專利名稱：一種隱孔菌菌粉的生產方法
技術領域：
本發明涉及微生物的生產方法，特別是一種隱孔菌菌粉的生產方法。
隱孔菌Cryptoporus volvatus(peck)Hubbard屬于非褶菌目，多孔菌科，隱孔菌屬，只有單一的一個隱孔菌種。具有平喘、止咳、祛痰、抗過敏、抗感染等藥用功效，是一種高效、低毒、無副作用的藥物。其植物形態、生長環境、生物學特性、藥用功效等已在國內外文獻雜志中作過多次報道，如《藥用真菌隱孔菌的生物學特性研究》(作者華啟洪、孫靜、沈禮，“中國中藥雜志”1991年第16卷第12期)；《中藥隱孔菌揮發油成分研究》(作者華啟洪、金國梁、沈禮，“中國藥學雜志”1993年第28卷第2期)；《中藥隱孔菌的化學成分》作者華啟洪、金國梁，“植物資源與環境”1993.2(1)60-61頁)。《隱孔菌生產的抗腫瘤多糖》(Antitumor polysaccharigdesproduced by Cryptoporus)[作者Usno，Saburo等，japen，kekai7894，021，1978；C.A.Vol，89，195409h).《隱孔菌生長所需要的營養素》(Nutritional reguirents forgrowth of Cryptoporus volvatus)作者Peffey，ThomasM.Can.J.Bot.1989.67(8)，2532-4，1989；C.A.Voi.111.211745v。《云南本草》(作者蘭茂，云南人民出版社出版，)見附件。野生隱孔菌在黑龍江、河北、湖北、福建、廣東、廣西、海南島、四川、云南、西藏、陜西、吉林、浙江、江西等省均有分布，但比較分散，采集加工困難，而且藥源數量稀少。隱孔菌菌種可由野生隱孔菌經組織分離、馴化培養獲得，也可以直接向中國科學院昆明植物研究所購買(見附件證明)，因此隱孔菌已經多次在國內外期刊文獻中使用，為本領域的專業人員所熟知，菌種也可以任意購得，可以認為隱孔菌菌種是公眾能夠得到的，所以該菌種的生產方法申請專利時，不需要提交中國專利局指定的單位保藏。我國支氣管哮喘的患病率占總人口的5.29％左右，達四、五千萬人之多，且尚有日益增多的趨勢，目前臨床上使用的藥物有一定的副作用和毒性，尤其對心血管的副作用更大，雖然隱孔菌具有很好的平喘、止咳功效，且低毒無副作用，可以成為一種優良的平喘、止咳藥物。但尚未有工業化規模生產隱孔菌藥物的報導。
本發明的目的就是要提供一種隱孔菌菌粉的規模化生產方法。
本發明的任務是以如下方式完成的一種隱孔菌菌粉的生產方法，其特點在于(a)將保存在4±1℃條件下的已知隱孔菌菌種Cryptoporusvolvatus(peck)Hubbard通過無菌操作移植到下述培養基中，在23—30℃條件下活化培養6-7天，培養基的組分和含量為葡萄糖 10-50g玉米粉 5-20g酵母粉 0.5-2gKH2PO40.5-2gMgSO40.2-1gVB13.0-5.0mg瓊脂20g水 1000ml上述培養基的PH值為4—7，消毒滅菌，然后(b)將上述活化后的隱孔菌菌絲移入內裝200-250ml下述培養基的1000ml三角燒瓶中，在振蕩頻率為150-220rmp、溫度為23—30℃條件下在旋轉式搖瓶機中振蕩培養5天，培養基的組分及含量為
