生產重建脂蛋白的方法

專利名稱：生產重建脂蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及以工業規模由載脂蛋白和脂類生產重建高密度脂蛋白(rHDL)的方法。rHDL具有如下性質在生物體內與脂類和類脂物質結合，能夠轉運這些物質并能影響其活性。因此，rHDL可用于對與脂類和類脂物質有關的疾病進行各種預防和治療。
人血液中的脂蛋白能夠使一系列的各種功能。脂蛋白的一種經過詳細研究而為人所熟知的功能是轉運脂類。脂蛋白具有與不溶性脂類結合、在水性環境中轉運這些脂類并將其帶至其目的地的能力。有時把個別的幾類脂蛋白與脂代謝失調較為緊密地聯系起來進行研究。在多數西方國家中，流行病學研究表明心血管病與血漿膽固醇高或低密度脂蛋白膽固醇(LDL膽固醇)高之間有正相關關系，與HDL高或HDL膽固醇高之間有負相關關系。雖然在市場上可以買到已證明有降脂效果的全套藥物，但可以想象，在某些病例中宜置換合適的脂蛋白。在這些病例中，合適的脂蛋白首先就是“好”脂蛋白，如HDL或HDL樣顆粒，例如由分離的載脂蛋白和合適的脂類得到的重建HDL(rHDL)。
除了由食物攝入的脂類外，還可以轉運或結合由其他脂類或類脂物質得到的脂蛋白。例如，死細胞的一些組分能與脂蛋白結合并被賦予新的功能。類脂物質如脂多糖(LPS)也可以與脂蛋白結合。脂多糖或內毒素是革蘭氏陰性菌細胞膜的組分。如果有足夠大量的內毒素能夠進入心血管系統，就會導致膿毒性休克甚至死亡。由于LPS與脂蛋白結合，可以調節改變LPS的功能或活性。通過加入脂蛋白或脂蛋白樣顆粒，可以在體內或體外顯著改變LPS活性。例如在體內可以證明加入重建HDL后抑制了腫瘤壞死因子(TNF)的形成，而腫瘤壞死因子是膿毒癥的一種重要介體。在體內，通過給予HDL或rHDL可使休克癥狀大大減輕。
除了脂蛋白或重建脂蛋白與脂類或類脂物質的相互作用外，文獻中還描述了脂蛋白與蛋白的相互作用脂蛋白能參與補體系統個別組分的相互作用，并因此而影響其活性;
同樣，已知凝血系統的一些組分也存在于脂蛋白部分中，也就是說，這些組分與某些脂蛋白相關聯;
在HDL部分中發現了急性期蛋白，如血清淀粉狀蛋白A(SAA);
此外，某些蛋白在表面上的吸附會由于用蛋白預處理而受到影響。
通過與細胞的特異性或非特異性結合，脂蛋白也能影響細胞活性血小板被激活的能力會由于HDL的結合而下降，也會由于加于LDL而受到刺激;
單核細胞和巨噬細胞同樣具有脂蛋白受體，脂蛋白的結合或吸收會引起這些細胞活性的變化;
參與宿主防御系統的其他細胞如中性白細胞的活性，也同樣會由于脂蛋白的結合而得到改變或調節;
此外，用成膠質細胞瘤細胞作例子表明，腫瘤細胞的生長也會由于脂蛋白而受到影響。
在科技文獻中還可以找到描述脂蛋白與病原體相互作用的報道。例如，據說脂蛋白有一種抗微生物活性。現已證明，也可以借助脂白使病毒影響。
在科技文獻中還可以找到描述脂蛋白與病原體相互作用的報道。例如，據說脂蛋白有一種抗微生物活性。現已證明，也可以借助脂蛋白使病毒滅活，或者(以錐蟲為例)可以使寄生蟲受到影響或分別受到抑制。
這些例子表明了將脂蛋白或rHDL用于預防或治療應用的多種可能性。
