鉀離子通道阻滯化合物及其用途的制作方法

專利名稱：鉀離子通道阻滯化合物及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及瞬時外向鉀離子通道和其它鉀離子通道的抑制劑。
背景技術：
以下是對相關技術的描述，其中無論哪個都不會認為是權利要求的現有技術。
鉀離子(K+)通道是跨膜蛋白，它能隨著膜電位的變化，或者隨著陽離子和/或配位體的激活而選擇性地把K+移入或移出細胞。K+通道的主要作用是保持靜息膜電位另一個作用是使敏感細胞中動作電位復極。鉀離子通道代表了不同類型的離子通道蛋白，并且現在已經闡明幾種毒素主要是通過阻滯一種或多種特殊K+通道來起作用(如果不只是唯一的作用)(Rudy，＂Diversity and Ubiquityof K Channels＂，25Neuroscience 729，1988)。心臟細胞是以K+通道不同亞型的顯著多樣性為特征的。在一次動作電位過程中因膜的除極而能夠打開好幾種類型的K+通道，這些不同通道運載的離子流(currents)總和會引起膜的復極而達到靜息電位。一旦膜除極，這些類型通道之一的瞬時外向K+通道能夠產生快速(在1-10毫秒)啟動的一股離子流(I10)，然后迅速(10-200毫秒)衰退(失活)。I10對心臟動作電位的最初復極起著最顯著的作用，并且能被幾種非特異性藥用化合物如氨基吡啶類化合物和tedisamil，一種三類抗心律失常劑所阻滯(Dukes等，“Tedisamil Blocksthe Transient and Delayed Rectifier K+Currents inMammal ian Cardiac and Glial Cells”254J.Pharmacd.Exp.Ther.560，1990)。阻滯I10導致心臟動作電位的延長。已從人心臟細胞中記錄下了I10，如Escande等在“ Two Types ofTransient Outward Currents inAdult Human Atrial Cells”，252Am.J.Physiol H142，1987中所述。據說延長心臟動作電位(并且因此無刺激反應)是抑制再活動性心房和心室心律失常的一種機理(Lynch等，“Therapeutic Potential of ModulatingPotassium Currents in the Diseased Myocardium”6FASEB J.2952，1992)。目前可得到的第III類抗心律失常劑，其中多數能夠通過阻滯稱作延緩型校正K+通道的一種單獨的K+通道亞型起作用，它可以引起心臟動作電位的過度延長，這樣會導致心室心律失常的出現，稱作torsades de pointes(Sanguinetti，“Modulation of Potassium Channels by Antiarrhythmicand Antihypertensive Drugs”，19 Hypertension 228，1992)。
電壓依賴性K+通道的打開也是中樞神經元非常短的動作電位特征過程中出現細胞膜復極的機理。在這種過程中，瞬時外向K+通道離子流(在神經元中稱作IA)起著重要作用。樹突毒素(dendrotoxin)，一種源于蛇類的毒素，選擇性阻滯神經節神經元中遲緩型非失活K+離子流(Penner等，“DendrotoxinASelective Blocker of a Non-inactivating PotassiumCurrent in Guinea-Pig Porsal Root Ganglion Neurones，407 Pfluqers Arch.365，1986)，并且在海馬狀突起的切片中也能阻滯瞬時外向K+離子流(IA)(Halliwell等，“CentralAction of DendrotoxinSelective Reduction of aTransient K Conductance in Hippocampus and Binding toLocalized Acceptors”，83Proc.Natl.Acad.sci.USA493，1986)。由樹突毒素所引起的神經元中動作電位時間的延長會導致神經遞質釋放的增加(Harvey and Anderson，“DendrotoxinsSnake Toxins That Block Potassium Channels andFacilitate Neurotransmitter Release”，31 Pharmac.Ther.33，1985)。有人已經提出在這個領域中的進一步研究可證實這將成為治療認識性疾病如阿爾茨海默氏癥的一種藥理途徑(Lavretskyand Jarvik，“A Group of Potassium-Channel Blockers-Acetylcholine ReleasersNev Potentials for AlzheimerDisease？A Review”，12J.Clinical Psychopharm.110，1992)。發明概述本發明一般涉及瞬時外向鉀離子通道(例如，在心臟細胞和神經元中分別稱作I10或IA的離子流)的新的特異性和有效的抑制劑或阻滯劑。本發明也涉及到從蜘蛛毒液中分離出的新多肽或其等同物，它們對一種或多種鉀離子通道如瞬時外向鉀離子通道有活性。
具體來說，提供了從蜘蛛疾行異足蛛和Olios fasciculatus的毒液中分離出的多肽毒素新活性的例子。這些肽(這里將其簡稱為化合物1、2和3)是電壓依賴性瞬時外向K+通道的特異性有效的阻滯劑，它們阻滯心臟細胞的相應整細胞離子流(I10)。這些藥劑本身，其片段或用一種配位體結合測定法(或其等同方法)應用這些毒素或其等同物發現的化合物，或其等同物，可用于治療心律不齊，并且可用于治療學習和記憶的障礙(如阿爾茨海默氏病)、帕金森氏癥、多發性硬化癥、精神分裂癥、癲癇、中風和肌肉痙攣癥。
一般來說，從蜘蛛疾行異足蛛和Olios fascicul atus的毒液中能夠分離到本文所述和要求保護類型的有用的K+通道阻滯性多肽。也能分離到其它阻滯鉀離子通道的具有相似或同源氨基酸(或其它化合物或單體)序列的多肽(或其等同物)。申請人相信本發明首次測出了源于蜘蛛毒液的毒素中這種K+通道阻滯活性的存在，由此表明對蜘蛛毒液中其它這類多肽的篩選是有用的和可生產的。本發明還涉及使用這些多肽來篩選作為活性劑可作用于共同位點(即，瞬時外向鉀離子通道)的其他藥劑的方法。
本申請人相信能選擇性地阻滯中樞神經元中IA通道并引起神經遞質釋放增加的化學藥劑可用于治療阿爾茨海默氏病和其它神經疾病，相似地，本申請人也相信能選擇性阻滯心臟細胞中I10通道的藥劑可用于治療心律失常。因此，能夠把這些多肽和相關的化合物或藥劑用于治療心律失常，阿爾茨海默氏病，帕金森氏病，多發性硬化病，精神分裂癥，癲癇，中風和肌肉痙攣癥。
所以，本發明第一方面闡述特異性有效的瞬時外向鉀離子通道抑制劑、阻滯劑或拮抗劑。
術語“瞬時外向鉀離子通道”是一個熟知的術語，該術語定義為不同種類細胞中特定亞型的鉀離子通道，如，在心臟細胞和神經細胞中分別以上述注明的離子流I10和IA為特征的K+通道。
術語“抑制劑”是用來指減少由瞬時外向鉀離子通道所產生的離子流的藥劑。在本領域中，術語如“阻滯劑”和“拮抗劑”是與術語“抑制劑”互換使用的。
“特異性”是指對瞬時外向鉀離子通道阻滯的半數最大值(IC50)為100nM或低于100nM，并且在至少高于瞬時外向K+通道IC50值10倍的濃度時對其它K+通道(如遲緩型校正K+通道，內向校正K+通道，乙酰膽堿激活的或ATP抑制的K+通道)，Na+或Ca2+通道均沒有作用。
“有效”是指在抑制劑的濃度小于100nM，優選小于10nM和更優選小于1nM時能夠抑制指定瞬時外向K+通道的50％。
在優選的實施方案中，這些藥劑是多肽或源于蜘蛛毒液中的多肽。盡管本文提供了這種多肽的具體實例，但在本發明中這些實例不是限定性的，并且本領域普通技術人員應當意識到在各種蜘蛛毒液中能夠容易鑒定出其它多肽，包括卻不限于本文所述的多肽。此外，本領域普通技術人員應當意識到用標準方法能夠合成等同的多肽。用常規的篩選方法能夠很容易地鑒定出這些肽阻滯、抑制或拮抗選定的瞬時外向鉀離子通道的特定活性部位。例如，能夠合成或用各種肽酶從完整的多肽中生成特定肽片段，并目如下文所述在測定方法中測得這些片段具有抑制活性。在本發明中作為抑制劑具有活性的這些片段可用于各種篩選試驗和治療應用中。
