磷腈是無規共聚物。磷原子可以與兩個類似的基團或兩個不同基團鍵合。帶有兩種或更多種類型的側基的聚磷腈可以通過使聚(二氯磷腈)與所需的一種親核試劑或多種親核試劑以所需比例反應來制備。在聚磷腈中所得側基的比率可由許多因素來決定，所述因素包括用于制備聚合物的起始原料的比率、所述親核取代反應進行的溫度以及所用的溶劑體系。盡管確定所得聚合物中各基團的準確取代方式是困難的，但是本領域技術人員可以容易地確定聚合物中各基團的比率。
在一種實施方案中，免疫佐劑是下式的生物降解性聚磷腈 其中A和B可以獨立地在聚合物中變化，并且可以為
(i)在使用條件下易于水解的基團，包括但不限于氯、氨基酸、氨基酸酯(通過氨基鍵合)、咪唑、甘油或葡糖基；或(ii)在使用條件下不易水解的基團，包括但不限于脂族基、芳基、芳烷基、烷芳基、羧酸、雜芳族基、雜烷基、(脂族基)氨基-(包括烷基氨基-)、雜芳烷基、二(脂族基)氨基(包括二烷基氨基-)、芳基氨基-、二芳基氨基-、烷基芳基氨基-，-氧基芳基，包括但不限于-氧基苯基CO2H、-氧基苯基SO3H、-氧基苯基羥基和-氧基苯基PO3H；-氧基脂族基，包括-氧基烷基、-氧基(脂族基)CO2H、-氧基(脂族基)SO3H、-氧基(脂族基)PO3H和-氧基(脂族基)羥基(包括-氧基(烷基)羥基)；-氧基烷芳基、-氧基芳烷基、硫基芳基、-硫基脂族基(包括-硫基烷基)、-硫基烷芳基、或硫基芳烷基；其中聚合物含有至少1％或1％以上、優選10％或10％以上、更優選80-90％或80-90％以上、但低于100％的在使用條件下不易水解的重復單元，并且其中n為整數4或4以上的整數，并且優選在10與20,000至300,000之間。
不言而喻，某些基團，例如非咪唑雜芳族基在中性含水條件下(例如血液中)以極緩慢的速率水解，因此，就本發明的目的而言，通常認為它們是不可水解的基團。然而，在某些條件下(例如正如所發現的那樣，在低pH條件下，例如在胃中)，正常的不可水解的基團(例如非咪唑雜芳族化合物)的水解速率可以增加到可以影響聚合物的生物降解性能的程度。本領域普通技術人員采用已知技術可以容易地確定在使用條件下側基是否以相當大的速率水解。本領域普通技術人員還可以確定具有本發明所述各種結構的聚磷腈類化合物的水解速率，并且可以選擇可提供適用于目的用途的所需生物降解特性的聚磷腈。
聚合物的水解降解程度將隨著易于水解的側基的百分率和可水解基團的水解速率而變化。所述可水解基團在含水環境下被羥基取代，所提供的P-OH鍵賦予聚合物以水解不穩定性。
在其它實施方案中，所述免疫佐劑為(i)一種非生物降解性聚磷腈，其中聚合物中的側基沒有一個(或基本上沒有)在使用條件下易于水解，或(ii)一種完全可生物降解的聚磷腈，其中所有的基團均在使用條件下易于水解(例如聚[二(羧甲氨基)磷腈])。
磷腈聚電解質在本發明中被定義為含有可提供陰離子型、陽離子型或雙親型聚磷腈的電離的或可電離的側基的聚磷腈類化合物。離子型基團可以為鹽、或已經或可以至少部分解離的酸或堿的形式。任何可藥用的單價陽離子均可以用作該鹽的抗衡離子，包括但不限于鈉、鉀和銨離子。磷腈聚電解質也可以含有非離子型側基。磷腈聚電解質在使用條件下可以是生物降解性或非生物降解性的。電離的或可電離的側基優選在使用條件下不易水解。
優選的磷腈聚電解質免疫佐劑含有包括羧酸、磺酸或羥基部分在內的側基。盡管酸性基團通常位于不可水解的側基上，但是它們也可以、或以結合方式位于可水解基團上。具有作為側鏈的羧酸基團的磷腈聚電解質的實例如下式所示
其中n為整數，優選在10與10,000至300,000之間的整數。該聚合物的化學名稱為聚[二(羧基苯氧基)磷腈]或聚[雙(羧基苯氧基)磷腈](PCPP)。
磷腈聚電解質優選是可生物降解的，以防止在身體的較遠部位(例如脾臟)處聚合物分子的最終沉積和累積。本文中所用的術語可生物降解的是指這樣的聚合物，一旦將其置于大約25-37℃的pH6-8的生理溶液中，在所需應用可接受的期間內、一般少于約五年并且最優選少于約一年的期間內降解。
最優選的是所述聚合物為包括在使用條件下不水解的、包括羧酸部分在內的側基以及在使用條件下易于水解的側基的聚(有機磷腈)。優選的帶有水解敏感性基團的磷腈聚電解質的實例為聚[二(羧基苯氧基)磷腈-共-二(氨基酸)磷腈-共-(羧基苯氧基)(氨基酸)磷腈]，具體包括聚[二(羧基苯氧基)磷腈-共-二(羧甲氨基)磷腈-共-(羧基苯氧基)(羧甲氨基)磷腈]和聚[二(羧基苯氧基)磷腈-共-二(氯)磷腈-共-(羧基苯氧基)(氯)磷腈]。
聚磷腈的毒性是用本領域技術人員公知的細胞培養實驗測定的。例如，聚[二(羧基苯氧基)磷腈]的毒性是在細胞培養物中按下述方法測定通過用聚[二(羧基苯氧基)磷腈]涂覆細胞培養皿，然后將小雞胚胎成纖維細胞接種到涂覆后的佩特里細胞菌養皿上。在小雞胚胎成纖維細胞接種后三天，細胞變平，并形成紡錘狀細胞。在相襯顯微鏡下，觀察到核分裂圖象。這些觀察提供了聚[二(羧基苯氧基)磷腈]對于復制細胞無毒性的證據。
用作免疫佐劑的交聯的聚磷腈類化合物可以通過使磷腈聚電解質與金屬多價陽離子例如鋅、鈣、鉍、鋇、鎂、鋁、銅、鈷、鎳或鎘結合來制備。
磷腈聚電解質的合成聚磷腈類化合物(包括磷腈聚電解質)可以通過聚(二氯磷腈)與各種化學試劑或試劑混合物按照本領域技術人員已知的方法進行大分子親核取代反應來制備。優選地，磷腈聚電解質通過使聚(二氯磷腈)與適合的一種或多種取代氯的親核試劑反應來制備。聚合物中可水解側鏈與不可水解的側鏈的所需比例可以根據需要通過調節與聚(二氯磷腈)反應的相應的親核試劑的用量及反應條件來獲得。優選的具有免疫活性的聚磷腈類化合物的分子量大于1,000。
