預防中性粒細胞介導的結締組織損傷的方法

專利名稱：預防中性粒細胞介導的結締組織損傷的方法
技術領域：
本發明的二氨基—聯苯—二磺酸低聚物可抑制參與結締組織降解的酶。特別地，本發明的二氨基—聯苯—二磺酸低聚物可抑制彈性蛋白酶和組織蛋白酶G的活性。
彈性蛋白酶和組織蛋白酶G都是絲氨酸蛋白酶，它們是人中性粒細胞的主要粒子，中性粒細胞能降解許多結締組織大分子，包括彈性蛋白、纖維蛋白、膠原蛋白和蛋白多糖。因為很多中性粒細胞存在于發炎部位，所以中性粒細胞彈性蛋白酶和組織蛋白酶G與和許多疾病有關的組織損傷相聯系，這些疾病包括成年人呼吸窘迫綜合癥、囊纖維變性、急性支氣管炎、肺氣腫和關節炎。
一般地，血漿和粘液分泌物中的大量內源性蛋白酶抑制物足以抵抗由中性粒細胞蛋白水解酶介導的結締組織損傷。但是，當抑制物和蛋白酶之間的平衡受到干擾時就可以發生組織損傷。如果沒有控制結締組織蛋白酶，結果就會使下層結締組織惡化。這一結果源于結締組織損傷的大量初始原因，包括直接的機體傷害、老化和遺傳失調。例如，患有遺傳缺失的病人(內源性抑制物—α—1—抗胰蛋白酶的水平降低)在早年極易得肺氣腫，因此進一步支持了結締組織疾病的酶失調理論。
本發明的一個目的是使用二氨基—聯苯—二磺酸低聚物作為彈性蛋白酶和組織蛋白酶G的抑制劑。這些抑制劑因此可以控制與這些組織降解有關的疾病。
本發明的二氨基—聯苯—二磺酸低聚物在1992年1月22日公開的歐洲專利申請0467185 A2中有詳細描述，其被描述為可用于診斷和/或治療AIDS和AIDS相關的綜合癥。
作用于中性粒細胞蛋白水解酶的治療性焦點集中于彈性蛋白酶。在患有成年呼吸窘迫綜合癥(ARDS)患者的支氣管粘液中發現了游離的粒細胞彈性蛋白酶(McGuire，等人，J.Clin.Invest.，69543—553，1982；Lee.等人，N.Engl.J.med.304192—196，1981)，同時也在及患有囊纖維變性患者的痰中發現了它(Suter，etal，J.Inf.Dis.153902—909，1986；Goldstein & Donring，Am.Rev.Respir.Dis.13449—56，1986)。向倉鼠的肺中滴注彈性蛋白酶可誘導急性損傷(其通過出血測量)(Bonney，等人，J.CellularBiochem.3947—53，1989；Fletcher，等人，Am Rev.Respir.Dis，141672—677，1990；Hassall，等人，FEBS Lett，1983201—205，1985)和類似見于肺氣腫中的長期改變(Stone，等人，Am.Rev.Respir.Dis 14147—52，1990)。疾病狀態中的組織蛋白酶G的作用是未知的。但是，彈性蛋白酶和組織蛋白酶G以大約相同的數量存在于中性粒細胞中，并且在某些病理狀態下已檢測出游離的組織蛋白酶G連同彈性蛋白酶。彈性蛋白酶和組織蛋白酶G都顯示出刺激牛粘膜下層漿細胞的分泌，其表明這些酶可使與吸煙、慢性支氣管炎和囊纖維變性有關的肺疾患中的粘膜下層腺體分泌過量(Sommerhoff，等人，J.Clin.Invest.85682—689，1990)。近來，已表明組織蛋白酶G可誘導血小板凝集、鈣回流及5—羥色胺從血小板的釋放(Ren-esto等人，Lab.Invest.62409—416 1990)，并且其與由具有腫瘤壞死因子的中性粒細胞刺激的血小板激活有關(Renesto等人，J.Im-munol.1462305—2309 1991)。此外，組織蛋白酶G也顯示出可激活漿膜或U—937細胞上的補體因子C3(Maison等人，J.Immunol.147921—926 1991)。