此外，能夠很容易地合成這種多肽的類似物或突變蛋白。這些合成包括對氨基酸序列中不影響原始多肽抑制或阻滯活性的區域進行修飾。在該抑制劑的許多保守區域中，可以取代氨基酸而不顯著改變該抑制劑的活性，例如，使用較小的氨基酸如甘氨酸取代其它較小的氨基酸如纈氨酸，或者用帶正電或負電荷的氨基酸取代相似電荷的氨基酸。
術語“衍生”簡單地表示能夠根據蜘蛛毒液中所鑒定的多肽通式結構合成化合物。用本領域所熟知的方法能進行這種衍生，上文一般性地提供了這種特定例子。術語“衍生”優選包括如上所述的類似物，突變蛋白和片段，它們具有如上文所述的多肽毒素的所需調節活性。
用蜘蛛疾行異足蛛和Olios fasciculatus的毒液中發現的多肽舉例說明上述發明，按照本發明的三種特定多肽以及含有該多肽的級份包括疾行異足蛛肽化合物1(SEQ.ID.NO.1)，疾行異足蛛肽化合物2(SEQ.ID.NO.2)，和Ol ios fasciculatus肽化合物3(SEQ.ID.NO.3)。在一個實例中，本發明的多肽阻滯心臟和神經細胞中的瞬時外、向K+通道。本發明包括具有與疾行異足蛛肽化合物1和化合物2以及Olios fascicul atus肽化合物3的多肽基本上相同的氨基酸序列和基本上相同的K+離子流阻滯活性的多肽。
本發明第二方面闡述一種篩選瞬時外向鉀離子通道活性劑的方法，它包括把一種瞬時外向鉀離子通道與一種已知特異性瞬時外向鉀離子通道抑制劑(如上述那些)和一種可能的瞬時外向鉀離子通道活化劑相接觸，然后測定可能的活化劑對已知抑制劑的結合的抑制作用。結合抑制作用表明是一種有用的瞬時外向鉀離子通道活化劑。能夠很容易地篩選出這類活化劑并測定其特異性。
“活性劑”是指增加(如果它作為一種激動劑)或者減少(如果它作為一種抑制劑)通過瞬時外向鉀離子通道離子流的一種化合物。
本發明相關的一方面闡述一種從蜘蛛毒液中篩選一種有用的K+通道活化劑的方法，作為本文所述方法的舉例說明。篩選該毒液來測定含有所需活性的級份。
“K+通道活性劑”是指增加或者抑制任何一種其它類型的K+通道(如遲緩型校正K+通道，內向校正K+通道Ca2+—激活或ATP—敏感型的K+通道)的化合物。
在優選的實施方案中，該篩選方法包括使用心臟或神經組織的瞬時外向鉀離子通道。
本發明范圍還包括一種鑒別能與瞬時外向鉀離子通道結合的化合物的方法，所述化合物優選在與疾行異足蛛肽化合物1和化合物2，以及Olios fasciculatus肽化合物3結合的相同位點上結合。
本發明第三方面闡述一種治療疾病或癥狀的方法，其中通過給生物體使用一種治療有效量的一種特異性瞬時外向鉀離子通道抑制劑或者一種源于蜘蛛毒液中的多肽(或其等同物)，調節瞬時外向鉀離子通道的活性，來達到治療有用的結果。被治療的特殊疾病包括(但不限定)上述所列的那些。
“調節”是指降低瞬時K+通道的活性。例如，通過阻滯該通道的細孔，或者通過改變通道閘門的電壓依賴性。
治療包括的步驟是，首先用常規的臨床方法診斷患有疾病或癥狀的患者(人或非人類)，然后給這類患者提供一種治療有效的本發明組合物。
“治療有效”是指能夠使患者的所述疾病或狀態的一種或多種癥狀緩解(到某種程度)的一種用量。此外，“治療有效”還指能夠使與該疾病或狀態有關的或是該疾病或狀態病因的生理或生化參數部分或者全部地恢復到正常的一種用量。通常該用量在大約1nmol/kg和1μmol/kg分子之間，這取決于它的EC50和患者的年齡，體重和疾病。
本發明另外一方面闡述一種藥用組合物，它包括一種特異性瞬時外向鉀離子通道抑制劑或蜘蛛毒液多肽(或其等同物)。
本發明還一方面闡述從一種蜘蛛毒液中可獲得的一種多肽(或其類似物)，它是鉀離子通道活性的一種抑制劑。本發明還提供這種多肽的獨特片段。如上文所定義，這種類似物不是從毒液中所得到的多肽本身，而是通過分析一種已分離出的多肽(如本文舉例說明的)所衍生的或者通過篩選其它毒液所獲得的。
術語“獨特片段”是指在本申請申請日已知序列中沒有發現同樣等同物的部分。用申請日時存在的一個解析多肽的數據庫來測定等同物能夠很容易地識別這些片段。
“藥學上可接受的組合物”是指在一種藥學上可接受的載體中含有一種治療有效量的本發明的一種化合物，即，一種制劑，其中能夠把該化合物加入其中溶解或者用別的方法使該化合物易于給藥。藥學可接受的載體例子包括水，生理鹽水和生理緩沖鹽水。這種藥物組合物是以適當劑量來提供的。這些組合物一般是指由FDA或者非美國的相同機構所批準用于治療一種特定疾病的那些組合物。
“疾病或狀態”是指上述所列出的那些疾病和涉及心臟或神經細胞的相關疾病。
這種化合物用作殺蟲劑也包括在本發明的范圍內。申請人相信本文所述的化合物具有顯著的殺蟲作用，或許是通過阻滯與哺乳動物心肌的瞬時外向K+通道結構上相似的通道起作用。我們知道蜘蛛產生的毒液含有具有有效殺蟲活性的多種毒素(Quistad，G.B，等“Insecticidal activity of Spider(Araneae)，centipede(Chilopoda)，scorpion(Scorpionidae)，and snake(Serpentes)venoms 85 Journal Economic Entomology 33，l992)。這些毒素在釋放壓力的作用下而放出，從而產生能夠有效和迅速殺死或麻痹捕獲昆蟲的毒素(Jackson，H和P.N.R.Usherwood，“Spider toxins as tools for dissectingelements of excitary amino acid transmission”，11Trends in Neurosciences 278，1988)。
本發明的其它特征和優點在下列所述的優選實施方案和權利要求中將是顯而易見的。
優選實施方案的描述首先簡要說明附圖附1是在用80％A/20％B平衡的、Vydac C18反相HPLC柱(10×250mm)上進行分離的疾行異足蛛毒液(120μl)的色譜分析圖。在44分鐘內用76％A/24％B到65％A/35％B的線性梯度洗脫(A＝0.1％TFA(含水)，B＝0.1％TFA(溶于CH3CN中))。注射該毒液5分鐘后開始該梯度洗脫，并在39分鐘時停止洗脫用3分鐘時間將柱洗以50％B以洗脫最后的峰。在220nm處監測洗脫物的吸收度。以吸收峰底部的數值標記級份(#1—8和最后級份)。
圖2是在陽離子交換柱上進行分離的肽化合物1和2的色譜分析圖。(a圖)對肽化合物1而言，用0～0.32M NaCl的50mM醋酸鈉pH4.0的線性梯度在32分鐘內展開該柱，然后用0.32～1M NaCl的50mM醋酸鈉pH4.0的線性梯度在5分鐘內展開該柱。(b圖)對肽化合物2而言，用0-0.3M NaCl的50mM醋酸鈉pH4.0的線性梯度在3分鐘內展開該柱，然后用含0.3-1M NaCl的50mM醋酸鈉pH4.0的線性梯度在35分鐘內展開該柱。以1ml/分鐘的流速洗脫，并在280nm處監測流出物。如色譜圖所示收集級份。
圖3是在Vydac C-18反相柱(300，10×250mm)上進行分離的Olios fasciculatus毒液(108ul)的色譜圖。注射試樣5分鐘后，用20-45％乙腈/0.1％TFA線性梯度在75分鐘內展開該柱。在50分鐘時，用100％乙腈/0.1％TFA流過柱子7分鐘。流速在3.0ml/分鐘，并且監測在320nm處流出物。如色譜圖所示收集級份。
圖4是用陽離子交換色譜分析純化的肽化合物3的色譜圖。注射試樣5分鐘后，用0.25-lM NaCl的50mM醋酸鈉緩沖液pH4.0的線性梯度在75分鐘內展開該柱。以1ml/分鐘流速洗脫并在280nm處監測流出物。如該色譜圖所示收集級份。
以下詳細描述發現和使用本發明有用的化合物治療如心律失常和記憶、學習障礙的方法和實驗。一種主要方法是用放射性配位體結合技術(或其等同技術)能夠迅速篩選出化合物(合成的和天然產物)，來識別能修改被化合物1、化合物2或化合物3所結合的瞬時外向K+通道上的位點結合的那些化合物。用一種相似方法能夠進行從蜘蛛毒液中篩選K+通道阻滯劑。此外，用這種技術也能很容易地篩選這種多肽的有用衍生物或類似物或突變蛋白質。
其他實驗包括記錄心臟和神經細胞中整個細胞離子流來確定那些能夠作為瞬時外向鉀離子流特異性活性藥劑而與放射性標記的化合物1、化合物2或化合物3競爭性結合，并且對其它類型的通道沒有顯著作用的藥劑。
本發明所述方法鑒別的藥劑的理想特性包括1)特異地和有效地阻滯一種鉀離子通道，如心臟或神經的瞬時外向K+通道。特異性阻滯是指該藥劑在體內特定濃度時對其它離子通道或受體沒有明顯的作用，所說特定濃度是指以對心律失常或學習、記憶失調或者以上所列的其它疾病的治療有效的劑量阻滯I10或IA時的體內濃度。