例如，聚[(羧基苯氧基)(羧甲氨基)磷腈](PC-GlPP)的制備方法如下使聚(二氯磷腈)的氯原子與對羥基苯甲酸丙酯和甘氨酸乙酯鹽酸鹽進行親核取代反應(PC-GlPP合成法)。然后，將所得的聚[(芳氧基)(羧甲氨基)磷腈]酯水解成相應的聚(羧酸)。其他的聚磷腈類化合物可以按下述文獻所述方法制備Allcock，H.R.等人，Inorg.Chem.11，2584(1972)；Allcock，H.R.等人，Macromolecules 16，715(1983)；Allcock，H.R.等人，Macromolecules 19，1508(1986)；Allcock，H.R.等人，Biomaterials 19，500(1988)；Allcock，H.R.等人，Macromolecules 21，1980(1988)；Allcock，H.R.等人，Inorg.Chem.21(2)，515521(1982)；Allcock，H.R.等人，Macromolecules 227579(1989)；U.S.P.Nos.4,440,921，4,495,174，4,880,622，授予Allcock，H.R.等人；U.S.P.No.4,946,938，授予Magill，等人，U.S.P.No.5,149,543，授予Cohen等人，和出版物Grolleman等人，J.Controlled Release 3，143(1986)，上述文獻的方法及其中所公開的聚合物并入本文作為參考。
抗原的選擇抗原可衍生自細胞、細菌或病毒粒子、或其部分。正如本文所定義的那樣，抗原可以是蛋白質、肽、多糖、糖蛋白、糖脂、核酸或其混合物，抗原在動物例如哺乳動物、鳥或魚中引起致免疫應答。正如本文所定義的那樣，致免疫應答可以是體液或細胞介導的。如果欲進行致免疫應答的物質的抗原性差，則可將其通過標準共價結合技術例如采用幾種市售試劑盒中的一種而軛合到載體例如白蛋白或半抗原上。
在一種實施方案中，用聚合物傳遞核酸，該核酸將抗原編碼到粘膜表面，在此表面上核酸得以表達。
優選的抗原的實例包括病毒蛋白例如流感蛋白、人免疫缺陷病毒(HIV)蛋白和B型肝炎蛋白，以及細菌蛋白和脂多糖例如革蘭氏陰性細菌細胞壁和淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea)蛋白。
致免疫組合物的制備將抗原與聚合物結合以同時施用致免疫組合物或疫苗是通過使聚合物佐劑與抗原結合來制備的。將大約0.5～0.0001份抗原加到1份聚合物中，優選通過攪拌聚合物和抗原的溶液直至得到溶液或懸浮液，優選在25℃攪拌10分鐘或10分鐘以上。聚合物優選通過一種將抗原均勻地分散到佐劑中的方法與抗原結合。液化聚合物的方法包括將聚合物溶于水基溶劑中，該溶劑的pH范圍優選為7.1至7.7，以及熔化該聚合物。后者只有當抗原在聚合物熔化溫度下是穩定的時候才是有用的。然后，將抗原與聚合物混合。固體形式(例如當抗原被冷凍干燥時)的聚合物和抗原也可例如通過擠壓成型用物理方法混合在一起。聚合物也可以用于包封抗原，例如采用美國專利5,149,543(授予Cohen等人)的方法(該文獻內容并入本文)或通過噴霧干燥聚合物和抗原的溶液來進行。另外，含有抗原和佐劑的微球體可以通過簡單地將各組分在水溶液中混合然后通過機械力使聚合物與該物質一起凝結從而形成微粒來制備。如果必要，微粒可以利用電解質、pH變化、有機溶劑、加熱或冷凍方法進行穩定化，從而形成聚合物基質包封的生物材料。
在一種優選的實施方案中，在攪拌下，將大約1份聚合物溶于10份3％Na2CO3水溶液中，然后緩慢加入10-90份磷酸鹽緩沖劑(pH7.4)。
聚合物-抗原軛合物聚合物也可以按照本領域技術人員公知的方法、通常通過抗原上氨基或羧基與聚合物上的可電離側基之一的共價鍵連而與抗原共價軛合，從而形成水溶性軛合物。
交聯的聚合物佐劑在另一優選的實施方案中，將聚合物用多價離子交聯，優選采用含有與聚磷腈的帶電荷的側基電性相反的多價離子(例如若聚合物具有酸性測基，則為多價陽離子，或若聚合物具有堿性側基，則為多價陰離子)的水溶液。
優選地，聚合物被二價和三價金屬離子(例如鈣、銅、鋁、鎂、鍶、鋇、錫、鋅和鐵)、有機陽離子(例如聚(氨基酸))或其他聚合物(例如聚(乙烯亞胺)、聚(乙烯胺)和多糖類)交聯。
聚合物-佐型混合物的添加劑本領域技術人員將會理解，致免疫疫苗組合物可以含有其他生理學上可接受的成分，例如水、鹽水或礦物油，例如DrakeolTM、MarkolTM和角鯊烯，從而形成乳劑。
聚合物-抗原疫苗的施用致免疫組合物可以作為疫苗按照本領域技術人員已知的引起免疫應答的任何方法來施用，包括胃腸外、口服或通過經膜或經粘膜途徑施用。優選地，將疫苗經胃腸外(靜脈內、肌內、皮下、腹膜內等)施用，優選皮下施用。粘膜表面施用途徑的非限制性實施有鼻內(或一般而言，與鼻有關的淋巴(樣)組織)、呼吸道、陰道和直腸途徑。
正如下列實施例所證明的那樣，劑量是由抗原負載量、測定劑量的標準技術、對每一抗原的施用方法(基于施用聚合物-抗原所引起的抗體效價)決定的。