先前，將通過受激中性粒細胞或中性粒細胞蛋白酶的軟骨間質蛋白多糖的降解用作結締組織降解的模型。利用彈性蛋白酶的特殊合成抑制物或單獨使用組織蛋白酶G以及其的聯合使用，發現結締組織間質的降解(由游離的中性粒細胞蛋白酶介導或在中性粒細胞和底物之間的血清抗蛋白酶保護的細胞周區域發生斷裂)只是在通過同時抑制彈性蛋白酶和組織蛋白酶G時才被阻滯(Janusz，等人，J.Immunol.1463922—2928 1991)。近來，已發現幾種聚陰離子多糖可抑制彈性蛋白酶和阻滯蛋白酶G(Baici，等人，Biochem.Phar-macol.291723—1727 1980和Redini，等人，Biochem.J.252515—519 1988)。發現這些陰離子聚合物對抗陽離子彈性蛋白酶和組織蛋白酶G的抑制能力隨著聚合物大小和硫酸鹽化作用的程度而增加。
本發明公開了一種通過給予下列通式的化合物及其藥用鹽(本文也稱作“化合物”)而抑制彈性蛋白酶和組織蛋白酶H活性的方 其中，n是選自5至10的整數。所述化合物一個優選的實例是n等于6的化合物。
本發明的目的之一是使用本發明的化合物或者其藥用鹽來治療成年人呼吸窘迫綜合癥(ARDS)、慢性支氣管炎、囊纖維變性、肺氣腫等肺病，以及治療關節組織炎癥例如關節炎。這些疾病都伴有結締組織的降解。
本發明的有益之處在于所述化合物抑制彈性蛋白酶和組織蛋白酶G，已知二者積極參與或者存在于ARDS、囊纖維變性、急性支氣管炎、肺氣腫和關節炎的發展中。特別地，上述化合物已顯示出直接地抑制人彈性蛋白酶和組織蛋白酶G。由于這些化合物能抑制人的彈性蛋白酶和組織蛋白酶G，因此其可用于干涉和治療。
本發明的另一目的是治療關節炎。這些化合物可保護軟骨間質蛋白多糖(CMP)以防包括彈性蛋白酶和組織蛋白酶G的破壞過程的能力顯示出其優越性。因此，通過這些化合物來保護結締組織CMP提供了一種干涉和治療關節炎的方法。
本發明的化合物也可用于防止急性肺損傷或者防止由彈性蛋白酶和組織蛋白酶G引起的肺組織的進一步損傷。本發明化合物可防止由于中性粒細胞彈性蛋白酶的結締組織損傷，因此，可用于治療ARDS、囊纖維變性、急性支氣管炎和肺氣腫。
本發明表明，低分子量的硫酸化聚合物可阻斷彈性蛋白酶和阻滯蛋白酶G對合成肽底物的作用及對大分子結締組織分子的作用。本發明范圍內的一個實例化合物在體內試驗時可抑制彈性蛋白酶誘導的肺出血。這些結果表明，陰離子聚合物在治療中性粒細胞介導的結締組織損傷中是有效的。材料和方法利用特異性底物—N—甲氧基琥珀酰—丙氨酸—丙氨酸—脯氨酸—結氨酸—對硝基—analide檢測彈性蛋白酶的活性，利用N—琥珀酰—丙氨酸—脯氨酸—苯丙氨酸—對硝基analide檢測組織蛋白酶G的活性。測試緩沖液0.5M NaCl和0.1％Brij—35的0.1MHEPES用于將彈性蛋白酶底物稀釋至0.2mM，并且將組織蛋白酶G底物稀釋至1mM。將適當底物的2ml測試緩沖液在一個加熱的分光光度計池中于37℃孵育，加入酶開始反應。在檢測抑制劑的實驗中，抑制劑在加入底物前與酶一起孵育5分鐘。用二極管分光光度計在410nm連續監測酶的斷裂。利用分光光度計的動力學軟件確定動力學常數。
通過紅細胞的葡聚糖沉降將人白細胞從檸檬酸化的血中分離，在pH7.4的不含酚紅、鈣和鎂的Hank′s平衡鹽溶液(HBSS)中洗出血漿和血小板，并通過梯度離心純化。收集中性粒細胞，在HBSS中洗滌一次，用蒸餾水孵育30秒鐘以溶解污染的紅細胞，在HBSS中洗滌兩次，于含有10％加熱滅活的小牛血清(FCS)、谷酰胺(2mM)、HEPES(20mM)和慶大霉素(50μM)的非血清介質中再懸浮并在Couler計數器上計數。用Diff—Quik對比著色表明，多于95％的中性粒細胞具有1—5％嗜曙紅細胞。通過錐蟲藍斥法估計大于98％的有活力。