2)在治療劑量時無明顯副作用，包括過度延長心電圖的QT間隔，心搏緩慢，高度興奮性或疾病突然發作。蜘蛛毒液毒素的分離以下是一種非限定的方法實例，由該方法可以分離本發明的抑制劑蜘蛛毒素。本領域的技術人員將會預想到用等同方法可以分離和識別具有本發明有用活性的其它多肽(或其等同物)。等同化合物是本文所指的類似物，突變蛋白和衍生物，并且是可用本文所述的方法來識別的具有對一種或多種K+通道有活性的類似物，突變蛋白和衍生物。本領域的技術人員將會預想到一旦識別和測序出一種有用的K+通道活性劑，就能夠化學合成其全部或片段，并且如下所述，可以對該序列進行修飾。此外，這類片段或多肽本身可以用來篩選其活性與原多肽等同的其它活性劑。
按照對本領域技術人員所熟知的方法用電刺激分泌方法從蜘蛛疾行異足蛛和0lios fasciculatus中獲得毒液。所用的方法優選應當保證全部毒液不被腹部反流液或血淋巴所污染。這種方法對本領域技術人員是熟知的。在—78℃左右以冷凍狀態存放這樣獲得的全部毒液直到用于如下所述的精制。在各種預備和半預備柱如C-4和C-18 Vydac柱(Rainin Instrument Co.Inc.，Mack Road；Woburn，Massachusetts 01801)上用反相高效液相色譜法實現從全部毒液中精制組分。在220nm進行單色峰值測定。例如用一臺Waters990二極管排列的測量儀(Millipore Corporation，WatersChromatography Division，34Maple Street，Milford，Massachusetts 01757)所測定收集的多色U V數據對級份進行進一步的分析。用已知方法如使用一臺級份收集儀和一臺ISCO2159峰值測定儀(ISCO，4700Superior，Lincoln，Nebraska，68504)收集柱中的級份。用適當大小的容器如無菌聚乙烯實驗室器皿收集該級份。然后用凍干洗脫液，再凍干水份來完成對級份的濃縮。使用與最后精制級份時所用體系不同類型的柱子通過色譜分析方法測定所得到的級份的純度。
肽的測序按照已知方法能夠對發明的多肽，如本文所識別的多肽進行測序。測定主結構的一般方法包括如下列步驟1)將二硫鍵連接的半胱氨酸殘基還原和進行S-吡啶化來提高底物對酶作用的敏感性；2)通過單一或多次步驟的酶解來控制該肽的裂解；3)用反相高效液相色譜層析法(HPLC)分離和純化肽的片段；4)經N-末端測序和離子噴射質譜分析使肽片段特征化。
例如在溶液中進行該多肽半胱氨酸殘基的S-吡啶乙基化研究，接著進行該多肽的氨基酸測序。如下所述能夠完成S-吡啶乙基化的步驟。
把約1到10μg的多肽溶于或稀釋在最多5μl的-種緩沖液中，這種緩沖液是混合1份含4mM EDTA pH8.5的三羥甲基氨基甲烷鹽酸和3份8M鹽酸胍制得的。加入2.5μl10％2-巰基乙醇水溶液并在暗處氬氣中室溫下把混合物保溫兩小時，保溫之后，加入2μl4-乙烯基吡啶(-20℃氬氣中存放的新鮮試劑)，并把混合物在暗處氬氣中室溫下再保溫兩小時。然后除去混合物中的鹽分，優選在一只較短的反相柱上用色譜法進行。最后按照已知方法對回收的烷基化多肽測序。
另一方面，如Kruft等，193Aral.Biochem.306(1991)所述在原位還原并S-吡啶乙基化后對該多肽測序。
目前，就來自疾行異足蛛毒液中的肽化合物1和化合物2和來自olios fasciculatus毒液中的肽化合物3而言，本文公開了特定的優點，使用不通過分離/純化整個毒液的方法也能夠獲得其它肽。使用重組DNA技術通過克隆所述多肽或其部分的一種編碼序列能夠生產本發明的多肽。例如，按照本領域技術人員所熟知的方法使用已利用目前已知該多肽氨基酸序列信息的雜交探針來克隆整個多肽的編碼序列。結合使用重組DNA技術和體外蛋白合成技術也能生產本發明的多肽。這種體外蛋白合成方法包括，但不限于，使用一臺ABI430A固相肽合成儀(Applied Biosystems，Ins.，850LincolnCentre Drive，Foster City，California94404)應用本領域技術人員所熟知的常規Merrifield化學法或其它固相化學方法。等同的肽眾所周知，在多肽中能夠進行特定氨基酸的取代而不影響或基本上不影響所說多肽的功能。這種可行性的取代在實際操作中因多肽的不同而有所不同。按照本領域技術人員熟知的方法對可允許的取代進行測定。因此，具有基本上相同的氨基酸序列和基本上相同的K+通道阻滯活性的所有多肽都應當屬于本發明的范圍之內。生物活性這種多肽及其片段可用于治療心律失常或記憶、學習失調如阿爾茨海默氏病以及上述其它疾病。當用于這類適應癥時，把該多肽及其片段按照本領域公知的常規制劑方法如在Remington′sPharmaceutical Sciences(最新版，Mack Pnblishing Company，Easton，PA)中所公開的那些方法，制備成制劑。該制劑的性能將取決于給藥途徑和所需劑量。使用肽類藥物常用的常規最優化技術能夠實現對特定適應癥的劑量最佳化。
一般來說，優選靜脈內，肌肉內，皮下或腹膜內注射給藥。對注射液來說，在液體基質如林格氏液，Hank溶液或其它形式的生理鹽水中配制該肽或片段。制劑也包括凍干制劑，它能在給藥時重新配制。把本發明活性化合物提供給受體的另一種方法包括透過粘膜或透皮給藥，其中該制劑含有滲透促進劑，如洗滌劑，以及其它賦形劑。適當配制的口服給藥也包括在本發明范圍內。使用肽類化合物1，2和3進行篩選測定此外，這種肽類及其生物活性片段可用于篩選試驗以測定小分子或其它準藥物抑制化合物1，2或3與心臟或神經瞬時外向鉀離子通道結合的能力。本文以下描述了對競爭性結合的適當測定，其中使用了本發明的化合物1，2和3。在用于這種測定時，一般以放射性標記的形式提供多肽類化合物1，2或3(或一種活性片段)，并且評價所測化合物與放射性標記化合物競爭的能力。
以下實施例是用來詳細說明而不是限定本發明的。
實施例1疾行異足蛛的毒液級份通過用A把75-120μl等份的粗制毒液稀釋成1ml，并將稀釋的部分上樣到20％B平衡的一只Vydae C18柱上(10×250mm)，將約900μl的疾行異足蛛毒液進行分級分離。(A＝0.1％TFA(含水)；B＝0.1％TFA(溶于CH3CN))。3分鐘后，用1分鐘時間將梯度變為24％B并且在第5分鐘時，開始用44分鐘時間將線性梯度由24％變為35％B。流速為3.5ml/分鐘，并在220nm測定流出液(

圖1)。收集到下列級份級份1(在5和16分鐘之間洗脫的峰)，級份2(在16和19分鐘之間洗脫的峰)，級份3(在19和23.5分鐘之間洗脫的峰)，級份4(在23.5和26.5分鐘之間洗脫的峰)，級份5(在26.5和29.5分鐘之間洗脫的峰)，級份6(在29.5和33分鐘之間洗脫的峰)，級份7(在33和37分鐘之間洗脫的峰)，級份8(在37和39分鐘之間洗脫的峰)以及最后的級份(在39和46分鐘之間洗脫的峰)。在39分鐘時，大部分毒液組分已經洗脫后，用50％B過柱3分鐘。當再沒有峰值洗脫出時(～7分鐘)，用4分鐘時間把柱恢復到20％B并平衡柱子用于下一次色譜分離。合并且凍干從8次色譜分離流出的類似級份。如下面實施2和4中分另所述，級份6和7的主要峰與化合物1和2一致。
實施例2Heteropoda肽化合物1將疾行異足蛛粗制毒液(～50μl)上樣至反相HPLC柱(Vydac，C-18300A，22×250nm)，并且在60分鐘內使用從80％A和20％B到65％A和35％B雙相線性梯度進行洗脫(A＝0.1％三氟醋酸(TFA)，B＝乙腈)，在220nm處測定，流速為15ml/分鐘。收集所需要的43到44分鐘的級份。用冷凍干燥法濃縮由各次運行中收集的組份。
用下列方法測定并確定肽化合物1的結構。使用Waters Pico-Tag系統對三份相同的1-10nmol樣品進行PTC氨基酸分析。在一臺脈沖-液相測序儀(ABI)上對天然和還原的/吡啶乙基化肽進行N-末端測序。從一臺SCI-EXAPI III離子噴射質譜儀上得到質譜分析。
按照Kruft等，193 Anal.Biochem.306(1991)的方法原位生產適合于N-末端測序的化合物1的吡啶乙基化衍生物。