盡管在優選實施方案中，聚合物抗原混合物是同時施用的，而在另一可供選擇的實施方案中，聚合物和抗原分別施用到同一部位或鄰近部位。聚合物用于吸引免疫系統的細胞至該部位，在此它們處理抗原。
參考下列非限制性實施例將進一步理解聚磷腈佐劑和合成方法。
實施例1聚[(羧基苯氧基)(羧甲氨基)磷腈]的合成聚[(羧基苯氧基)(羧甲氨基)磷腈]制備如下。將聚(二氯磷腈)(5.0，0.0425mol)溶于300ml四氫呋喃(THF)中。向溶解的聚合物中滴加對羥基苯甲酸丙酯的鈉鹽(通過使羥基苯甲酸丙酯(30.6g，0.17mol)與60％的氫化鈉(6.12，0.15mol)的THE溶液反應來制備)。加入鈉鹽后，將反應混合物在回流條件下攪拌2天，并由31P NMR監測。
將甘氨酸乙酯鹽酸鹽(23.63g，0.17mol)懸浮于50ml含有三乙胺(23.69，0.17mol)的甲苯中，并回流3.5小時。將反應混合物在冰浴中冷卻，三乙胺鹽酸鹽從溶液中沉淀出來。過濾溶液，將其在0℃下加入到聚合物混合物中。使反應混合物溫熱至室溫，并攪拌2天。聚合物經反復沉淀入100％乙醇中來純化。
將所得聚合物(0.5g，1.33mmol)溶于無水THF(20ml)中。將該溶液緩慢加入到叔丁醇鉀和水在無水THF中的混合物中。在最初5分鐘內，將該混合物冷卻至0℃；然后將其于室溫下攪拌40小時。加入大過量的冰水(300ml)，溶液經蒸發濃縮。聚合物經用鹽酸酸化溶液至pH5.5來分離。反應條件和在水中用凝膠滲透色譜法測定的所得聚合物的重均分子量列于下面表1中。表1.聚[(羧基苯氧基)(羧甲氨基)磷腈]的合成編號聚合物濃度叔丁醇鉀水的濃度反應時間MW％w/v mol/l的濃度 mol/l 小時 kDa1 0.42 0.300.1 42 802 0.42 0.150.05 18 1303 0.42 0.040.05 5 170聚合物結構是用1H和31P NMR(JEOL FX90Q NMR分光計)和元素微量分析來證實的。
實施例2聚[(二(羧基苯氧基)磷腈]的合成聚[二(羧基苯氧基)磷腈]是通過用對羥基苯甲酸丙酯的鈉鹽對聚(二氯磷腈)進行化學修飾、接著按Allcock，H.R.&Kwon，S.(1989)Macromolecules 22，75-79所述方法將酯基水解為羧酸來制備的，上述文獻的內容并入本文。
實施例3聚[(羧基苯氧基)(氯)磷腈]的合成聚[(羧基苯氧基)(氯)磷腈]的制備如下。將聚[二(氯)磷腈](5.0g，0.0425mol)溶于300ml四氫呋喃(THF)中。向該溶解的聚合物中滴加對羥基苯甲酸丙酯的鈉鹽(通過使羥基苯甲酸丙酯(15.52g，0.0864mol)與60％氫化鈉(3.06g，0.0765mol)的THF溶液反應來制備)。加入鈉鹽后，將反應混合物在回流條件下攪拌2天，并用31P NMR監測。聚合物通過反復沉淀入水、乙醇和己烷中來純化。
將聚[(羥基苯甲酸丙酯)(氯)磷腈](2.0g)溶于200ml無水THF中。將20g叔丁醇鉀溶于200ml THF中。將該堿性溶液冷卻至0℃。向丁醇鹽/THF溶液中加入水(1ml)，并攪拌5分鐘。然后將聚合物溶液滴加到堿的水溶液中。將反應混合物溫熱至室溫，并攪拌40小時。40小時后，將反應混合物傾入到冰水混合物中，并蒸發THF。然后將水溶液對水滲析2天。滲析完成后，滲析液用HCl酸化，得到的白色沉淀聚[(羧基苯氧基)(氯)磷腈](含有鉀作為抗衡離子)用水洗滌，并從溶液中濾出。元素分析數據“P”-10.39；“N”-4.52；“C”-47.26；“Cl”-1.44，“K”-2.61。
實施例4磷腈聚電解質的降解在37℃下、在空氣重力保溫箱(Imperial II Incubator，Lab-Line Instruments.Inc.)中、在旋轉搖動器(ORBIT Shaker，LabLine Instruments，Inc.，Melrose Park，III.)的溫和攪拌下，于含有50mg聚合物在5ml 13mM HEPES緩沖鹽水溶液(pH7.4)中的懸浮液的小瓶中體外研究聚[(羧基苯氧基)(羧甲氨基)磷腈]的降解。聚磷腈的分子量是由Perkin-Elmer Series 10液相色譜儀(利用紫外光)和折光指數檢測器采用Ultragel 2000柱(WatersChromatography Division，Millipore Corporation，Milford，MA)來測定。用13mM Hepes緩沖鹽水溶液(pH7.4)作洗脫劑。色譜圖用GPC5和CHROM2軟件(Perkin-Elmer)進行處理以計算重均分子量和數均分子量(采用聚丙烯酸作標準物)。聚合物分子量隨時間的下降列于表2中。表2.聚[(羧基苯氧基)(羧甲氨基)磷腈]的降解時間重均分子量數均分子量天kDakDa0 132.0 70.01540.6 13.860 6.3 1.5180 6.0 0.9240 0.9 0.5聚[(羧基苯氧基)(氯)磷腈]的降解是在37℃下、在保溫箱-搖動器(New Brunswick Scientific，G24)中、在含有0.2％聚合物在磷酸鹽緩沖鹽水溶液(pH7.4)中的溶液的小瓶中進行體外研究。聚磷腈的分子量是用利用紫外光的Waters色譜儀(Water 486，Millipore Corporation，Milford，MA)和折光指數檢測器(Waters410，Millipore Corporation，Milford，MA)采用Ultragel線性柱(Waters Chromatography Division，Millipore Corporation，Milford，MA)進行測定的。