葡萄糖 20-50g玉米粉 10-20g酵母粉 1-3gKH2PO40.1-1gMgSO40.05-0.5gVB13.0-5.0mg水 1000ml上述培養液的PH值為4-7，消毒滅菌，然后(c)在100l3的種子罐中裝入等于或小于70％罐容量的下述培養液，用壓差法移接相當于罐容量5-10％搖瓶培養的隱孔菌菌絲液，在通風量為1∶0.2-1.0(v/v分鐘)，葉輪攪拌速度為100-200rpm，罐壓0.5-1.0kg/cm2，溫度23-30℃條件下培養48h，培養液的組分及含量為葡萄糖 50-400g玉米漿 4-15g蛋白胨 1-8g酵母膏 1-3gKH2PO40.5-2gMgSO40.25-1.0g(NH4)2SO42-8g水 1000ml上述養液的PH值為4-7，消毒滅菌，然后(d)在1000l3-5000l3的發酵罐中裝入等于或小于70％罐容量的下述培養液，再裝入5-10％罐容量的種子罐培養的隱孔菌菌絲液，在通風量為1∶0.2-0.6(v/v分鐘)，葉輪攪拌速度為100-200rpm，罐壓0.5-1.0kg/cm2，溫度為23-30℃條件下培養發酵4天，培養液的組分及含量為葡萄糖 50-400g玉米漿 4-15g蛋白胨 1-8g酵母膏 1-3gKH2PO40.5-2gMgSO40.25-1.0g(NH4)2SO42-8g水 1000ml上述培養液的PH值為4-7，消毒滅菌，然后(e)將上述發酵罐內的隱孔菌菌絲液體壓濾，所得隱孔菌菌絲體濾餅在70-100℃條件下烘干、粉碎、過篩得到顆粒小于60目的隱孔菌菌粉。
本發明方法和已知技術相比，所采用的隱孔菌菌種易得，由于它通過三級通氣發酵進行自我繁殖而被大量獲得，其得率達到0.4-1.2％。本發明方法所采用的培養基，培養液中的碳源和氮源組分價格很便宜、含量也不高，因此生產成本很低。將用本發明方法生產的隱孔菌菌粉裝入膠囊即可構成《平喘膠囊》藥物，按年產隱孔菌菌粉4T計，可生產57萬盒平喘膠囊(0.29g×24/盒＝6.96g/盒)，每盒成本約3元，出廠價為21元/盒，稅后利潤為14.94元/盒，總利潤為850萬元。按我國4-5千萬病人中有1％，服平喘膠囊一個療程(9粒×15天)計，每年預計銷售量為240萬盒，總年利潤約3600萬元，因此具有很好的經濟效益。本發明方法無污染，因此也有很好的環境效益。
用本發明方法生產的隱孔菌菌粉所作的藥理試驗如下試驗單位(浙江醫科大學杭州分校)1、鎮咳試驗實驗方法小白鼠氨水引咳法
※5％阿拉伯樹膠1毫升/公斤。※※可待因50毫克/公斤實驗結果表明，小白鼠服本發明方法生產的隱孔菌菌粉后，其在統計學上的P值小于0.05，表明鎮咳效果顯著，以大劑量試驗的效果為最佳。
2、祛痰作用實驗方法采用小白鼠酚紅法。
5％阿拉伯樹膠1毫升/公斤。
實驗結果表明，用本發明方法生產的隱孔菌菌粉其祛痰效果很好，小、中、大劑量組在統計學上的P值均小于0.01，具有非常顯著的效果。
3、平喘作用實驗方法采用藥物性豚鼠哮喘模型，藥物引喘法
實驗表明，劑量在208毫克/公斤和2380毫克/公斤時，在統計學上的P值均小于0.01，表明本發明方法生產的隱孔菌菌粉的平喘效果非常顯著。
4、對豚鼠卵蛋白過敏性哮喘的拮抗作用實驗方法采用豚鼠過敏性支氣管痙攣試驗法。
生理鹽水※※含(生藥)39.21毫克/毫升實驗表明，本發明方法生產的隱孔菌菌粉對抗過敏的作用非常顯著，其在統計學上的P值小于0.01。
5、隱孔菌菌粉毒性生試驗(1)急性毒性試驗(LD50)口服(粉劑)LD50＞66克/公斤，最大耐授量39克/公斤～50.7克/公斤
30.98毫克/公斤，22.77毫克/公斤(2)長期毒性試驗(三個月)實驗結果服藥三個月后血液學檢查和血清生化測定的各項指標都正常，病理切片觀察，無異常發現，證明菌粉對心、肝、腎、脾、腦、睪丸或卵巢和造血系統等25個器官組織均無毒性反應。
6、臨床資料病例采自杭州市一院內科門診成年及13歲以下支氣管哮喘的患者。11例均為反復發作性或長期持性呼吸困難伴有肺部哮鳴音者。服用本發明方法生產的隱孔菌菌粉膠囊，成人每日三次，每次服三顆(每顆含隱孔菌菌粉0.29g)，兒童減半，服2-3周為一個療程，隨后評定效果。