同時獲得的這些數據證實了肽化合物1的結構如下所示。SEo.ID.No.1Asp Asp Cys Gly Lys Leu Phe Ser Gly Cys Asp Thr Ash Ala1 5 10Asp Cys Cys Glu Gly Tyr Val Cys Arg Leu Trp Cys Lys Leu15 20 25Asp Trp3030個殘基，6個半胱氨酸，3個二硫鍵。計算的質量＝3412.86(酰胺)。測得的質量＝3412.70(離子噴射質譜)。估算的p1＝3.76。
實施例3Heteropoda肽化合物1在一只HEMA-IEC BIO SB柱(10μm，4.6×150cm；Alltech Associates，Deerfield，IL 60015)上用離子交換色譜分離法進一步純化肽化合物1。把從反相層析法得到的含有肽化合物1的凍干物溶于3ml50mM醋酸鈉(pH4.0)，并且如下用三等分進行層析分離。把1ml樣品上樣在用50mM醋酸鋼(pH4.0)平衡的HEMA-IEC BIO SB柱子上。5分鐘后，在32分鐘內用0-0.32M NaCl的50mM醋酸鈉溶液(pH4.0)的線性梯度展開該柱，接著在5分鐘內用0.32-1M NaCl的50mM醋酸鈉溶液(pH4.0)的線性梯度展開該柱(圖2a)。10分鐘后，在5分鐘內把柱恢復到起始條件，并且平衡該柱以用于下一步的色譜分析。以1ml/分鐘洗脫，并在280nm監測洗出液。如色譜圖上所示收集級份。把另外2ml粗制化合物1如上所述進行色譜分離并合并三次色譜分離中相似的級份。
在一只Vydac C-18反相柱(10×250mm，300)上使在26.5和29分鐘之間從離子交換柱上洗脫出的主要吸收峰脫鹽，把合并的級份(～10ml)裝載到用20％乙腈/0.1％TFA平衡的反相柱上。10分鐘后，在30分鐘內用20-35％的乙腈/0.1％TFA的線性梯度以3.5ml/分鐘的流速展開該柱，并在220nm處監測洗出液。把35.5和38分鐘之間洗脫出的級份冷凍干燥，得到641μg的純化肽化合物1。測得該肽質量為3412.72(電子噴射離子化質譜法)。
實施例4Heteropoda肽化合物2把疾行異足蛛粗制毒液(～50μl)上樣至一只反相HPLC柱(Vydac，C-18，300A，22×250mm)上，并在60分鐘內使用由80％A和20％B到65％A和35％B的雙相線性梯度進行洗脫(A＝0.1三氟醋酸(TFA)，B二乙腈)，在220nm測定，流速為15ml/分鐘。在46到48.5分鐘之間收集所要的級份。用冷凍干燥法濃縮從各次運行中收集的級份。
把源于50μl粗制毒液的上述級份的物質上樣至一只反相HPLC柱(Vydac，C-18，300A，22×250mm)上，并使用75％A和25％B+(A＝0.1％TFA，B＝乙腈)等效洗脫程序進行洗脫，在220nm處測定，并以3.5ml/分鐘的流速進行操作。在55到68分鐘之間收集所需的級份。用冷凍干燥法濃縮從各次運行中收集的級份。
用下列方法測定并確定肽化合物2的結構。用Waters Pico-Tag系統對三份相同的1-10nmol樣品進行PTC氨基酸分析。用一臺脈沖-液相測序儀(ABI)對天然和還原的/吡啶乙基化肽進行N-末端測序，從一臺SCI-EXAPI III離子噴射質譜儀上得到質譜分析。
按照Kruft等，193Anal Biochem 306(1991)的方法原位生產適合N-末端測序的化合物的吡啶乙基化衍生物。
同時獲得的這些數據證實了如下所示的肽化合物2的結構。SEQ.ID.No.2Glu Cys Gly Thr Leu phe ser Gly Cys Ser Thr His Ala Asp1 5 10Cys Cys Giu Gly Phe Ile Cys Lys Leu Trp Cys Arg Tyr Glu15 20 25Arg Thr Trp3031個殘基，6個半胱氨酸，3個二硫鍵。計算的質量＝3599.05(酰胺)測得的質量＝3599.38(離子噴射質譜)估算的pl＝5.41。
實施例5Heteropoda肽化合物2在一只HEMA-IEC BI0 SB柱(10μm，4.6×150cm)上用陽離子交換層析法純化肽化合物2。把從最初反相層析得到的含有肽化合物2的凍干物溶解在3ml50mM醋酸鈉(pH4.0)中，并如下對三等份進行色譜分析。把1ml樣品上樣至在用50mM醋酸鈉(pH4.0)平衡的HEMA-IEC BIO SB柱上。5分鐘后，在3分鐘內用0-0.3M NaCl的50mM醋酸鈉溶液(pH4.0)的線性梯度展開該柱子，接著在35分鐘內用0.3-1M NaCl的50mM醋酸鈉溶液(pH4.0)線性梯度展開該柱(圖2b)。5分鐘后，在10分鐘內把該柱恢復到起始條件并進行平衡以用于下一步層析。以1ml/分鐘流速洗脫，并在280nm監測洗出液。如色譜上所示收集級份。如上所述把其它兩毫升粗制化合物2進行層析。并且合并來自三次層析的相同級份。
在一只Vydac c-18反相柱(10×250mm，300)上分兩部分脫去在30和34分鐘之間從陽離子交換柱上洗脫的主要吸收峰的鹽分。把該柱在25％乙腈/0.1％TFA中平衡，并用起始溶劑洗脫10分鐘接著在20分鐘內用25-35％乙腈/0.1％TFA線性梯度以3.5ml/分鐘的流速洗脫。在220nm處監測洗出液，并且在26.5到29分鐘以單峰形式洗脫出肽化合物2。然后把從陽離子交換柱中得到的其它洗出液脫去鹽分，并且合并相同的級份。冷凍干燥這些流出液得到1.88mg純化的肽化合物2。測得這種肽的質量為3599.52(電子噴射離子化質譜法)。
實施例6Olios fasciculatus毒液的分級分離用1.5ml的20％乙腈/0.1％TFA稀釋大約108μl的Oliosfasci culatus的毒液并將樣品上樣至用相同緩沖液平衡過的一只VydacC-18柱(300，10×250mm)將全部毒液進行分級分離。注射樣品5分鐘后，在75分鐘內用20-45％乙腈/0.1％TFA的線性梯度展開該柱(圖3)。在50分鐘時，大多數毒液成分洗脫下來后，用7分鐘時間將柱子洗以100％乙腈/0.1％TFA。流速為3.0ml/分鐘，并且在220nm監測洗出液。如色譜圖上所示收集級份。冷凍干燥在40和42分鐘之間洗脫出的含有肽化合物3的級份(#21)，并把殘余物溶于2ml 50nM醋酸鈉，0.25M NaCl溶液(pH4.0)中。
實施例7Olios fasciculatus化合物3在一只HEMA-IEC BIO SB柱(10μm，4.6×150cm，來自Alltech Associates，Deerfield，IL60015)上用陽離子交換層析法進一步純化肽化合物3。把從反相層析中得到的含肽化合物3的溶液(1.5ml)裝載在用相同緩沖液平衡過的HEMA-IEC BIO SB柱上。5分鐘后，在75分鐘內用0.25-1M NaCl的50mM醋酸鈉緩沖液(pH4.0)的線性梯度展開該柱(圖4)。以1ml/分鐘流速洗脫，并在280nm處監測洗出液。如該色譜圖上所示收集級份。
在一只Vydac C-18反相柱(10×250mm，300)上把在27和32分鐘之間從陽離子交換柱上洗脫下來的主要峰值的物質(級份#4)脫鹽。把級份(～4.5ml)裝載在用0.1％TFA平衡過的反相柱上。3分鐘后，在3分鐘內用0-15％異丙醇/0.1％TFA的線性梯度展開該柱，接著在5分鐘內用15-30％異丙醇/0.1％TFA的線性梯度展開該柱。以1.0ml/分鐘流速洗脫，并在220nm處監測洗出液。冷凍干燥在43和45分鐘之間洗脫出的級份得到70μg純化的肽化合物3。測得該肽的質量為3786.64(電子噴射離子化質譜法)。
得到了還原、衍生的肽化合物3的N-末端序列分析。序列如下
SEQ.ID.No.3Asp Asp Cys Ala Gly Trp Met Glu Ser Cys Ser Ser Lys1 5 10Pro Cys Cys Ala Gly Arg Lys Cys Phe Ser Glu Trp Tyr15 20 25Cys Lys Leu Val Val Asp Gln Asn3034個殘基，6個半胱氨酸，3個二硫鍵。測得質量＝3786.64(離子噴射質譜)對氨基酸33和34的鑒別可信度較低。實施例8疾行異足蛛和Olils fasCiculatus肽級份和化合物1，2和3的K+通道阻滯活性用下列方法證實本發明的肽級份和化合物1，2和3阻滯瞬時外向K+通道的能力。