脂蛋白分為四大類乳糜微粒、VLDL(極低密度脂蛋白)、LDL(低密度脂蛋白)和HDL(高密度脂蛋白)，其中乳糜微粒是主要由甘油三酯組成的顆粒，正常情況下只在進食脂肪性食物后較大量地出現在血漿中。上述命名方法源于利用超離心來分離脂蛋白的方法。經典方法用密度梯度來分離脂蛋白。這種方法只能以實驗室規模應用，因為它需要專門的裝置且耗時很長。用這種方法在幾天內至多只能制得幾百毫克脂蛋白或載脂蛋白。分離載脂蛋白或脂蛋白的其他方法也曾一度為人所知，這些方法在許多情況下都是基于沉淀法，例如借助二價陽離子和/或聚乙二醇或葡聚糖進行沉淀。分離載脂蛋白的另一個可能方法是如歐洲專利EP0329605B1所述利用醇分級分離法進行沉淀。利用最后提到的這種方法，有可能分離出較大量的載脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ)或富含apoA-Ⅰ的部分，并使其可供在治療上應用。利用如此分離出的apoA-Ⅰ或富含apoA-Ⅰ的蛋白部分已進行了一系列實驗，既有用動物也有用人進行的實驗。根據這些實驗，不僅可以證明這些產品就病毒而言的安全性，而且apoA-I的使用形式不會在人或動物體內引起明顯的副反應。盡管如此，在體外試驗中卻一種所希望的活性也測不出，例如測不出膽固醇轉運或apoA-Ⅰ對諸如中性白細胞、巨噬細胞、單核細胞或血小板的作用。在動物體和人體內進行的體內試驗中，都觀察到apoA-Ⅰ在血漿中的半壽期很短。由于游離apoA-Ⅰ的分子量小(28000道爾頓)，存在apoA-Ⅰ被腎臟排出的可能。實際上，在家兔尿可檢測到apoA-Ⅰ。這些結果證實，大量輸注的apoA-Ⅰ并不分布到所希望的脂蛋白部分中。由于其半壽期短，apoA-I的體內作用至多也只能持續很短的時間。因此，要通過以脂蛋白或脂蛋白樣顆粒輸注apoA-I來實現一種更為合適的施用形式。
生產重建脂蛋白的方法已在科技文獻中有描述，尤其是生產載脂蛋白A-Ⅰ、A-Ⅱ、A-Ⅳ、apoC和apoE的方法(A.Jonas，Methods in Enzymology 128∶553-582，1986)。最常用于重建的脂是由卵或大豆中提取出的磷脂酰膽堿。也使用其他磷脂以及諸如甘油三酯或膽固醇等脂類。重建時，將脂類先溶于有機溶劑，然后在氮氣下蒸發。在該方法中，脂以薄膜狀粘在玻璃壁上，然后加入載脂蛋白和一種去污劑(通常是膽酸鈉)并混合。加入的膽酸鈉使脂分散。經過合適的保溫期后，將混合物用大量的緩沖液透析較長的時間，從而除去大部分膽酸鈉，同時脂類和載脂蛋白自發地自身形成脂蛋白或所謂的重建脂蛋白。作為透析法的替代方法，可以利用能吸附去污劑的疏水性吸附劑(Bio-Beads SM-2，Bio-Rad;Amberlite XAD-2，Rohm & Haas)(E.A.Bonomo，J.B.Swaney，J.Lipid Res.，29∶380-384，1988)，也可以利用凝膠色譜法(Sephadex G-25，Pharmacia)除去去污劑。還可以不用去污劑來生產脂蛋白，例如通過將合適脂的水性懸浮液與載脂蛋白一起保溫，在載脂蛋白中加入溶于有機溶劑中的脂并對該混合物另外加熱或不另外加熱，或者通過對apoA-Ⅰ脂混合物進行超聲處理。利用這些方法，由(例如)apoA-Ⅰ和磷脂酰膽堿起始，可以得到相應于新生態脂蛋白的盤形顆粒。通常在保溫后利用離心法或凝膠色譜法分離未結合的載脂蛋白和游離脂，以分離出均一的重建脂蛋白顆粒。
美國專利5，128，318描述了一種生產重建HDL的方法，該方法借助有機溶劑將磷脂酰膽堿溶于一種溶液中。