試驗結果，本組11例治后止咳、祛痰、平喘顯效高達81.8％，好轉者9.2％，其中顯效者經隨訪二個月臨床癥狀無發作，且兩肺哮鳴音消失。11例患者治療前后測得CAMP及其比值(CAMP/CGMP)相比較有明顯差異(P＜0.05)，治療后顯見CAMP增高。臨床試驗結果表明，其療效與藥理試驗的結果完全一致。表明本發明方法生產的隱孔菌菌粉作為藥物具有很好的社會效益。
以下提供用本發明方法生產隱孔菌菌粉的三個實施例。
實施例一(a)將保存在5℃條件下的已知隱孔菌菌種Cryptoporusvolvatus(peck)Hubbard通過無菌操作移植到下述培養基中，在23℃條件下培養6天，菌絲已長滿整個斜面。
培養基配方葡萄糖10g玉米粉5g
酵母粉0.5gKH2PO40.5gMgSO40.2gVB13.0mg瓊脂 20g水1000ml上述培養基配方PH值為4菌絲生長情況菌絲灰白色，纖細、稀疏、生長緩慢，生長勢較差，(b)將上述活化隱孔菌菌種的菌絲移入內裝200m1下述液體培養基的1000ml三角燒瓶中，用旋轉式搖瓶機振蕩培養，振蕩頻率為100rpm，在23℃條件下振蕩培養5天。菌絲生長緩慢，培養基中形成一定數量的菌球，液體培養基配方葡萄糖20g玉米粉10g酵母粉1gKH2PO41gMgSO40.5gVB13.0mg水1000ml上述培養基的PH值為4(c)在100l3的種子罐中裝入60％罐容量的下述培養液，用壓差法移接相當于罐容量5％搖瓶培養的隱孔菌菌絲液，在通風量為1∶0.2(v/v分鐘)葉輪攪拌速度為100rpm，罐壓為0.5公斤/cm2，溫度為23℃條件下培養48h，
培養液的配方為葡萄糖50g玉米漿4g蛋白胨1g酵母膏1gKH2PO40.5gMgSO40.25g(NH4)2SO42g水1000ml上述培養液的PH值為4，消毒滅菌，然后(d)在1000ml的發酵罐中裝入60％罐容量的下述培養液，再裝入5％罐容量的種子罐培養的隱孔菌菌絲液，在通風量為1∶0.2(V/V分鐘)，葉輪攪拌速度為100rpm，罐壓為0.5公斤/cm2，培養溫度為22℃，發酵培養4天，培養液配方為葡萄糖50g玉米漿4g蛋白胨1g酵母膏1gKH2PO40.5gMgSO40.25g(NH4)2SO42g水1000ml上述培養液的PH值為4，消毒滅菌，然后(e)將上述發酵罐內的隱孔菌菌絲液用板框壓濾，得到隱孔菌菌絲體的濾餅，在80℃的烘房內烘干，經過粉碎，用60目篩子過篩得到隱孔菌菌粉，其得率為0.4-0.5％。
實施例二(a)將保存在4℃條件下的已知隱孔菌菌種Cryptorusvolvatus(peck)Hubbard通過無菌操作移植到下述培養基中，在26℃條件下培養6天，菌絲已長滿整個斜面培養基，培養基配方葡萄糖 35g玉米粉 10g酵母粉 1gKH2PO41gMgSO40.5gVB14.6mg瓊脂 20g水 1000ml上述培養基的PH值為6菌絲生長情況菌絲生長十分旺盛，菌絲粗壯，純白色，氣生菌絲濃密，生長勢好，(b)將活化的隱孔菌菌種的菌絲移入內裝250毫升下述培養基的1000ml的三角燒瓶中，用旋轉式搖瓶機振蕩培養。振蕩頻率為150rpm，在26℃條件下振湯培養5天、菌絲生長快，培養基中菌絲濃，菌球大小均勻，直徑約0.3-0.4mm，培養液清、淡黃色，培養基配方葡萄糖 35g玉米粉 15g
酵母粉 2gKH2PO40.5gMgSO40.1gVB14.6mg水 1000ml上述培養基的PH值為6，消毒滅菌，然后(c)在100l3種子罐中裝入70％罐容量的下述培養液，用壓差法移接相當于罐容量10％搖瓶培養的隱孔菌菌絲液，在通風量為1∶0.3(v/v分鐘)，葉輪攪拌速度為150rpm，罐壓為1kg/cm2，溫度為26℃條件下培養48h，培養液的配方為葡萄糖 350g玉米漿 10g蛋白胨 5g酵母膏 2gKH2PO41gMgSO40.5g(NH4)2SO45g水 1000ml上述培養液的PH值為6，消毒滅菌，然后(d)在5000l3的發酵罐中裝入70％罐容量的下述培養液，再裝入10％罐容量的種子罐培養的隱孔菌菌絲液，在通風量為1∶0.3(v/v分鐘)，葉輪攪拌速度為150rpm，罐壓為1kg/cm2，培養溫度為26℃，發酵培養4天，發酵產物有濃郁芳香撲鼻的揮發性氣味，顏色棕色，