按照前面所述的方法(Kamp等，“Voltage-and Use-dependent Modulation of Cardiac Calcium Channels bythe Dihydropyridine(+)-202-791”，64 Circ.Res.3381989)分離鼠心室的心肌細胞。該方法包括用含有膠原酶和蛋白酶的溶液逆行灌注到一個切下的鼠心臟來酶解整個心臟從而分離適用于標準電位差施加試驗的單個心臟肌細胞。用其他所詳細描述(Hamill等，“Improved Patch Clamp Techniqnes for High-resolutionCurrent Recording from Cells and Cell-Free MembranePatches”，391 Pflugers Arch.85，1981)的施加電位差技術從分離的肌細胞記錄全部細胞的離子流。把細胞放入一個0.5ml記錄室中，并用下列組合物的緩沖液浸泡，這種組合物為(以mM計)NaCl 132MgCl2，1.2: CaCl2，1.8；KCl，4；HEPES，10；葡萄糖，10pH為7.4。在記錄K+離子流的大多數試驗中，去除CaCl2而向該溶液中加1mM Co2+來阻滯Ca2+離子流。用商業上可買到的片夾放大器(Axon Instruments Axopatch ID)給該肌細胞施加一個電位差，并用個人計算機收集和分析數據。給細胞施加-60mV的電壓。使用的測試電壓(500毫秒間隔)范圍是-40至+30mV。利用這些技術能夠記錄這些細胞中的幾種K+離子流，包括內向校正K+離子流；迅速激活、非失活的遲緩型校正K+離子流；和電壓依賴性的瞬時外向K+離子流(I10)。分別把實施例1中所述制得的毒液級份1-8和最后級份的干級份殘余物溶于1ml水中。然后用3ml的緩沖液稀釋10μl的每個樣品來測試心臟K+離子流的作用。在這些條件下，肽級份2-9以一種電壓依賴性的方式阻滯I10。在-10mV的試驗電位時完全阻滯，在+30mV試驗電位時阻滯降低到對照值的30到70％。如上述實施例3和5中所述分離并純化級份6(化合物1)和級份7(化合物2)的主要肽。化合物1以電壓依賴性方式阻滯I10，在較小的除極試驗電位時有較大的阻滯出現。通過測定抑制50％的I10所需的濃度(IC50)和在三種不同的試驗電位時這種離子流的最大阻滯的方法來定量表示這種阻滯。在-10mV，+20mV和+50mV試驗電位時I10的最大阻滯分別是100％，79％和69％，阻滯I10的IC50在-10mV為16nM，在+20mV為35nM以及在+50mV為138nM(n＝4-6)。與阻滯I10一樣，在90％復極時測得，化合物1(30nM)延長了34±5％所分離的鼠心室肌細胞的動作電位時間。選擇性地延長動作電位時間是第三類抗心律失常藥的活性(VaughanWilliams，“Delayed ventricular repolarization as anantiarrhythmic principle”，6 Eur.Heart J.145，1985)。測定化合物1或2對其它心臟離子流的作用來評價其特異性。如使用標準全細胞電位施加技術所測試的，在0.2-1.0μm濃度時化合物1或化合物2不影響下列心臟的離子流——鼠心室肌細胞中超速遲緩型校正K+離子流(Ikur)——豚鼠心室肌細胞中緩慢遲緩型校正K+離子流(Iks)——鼠和豚鼠心室肌細胞中內向校正K+離子流(Iki)——鼠心室肌細胞的鈉離子流(INa)——鼠和豚鼠心室肌細胞中L型Ca2+離子流(Ica-L)在一個分離的人心室肌細胞中，化合物1(0.2μM)也阻滯I10但不阻滯Ikw，類似于在鼠心室肌細胞中的發現。
化合物3也有相似活性，在試驗電位＜0mV在1μM時完全阻滯I10，同時對遲緩型校正或內向校正K+離子流沒有影響。一旦失去了毒素，化合物1和化合物2(1μM)的作用基本上相反。
還測試了化合物1或2對由分離的非心臟細胞所記錄的許多其他K+通道的活性。在0.2-1.0μM，化合物1或2對下列無作用——鼠中樞細胞(浦肯野氏神經元，小腦粒細胞，海馬錐體細胞，交感神經神經節細胞)，GH3垂體細胞或兔破骨細胞的迅速遲緩型校正K+離子流(Ik)——鼠小腦粒細胞或交感神經的神經節細胞的瞬時外向電流(In)——在Xenopus oocytes中所表達的一種克隆通道。
因此表明化合物1和2對心臟肌細胞中的一種類型的通道(一種電壓激活的瞬時外向K+離子流)是非常具有特異性唯一報道的抑制(神經細胞中)瞬時外向K+離子流的其它毒素是樹突毒素(Halinell等“Central action of dendrotoxinSelective veductionof a transient K conductance in hippocampus andbinding to localized acceptors”83 Proc.Natl.Acad.Sci.USA493，1986)。但是，我們已證明樹突毒素(2μM)對鼠心臟I10沒有作用。所以，化合物1，2和3是首次描述能特異性阻滯心臟I10的毒素。
實施例9化合物1和2的神經作用用本發明化合物1和2對海馬切片的電生理作用來證實它影響中樞神經活性的能力。
用斷頭術處死雄性Sprague-Dawley鼠(100-2009)。從顱內取出大腦，馬上放入冷的(4-6℃)充氧的(95％O2/5％CO2)人造腦脊髓液(aCSF)中，這種人造腦脊髓液是由NaCl，126；KCl，2.5，NaH2PO4，1.24；MgSO4，1.3；CaCl2，2.4；NaHCO3，26；葡萄糖11(單位mM)所組成，如前面(Mueller等，“Arylamine spider toxins antagonize NMDA receptor-mediated synaptic transmission in rat hippocampalslices”，9synapse244，1991)所述制備海馬切片。室溫下把切片保存在有充氧的aCSF的200ml容器中。在1小時的恢復期后，把一個切片轉移到小容量(～300μl)的記錄室中。在該切片上放置較輕的鉑來增加記錄的穩定性。用aCSF覆蓋該切片，并以一種過冷系統保持。新鮮充氧的aCSF流速為2ml/分鐘。保持該切片浸泡在該流動的aCSF中，以使藥物進入該切片的電位問題降到最低。對細胞外的電位記錄時，把記錄室的溫度保持在33℃。在肉眼觀察下把雙極同軸刺激電極放在靠近CA1-CA2邊緣的輻射層下。為引發突觸反應，每30秒向各切片釋放3-50V的50微秒的單向脈沖同時測量該反應，直到從特定記錄位置上得到電位的最大幅度為止。然后設置電壓來引發半數最大反應。用充有0～9％NaCl的2-3MW玻璃微電極進行記錄，該電極也是在肉限觀察下放置的。記錄來源于CA1錐體細胞層(總體峰)或輻射層(場的興奮性突觸后電位(EPSP)和輸入沖動排(AV))的突觸反應，并將其數字化，輸入一種以IBMPC機為基礎的數據采集和存貯系統中。用磷酸鹽緩沖液(PBSNaCl，140mM；KCl，2.5mM；KH2PO4，1.5mM；Na2HPO4，8.1mM；pH7.4)以所需最終濃度的100-1000倍配制毒素，然后轉入儲備注射器中，以便通過稀釋和混合達到所需的最終濃度。將全部藥物和毒素過冷30分鐘后使用，此時反應幅度一般已經平衡。把全部波型數據化并存盤。計算用藥前5分鐘期間(對照，用藥前)和用藥后5分鐘期間(用藥后25-30分鐘)的細胞外所記錄反應幅度平均值。
化合物1在總體峰的幅度上出現一個持續的增長，這種增長在用新鮮的aCSF沖洗化合物1期間沒有恢復原狀。對500nM化合物1的平均反應是增長35±9％(平均值±S.E.M.，n＝5個切片)在這些切片的兩個切片中，同時記錄的場興奮性突觸后電位的帽度以16％的平均值增長，而輸入沖動排沒有變化。
使用純化的化合物2可得到相似結果，當以1μM的最后濃度使用化合物2時，它能在總體峰的幅度上產生25±7％(平均值±S.E.M.，n＝9個切片)的增長。在這些切片的兩個切片中，同時記錄的場興奮性突觸后電位的幅度以12％平均值增長，而輸入沖動排沒有變化。
綜上所述，這些結果證實化合物1和2能夠長時間增加Schaffer側突的-CA1錐體細胞突觸上的突觸傳遞。這些數據不能區分突觸前和突觸后的作用部位，也不能清楚地表明作用的機理。在突觸傳遞上的這種增長可能是因為對電壓敏感性鉀離子通道的阻滯所致。
當靜脈注射(i.v.)或當通過腦室內注射給藥(i.c.v)時，許多K+通道阻滯劑能夠引起癲癇發作。例如，當以0.008μg/g通過腦室內注射時，相當于大約0.24μg只鼠，樹突毒素能引起鼠抽搐和死亡(Schweitz，H.等，＂Purification andpharmacological Characterization of peptide toxins fromthe black mamba(Dendroaspis polylepis)venom＂，28Toxicon 847，1990)。比較起來，給有聽原性癲癇發作傾向的鼠用1μg(n＝3)或2μg(n＝1)的化合物2通過腦室內注射時，化合物2不會引起抽搐或癲癇發作。以10，15或24μg(n＝1每次劑量)劑量靜脈注射化合物2后，它能引起鼠瞬時共濟失調，但沒有觀察到抽搐。