上述的生產重建脂蛋白的方法，只適于幾毫克到至多幾克的較小量實驗室規模生產，原因如下
溶液在中間產品中的高度稀釋使混合物不可能在要求的時間內進行加工;
通常得不到大體積所必需的基礎結構;
所用的有機溶劑對環境有害;
最終產品不能貯存;
最終產品的濃度過低，因此給患者輸注的體積將會過大;
產品通常必須進一步純化，例如利用凝膠色譜法從所要的rHDL顆粒中分離出殘留的游離脂和/或游離蛋白。
另外，A.Hubsch等人(Circulatory Shock 40∶14-23，1993)描述了一種生產重建脂蛋白的方法，該方法采用的載脂蛋白與脂比例為1∶200。該方法的結果是所得的產品含有可觀的一部分游離脂，這對其治療應用有不利影響。
就rHDL在人體中的治療或預防應用而言，rHDL的劑量必須以克計才能使apoA-Ⅰ或HDL的血漿水平顯著提高。因此，用上述方法不可能以千克規模或更大規模經濟地生產出用于臨床目的的rHDL。
因此，本發明的目的是提供一種生產不具有上述缺點的rHDL的方法，具體地說，該方法的產品不含大部分游離脂或游離apoA-Ⅰ。本發明的另一個目的是提供一種不加有機溶劑就能夠進行的方法。現已發現，利用簡單、快速且在工業上適用的手段，能夠由載脂蛋白和脂類生產出重建脂蛋白，尤其是重建HDL(rHDL)。
所以，本發明的主題是一種由載脂蛋白和脂類工業生產含重建脂蛋白顆粒的制備物的方法，該制備物在蛋白含量為20±2g/l，溫度為20℃±2℃時的濁度小于40NTU(比濁法濁度單位)，其中，在不加有機溶劑的條件下，使濃度為1-40g蛋白/升的載脂蛋白水溶液與脂-去污劑水溶液混合，脂與去污劑的摩爾比在1∶0.5至1∶4.0范圍內，載脂蛋白與脂的重量比在1∶1.5至1∶5.0范圍內，所得的載脂蛋白-脂-去污劑混合物隨后在脂在水中的相轉變溫度±10℃范圍內的溫度下保溫，利用排阻法或吸附劑吸附法分離去污劑，直到形成直徑5-50nm、分子量50000至1000000道爾頓的蛋白-脂顆粒，其中，如果不經過進一步的純化步驟，有大于95%的所用蛋白與大于90%的總脂結合。
本發明的主題也是一種由載脂蛋白和脂類工業生產含重建脂蛋白顆粒的穩定冰凍干燥物的方法，其中，不必加入有機溶劑，使濃度為1-40g蛋白/升的載脂蛋白水溶液與脂-去污劑水溶液混合，脂與去污劑的摩爾比在1∶0.5至1∶4.0范圍內，載脂蛋白與脂的重量比在1∶1.5至1∶5.0范圍內，所得的載脂蛋白-脂-去污劑混合物隨后在脂在水中的相轉變溫度±10℃范圍內的溫度下保溫，利用排阻法或吸附劑吸附法分離去污劑，直到形成直徑5-50nm、分子量50000至1000000道爾頓的蛋白-脂顆粒，其中，如果不經過進一步的純化步驟，有大于95%的所用蛋白與大于90%的總脂結合，得到一種流體產品，該產品在蛋白含量為20±2g/l，溫度為20℃±2℃時的濁度小于40NTU，所得產品利用選自碳水化合物如蔗糖或甘露醇的穩定劑通過冰凍干燥來穩定化。
所用的載脂蛋白有例如，重組載脂蛋白、由人血漿載脂蛋白A-Ⅰ的濃縮部分得到的載脂蛋白、載脂蛋白片段、或具有兩親性質的天然、合成或重組多肽。載脂蛋白的片段可以通過天然或合成載脂蛋白的化學或酶斷裂來制取。作為化學斷裂的實例，可以提出用溴化氰處理，作為酶斷裂的實例，可以提出蛋白酶，如胰蛋白酶。