培養液配方葡萄糖 350g玉米漿 10g蛋白胨 5g酵母膏 2gKH2PO41gMgSO40.5g(NH4)2SO45g水 1000ml上述培養液的PH值為6，消毒滅菌，然后(e)將上述發酵罐內的隱孔菌菌絲液體用板框壓濾，得到隱孔菌菌絲體濾餅，在90℃的烘房內烘干，經粉碎并用60目篩子過篩，得到隱孔菌菌粉，本實施例隱孔菌菌粉的得率高達1.2％，所用培養液組分的含量居中，生產成本也最低。
實施例三(a)將保存在3℃條件下的已知隱孔菌菌種Cryptoporusvolvatus(peck)Hubbard通過無菌操作移植到下述培養基中，在30℃條件下培養7天，培養基配方葡萄糖 50g玉米粉 20g酵母粉 2gKH2PO42gMgSO41gVB15.0mg
瓊脂 20g水 1000ml上述培養基的PH值為7菌絲生長情況菌絲生長較快，菌絲纖細，稀疏，灰白色，生長勢較差。
(b)將上述活化隱孔菌菌種的菌絲移入內裝250毫升已滅菌的下述培養液的1000ml三角燒瓶中，用旋轉式搖瓶機振蕩培養，振蕩頻率為200rpm，在30℃條件下振蕩培養5天，菌絲生長情況比實施例二差，培養基配方葡萄糖 50g玉米粉 20g酵母粉 3gKH2PO40.1gMgSO40.05gVB15.0mg水 1000ml上述培養基的PH值為7，消毒滅菌，然后(c)在100l3的種子罐中裝入65％罐容量的下述培養液，用壓差法移接相當于罐容量7％搖瓶培養的隱孔菌菌絲液，在通風量為1∶0.6(v/v分鐘)，葉輪攪拌速度為200rpm，罐壓為1kg/cm2，溫度為30℃的條件下培養48h，培養液配方葡萄糖 400g玉米漿 15g
蛋白胨8g酵母膏3gKH2PO42gMgSO41g(NH4)2SO48g水1000ml上述培養液PH值為7，消毒滅菌，然后(d)在1000l3發酵罐中裝入65％罐容量的下述培養液，再裝入7％罐容量的種子罐培養的隱孔菌菌絲液，在通風量為1∶0.6(v/v分鐘)，葉輪攪拌度為200rpm，罐壓為1kg/cm2，培養溫度為30℃條件下發酵培養4天，培養液配方葡萄糖400g玉米漿15g蛋白胨8g酵母膏3gKH2PO42gMgSO41g(NH4)2SO48g水1000ml上述培養液PH值為7(e)將所得發酵液經板框壓濾得隱孔菌菌絲體濾餅，在100℃烘房烘干，經粉碎，用60目篩子過篩，得到隱孔菌菌粉。
本實施例的碳源和氮源的用量均較高，培養基PH值偏高，培養溫度取上限，生產得率不高，只有0.4-0.5％。
權利要求
1.一種隱孔菌菌粉的生產方法，其特征在于(a)將保存在4±1℃條件下已知的隱孔菌菌種Cryptoporusvolvatus(peck)Hubbard通過無菌操作移植到下述培養基中，在23-30℃條件下活化培養6-7天，培養基的組分和含量為葡萄糖10-50g玉米粉5-20g酵母粉0.5-2gKH2PO40.5-2gMgSO40.2-1gVB13.0-5.0mg瓊脂 20gH2O 1000ml上述培養基的PH值為4-7、消毒滅菌，然后，(b)將上述活化后的隱孔菌菌絲移入內裝200-250ml下述培養液的1000ml三角燒瓶中、在振蕩頻率為150-220rmp、溫度為23-30℃條件下在旋轉式搖瓶機中振蕩培養5天，培養液的組分和含量為葡萄糖20-50g玉米粉10-20g酵母粉1-3gKH2PO40.1-1gMgSO40.05-0.5gVB13.0-5.0mg水 