通過在4ml的0.34N蔗糖中再懸浮2.5×108并用微頭探針進行聲處理30秒而制備中性粒細胞顆粒溶胞產物。顯微觀察表明，中性粒細胞幾首徹底破裂并釋放出顆粒。將中性粒細胞溶胞產物在4℃于1000xg離心10分鐘，收集上清液并在4℃于30,000xg離心30分鐘，將含有中性粒細胞顆粒的小丸在PH為5.5、含有1M NaCL和0.1％Brij—35的醋酸鈉緩沖液中再懸浮，冷凍30分鐘同時在孵育過程中進行幾次約30秒鐘的簡單聲處理。顯微觀察表明了顆粒的破裂。顆粒溶胞產物在4℃于30,000xg離心30分鐘，收集上清液，用如上合成的底物檢測彈性蛋白酶和組織蛋白酶G的含量，等分試樣并在70℃貯存待用。放射性標記牛軟骨的制備從本地屠宰場獲取新鮮的牛鼻中隔，用2號軟木鉆孔機制備4mm的軟骨圓柱體。將圓柱體切成1mm的片。棄去上面和下面的片，混合剩余的軟骨片，在HBSS中洗滌3次，與抗生素和補體在Dulbecco′s Modified Eagles Medium(DMEM)中再懸浮。通過加入10μCi/ml的Na235SO4將組成軟骨蛋白多糖葡糖胺聚糖(glycosaminoglycan)側鏈的硫酸化糖進行放射性標記，然后在緩緩搖動下于37℃孵育過夜。除去放射活性的介質，用HBSS將小片洗滌10次以除去未結合的標記物。將放射性標記的軟骨片冷凍—融化5次，于65℃加熱15分鐘以殺死軟骨細胞并滅活內源性酶。這一處理方法消去了軟骨的自溶，但并不顯著改變蛋白多糖對外源蛋白酶的敏感性。在這些研究中所有的大部分小片含有5.0×104至2.0×105dpm的未結合35S。結締組織間質的中性粒細胞蛋白酶的降解通過用中性粒細胞溶胞產物、非血清介質中純化的彈性蛋白酶或組織蛋白酶G于37℃孵育35S—放射性標記的軟骨小片4小時，收集上清液并計數上清液和小片中放射性標記物而測量中性粒細胞蛋白酶降解結締組織間質的能力。將小片在6MHCl中于100℃徹底消化1小時，真空蒸發除去HCl并在0.5ml HBSS中再懸浮干燥物來測定除去上清液后殘留在軟骨片中的放射活性。上清液和加工后的小片在Beckman LS 2801內爍計數器上計數。數據以35S標記物釋放人上清液的百分數表示。利用人中性粒細胞的結締組織降解將放射性標記的軟骨片置于96孔微滴度盤的孔中，并用懸浮于含有10％FCS的DMEM的人中性粒細胞覆蓋。加入1mg/ml的調理酵母多糖刺激中性粒細胞，用5％的CO2于37℃孵育4小時。用所釋放的放射性標記物的量計算結締組織間質降解。在使用蛋白酶抑制劑的實驗中，于中性粒細胞后立即加入抑制劑。用蛋白酶抑制劑孵育的中性粒細胞的活力通過測試上清液的乳酸脫氫酶(LDH)及中性粒細胞排斥的錐蟲藍來確定。此外，蛋白酶抑制劑對主要顆粒酶分泌的效應通過測量髓過氧化物酶的釋放而監測。彈性蛋白酶誘導的肺出血雄性Sprague Dawley大鼠用水合氯醛(300mg/kg)麻醉。將鹽水或人中性粒細胞彈性蛋白酶氣管內給藥。簡而言之，將大鼠置于外科手術板上，腹部朝上，將一膠帶置于其門牙上以使嘴張開。把舌頭拉向一邊，在亮光源及3寸、22規鈍頭針的協助下將100微升的彈性蛋白酶溶液(1mg/ml)經氣管給藥。給予彈性蛋白酶后1小時，用CO2處死大鼠，手術暴露氣管并進行氣管插管。用10ml鹽水洗肺，利用氰化正鐵血紅蛋白測定法確定血紅蛋白的含量。在測試抑制劑的實驗中，給予彈性蛋白酶前以不同的倍數將化合物的100μl鹽水于氣管內給藥。結果通過硫酸化聚合物抑制合成底物彈性蛋白酶和組織蛋白酶G的斷裂測定幾種硫酸化聚合物抑制相應底物的彈性蛋白酶和組織蛋白酶G降解的能力。MDL—101，028(一種本發明范圍內的化合物，其中n為6)和4，4’—二異硫氰酸根合氐—2，2’—二磺酸(體內等同于MDL—101，114(DIDS)以一種依賴劑量的方式同時抑制彈性蛋白酶和組織蛋白酶G。抑制2μg彈性蛋白酶的IC50為MDL—101，028(*—*)40nM，DIDS(□—□)1100nM(