用磷酸鹽緩沖鹽水溶液(pH7.4)作為洗脫劑。色譜圖用Millenium2.0軟件進行處理以計算重均分子量和數均分子量(采用聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸作標準物(1,250 Da-1,100,000 Da))。聚合物分子量隨時間的降低示于表3。表3.聚[(羧基苯氧基)(氯)磷腈]的降解時間重均分子量數均分子量天 kDa kDa0 120.0 42.01 113.0 42.06 105.0 41.08 100.0 39.01096.0 39.01495.0 39.01886.0 35.02873.0 31.03567.0 30.05959.0 28.09151.0 23.0實施例5用混有聚磷腈佐劑的破傷風類毒素免疫后的抗體效價抗體效價在用混有各種濃度的聚磷腈佐劑的破傷風類毒素接種后的、7-8周齡的雌性BALB/c小鼠中測定。
含有在聚磷腈中的破傷風類毒素的致免疫組合物的制備如下。將100mg聚[二(羧基苯氧基)磷腈]溶于1ml Na2CO3中，并加入1ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(pH7.2)。將1.4ml破傷風類毒素(2.2mg/ml或1000LF/ml，Connaught Laboratories，Inc.，Swiftwater，PA)與0.6ml含有0.025％Brij的溶液(10μl10％Brij 58，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)一起加到聚合物中。用摻有含有0.5％聚磷腈、0.05％聚磷腈或0.005％聚磷腈的dH2O稀釋液的單次劑量的25μg破傷風類毒素對5只一組的小鼠進行皮下免疫。另一組小鼠用單次皮下給藥劑量的在弗氏完全佐劑(SIGMA，St.Louis，MO)中的25μg破傷風類毒素進行免疫。從用CO2麻醉后的小鼠的眶后竇取血樣，用ELISA免疫測定法分析抗破傷風類毒素IgG。
正如表4所示，抗原聚合物溶液以劑量依賴性方式產生抗破傷風類毒素ELISA抗體。0.5％ PCPP使對破傷風類毒素的免疫應答比在水中對破傷風類毒素的免疫應答提高了100多倍。濃度為0.05％及0.005％的PCPP也比在水中的破傷風類毒素產生較高的抗體效價，盡管沒有用0.5％PCPP所得到的高。此外，0.5％PCPP濃度作為佐劑與弗氏完全佐劑一樣濃。
另一種含有各種劑量的在聚磷腈中的破傷風類毒素的致免疫組合物的制備如下。將100mg聚[二(羧基苯氧基)磷腈]溶于1mlNa2CO3中，并加入1ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(pH7.6)。然后，將破傷風類毒素(2.2mg/ml)(Connaught Laboratories，Swiftwater，PA)以1∶10的比例在水中稀釋，并將適當的體積與0.1％聚磷腈混合。
將3只一組的小鼠用單次劑量的每一致免疫組合物進行皮下免疫。接種21天后，從用CO2麻醉后的小鼠的眶后竇取出血樣，并用ELISA免疫測定法分析抗破傷風類毒素IgG(表5)。正如所期望的那樣，用可溶性PCPP在所有時間點均有明確的抗原劑量依賴性應答。配制到0.1％PCPP中的25μg破傷風類毒素劑量所引起的ELISA效價大大高于相同量的抗原在水中所引起的ELISA效價，并且高于25μg破傷風類毒素在弗氏完全佐劑中所引起的ELISA效價。應該注意的是，在PCPP中的5、1及0.2μg抗原劑量水平在第25周時ELISA效價仍在升高，而用弗氏完全佐劑的制劑的ELISA效價卻早就達到峰值。
實施例6用混有聚磷腈佐劑的流感病毒免疫后的抗體效價將含有流感病毒(流感)(Influenza Branch，Ceter for DiseaseControl，Atlanta，GA)和0.1％PCPP的致免疫組合物配制成制劑。流感是在蛋中按照標準方法生長的，并用蛋白質、血細胞凝集作用和蝕斑測定法定量。流感用加入最終稀釋度為1∶4000的38％甲醛溶液進行福爾馬林滅活。
采用下列流感免疫測定法測定流感效價將一個96孔ELISA微滴度板用10μg/ ml在碳酸鹽緩沖液(pH9.6)中的流感細胞溶解產物涂敷，每孔100ml，并于37℃下保溫2小時。該板用0.05％吐溫20/PBS(Sigma，St.Louis，MO)洗滌，并向每孔中加入100μl2.5％牛血清白蛋白/磷酸鹽緩沖鹽水(BSA/PBS)作為阻斷手段。然后將板于37℃保溫1小時，用0.05％吐溫20/PBS洗滌。向所有孔中加入50μl 1％BSA/PBS。通過將5μl血清加入到635μl 1％BSA/PBS中而將血清樣品稀釋成1∶128。將50μl待測的稀釋后的血清樣品加入一排孔的第一個孔中(1∶256稀釋度)。試驗陽性和陰性對照組。兩倍連續稀釋的血清樣品按下述方法制備從一排孔的第一個孔中取出50μl、并在攪拌下將該50μl加到第二孔中；然后從第二個孔中取出50μl并將其在攪拌下加入到第三個孔中，并對該排其余孔類似操作，從最后的孔或第12個孔中棄去50μl。然后，將該板在37℃保溫1小時，并用0.05％吐溫20/PBS洗滌。向每孔中加入100μl OPD溶液(鄰苯二胺二鹽酸鹽(Sigma，St.Lonis，MO)在含有0.05％過氧化氫(20.8μl 30％H2O2/12.5ml檸檬酸鹽緩沖液)的0.05M磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液(pH5.0)中的0.4mg/ml溶液(1片OPD/12.5ml檸檬酸鹽緩沖液)。顯色30分鐘，然后加入50μl 2MH2SO4/孔來停止。在OD490處讀出吸光度，終點效價通過查出每一血清樣品的稀釋度來測定，所述每一血清樣品的OD490大于或等于相同稀釋度的陰性對照組的OD490數值的兩倍。