本發明所用的脂-去污劑溶液中所含的脂的例子有可來源于大豆或卵的磷脂、膽固醇、膽固醇酯、脂肪酸或甘油三酯。去污劑優選膽酸或其鹽，例如膽酸鈉或脫氧膽酸鈉。
本說明書中給出的溫度20±2℃包括落在18℃至22℃范圍內的所有值。蛋白含量20±2g/l包括18g/l至22g/1范圍內的所有濃度。術語“相轉變溫度±10℃”包括落在低于相應脂在水性環境中的相轉變溫度10℃的溫度到高于該脂的相轉變溫度10℃的溫度之間這一范圍內的所有溫度。這些溫度值涵蓋了從溶液的冰點到50℃之間的范圍，其中優選低于25℃的溫度。
優選的起始材料是由人血漿純化出來的脂蛋白，該脂蛋白已用合適的手段如巴氏消毒法進行過病毒滅活。通過該方法產生的變性蛋白(聚集體)隨后通過在弱堿性pH和略高的溫度下保溫而得以復性，保溫過程在一種離液序列高的組分如脲或鹽酸胍存在下進行，從而在蛋白于10mMNaCl中進行緩沖液交換后，有大于70%的apoA-Ⅰ呈單體形式(利用分析排阻色譜法測定將40μg apoA-Ⅰ加到TSKG3000SWUltropac柱(LKB)上，緩沖液為10mM磷酸鈉、0.02%疊氮鈉，pH7.4;流速為0.4ml/分;在280nm處測定流出液)。
在進一步的加工過程中，將高濃度的脂蛋白與脂(諸如磷脂酰膽堿等磷脂、膽固醇、甘油三酯等)在膽酸或其鹽(如膽酸鹽、脫氧膽酸鹽、烏索脫氧膽酸鹽)的溶液中的溶液混合，溶液中不含有機溶劑。與Hubsch等人(Circulatory Shock 40∶14-23，1993)所述的工作不同的是，載脂蛋白與脂的比例的選擇方式是使終產物中既沒有大量的游離脂，也沒有大量游離載脂蛋白，因此使可以不對rHDL進行進一步的純化。具體地說，apoA-Ⅰ磷脂酰膽堿比例降低了，該比例明顯低于1∶200(摩爾比;重量比約為1∶5.5)，即降低到1∶50至1∶180范圍內的比例，優選1∶100至1∶150(摩爾比;對apoA-Ⅰ和大豆磷脂酰膽堿而言相應的重量比為1∶2.8至1∶4.2)。這一做法與透濾法相結合，致使游離脂的含量(利用排阻色譜法、Superose6凝膠過濾法定量測定，見下文)急劇下降，同時也使終產物中的膽酸濃度大大降低。高濃度的膽酸和高含量的游離磷脂酰膽堿都能在體外和體內造成細胞損傷，因此必須對其加以準確控制。一方面，膽酸鹽濃度要針對apoA-Ⅰ磷脂酰膽堿比例進行優化，同時又要在必要時與脂尤其是膽固醇的額外加入相適應。這里的最佳濃度也是通過在終產物中取盡可能少量的游離脂和游離apoA-Ⅰ來測定的。對apoA-Ⅰ磷脂酰膽堿比例為1∶150的rHDL制備物來說，測得膽酸鈉的摩爾比為1∶200(即，在將要敘述的保溫過程中apoA-Ⅰ磷脂酰膽堿膽酸鈉＝1∶150∶200(摩爾比))。于0℃-2℃下保溫4-16小時后(對大豆磷脂酰膽堿而言)利用透濾法降低膽酸濃度，所用超濾膜的孔徑相應于1000到10000道爾頓，優選30000道爾頓以下的球蛋白。因此，必要的緩沖液具有低于100毫摩爾/升，優選低于10毫摩爾/升的低離子強度，其pH高于6，優選7.5-9，并含有低濃度的碳水化合物，例如1%蔗糖。在這些條件下，每克蛋白使用1升至最多2升緩沖液就足以一方面達到必要的低去污劑濃度，另一方面達到要求的粒度分布。這些緩沖液體積比以前所述的方法小許多倍(10-200倍)。必要時，用一個額外的Amberlite XAD-2吸附步驟將去污劑濃度降低至要求的濃度。