圖1)。抑制2微克組織蛋白酶G需要稍微高的化合物濃度，MDL—101，028(*—*)和DIDS(□—□的IC50分別為80nM和1400nM(圖2)。硫酸化聚合物對軟骨間質蛋白多糖的彈性蛋白酶和組織蛋白酶G降解的效應將軟骨間質蛋白多糖(CPG)用作大分子結締組織底物降解的模型體系。純化的人中性粒細胞彈性蛋白酶和組織蛋白酶G都以一種依賴劑量和時間的方式降解CPG。MDL—101，028以一種依賴劑量的方式同時抑制彈性蛋白酶(圖3)和組織蛋白酶G(圖4)介導的CPG降解，IC50分別為約8和9μM。MDL—101，114也抑制彈性蛋白酶(圖3)和組織蛋白酶G(圖4)介導的軟骨降解，IC50’S分別為約38和50μM。硫酸化聚合物對人中性粒細胞溶胞產物介導的CPG降解的效應非血清介質中以1∶100稀釋的人中性粒細胞溶胞產物在37℃孵育4小時后以34％＋2％(平均+S.E.M.，n＝3)降解CPG(圖5)。MDL—101，028分別在4，10和25微摩爾的濃度以54％，70％及79％抑制CPG的降解(圖5)。硫酸化聚合物對人中性粒細胞介導的CPG降解的效應將含有10％FCS介導中的人中性粒細胞置于微滴度盤孔中的軟骨小片上，用1mg/ml的調理酵母多糖刺激，在存在及不存在硫酸化聚合物下于37℃孵育4小時。存在血清抗蛋白酶的受激中性粒細胞以23％加或減2％(+S.E.M.，n＝4)降解CPG(圖6)。用MDL—101，028孵育的受激人中性粒細胞分別在4，10和25微摩爾的濃度以31％，47％及73％抑制CPG的降解。
用MDL—101，028處理的中性粒細胞的活力未消失，其通過錐蟲藍排斥和乳酸脫氫酶的釋放來估算。在介質中用酵母多糖刺激4小時的中性粒細胞(排除錐蟲藍)的百分率為85％，而用MDL—101，028分別在4，10和25微摩爾劑量孵育的中性粒細胞為77％—87％。其與LDH的釋放有關，用介質處理的受激中性粒細胞為7—11％。通過阻斷酶從中性粒細胞釋放(如髓過氧化物酶的釋放)而不抑制CPG降解的MDL—101，028不被抑制。MDL—101，028抑制彈性蛋白酶誘導的大鼠肺出血氣管內滴注人白細胞彈性蛋白酶產生可由出血估計的急性肺損傷(圖7)。通過測量肺灌洗液的血紅蛋白的活力確定出血量。向大鼠氣管內滴注100μg中性粒細胞彈性蛋白酶得到含有1.7＋.3(平均+SEM，n＝12)mg/ml血紅蛋白的鮮紅出血性肺灌洗液(圖7)。當在彈性蛋白酶之前立即(30秒內)以280μg，700μg或2800μg的劑量將MDL—101，028氣管內給藥可分別以48％，90％和90％抑制肺出血(圖7)。
滴注彈性蛋白酶之前，在不同的時間間隔將MDL—101，028給予大鼠以確定作用的持久性。氣管內給予大鼠彈性蛋白酶可得到含有1.5＋.2(平均+S.E.M.，n＝20)mg/ml血紅蛋白的出血性肺灌洗液(圖8)。在彈性蛋白酶之前1，2或4小時將MDL—101，028給藥可分別要61％，63％和20％抑制肺出血(圖8)。因此，通過氣管內給藥途徑的用作持續時間大于2小時而小于4小時。
本發明化合物可通過不同的途徑給藥。該化合物可以口服或非胃腸道(即，皮下、靜脈內、肌內、腹膜內或氣管內)給藥。特別地，本發明提供了一種治療患有肺病包括成年人呼吸窘迫綜合癥(ARDS)、慢性支氣管炎、囊纖維變性、肺氣腫以及關節組織炎癥例如關節炎的方法，其中這些疾病可通過將有效抑制量的本發明化合物在需要時對患者給藥而治療。
本發明化合物的治療有效抑制量是指能有效地控制與成年人呼吸窘迫綜合癥、囊纖維變性、急性支氣管炎、肺氣腫和關節炎相關的結締組織降解的量。術語“控制”意指可以減緩、干擾、抑制或阻止疾病發展的所有方法，并且未必為將所有的疾病癥候全部消除。