流感血細胞凝集作用抑制抗體測定是用加熱失活的小鼠血清進行的，該小鼠血清已與10％小雞紅血細胞(Spafas)保溫30分鐘以除去非特異性抑制劑。向一96孔微滴度板中加入2倍稀釋的血清，向每孔中加入相同體積的8HA單位的病毒懸浮液，并在室溫下保溫30分鐘。向每一孔中加入0.5％小雞紅血細胞懸浮液，并在室溫下保溫45-60分鐘。HAI效價表示為完全抑制紅細胞的血細胞凝集作用的最高稀釋度的倒數。
流感抗原特異性中和抗體的誘導是通過蝕斑減少測定的。該測定法測量導致細胞培養物中流感感染性降低50％的抗體的量。將血清樣品在56℃加熱滅活30分鐘。血清的兩倍稀釋是在DMEM(JRHBiochemicals)中從1∶50開始進行的，并將0.5ml每個稀釋液加入到0.5ml效價為400pfu/ml的流感病毒中。在37℃保溫1小時后，使250μl各樣品吸收MDCK細胞的融合單分子層1小時。抽吸掉吸附混合物，并將細胞涂上含有10μg/ml胰蛋白酶的MEM/0.6％瓊脂糖混合物。3天后觀察到蝕斑。去除瓊脂糖管塞，單分子層用結晶紫(J.J.Baker)染色。計數蝕斑，50％效價降低通過與不含血清的對照感染中蝕斑數目的50％相比較來測定。
將小鼠用在0.1％PCPP中配制的各種流感劑量或5μg流感在水或弗氏完全佐劑中進行皮下接種。在如所期望的那樣，在接種用0.1％PCPP配制的流感抗原后，在所有時間點均存在劑量依賴性ELISA免疫應答(表6)。在該試驗中，在0.1％聚磷腈中的5μg流感誘發的抗流感應答遠高于在弗氏完全佐劑中的5μg流感誘發的抗流感應答。此外，在PCPP制劑中的所有抗原劑量引起的免疫應答在第25周時仍然在上升，而弗氏完全佐劑制劑在較早的時間點時就誘導峰值效價。這與在破傷風類毒素試驗中觀察到的結果相似。特別值得注意的是，在PCPP中的0.04μg劑量直至第2 5周才誘發可檢測的抗體水平。這可以認為是抗原緩釋的證據。
0.1％PCPP溶液誘導官能性抗體的能力是在血細胞凝集抑制(表7)和中和(表8)測定法中測定的。同樣，PCPP制劑在血細胞凝集測定法和中和測定法中誘導非常高的抗體活性，而在這些測定法中，弗氏完全佐劑制劑幾乎沒有或沒有可檢測的活性。
流感疫苗施用于人體時不加明礬，因為該佐劑對免疫應答具有非常小的正面作用。在小鼠潛能試驗中，誘發大于40個單位的HAI抗體效價的抗原劑量是對人體有保護作用的預示。因此，在0.1％PCPP中的0.04μg全部流感抗原能夠誘發保護水平的抗體，這是用5μg不加佐劑的抗原無法達到的。
還測定了在此應答中產生的抗體同型(表9)。盡管用PCPP配制的流感抗原主要誘發IgG1應答，但是也檢測到了顯著的IgG2a和IgG2b應答。該應答的水平大于對用弗氏完全佐劑配制的流感抗原所觀察到的應答的水平。在該試驗中沒有檢測到IgG3抗體。
實施例7用混有聚磷腈佐劑的H.流感b型多糖抗原免疫后的抗體效價前面所討論的所有抗原均為蛋白質抗原。下面我們將研究衍生自流感嗜血桿菌B型(Hib)的PRP多糖的致免疫性。多糖抗原一般不給出記憶性IgG應答，除非它們與蛋白質抗原軛合。軛合到破傷風類毒素上的Hib用明礬或0.1％PCPP進行配制(表10)。將小鼠皮下注射在明礬或PCPP制劑中的2μg PRP。抗體應答是通過測定在每一時間點的特異性抗PRP IgG水平來追蹤的。加入明礬佐劑的免疫原在第4周時間點處引發可檢測的抗體水平，在第8周時引發峰值效價。隨后在到20周的時間內，抗體效價迅速降低。用PCPP佐劑的Hib抗原在第4周時間點比用明礬佐劑時所觀察到的抗體水平高6倍。用PCPP佐劑的抗原也在第8周引發峰值效價，但是這些效價比用明礬佐劑時引發的效價大約高10倍。盡管用PCPP佐劑的抗體效價隨周數增加而降低，但是它們在第20周時的數直仍比用明礬佐劑在峰值第8周時間點時所達到的數值高2倍。
實施例8用混合有聚電解質的破防風類毒素抗原免疫后的抗體效價我們比較了PCPP的效果與用兩種其他聚電解質即聚甲基丙烯酸(PMA)和聚丙烯酸(PAA)所達到的效果。將小鼠注射1μg配制于0.1％聚合物溶液中的TT。在第3、6和9周測定抗TT ELISA效價。從表11中所匯編的數據可清楚地看出，0.1％PCPP所刺激的抗體應答比用任何分子量的PMA和PAA所觀察到的抗體應答都高。應該注意到的是，抗體應答有某種隨著PMA和PAA聚合物的分子量增加而上升的趨勢。然而，分子量為1.3×106道爾頓的0.1％PMA不能刺激等同于0.1％PCPP所刺激的免疫應答。