實施例10其它K+通道阻滯毒素化合物1、2和3是指從蜘蛛毒液中分離出來的能夠阻滯特異性K+通道的首次報道的毒素例子。在不是疾行異足蛛和Oliosfasciculatus種的蜘蛛毒液中也含有結構上不相關的毒素(肽類和非肽類)，這些毒素能有效地阻滯哺乳動物細胞中的I10或者其它類型的K+通道。
現在已經知道從脊柱動物和非脊動物毒液中分離的幾種其它毒素的特性。例如，從蜜蜂Apis mellifera毒液中已分離出兩種毒素能夠阻滯K+通道。蜜蜂神經毒素能夠阻滯低電導Ca2+激活的K+通道，而MCD(肥大細胞脫粒)肽能阻滯非失活遲緩型校正K+通道(Strong，“Potassium Channel Toxins”，46Pharmac.Ther.137，1990)。從蝎子和蛇產生的毒液中已分離出了其它K+通道的特異性阻滯毒素。例如，Leiurus quinquestriatus蝎子的毒液中含有至少兩種毒素，charybdotoxin和leiurotoxin，它們分別能阻滯高電導和低電導Ca2+激活性K+通道(Strong，“potassiumChannel Toxins”，46Pharm.Ther.127，1990)。現在已經從窄頭眼鏡蛇的毒液中分離出了能夠阻滯神經元的非失活遲緩型校正K+通道的毒素(Harvey和Anderson，“DendrotoxinsSnakeToxins That Block Potassium Channels and FacilitateNeurotransmitter Release”，31Pharmac.Ther.33，1985)。來自綠色窄頭眼鏡蛇(Dendroaspis angusticeps)的樹突毒素和來自黑色窄頭眼鏡蛇(D.Polylepis)的毒素1都具有與β-金環蛇毒素明顯的序列同源現象，其中β-金環蛇毒素是從Bungarusmulticinctus的毒液中分離出來的也能夠阻滯相同類型K+通道的一種抑制性突觸前神經毒素(Moczydlowski等，“An EmergingPharmacology of Peptide Toxins Targeted Against PotassiumChannels”，105J.Membrane Biol95，1988)。據報道以上所指的毒素具有除阻滯非失活遲緩型校正K+通道之外的作用。例如，β-金環蛇毒素也具有磷脂酶A2活性(Moczydlowski等)，而樹突毒素也能阻滯海馬神經元的鈉離子流和一種緩慢失活的瞬時K+離子流(Li和McArdle“Dendrotoxin Inhibits Sodium andTransient Potassium Cuments in Murine HippocampalNeurons”，64.Biophys.J.A198，1993)。
上述毒素已經用于定義正常細胞的生理學和疾病組織細胞中的特異性K+通道的作用。但是已經發現對幾種K+通道還沒有發現較高特異性和有效的調節劑。對于發現這類新的通道配合體來說，蜘蛛毒液是一種可以發掘的資源。
通過使用全細胞電壓施壓記錄技術測定整個毒液，由標準HPLC方法分離的毒液級份，和分離的毒素對分離的哺乳動物心臟和神經細胞K+離子流的作用來檢測蜘蛛毒液中K+通道特異性毒素的存在。
實施例11篩洗能存神經組織中瞬時外向K+通道部位與化合物
1/化合物2 /化合物3結合的化合物的方法用本領域中已知的方法(乳過氧化物酶，Bolton-Hunter，氯胺T等)用125I標記化合物1，2或3或相關肽。使用下述方法測定作用于化合物1/化合物2/化合物3結合部位的候選化合物，通過測定其取代用125I標記的[125I]化合物1，[125I]化合物2，或[125I]化合物3或相關肽的特異性結合的能力來評價所述候選化合物。
把下列測試法作為一種高生產率的測試方法，來篩選產品庫(如，天然產物庫和主要制藥公司申請的化合物)從而識別在I10通道上的化合物1/化合物2/化合物3結合部位具有活性的新的一類化合物。然后用這類新化合物作為以神經I10通道上化合物1/化合物2/化合物3結合部位為目標的藥物開發項目的化學主結構。用這種測試法識別的化合物給學習和記憶失調如阿爾茨海默氏病和上述所列的其它疾病提供了一種新的治療途徑。如果在定量試驗中使用了一種肽，確保該肽保留著它的生物活性是很重要的。就阻滯心臟I10而言，碘化的(125I)化合物1、化合物2和化合物3保留著它們的正常活性。例如，125I-化合物1以一種電壓依賴性方式阻滯鼠心室肌細胞的I10，估計IC50在-10mV為25nM，在+20mV為70nM，并且在+50mV為150nM。
按照Williams等(“Effects of Polyamines on theBinding of[3H]MK-801 to the NNDA ReceptorPharmacological Evidence for the Existence of aPolyamine Recognition Site”36Molec.Pharmacol.575，1989)的方法制備鼠腦膜，如下把重量為100-200g的雄性Sprague-Dawley小鼠(Simonsen Laboratories)用斷頭術處死。用一臺玻璃/Teflon勻漿機在含5mMK-EDTA的300ml0.32M蔗糖溶液(pH7.0)中把20只小鼠大腦(去掉小腦和腦干)勻漿。在1000xg把勻漿離心分離10分鐘，去掉上清液，再在30,000xg離心分離30分鐘。把所得到的沉淀物懸浮于250ml 5mM K-EDTA(pH7.0)，并在冰上攪拌15分鐘。然后在30,000xg離心分離30分鐘。把該沉淀物懸浮于90ml 5mM K-EDTA(pH7.0)，并把15-ml等分試樣在0.9M和1.2M蔗糖溶液(各10ml)的不連續蔗糖梯度中分層。在95,000xg把該梯度溶液離心分離90分鐘，收集在0.9M/1.2M蔗糖溶液界面的突觸漿膜(SPM)。用500ml5mM K-EDTA(pH7.0)的懸浮液沖洗該膜，并在32℃保溫30分鐘，再在100,000xg離心分離30分鐘。重復三次該沖洗步驟，包括30分鐘的保溫，將最后的沉淀物再懸浮于60ml 5mMK-EDTA(pH7.0)中，并在-80℃以等分試樣存放。為進行與[125I]化合物1，2或3的結合試驗，把突觸漿膜(SPMs)融化，在32℃溫育30分鐘，沖洗一次，然后以100,000xg離心分離30分鐘。把SPMs再懸浮于緩沖液A中(20mMK-HEPES，1mM K-EDTA，(pH7.0)。向該反應混合物中加入[125I]化合物1，2或3。在聚丙烯試管中進行結合試驗。最后溫育體積為200μl。在100μm非放射活性的化合物1，2或3存在下測定非特異性結合。把三份相同樣品在32℃溫育2小時。加入10ml冰冷的緩沖液A結束試驗，然后用玻璃纖維濾紙過濾(Schl eicher&Schuell No.30)。用另外10ml緩沖液A沖洗濾紙，并用γ計數儀測定125I的放射活性。
為了證實上述測試，也進行了下列試驗。
(a)把200μl含100nM[125I]化合物1、2或3的緩沖液A通過該玻璃纖維濾紙來測定與該濾紙非特異性結合的[125I]化合物1、2或3的量。用另外10ml緩沖液A沖洗該濾紙，并用閃爍計數法測定與該濾紙結合的放射活性。如果出現大量的非特異性結合的[125I]化合物1，2或3，則用未標識的化合物1，2或3提前沖洗該濾紙來限制這種結合。如果不出現較高非特異性結合，則用離心法而不是過濾法結束該試驗，用閃爍計數法測定沉淀物中放射活性的量。
(b)將SPMs再懸浮于緩沖液A，作出一條飽和曲線。測試緩沖液含有75μg的蛋白質。使用[125I]化合物1，2或3的9個濃度，范圍從10nM到100μM(半數對數單位)。由數據作一條飽和曲線，并用Scatchard分析法(Scatchard，“The Attractionsof Proteins for Small Molecules and Ions”，51Ann.N.Y.Aead.Sci.660，1949)測定近似KD值和Bmax。用Hill曲線的制圖(Hill，“A New Mathematical Treatmentof Changesof Ionic Concentrations in Musele and Nerve Under theAction of Electric Currents，With a Theory to TheirMode of Excitation”40 J.Physiol.190，1910)測定[125I]化合物1，2或3的結合協同性。