利用前面提到的透濾技術，將產物調至10-50g蛋白/升的高濃度，然后在穩定劑如蔗糖存在下加工成穩定的、耐貯存的終產物(流體或經過冰凍干燥的)。冰凍干燥物在使用前用水溶解，得到澄清的、略呈乳色的溶液，該溶液依其脂含量而呈淺黃色。在該溶液中，加工后測定的rHDL顆粒(盤形)可以以實際上不變的形式重新檢測到。利用排阻色譜法，測出小于10%比例的聚集體(大部分是游離脂)和小于5%比例的游離載脂蛋白。冰凍干燥前后測定的流體終產物的濁度，在蛋白濃度為20g/l時為40NTU以下。用酶顯色測定法測得的膽酸鹽含量通常小于每克蛋白0.5g膽酸鈉(膽酸的檢測是借助3-α-羥基類固醇脫氫酶通過在NAD+存在下形成NADH來進行，所形成的NADH在心肌黃酶催化下與硝基四唑藍反應，形成藍色的甲替衍生物，再用光度法檢測)。
冰凍干燥rHDL在溶解于適當體積的溶劑(優選水)中后，通過電子顯微鏡觀察發現，rHDL的存在形式為與新生HDL類似的盤形顆粒，其直徑為5-50nm，通常為8-20nm，厚度為2-6nm。利用測定粒度及其相對分布的分析方法，例如用Superose 6HR10/30柱(Pharmacia Biotech)在生理緩沖液中進行凝膠過濾(排阻色譜)，測得大于80%的顆粒處于10000至1000000道爾頓的分子量范圍內。同樣，根據梯度凝膠電泳(A.V.Nichols等人的方法，見Methods in Enzymology 128∶417-431，1986)結果，大于80%的顆粒的分子量分布在50000至1000000道爾頓范圍內。
附圖
有助于更好地理解本發明，并支持上述的實施方案。該附圖顯示了用不同apoA-Ⅰ與磷脂酰膽堿比例生產的rHDL顆粒的凝膠過濾洗脫圖(吸收-洗脫對時間作圖)。[apoA-Ⅰ和rHDL顆粒的高效排阻色譜;在用PBS(10mM磷酸鈉、150mM NaCl，pH7.4)平衡的Superose 6HR10/30柱(Pharmacia Biotech)上分離100μl 0.9%NaCl中的200μg rHDL，流速為0.5ml/分]。在280nm處測定柱流出液的光吸收(L.L.Rudel，C.A.Marzetta和F.L.Johnson，Methods in Enzymology 129∶45-57，1986)。為確定色譜圖中各部分的含量，計算曲線下的面積。由1∶200產物的洗脫曲線可見，洗脫開始時游離脂被洗出，而1∶100-1∶150產物則不是這樣。作為比較，同樣也畫出了純載脂蛋白(apoA-Ⅰ)的曲線。
下列實施例進一步說明本發明，但這些實施例不應認為是限制本發明的定義。
實施例1將1kg apoA-Ⅰ溶解于500升0.15摩爾/升NaCl中。另外如下制備脂溶液將大豆油磷脂酰膽堿(Phospholipon 90 ，Nattermann，Cologne，Germany)溶解于由10毫摩爾/升Tris/HCl、150毫摩爾/升NaCl、1毫摩爾/升EDTA組成的緩沖液(pH8.0)中，將2.8Kg磷脂酰膽堿和2.325Kg膽酸鈉溶于上述緩沖液使體積為100升。攪拌1-2小時，必要時加熱至約40℃，直到溶液澄清。然后冷卻到4℃，使100升該脂-膽酸鹽溶液與1kg apoA-Ⅰ混合使體積達到500升。將混合物于2-4℃下緩慢攪拌過夜。經過這一保溫過程后進行過濾滅菌，并用帶有PTGC槽的Pellicon于4℃下透濾，該透濾裝置的額定分子量極限(NMWL)為10000道爾頓。