實施例9用混有各種分子量的聚磷腈的流感抗原免疫后的抗體效價在上面實施例中所描述的試驗中所用的PCPP溶液多分散成含有2,000至大約10,000,000道爾頓的分子。因此，檢驗PCPP分子量對佐劑性質的影響是有意義的。將PCPP通過順序酸沉淀法和FPLC柱色譜法進行分級，以便獲得具有較窄多分散性(1.37-2.01)和峰值平均分子量為3,000-1.8×106的PCPP級分。對這些級分的HPLC分析示于表12中。將0.1％濃度的每一上述級分與5μg福爾馬林滅活的流感病毒混合并皮下注射到小鼠中。還制備了相同體積的每一上述制劑的摻合物，使得最終PCPP濃度為0.1％，并且滅活的流感病毒的用量為5μg。對小鼠注射該PCPP重組制劑。作為對照，對另一組小鼠注射配制于0.1％未分級的PCPP中的流感。表13中所示數據證明，在增加的PCPP分子量與增加的對流感抗原的抗體應答之間存在正性相互關系。由分子量為1.8×106的0.1％PCPP所引發的應答與重組級分的PCPP制劑和未分級的PCPP所引發的應答基本上是不可區分的。
實施例10用混有各種濃度的三種不同的磷腈聚合物佐劑的破防風類毒素或流感免疫后的抗體效價將100mg聚[二(羧基苯氧基)磷腈](聚合物1)、聚[(羧基苯氧基)(羧甲氨基)磷腈](聚合物2)或聚[(羧基苯氧基)(氯)磷腈](聚合物3)溶于1ml Na2CO3中并將3ml PBS加入到聚合物溶液中。
抗體效價是在幾組雌性BALB/c小鼠中測定的，每組3只小鼠，7-8周齡，皮下注射過混有聚合物1或聚合物2的5μg流感。如表14所示，在聚合物1或聚合物2中的流感與在弗氏完全佐劑中的相同劑量的抗原所引發的血清IgG效價一樣高或更高。這些血清IgG效價在免疫后21周得到保持。
抗體效價是在幾組雌性BALB/c小鼠中測定的，每組3只小鼠，7-8周齡，皮下注射過混有聚合物1或聚合物3的1μg破傷風類毒素。如表15所示，在聚合物1或聚合物3中的破傷風類毒素誘發的血清IgG效價在免疫后25周得到保持。
表4施用混有各種濃度的聚磷腈佐劑或弗氏佐劑的破傷風類毒素后的ELISA抗體效價在以下各周的抗TT ELISA效價3 5 7 9TT/水 1024 2048 2048 4096TT /0.5％PCPP 65536 262144524288524288TT/0.05％PCPP 16384 32768 32768 65536TT/0.005％PCPP 4096 8192 32768 32768TT/CFA16384 131072262144262144小鼠用25μg破傷風類毒素(TT)免疫。
表5施用混有聚磷腈佐劑或弗氏佐劑的各種劑量的破傷風類毒素后的ELISA抗體效價在下列各周的抗TT ELISA效價3 6 9172525μgTT/0.1％PCPP 16384 65536 131072 ＞5242882621445μgTT/0.1％PCPP4096 16384 32768655361310721μgTT/0.1％PCPP2048 16384 1638432768 655360.2μgTT/0.1％PCPP 5121024 1024 2048 409625μgTT/水 20482048 8192 8192 1638425μgTT/cFA16384 131072 262144 131072131072
表6施用混有聚磷腈佐劑或弗氏佐劑的流感后的ELISA抗體效階在下列各周的抗-TT ELISA效價3 691725375μgflu/0.1％PCPP 20481638416384 32768 65536163841μgflu/0.1％PCPP 40961638416384 21768131072163840.2μgflu/0.1％PCPP ＜256 4096 4096 16384 65536 81920.05μgflu/0.1％PCPP ＜256＜256＜256 ＜256 4096 10245μgflu/水 256 256 256 ＜256 ＜256＜2565μgflu/CFA512 4096 4096 2048 1024 2048表7施用混有聚磷腈佐劑或弗氏佐劑的流感后的血細胞凝集作用抑制抗體效價在下列各周的HAI效價369 17 25 375μgflu/0.1％PCPP 160 1280 1280 2560 6401280lμgflu/0.1％PCPP 320 1280 1280 2560256012800.2μgflu/0.1％PCPP 40 640 640 2560128012800.05μgflu/0.1％PcPP 陰性 40 80 160 160 1605μgflu/水陰性 陰性 20 陰性陰性陰性5μgflu/CFA 陰性 80 40 40 40 40
