大潛在轉化生長因子-β復合物及其有用結構物的生產方法

專利名稱：大潛在轉化生長因子-β復合物及其有用結構物的生產方法
技術領域：
本發明涉及轉化生長因子-β(TGF-β)。具體說，本發明涉及在真核細胞(如中國倉鼠卵巢細胞(CHO))表達大潛在TGF-β復合體。同時，本發明也描述了在真核細胞中表達這種大潛在TGT-β(LL-TGF-β)復合體及其后來對該復合體的純化。本發明進一步涉及以上所述的rLL-TGF-β中分離大潛在相關肽(L-LAP)的一種方法。
轉化生長因子-β是一大類對許多類型細胞具有潛在細胞調節活性的蛋白質。(參見Roberts和Sporn，肽生長因子和它們的受體I，419-472，1990)。人TGF-β的三種同型異構體(TGF-β1，-β2，β3)已經被確定且其特征也已搞清楚。TGF-β1是首次被鑒定作為一種生長因子，它可在半固體瓊脂上刺激一些嚙齒類動物成纖維細胞生長。然而現在越來越清楚地認識TGF-β1，對許多不同類型的細胞來說也是一種潛在生長抑制物，一種細胞分化的調節劑和一種細胞外基質的生產和沉積作用的誘導物。
TGF-β1作為一種高分子量的潛在復合體可由廣泛的多種多樣正常和腫瘤細胞產生。從人的血小板(Miyazono et al.，J.Biol.Chem.263，6407-6415，1988;Wakefield et al.，J.Biol.Chem.263，7646-7654，1988)和大鼠血小板(Okada et al.，J.Biochem.106，304-310，1989)純化后的潛在TGF-β1的結構已經被確定。已經使用人紅白血病細胞系搞清了它的生物合成(Miyazono et al.，EMBO J.10，1091-1101，1991)。
這種潛在型的TGF-β1是由三種不同的組分組成1)成熟的TGF-β1;2)TGF-β1前體的N-末端殘余部分;3)潛在的TGF-β1結合蛋白(以下被稱為LTBP)。TGF-β1前體的N-末端殘余部分對于TGF-β潛在性是非常重要的，所以這就被表示為TGF-β1潛在性相關肽(β1-LAP)(Gentry et al.，Biochemistry，29，6851-6857，1990)。象本發明所稱的那種大潛在性相關肽(rL-β1-LAP是由兩種組分組成，即TGF-β1潛在性相關肽(β1-LAP)和LTBP。
成熟TGF-β1是一種二硫鍵連接的二聚體，它是以β1-LAP中經蛋白酶切割而成，形成了一個連接LTBP單一分子上二硫鍵的二聚體。含LTBP的潛在TGF-β1復合物稱為“大潛在復合物(1arge latent complex，LL-TGF-β1)”，而不含LTBP的復合物稱為“小潛在復合物(small latent complex)”(Wakefield et al.，Growth Factors，1，203-218，1989;Miyazono et al.，EMBO J.，10，1091-1101，1991)LTBP首次以自由形態和作為LL-TGF-β1復合物的一種組分從人血小板中純化而得到。編碼LTBP的cDNA克隆最近也從人前皮成纖維細胞中分離出來(參見U.S.serial NO.07/487，343，美國專利5177197號，這些文章的內容結合參考文獻會給一個全面的認識)。cDNA序列的敞開閱讀框架指出LTBP是一個由1394個氨基酸組成的蛋白質，它含有2種不同類型重復序列，16個類表皮生長因子(EGF)的重復片段和在一個基元序列中含有8個半胱氨酸重復順序的3個拷貝。在一些類EGF重復順序，β-羥基化天冬酰胺殘基已被鑒定出來(Kanzaki et al.，Cell61，1051-1061，1990)表明LTBP是一種Ca2+結合蛋白(Dahlback et al.J.Biol.Chem.266，18481-18489，1990)。LTBP不直接與TGF-β1潛在性相關，但它在由生產細胞裝配和分泌潛在TGF-β1分子中起一定作用。
已經發現了幾乎純的類受體樣TGF-β1結合的糖蛋白，這些分子經十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定出分子量為160KD，70-80KD和30-40KD，并證實能結合TGF-β1分子(參見美國系列號07/717，316，美國專利5229495號，這些文獻上的內容連同參考文獻為提供一個完整的認識)。
本發明通過為編碼LTBP和前-TGF-β的DNA序列引入真核細胞，總的來說提供了一種生產重組大潛在TGF-β的方法。這些序列被引入真核細胞并協同得以表達。象這里所用的“Co-expression”和“Co-expessed”本語意味著由一個熟練技術人員所知的任何一種方法表達該復合體中的兩種成份，即前-TGFβ和LTBP。這些可能已意味著包括用兩個表達載體順序轉化或用能夠表達兩種成分的單一載體進行轉化。
本發明進一步通過為LTBP DNA序列引入表達前-TGF-β的真核細胞來提供一種產生重組大潛在TGF-β。具體講就是本發明提供構建一個LTBP表達質粒，pDSV2-BP，和它后來轉染到CHO細胞內，需要指出的是最好使用CHO細胞系T23-7-11。篩選出LL-TGF-β復合體最高表達量的克隆用于純化(LT3-1克隆)。