透濾時先用4倍體積的5毫摩爾/升碳酸氫鈉，然后再用2倍體積的10%蔗糖，并保持產物的體積恒定。然后緩慢提高濃度，直到蛋白濃度達到20g/l。將溶液再次過濾滅菌并裝入小瓶中，然后進行冰凍干燥。在整個操作過程中要特別小心保護脂溶液使其不接觸空氣、光和過高的溫度。終產物溶于適量的水中之后得到20±1g/l的蛋白濃度，該產物的apoA-Ⅰ與磷脂酰膽堿的摩爾比為1∶100，游離脂少于5%，濁度小于40NTU。
實施例2將10kgapoA-Ⅰ溶解于2000升10毫摩爾/升NaCl中。將1.38kg膽固醇和29.9kg膽酸鈉置于200升緩沖液中攪拌，該緩沖液中含有10毫摩爾/升Tris-HCl、150毫摩爾/升NaCl、1毫摩爾/升EDTA，pH8.0。將溫度提高到65℃，將混合物攪拌2小時直到得到澄清溶液。然后冷卻到20℃，加入27.9kg磷脂酰膽堿。然后將溶液冷卻到4℃，再攪拌2小時。將該混合物加到蛋白溶液中，混合后過濾滅菌。于4℃下將濾液緩慢攪拌過夜(至少16小時)。然后保持產物的體積恒定，用4倍體積的50毫摩爾/升NaCl、1毫摩爾/升EDTA，pH7.5透濾2-4小時，然后用2倍體積的10%蔗糖進行透濾。然后將溶液的濃度提高到蛋白濃度為20g/l。然后將溶液過濾滅菌，裝入玻璃小瓶內并冰凍干燥。將小瓶真空密封并在4℃下置于暗處。用這一方法以apoA-Ⅰ∶磷脂酰膽堿膽固醇摩爾比為1∶100∶10的摩爾比得到rHDL。
實施例3以apoA-Ⅰ∶磷脂酰膽堿為1∶150比例生產rHDL將3.08kg膽酸鈉溶解于25升緩沖液中，該緩沖液為10毫摩爾/升Tris-HCl、10毫摩爾/升NaCl、1毫摩爾/升EDTA，pH8.0。在該溶液中于室溫下再溶解4.2kg磷脂酰膽堿。然后加入1kgapoA-Ⅰ在200升10毫摩爾/升NaCl中的溶液，將該混合物于0-4℃下保溫過夜。然后以恒定的體積進行透濾，先用4倍體積的50毫摩爾/升NaCl、1毫摩爾/升EDTA，pH7.5透濾4小時，再用2倍體積的1%蔗糖進行透濾。最后將濃度提高到20g/l蛋白。再加入一些固體蔗糖使蔗糖濃度提高到10%。將該溶液過濾過菌并冰凍干燥。
實施例4以apoA-Ⅰ∶磷脂酰膽堿膽固醇為1∶100∶10的比例生產rHDL將4.61kg膽酸鈉溶于25升緩沖液中，該緩沖液含有10毫摩爾/升Tris-HCl、10毫摩爾/升NaCl、1毫摩爾/升EDTA，pH8.0。于65℃下將138g膽固醇溶解于此緩沖液-膽酸鹽混合物中2小時。然后將該混合物冷卻至室溫，在其中溶解2.8kg磷脂酰膽堿1小時。加入1kgapoA-Ⅰ在200升10毫摩爾/升NaCl中的溶液。將該混合物如前一實施例所述進行保溫，同樣進行透濾，并如上所述提高濃度。
實施例5apoA-Ⅰ∶磷脂酰膽堿∶膽固醇比例為1∶150∶10∶將5.38kg膽酸鈉溶解于實施例3和4所述的緩沖液中。于65℃下在該溶液中溶解180g膽固醇2小時。然后加入4.2kg磷脂酰膽堿，并于室溫下溶解1小時。將該混合物加到200升5g/lapoA-Ⅰ在10毫摩爾/升NaCl中的溶液中，并于4℃下保溫過夜。如上所述透濾并生產出終產物。
實施例6以低膽酸鈉含量生產rHDL。如實施例1-5所述生產出rHDL。在經過透濾并提高濃度后，將1倍體積的rHDL溶液與Amberlite XAD-2(2倍體積)混合，在充分混合的同時將該混合物于4℃下保溫1小時。保溫后，如實施例1-5所述過濾分離出rHDL，過濾滅并冰凍干燥。