作為本領域的技術人員，診斷醫師可以通過使用常規的技術并且觀察在類似環境下所得的結果來確定在此所述的用于治療的化合物的治療有效抑制量。當確定治療有效量時，診斷醫師應考慮許多因素，包括(但并不限于此)哺乳動物的種類；其的大小、年齡及通常的健康狀況；特殊的疾病；疾病的嚴重或相關程度；患者的反應；給予的特殊化合物；給藥方式；所給制劑的生物利用度特性；所選擇的劑量方案；同時使用的藥物及其它相關的情況。
通式(1)化合物的治療有效量可以從每天約0.1毫克每公斤體重(mg/kg/天)到約100mg/kg/天不等。優選的劑量可通過本領域的技術人員確定。本領域制備藥劑的技術人員可根據由待治療疾病的狀態、疾病的階段和其它相關情況而選擇的化合物的特殊性質來選定正確的給藥方式和方法(Remington′s Pharmaceutical Science，18thEdition，Mack Publishing Co.(1990))。
可用本領域內已知技術生產藥物組合物。典型來說，該化合物的保護是與可藥用載體混合。
對于口服給藥而言，可將化合物制成固體或液體的制劑，例如膠囊、丸、片劑、錠劑、熔化物、粉劑、懸浮劑或乳劑。固體單位劑量形式可以為常用的明膠類型的膠囊，其含有例如表面活性劑、潤滑劑和惰性填料如乳糖、蔗糖和玉米淀粉或者其可以是緩釋制劑。
另一實例中，本發明的化合物可以用常規的片劑基質例如乳糖、蔗糖和玉米淀粉與粘合劑例如阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠，崩解劑如馬鈴薯淀粉和海藻酸，潤滑劑如硬脂酸或硬脂酸鎂一起制成片劑。通過將活性成分溶于含水或非水藥用溶劑中(其也可含有本領域已知的懸浮劑、甜味劑、矯味劑、防腐劑)而制備液體制劑。
對非胃腸道給藥的制劑而言，可將化合物溶于生理上可接受的藥用載體中，以溶液或懸浮液給藥。適當的藥用載體的例子有水、鹽水、葡萄糖溶液、果糖溶液、乙醇，或者動物油、植物油或合成油。藥用載體也可含有本領域已知的防腐劑、緩沖劑等等。
本發明化合物也可局部給藥。這可以通過簡單制備待給化合物的溶液而實現，優選使用一種已知能促進透皮吸收的溶劑例如乙醇或二甲基亞砜(DMSO)連同或不含其它賦形劑。優選的局部給藥可以使用一種藥物儲庫和多孔膜類型的膏藥或者固態基質類型的膏藥來實現。
在此所用的術語“患者”意指溫血動物例如遭受特殊炎癥的哺乳動物。可以理解豚鼠、狗、貓、大鼠、小鼠、馬、牛、羊和人為該術語范圍內的動物實例。
權利要求
1.一種通過給予患者治療有效量的下列通式的化合物及其藥用鹽而控制結締組織降解的方法 其中，n是5至10的整數。
2.權利要求1的控制結締組織降解的方法，其中所述化合物的n是6。
3.權利要求1—2的任一方法，其控制發生于成年人呼吸窘迫綜合癥中的結締組織降解。
4.權利要求1—2的任一方法，其控制發生于囊纖維變性中的結締組織降解。
5.權利要求1—2的任一方法，其控制發生于急性支氣管炎中的結締組織降解。
6.權利要求1—2的任一方法，其控制發生于肺氣腫中的結締組織降解。
7.權利要求1—2的任一方法，其控制發生于關節炎中的結締組織降解。
8.權利要求1—2的任一方法，其通過抑制中性粒細胞誘導的損傷而控制結締組織的損傷。
9.權利要求1—2的任一方法，其通過抑制彈性蛋白酶誘導的損傷而控制結締組織的損傷。
10.權利要求1—2的任一方法，其通過抑制組織蛋白酶G誘導的損傷而控制結締組織的損傷。
11.權利要求1—2的任一方法，其使用所述化合物和藥用載體而控制結締組織降解。
全文摘要
通式(I)的低聚物表明可有效地防止結締組織損傷。
文檔編號A61P43/00GK1128952SQ94193029
公開日1996年8月14日 申請日期1994年7月11日 優先權日1993年8月12日
發明者M·J·賈納斯 申請人:默里爾藥物公司