(c)把SPMs懸浮于緩沖液A來測定結合對蛋白(受體)濃度的依賴性。這種試驗緩沖液(200μl)含有與其KD值相等濃度的[125I]化合物1，2或3和可增長濃度的蛋白。[125I]化合物1、2或3的特異性結合應當與蛋白(受體)的含量呈線性關系。
(d)把SPMs懸浮于緩沖液A中來測定配合體-受體結合的時間過程。該試驗用的緩沖液(300μl)含有與其KD值相等濃度的[125I]化合物1，2或3和100μg蛋白。在不同時間長度于32℃溫育三份相同的樣品；測定達到平衡的時間，并且在所有隨后進行的試驗中通常用到這個時間點。
(e)用競爭性試驗能夠分析結合部位的藥理。在這種試驗中，保持[125I]化合物1，2或3的濃度和蛋白量不變，同時改變試驗(競爭)藥物的濃度。這種試驗能夠測定競爭藥物的IC50和近似KD(Cheng和Prusoff，“Relationship Between theInhibition Constant(K1)and the Concentration ofInhibitor Which Causes 50 Percent Inhibition(IC50)ofan Enzymatic Reaction”，22J.Biochem.Pharmacol.3099，1973)。用Hill曲線分析法確定該競爭藥物的結合協同性。化合物1，2或3的特異性結合是指能與I10通道上的一個新部位結合。按照這樣，與化合物1，2或3相關的肽應當以競爭性方式競爭[125I]化合物1，2或3的結合，并且在這種試驗中它們的功效應當與在阻滯I10(如，在分離出的神經或心臟細胞中對I10的抑制)的功能性試驗中它們的抑制功效有關。相反，在I10通道上的其它部位具有活性的化合物應當不能以競爭性方式替換[125I]化合物1，2或3的結合。相反地，可能會出現對[125I]化合物1，2或3結合的復雜變構調節，這表明是非競爭性的相互作用。
(f)在[125I]化合物1，2或3的結合達到平衡(見上述(d))后測定它們的結合，并向反應混合物中加入較多過量的無放射活性的競爭性藥物來進行評估解離動態的研究。然后在不同時間間隔測定[125I]化合物1，2或3的結合。用這種測試方法，測出[125I]化合物1，2或3結合的結合和解離比(Titeler，“Multiple Dopamine ReceptorsReceptor Binding Studiesin Dopamine Pharmacology”，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，1983)。另外的試驗包括改變反應溫度(20℃到37℃)來搞研究這些參數對溫度的依賴性。
實施例12能夠結合至心臟組織的瞬時外向K+通道上化合物1/化合物2/化合物3結合部位的化合物的篩選方法通過本領域中已知方法(乳過氧化物酶，Bolton-Hunter氯胺T等)用125I標記化合物1，化合物2，化合物3和相關的肽。用以下所述的技術測定作用于化合物1/化合物2/化合物3結合部位的候選化合物替換[125I]化合物1，[125I]化合物2，[125I]化合物3或用125I標記的相關肽的特異性結合的能力來評估它們。
把下列測試法當作一種高生產率的試驗方法使用來篩選產品庫(如，天然產物庫和多數制藥公司申請的化合物)，從而識別在心臟I10通道上化合物1/化合物2/化合物3結合部分具有活性的新的一類化合物。然后用這類新化合物作為以心臟I10通道上化合物1/化合物2/化合物3的結合部位為目標的藥物開發項目的化學主結構。用這種測試法識別出的化合物給治療再活動性室上和心室的心律失常提供了一條新的治療途徑。
按照Doyle等的方法(“Saxitoxin binding and“Fast”SodiumChannel Inhibition in Sheep Heart Plasma Membrane”249Am.J.Physiol H328，1985)。以及Jones和Besch的方法(“Isolation of Canine Cardiac Sarcolemmal Vesicles”，5Methods in Pharmacology 1，1984)，如Kamp和Miller改良的方法(“Voltage-dependent Nitrendipine Binding toCardiac Sarcolemmal Vesicles”，32Mol.Pharmacol.278，1987)制備心臟肌纖維膜泡囊。在0-4℃下制備新鮮的牛或其它合適哺乳動物心臟組織的心臟肌纖維膜泡囊。把心臟切成1cm3的小塊，并用一臺絞肉機制成糊狀。在4倍肉糊體積的0.75M膽堿氯中(用30mMN-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)-15mMTris緩沖到pH7.4)把該肉糊勻漿。用一種Tekmar T185軸在300ml聚丙烯離心管中進行兩次30秒的勻化攪拌。這種和所有其它的緩沖液都包括蛋白酶抑制劑0.2mM苯基甲磺酰氟，1mM EGTA，和1mM二硫蘇糖醇(dithiothreitol)。在一臺Sorvall離心機的GSA轉子中以27,000xg把所得到的勻漿離心20分鐘。除去上清液并把沉淀物再懸浮于10mM HEPES-5mM Tris(pH7.4)中，并如上述再進行離心。把這次離心沉淀物再懸浮于10mM HEPES-Tris中，并用Tekmar的T185軸以5檔設置進行三次勻化各30秒。在GSA轉子中以14,000xg把勻漿離心20分鐘。然后在GSA轉子中以27,500xg把上清液離心70分鐘。
在初步離心后，該膜懸浮于50％蔗糖，150mM KCl，100mMTris Cl和5mM焦磷酸鈉中。把這些泡囊填充到四步不連續梯度的底部其它步驟的濃度為30％，21.5％和9.5％蔗糖。在一臺Beckman50.2Ti轉子中以193,000xg把這個梯度溶液離心1.5小時。在9.5％-21.5％蔗糖溶液界面的薄膜富集在表面肌纖維膜上。收集這種薄膜并將其釋釋到含150mM KCl，0.8mM NgSO4和10mM Tris HCl的緩沖液(pH＝7.4@22℃)中，然后在193.000×g離心35分鐘。把所得到的沉淀物再懸浮于填料緩沖液，并再離心一次。把最后的沉淀物再懸浮于填料緩沖液到最終蛋白濃度為2mg蛋白/ml，液氮冷凍并在-70℃存貯到使用。
用150mM KCl填充膜泡囊(20-40μg蛋白)并稀釋50倍制成1ml含150mM KCl的結合緩沖液。把該泡囊在37℃預保溫5分鐘，然后在沒濃度的[125I]化合物1，2或3(1nM-1μm)存在下再次溫育達到平衡條件所需的時間(由最初試驗測得準確的時間)。加入4ml冰冷的結合緩沖液來終止結合反應，然后在Whatman GF/C濾紙上迅速過濾，隨后用另外三份4ml的冰冷的結合緩沖液沖洗。用常規的γ計數技術測定與該濾紙結合的放射活性。[125I]化合物1，2或3的特異性結合定義為用總結合減去在1-10μm冷的化合物1，2或3存在下測得的結合。
用實施例8的(a)-(f)圖中所略述的方法證實上述試驗。
實施例13重組受體結合試驗下面是迅速篩選本發明有用化合物的試驗例。在這個試驗中，用一般方法從合適的生物體如入可獲得編碼I10通道結合部位(受體)的cDNA或基因克隆。已克隆出了這類受體，并且在現有技術中是公知的。在一種適當表達載體中表達該克隆的分離片段來生產從該受體中能獲得的最小多肽，這種多肽保留了結合化合物1，2或3的能力。用這種方法能夠識別出含有新的化合物1/化合物2/化合物3受體的多肽。使用表達I10通道的穩定轉染的哺乳動物細胞系(如，HEK293細胞)能使這種試驗變得容易。
另一方面，化合物1/化合物2/化合物3受體能夠與化學改性的化合物1，2或3以這樣一種方法進行化學反應，即修飾與選擇的化合物接觸(或相鄰)的化合物1/化合物2/化合物3肽受體的氨基酸殘基，并由此可得到識別。如上所述，使用標準表達載體能夠重組表達化合物1/化合物2/化合物3受體的片段，該片段含有經測定能與化合物1，2或3結合且足以能夠與所說分子結合的那些氨基酸。