表8施用混有聚磷腈佐劑或弗氏佐劑的流感后的蝕斑中和抗體效價在下列各周的HAI效價3 6 9 17 25 375μgflu/0.1％PPP 200 400 400200 400 16001μgflu/0.1％PPP 400 --- 200400 400 4000.2μgflu/0.1％PPP ＜100 --- 100100 400 4000.05μgflu/0.1％PPP ＜100 --- ＜100 ＜100 ---＜1005μgflu/水 ＜100 ＜100 ＜100 ＜100 ---＜1005μgflu/CFA ＜100 ＜100 ＜100 ＜100 ---＜100表9施用混有聚磷腈佐劑或弗氏佐劑的流感后的流感特異性抗體同型在下列各周的抗體同型3 6 9IgG1 IgG2A IgG2B IgG1 IgG2A IgG2B IgG1 IgG2A IgG2A5μgflu/0.1％PCPP8192 ＜256 ＜256 131072 ＜256 256 131072 256 10241μgflu/0.1％PCPP8192 ＜256 ＜256 65536 256 1024 65536 1024 40960.2μgflu/0.1％PCPP 256 ＜256 ＜256 16384 1024 2048 16384 1024 10245μgflu/水 ＜256 1024 ＜256256 1024 ＜256256 512 ＜2565μgflu/CFA 2048 ＜256 ＜256 16384 1024 512 16384 1024 256所有樣品的IgG3抗體效價均小于256。
表10施用混有聚磷腈佐劑或明礬佐劑的H.流感b型多糖后的ELISA抗體效價抗PRP IgG(μ g/ml)明礬聚磷腈wk 4 wk 8 wk 12 wk 16 wk 20 wk 4wk 8wk 12wk 16wk 205.48 10.00 5.97 5.45 3.8432.16 109.3150.8035.5118.60*10只小鼠的幾何平均效價免疫劑量＝2μg PRP/小鼠wk＝周表11施用混有聚電解質的破傷風類毒素后的ELISA抗體效價在下列各周的抗flu ELISA效價3 6 9TT/PBS 512 512256TT/CFA 40964096 4096TT/0.1％PCPP 16384 16384 65536TT/0.1％PMA MW 7.00010241024 1024TT/0.1％PMA MW 25,000512 512512TT/0.1％PMA MW 70,0005121024 1024TT/0.1％PMA MW 110,000 5121024 1024Tr/0.1％PMA MW 350,000 10241024512TT/0.1％PAA MW 2,0001024 512512TT/0.1％PAA MW 35,000512 512 1024TT/0.1％PAA MW 500,000 40964096 4096TT/0.1％PMA MW 1.300,00040964096 4096
表12在HPLC上測定的分級的聚磷腈的分子量和多分散性聚磷腈分級-HPLC峰值平均分子量 多分散性3,000 1.6225,500 1.3772,000 1.54331,000 1.64464,000 1.57634,000 1.561，846,000 2.01表13施用混有各種分子量的聚磷腈的流感后的ELISA抗體效價PBS ＜64PCPP MW 464 ＜64128 512＜64 256＜64 256＜64 512PCPPMW 3,000 ＜64 PCPP MW 634,6000512＜64 512＜641024＜641024＜641024CPP MW 25,500 256 PCPP MW10241,846,000＜641024＜6420481288192＜644096PCPP MW 72,000＜64 重組的PCPP級分 51＜641024
＜64 2048＜64 2048256128PCPP MW 331,000256未分級的PCPP 8192＜64 2048128 81822048 2048256 2048小鼠用每劑量5μg福爾馬林滅活的流感病毒免疫。所有PCPP溶液均以0.1％濃度施用。
表14施用混有聚[二(羧基苯氧基)磷腈](聚合物1)、聚[(羧基苯氧基)(羧甲氨基)磷腈](聚合物2)或弗氏佐劑的流感后的ELISA抗體效價在下列各周的抗flu ELISA效價3 5 7 9 13 17 21Flu/0.1％聚合物14096819265535 3276881923276832768Flu/0.1％聚合物210241024 409620481024 4096 4096Flu/弗氏完全佐劑 2561024163841024 512 4096 4096小鼠用5μg完全福爾馬林滅活的流感病毒粒子皮下免疫。
表15施用混有聚[二(羧基苯氧基)磷腈](聚合物1)或聚[(羧基苯氧基)(氯)磷腈](聚合物3)的破傷風類毒素后的ELISA抗體效價在下列各周的抗flu ELISA效價3 6 9 13 17 21 25TI/0.1％聚合物14096 20484096 4096 81921638416384TI/0.1％聚合物320485122048 1024 1024 2048 2048小鼠皮下免疫1μgTT。
從上述詳細描述可見，本發明的改良和變體、聚合物佐劑和合成方法及在疫苗組合物中的應用對本領域技術人員來說是顯而易見的。這些改良和變體應在所附權利要求書的范圍內。
權利要求
1.一種疫苗組合物，該組合物包含水溶性的聚磷腈聚電解質以及與之結合的抗原。
2.權利要求1所述的組合物，其中所述的聚磷腈聚電解質具有下式結構 其中A和B可以在聚合物中獨立地變化，并且可以為(i)在使用條件下易于水解的基團；或(ii)在使用條件下不易水解的基團，選自下列基團脂族基、芳基、芳烷基、烷芳基、羧酸、雜芳族基、雜烷基、(脂族基)氨基-、雜芳烷基、二(脂族基)氨基、芳基氨基-、二芳基氨基-、烷基芳基氨基-、-氧基芳基、-氧基苯基CO2H、-氧基苯基SO3H、-氧基苯基羥基、-氧基苯基PO3H、-氧基脂族基、-氧基烷基、-氧基(脂族基)CO2H、-氧基(脂族基)SO3H、-氧基(脂族基)PO3H、-氧基(脂族基)羥基、-氧基烷芳基、-氧基芳烷基、-硫基芳基、-硫基脂族基、-硫基烷芳基、-硫基芳烷基或-NHC(O)O-(芳基或脂族基)、-O-[(CH2)xO]y-(CH2)xNH2-O-[(CH2)xO]y(CH2)xNH(CH2)xSO3H和-O-[(CH2)xO]y-(芳基或脂族基)，其中x為1-8，y為1-20的整數；并且其中n為整數。