實施例7將400gapoA-Ⅰ在80ml10毫摩爾/升NaCl中的溶液與一種脂溶液混合，所述脂溶液由1.66kg磷脂酰膽堿、1.23kg膽酸鈉在實施例3-6中所述的緩沖液中構成。將該混合物于0-2℃下保溫16小時。然后先用4倍體積的EDTA(0.1毫摩爾/升)，再用2-4倍體積的蔗糖(1%)進行透濾，最后將濃度提高到蛋白濃度為21-25g/l。然后把rHDL溶液調至終濃度為10%蔗糖和20g/l蛋白。過濾滅菌后以50g為一份分裝(50ml小瓶中裝1grHDL)，并冰凍干燥。
實施例8用醇沉淀法由980kg沉淀Ⅳ(Kistler，P.，Nitschmann，H.;Vox Sang，7∶414-424，1962)制得11.2kg沉淀apoA-Ⅰ。將其懸浮于3倍體積的4M鹽酸胍溶液中。將pH調至5.2，將溶液于60℃下巴氏滅菌10小時。在pH7.5和45℃下使蛋白溶解。過濾后，利用Sephadex G-25(Pharmacia Biotech)凝膠過濾法，與10mMNaCl溶液進行緩沖液交換。得到總共含1040gapoA-Ⅰ的160kgapoA-Ⅰ溶液。在0-2℃下使蛋白溶液與脂溶液一起保溫2-16小時。脂溶液是在室溫下用以下方法另外制備的將大豆油磷脂酰膽堿溶解于實施例3-7所述的緩沖液中。在26kg該緩沖液中溶解3203g膽酸鈉和4460g磷脂酰膽堿。在后續的透濾中(NMWL＝10000道爾頓)，先將蛋白-脂混合物的濃度提高到7g蛋白/升。然后用1%蔗糖溶液進行透濾，直到膽酸鹽含量達到小于4g/l。pH一直保持在至少7.5。最后，將溶液的濃度提高到25g/l蛋白，并加蔗糖使其穩定化。將終產物調至蛋白濃度為20g apoA-Ⅰ，蔗糖濃度為100g/l，并過濾滅菌。在排阻色譜中，測得游離脂不到5%，游離apoA-Ⅰ不到1%。將該蛋白-脂混合物以50ml為一份分裝，并冰凍干燥。終產物溶于適量水中后顯示apoA-Ⅰ磷脂酰膽堿的摩爾比為1∶140。
權利要求
1.一種由載脂蛋白和脂類工業生產含重建脂蛋白顆粒的制備物的方法，該制備物在蛋白含量為20±2g/l，溫度為20℃±2℃時的濁度小于40NTU，其中，使濃度為1-40g蛋白/升的載脂蛋白水溶液與脂-去污劑水溶液混合，脂與去污劑的摩爾比在1∶0.5至1∶4.0范圍內，載脂蛋白與脂的重量比在1∶1.5至1∶5.0范圍內，所得的載脂蛋白-脂-去污劑混合物隨后在脂在水中的相轉變溫度±10℃范圍內的溫度下保溫，利用排阻法或吸附劑吸附法除去去污劑，直到形成直徑5-50nm、分子量50000至1000000道爾頓的蛋白-脂顆粒，其中，如果不經過進一步的純化步驟，有大于95%的所用蛋白與大于90%的總脂結合。
2.權利要求1的方法，其中脂-去污劑水溶液不含必要量的有機溶劑。
3.權利要求1的方法，其中通過排阻法或透濾法除去去污劑，每克蛋白最多使用2升緩沖液。
4.權利要求1的方法，其中在脂-載脂蛋白-去污劑混合物保溫后，通過用分批吸附法或柱吸附法在疏水性吸附劑上吸附來結合去污劑。
5.權利要求4的方法，其中疏水性吸附劑是不溶性的交聯聚苯乙烯共聚物。
6.權利要求1的方法，其中脂-去污劑溶液含有磷脂、膽固醇、膽固醇酯、脂肪酸和/或甘油三酯。