用標準化學方法能把具有所需結合特性的重組多肽與一種固相支持物相結合。然后把這種固相或親和性基質與化合物1，2或3接觸來證實這些化合物能與該柱子相結合，并且測定出從這些固相上除去該化合物的條件。然后用大數據庫中的化合物重復這種步驟來測定能與該親和性基質結合的那些化合物，然后用與化合物1，2或3的相似方式將其釋放。盡管如此，也可以使用其他的結合和釋放條件以獲得能夠在不同于化合物1/化合物2/化合物3肽結合所用的條件(如，尤其是在病理狀態下能夠更好模擬生理狀態的條件)下結合的化合物。因此能夠從存在于液體基質或提取物中的非常大量的化合物中篩選出確實能夠結合的那些化合物。
一旦鑒別出能與上述化合物1/化合物2/化合物3結合多肽結合的化合物，即可用上述各種試驗容易地測定那些化合物，確定它們或其簡單的衍生物是否是可用于治療心臟和神經疾病的有用化合物。
在另外一種方法中，可以將天然化合物1，2或3受體與一種柱或其它固相支持物結合。然后能夠鑒別出不被在該受體其它部位結合的試劑所競爭的那些化合物。這類化合物定義了該受體上新的結合部位。被其它已知化合物所競爭的化合物能夠與已知部位結合，或者與已知部位重迭的新部位結合。不管怎樣，這類藥物在結構上不同于已知化合物。因此，可以用來定義可用作治療劑的新化學類別的興奮劑或拮抗劑。制劑和給藥如本文所證實的，本發明有用的化合物可用于治療神經性疾病或失調。盡管這些化合物常用于治療人類患者，但它們也可用來治療其它脊椎動物如其它靈長類動物，農用動物如豬，牛和家禽，以及體育用動物和玩賞用動物如馬、狗和描的類似或相同疾病。
在治療和/或診斷使用中，把本發明化合物配制成不同給藥方式的制劑，這些給藥方式包括全身和外科或局部給藥。在Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，EastonPA中一般可以找到制劑技術和劑型。
對全身用藥來說，優選口服用藥。另一方面，也可以使用注射，如肌內，靜脈內，腹膜內和皮下注射。對注射液來說，把本發明化合物用液體溶液，優選生理上可接受的緩沖液如Hank氏溶液或林格氏溶液配成制劑。另一方面，也可以把本發明的化合物用一種或多種賦形劑(如，聚乙二醇)配成制劑，這種賦形劑一般是以USP標準所規定的安全性可接受的。此外，可以把該化合物配成固體形式，并且在使用前迅速再溶解或懸浮。也包括凍干形式。
用透過粘膜或透過皮膚的方法也能全身給藥，或者口服該化合物給藥。對透過粘膜或透過皮膚給藥來說，在該制劑中使用適合滲透該障礙的滲透劑。這些滲透劑在現有技術中一般都是已知的。例如，對透過粘膜給藥來說，這種滲透劑包括膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。此外，使用洗滌劑可有利于滲透。透過粘膜給藥可以通過部鼻部噴霧給藥，例如，或者使用栓劑給藥。對口服給藥來說，把該化合物配成常規的口服劑型如膠囊劑、片劑和保健藥劑。
對局部給藥來說，如現有技術中所公知的，可把本發明化合物配成油劑，油膏劑、凝膠劑或霜劑。
用一般方法能夠測定出本發明不同化合物的必須給藥量。治療用量一般是對于每公斤所治療動物體重，劑量為1到50mg。
其它實施方案包括在下列權利要求中。
“序列表”(1)一般資料(i)申請人Michael.C.Sangui nettiAlanMueller(ii)發明名稱 鉀離子通道阻滯化合物及其用途(iii)序列數 3(iv)通信地址(A)住址 Lyon&Lyon(B)街道 6l1 West Sixth Street(C)城市 Los Angeles(D)州 California(E)國家 美國(F)郵編 90017(v)計算機可讀形式(A)介質類型 3.5寸盤，1.44Mb容量(B)計算機 IBM兼容機(C)操作系統 IBM MS-DOS(5.0版)(D)軟件 WordPerfeet(5.1版)(vi)當前申請數據(A)申請號(B)申請日(C)分類(vii)在先申請數據全部在先申請，包括下列所述申請1(A)申請號08/033,388
(B)申請03/18/93(viii)律師/代理人資料(A)姓名 WARBURG，RICHARD J.
(B)登記號 32,327(C)參考/案號206/093(ix)通訊資料(A)電話 (213)489-1600(B)傳真 (213)955-0440(C)電傳 67-3510(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度30(B)類型氨基酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO1Asp Asp Cys Gly Lys Leu Phe Ser Gly Cys Asp Thr Asn Ala1510Asp Cys Cys Glu Gly Tyr Val Cys Arg Ler Trp Cys Lys Leu15 20 25Asp Trp30(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度31(B)類型氨基酸(C)鏈型單股
(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO2Glu Cys Gly Thr Leu Phe Ser Gly Cys Ser Thr His Ala Asp1 5 10Cys Cys Glu Gly Phe Ile Cys Lys Leu Trp Cys Arg Tyr Glu15 20 25Arg Thr Trp30(3)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度34(B)類型氨基酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO3Asp Asp Cys Ala Gly Trp Met Glu Ser Cys Ser Ser Lys Pro15 10Cys Cys Ala Gly Arg Lys Cys Phe Ser Glu Trp Tyr Cys Lys15 20 25Leu Val Val Asp Gln Asn30
權利要求
1.特異性有效瞬時外向鉀離子通道抑制劑。
2.篩選瞬時外向鉀離子通道活性劑的方法，包括的步驟為把一種所述的瞬時外向鉀離子通道與一種已知的特異性瞬時外向鉀離子通道抑制劑和一種可能的瞬時外向鉀離子通道活性劑接觸，和測定所述可能的瞬時外向鉀離子通道活性劑對所述已知特異性瞬時外向鉀離子通道抑制劑結合的抑制作用，其中對結合的抑制表明是一種有用的瞬時外向鉀離子通道活性劑。
3.治療一種疾病或癥狀的方法，其中調節瞬時外向鉀離子通道活性對所述病癥在治療上是有用的，該方法包括下列步驟給藥一種治療有效的特異性瞬時外向鉀離子通道抑制劑。
4.治療一種疾病或癥狀的方法，其中調節瞬時外向鉀離子通道活性對所述病癥在治療上是有用的，該方法包括下列步驟給藥一種治療有效的鉀離子通道抑制劑，所述抑制劑相應于存在于蜘蛛毒素中的抑制劑。
5.權利要求4的方法，其中所述通道是一種瞬時外向鉀離子通道。
6.從蜘蛛毒液中可獲得的抑制劑或該多肽的獨特片段或多肽的類似物，其對調節一種鉀離子通道具有活性的。
7.篩選一種鉀離子通道活性劑的方法，包括下列步驟把一種所述鉀離子通道與源自蜘蛛毒液的一種已知鉀離子通道抑制劑和一種可能的鉀離子通道活性劑接觸，并測定所述可能的活性劑對所述已知抑制劑結合的抑制作用，其中對結合的抑制表明是一種有用的鉀離子通道活性劑。
8.權利要求2的方法，其中所述外向鉀離子通道抑制劑選自化合物1、化合物2和化合物3。
9.權利要求3的方法，其中所述瞬時外向通道抑制劑選自化合物1、化合物2和化合物3。
10.權利要求2的方法，其中所述瞬時外向鉀離子通道源于心臟或神經組織。
11.一種含有化合物3或其藥學上可接受的鹽的組合物。
12.一種藥物組合物，含有選自化合物1、化合物2和化合物3中的一種化合物。
13.權利要求1的一種抑制劑，選自化合物1、化合物2和化合物3。
14.使用從蜘蛛毒液中分離出來的一種鉀離子通道抑制劑作為殺蟲劑的方法，包括下列步驟給昆蟲或其環境使用存在于蜘蛛毒液中的一種抑制劑。
全文摘要
有效的特異性瞬時外向鉀離子通道抑制劑，和源于蜘蛛毒液的多肽及其用途。
文檔編號A61K35/56GK1125402SQ94192030
公開日1996年6月26日 申請日期1994年3月14日 優先權日1993年3月18日
發明者M.C.桑金內蒂, A.L.米勒 申請人:Nps藥物有限公司