1000ml上述培養液的PH值為4-7、消毒滅菌，然后(c)在100l3的種子罐中裝入等于或小于70％罐容量的下述培養液，用壓差法移接相當于罐容量5-10％搖瓶培養的隱孔菌菌絲液，在通風量為1∶0.2-1.0(v/v分鐘)、葉輪攪拌速度為100-200rpm、罐壓0.5-1.0kg/cm2，溫度23-30℃條件下培養48h，培養液的組分及含量為葡萄糖 50-400g玉米粉 4-15g蛋白胨 1-8g酵母膏 1-3gKH2PO40.5-2gMgSO40.25-1g(NH4)2SO42-8g水 1000ml上述培養液的PH值為4-7，消毒滅菌，然后(d)在1000-5000l3的發酵罐中裝入等于或小于70％罐容量的下述培養液，再裝入5-10％罐容量的種子罐培養的隱孔菌菌絲液，在通風量為1∶0.2-0.6(v/v分鐘)，葉輪攪拌速度為100-200rpm，罐壓0.5-1.0kg/cm2，溫度為23-30℃條件下培養發酵4天，培養液的組分及含量為葡萄糖 50-400g玉米漿 4-15g蛋白胨 1-8g酵母膏 1-3gKH2PO40.5-2gMgSO40.25-1g(NH4)2SO42-8g水 1000ml上述培養液的PH值為4-7，消毒滅菌，然后(e)將上述發酵罐內的隱孔菌菌絲液體壓濾，所得隱孔菌菌絲體濾餅在70-100℃條件下烘干、粉碎、過篩得到顆粒小于60目的隱孔菌菌粉。
2.根據權利要求1所述的隱孔菌菌粉的生產方法，其特征在于(a)將保存在4℃條件下的已知隱孔菌菌種通過無菌操作移植到下述培養基中，在26℃條件下培養6天，培養基配方葡萄糖 35g玉米粉 10g酵母粉 1gKH2PO41gMgSO40.5gVB14.6mg瓊脂 20g水 1000ml上述培養基的PH值為6(b)將活化的隱孔菌菌種的菌絲移入內裝250ml下述培養基的1000ml的三角燒瓶中，用旋轉式搖瓶機振蕩培養，振蕩頻率為150rmp，在26℃條件下振蕩培養5天培養基配方葡萄糖 35g玉米粉 15g酵母膏 2gKH2PO40.5gMgSO40.1gVB14.6mg水 1000ml上述培養基的PH值為6，消毒滅菌，然后(c)在100l3種子罐中裝入70％罐容量的下述培養液，用壓差法移接相當于罐容量10％搖瓶培養的隱孔菌菌絲液，在通風量為1∶0.3(v/v分鐘)，葉輪攪拌速度為150rpm，罐壓為1kg/cm2，溫度為26℃條件下培養48h，培養液的配方為葡萄糖 350g玉米漿 10g蛋白胨 5g酵母膏 2gKH2PO41gMgSO40.5g(NH4)2SO45g水 1000ml上述培養液的PH值為6，消毒滅菌，然后(d)在5000l3的發酵罐中裝入70％罐容量的下述培養液，再裝入10％罐容量種子罐培養的隱孔菌菌絲液，在通風量為1∶0.3(v/v分鐘)，葉輪攪拌速度為150rpm，罐壓為1kg/cm2，培養溫度為26℃，發酵培養4天，培養液配方為葡萄糖350g玉米漿10g蛋白胨5g酵母膏2gKH2PO41gMgSO40.5g(NH4)2SO45g水1000ml上述培養液的PH值為6，消毒滅菌，然后(e)將上述發酵罐內的隱孔菌菌絲液體用板框壓濾，得到隱孔菌菌絲體濾餅，在90℃的烘房內烘干，經粉碎并用60目篩子過篩，得到隱孔菌菌粉。
全文摘要
本發明提供了一種隱孔菌菌粉的生產方法。隱孔菌菌絲在23-30℃、pH為4-7的培養基中培養6-7天；移入帶培養液的燒瓶中振蕩培養5天(頻率150-220rpm、溫度23-30℃)；用壓差法將菌絲液移入帶培養液的種子罐中培養48h(通風量1∶0.2-1.0(v/v分鐘)，葉輪攪拌速度100-200rpm，罐壓0.5-1.0kg/cm
文檔編號A61K36/185GK1121111SQ9411722
公開日1996年4月24日 申請日期1994年10月15日 優先權日1994年10月15日
發明者華啟洪, 金國梁, 孫靜 申請人:華啟洪, 金國梁, 孫靜