7.權利要求1的方法，其中作為載脂蛋白使用的是富含載脂蛋白A-Ⅰ的人血漿的一個部分，該部分已用至少一個病毒滅活步驟處理過，處理方法是先在一種含有高離液序列組分的溶液中保溫，然后在離子強度小于50毫摩爾/升的溶液中進行緩沖液交換，其后有大于70%的脂蛋白呈單體形式。
8.權利要求1的方法，其中脂-去污劑溶液中主要含有磷脂作為脂組分。
9.權利要求8的方法，其中磷脂是合成的磷脂酰膽堿。
10.權利要求1的方法，其中磷脂是天然磷脂，優選從大豆或卵中提取出的磷脂。
11.權利要求10的方法，其中磷脂是大豆磷脂酰膽堿，載脂蛋白-脂-去污劑混合物的保溫在0-15℃的溫度下進行。
12.權利要求1的方法，其中所用的去污劑選自膽酸類或其鹽。
13.權利要求12的方法，其中去污劑是膽酸鈉或脫氧膽酸鈉。
14.權利要求1的方法，其中載脂蛋白水溶液中含有載脂蛋白、重組載脂蛋白、得自人血漿富含載脂蛋白A-I部分的載脂蛋白、載脂蛋白片段、或合適的具有兩親性質的天然、合成或重組多肽。
15.權利要求1的方法，其中在脂-載脂蛋白-去污劑混合保溫后，利用透析法或透濾法將去污劑的含量降低至濃度低于每克蛋白0.5克去污劑。
16.權利要求1的方法，其中在分離出去污劑之前或之后，利用透濾法將蛋白濃度提高到10-50g/l。
17.權利要求1的方法，其中載脂蛋白水溶液或脂-去污劑溶液被緩沖在pH6-pH9范圍內的pH。
18.權利要求17的方法，其中載脂蛋白水溶液或脂-去污劑溶液被緩沖在pH7.5-pH8.5范圍內的pH。
19.一種由載脂蛋白和脂類工業生產含重建脂蛋白顆粒的穩定冰凍干燥物的方法，其中，使濃度為1-40g蛋白/升的載脂蛋白水溶液與脂-去污劑水溶液混合，脂與去污劑的摩爾比在1∶0.5至1∶4.0范圍內，載脂蛋白與脂的重量比在1∶1.5至1∶5.0范圍內，所得的載脂蛋白-脂-去污劑混合物隨后在脂在水中的相轉變溫度±10℃范圍內的溫度下保溫，利用排阻法或吸附劑吸附法除去去污劑，直到形成直徑5-50nm、分子量50000至1000000道爾頓的蛋白-脂顆粒，其中，如果不經過進一步的純化步驟，有大于95%的所用蛋白與大于90%的總脂結合，得到一種流體產品，該產品在蛋白含量為20±2g/l，溫度為20℃±2℃時的濁度小于40NTU，所得產品在選自碳水化合物的穩定劑存在下通過冰凍干燥來穩定化。
20.權利要求19的方法，其中脂-去污劑水溶液不含必要量的有機溶劑。
21.權利要求19的方法，其中將產品調至蛋白濃度為5-50g/l，并在5-15%二糖如蔗糖或2-10%單糖如甘露醇存在下，對溶液進行冰凍干燥以使產品穩定化。
全文摘要
由載脂蛋白和脂類生產重建高密度脂蛋白(rHDL)，其中不必加有機溶劑，使濃度為1－40g蛋白/升的載脂蛋白水溶液與脂-去污劑水溶液混合，脂與去污劑的摩爾比為1∶0.5至1∶4，脂與去污劑的重量比為1∶1.5至1∶5，所得的載脂蛋白-脂-去污劑混合物再在脂在水中的相轉變溫度±10℃范圍的溫度下保溫，至少部分除去去污劑，rHDL可用于對與脂類和類脂物質有關的疾病進行各種預防和治療。該方法特別適于工業生產。
文檔編號A61P3/06GK1108662SQ94119129
公開日1995年9月20日 申請日期1994年12月31日 優先權日1993年12月31日
發明者P·勒希, G·霍德勒, V·福爾施 申請人:瑞士紅十字會創立血液捐贈服務中央實驗室