3.權利要求2所述的組合物，其中聚合物含有至少10％或10％以上在使用條件下不易水解的重復單元。
4.權利要求2所述的組合物，其中聚合物含有至少90％或90％以上在使用條件下不易水解的重復單元。
5.權利要求2所述的組合物，其中可水解的基團獨立地選自氯、氨基酸或氨基酸酯(通過氨基鍵合)、咪唑、甘油和葡糖基。
6.權利要求1所述的組合物，其中聚磷腈聚電解質是可生物降解的。
7.權利要求1所述的組合物，其中聚磷腈與抗原相混合。
8.權利要求8所述的組合物，其中聚磷腈聚電解質用多價陽離子交聯。
9.權利要求8所述的組合物，其中多價陽離子選自鈣、銅、鋁、鎂、鍶、鋇、錫、鋅、鐵、聚(氨基酸)、聚(乙烯亞胺)、聚(乙烯胺)、和多糖類。
10.權利要求1所述的組合物，其中抗原選自衍生自細胞、細菌或病毒粒子或其部分的化合物，其中化合物選自蛋白質、肽、多糖、糖蛋白、糖脂、核酸或其混合物。
11.權利要求10所述的組合物，其中抗原選自流感蛋白、人免疫缺陷病毒(HIV)蛋白、B型肝炎蛋白、細菌蛋白和細菌脂多糖。
12.權利要求1所述的組合物，其中聚磷腈聚電解質與抗原共價軛合。
13.權利要求2所述的組合物，其中聚磷腈聚電解質為具有選自羧酸、磺酸和羥基的酸性側鏈的磷腈。
14.權利要求10所述的組合物，其中聚磷腈聚電解質是可生物降解的。
15.用于口服給藥的權利要求1所述的組合物。
16.用于對與鼻有關的淋巴(樣)組織給藥的權利要求1所述的組合物。
17.用于對直腸給藥的權利要求1所述的組合物。
18.用于對給藥的權利要求1所述的組合物。
19.一種在動物中引起免疫應答的方法，該方法包括對動物施用一種抗原以及與之結合的水溶性聚磷腈聚電解質的步驟。
20.權利要求19所述的方法，其中抗原與聚磷腈聚電解質軛合。
21.權利要求19所述的方法，其中抗原和聚磷腈分別施用到鄰近的部位。
22.權利要求19所述的方法，其中首先使抗原與聚磷腈結合，并將結合物施用于動物。
23.權利要求19所述的方法，其中施用方法是胃腸外法。
24.權利要求19所述的方法，其中施用方法是口服法。
25.權利要求19的方法，其中聚磷腈電解質具有下式結構 其中A和B可以在聚合物中獨立地變化，并且可以為(i)在使用條件下易于水解的基團；或(ii)在使用條件下不易水解的基團，選自下列基團脂族基、芳基、芳烷基、烷芳基、羧酸、雜芳族基、雜烷基、(脂族基)氨基-、雜芳烷基、二(脂族基)氨基、芳基氨基-、二芳基氨基-、烷基芳基氨基-、-氧基芳基、-氧基苯基CO2H、-氧基苯基SO3H、-氧基苯基羥基、-氧基苯基PO3H、-氧基脂族基、-氧基烷基、-氧基(脂族基)CO2H、-氧基(脂族基)SO3H、-氧基(脂族基)PO3H、-氧基(脂族基)羥基、-氧基烷芳基、-氧基芳烷基、-硫基芳基、-硫基脂族基、-硫基烷芳基、-硫基芳烷基、-NHC(O)O-(芳基或脂族基)、-O-[(CH2)xO]y-CH2)-O-[(CH2)xO]y(CH2)xNH(CH2)xSO3H或-O-[(CH2)xO]y-(芳基或脂族基)，其中x為1-8，y為1-20的整數；并且其中n為整數。
26.權利要求25所述的方法，其中聚合物含有至少10％或10％以上在使用條件下不易水解的重復單元。
27.權利要求25所述的方法，其中聚合物含有至少90％或90％以上在使用條件下不易水解的重復單元。
28.權利要求19所述的方法，其中聚磷腈聚電解質是可生物降解的。
29.權利要求28所述的方法，其中聚磷腈聚電解質含有選自氨基酸、氨基酸酯、氯、咪唑、甘油和葡糖基的可水解側鏈。
30.權利要求19所述的方法，其中聚磷腈聚電解質被多價陽離子交聯。
31.權利要求19所述的方法，其中聚磷腈聚電解質與抗原物理混合。
32.權利要求19所述的方法，其中抗原選自衍生自細胞、細菌或病毒粒子或其部分的化合物，其中所述化合物選自蛋白質、肽、多糖、糖蛋白、糖脂、核酸或其混合物。
33.權利要求32所述的方法，其中抗原選自流感蛋白、人免疫缺陷病毒(HIV)蛋白、B型肝炎蛋白、細菌蛋白和細菌脂多糖。
34.用于口服給藥的權利要求19所述的方法。
35.用于對與鼻有關的淋巴(樣)組織給藥的權利要求19所述的方法。
36.用于對呼吸道給藥的權利要求19所述的方法。
37.用于對直腸給藥的權利要求19所述的方法。
全文摘要
本發明公開了一種免疫佐劑，即可溶性聚磷腈聚電解質。在一種實施方案中，所述聚合物佐劑是下述聚(有機磷腈)，它具有(i)電離的或可電離的側基，該側基含有例如羧酸、磺酸或羥基部分；和(ii)在使用條件下易于水解的側基以賦予聚合物以生物降解性。
文檔編號A61K39/39GK1128954SQ94193067
公開日1996年8月14日 申請日期1994年7月8日 優先權日1993年7月12日
發明者A·K·阿德里安諾夫, S·A·詹金斯, L·G·佩恩, B·E·羅伯斯 申請人:病毒研究院