本發明也提供構建一個pME-TGF-β2質粒和它與pRSVneo質粒共同轉染在基因組上含有一個放大LTBP cDNA序列的BP-1-1 CHO細胞中的全過程，已檢測表達到培養基內的LL-TGF-β2活性。
本發明也提供一個方法用于通過降解LL-TGF-β和分離出LL-LAP來獲得L-LAP的方法。
本發明也描述一個能特異性連接到LL-TGF-β復合物而不連接LTBP的抗體。
本文圖示的簡要說明

圖1表達質粒pDSVE2-BP的構建。
圖2A表示用Ab-39多克隆抗體檢測由質粒pDSVE2-BP轉染細胞克隆分泌到培養基中的LL-TGF-β1。
圖2B表示用LT-1多克隆抗體描述圖2A中的試驗。
圖3表示從LT3-1條件培養基中純化LL-TGF-β1的方案。
圖4表示A在SDS-PAGE上分析純化的LL-TGF-β1。
圖4B表示用免疫印跡法分析經SDS-PAGE后純化的LL-TGF-β1。
圖5表示純化LTBP酶水解片段的分離和順序。
圖6表示CCL-64細胞DNA合成的抑制作用。
圖7表示SDS-PAGE分析用碳4(C4)反相高效液相色譜柱洗脫出的重組LTBP。
圖8表示檢測用從含有一個早前-TGF-β2(Prepro-TGF-β2)cDNA的質粒DNA轉染的BP-1-1細胞克隆中分泌的LL-TGF-β2。
圖9表示結合到LTBP的45Ca2+。
圖10A表示Ca2+對自由型LTBP的胰蛋白酶敏感性的影響。
圖10B表示Ca2+對重組LL-TGF-β1的胰蛋白酶敏感性的影響。
圖11A表示Ca2+在5mM EDTA存在下對LTBP陰離子交換層析的影響。
圖11B表示用5mM CaCl2描述在圖11A中的試驗。
圖12用瓊脂糖12(Superose 12)凝膠過濾純化重組L-LAP。
圖13用SDS-PAGE分析純化的重組L-LAP。
本發明通過參考下列實施例將得到更好的理解，這里所包括的實施例其目的給予例證并不構成對本發明的限制。
實施例1一個被稱為pDSVE2-BP的LTBP表達質粒是采用標準重組方法(如Maniatis等人在分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningA Laboratory Manual)，1982中所述的方法)構建的。具體地講質粒pDSVE2-BP是按下述方法構建的pUC19-A和PUC19-B分別為帶有5′未翻譯區(Kanzaki et al.，Cell 61，1051-1061，1990)的LTBP cDNA 5′-端一半EcoRI片段的質粒和帶有3′未翻譯區的LTBP cDNA 3′一端一半EcoRI片段的質粒。首先將帶有LTBP cDNA 5′一端一半的DraI-EcoRI片段從pUC19-A中分離出來并亞克隆到SRα-296質粒的PstI-EcoRI位點(Takabe et al.，Mol.Cell.Biol.8，466-469，1988)。3′一端一半EcoRI片段從pUC19-B中分離出來并引入到SRα-296質粒的EcoRI位點構建出SRα-BP。該質粒攜帶LTBP的全長cDNA。最后LTBP cDNA用XhoI酶消化切割由SRα-BP中分離出來插入到含有一個鼠二氫葉酸還原酶(dhfr)微基因的一個哺乳動物細胞表達質粒pDSVE2的SalI酶位點中用于基因擴增。最后的質粒稱為pDSVE2-BP，參見圖1。
實施例2T23-7-11是一株大量生產重組人前-TGF-β1復合體的CHO細胞系。這個細胞系的建立和特性已在公開的日本專利申請(KOKAI3-180192，1981)中作了詳細描述。描述建立T23-7-11細胞的核心成分將在下面作簡要描述。
人早前-TGF-β cDNA克隆分離自一株人脂盤細胞(human placenta cells)的λgt10 cDNA庫(Library)。從人脂盤組織制備出總DNA。用已知方法寡聚(dT)-纖維素柱層析分離出poly(A)RNA。用G1uber和Hoffmann(Gluber et al.，Gene 25，263，1983)方法合成為雙股cDNA并克隆到一個λgt10載體的EcoRI位點。按發表的人TGF-β1cDNA核酸序列合成一個寡聚DNA探針(Derynck et al.，Nature 316，701-705，1985)。帶有人早前-TGF-β1蛋白的cDNA序列的克隆，用上述探針從人脂盤基因庫中篩選出來。一株cDNA克隆T1攜帶人早前-TGF-β1全長cDNA序列通過斑點雜交和DNA定序后從3×105獨立噬斑中鑒定出來。該cDNA克隆然后亞克隆到pUC19的EcoRI位點。
一個人早前-TGF-β1cDNA的哺乳動物的表達質粒pECβ是按下面方法構建的。首先，帶有人早前-TGF-β1cDNA的PUC-19質粒用coRI消化，一個含有cDNA的分離出的EcoRI片段被做成鈍端，然后插入到載體pSVL的SmaI位點而得到pSVL-TGF-β1。第二，哺乳動物細胞表達質粒CDM8(參見Seed，B.，Nature 329，840-842，1987)用SacII和BamHI消化。含有一個琥珀抑制物supF tRNA基團，巨細胞病毒(CMV)介導早期啟動子DNA序列和猿猴病毒40(SV40)多腺苷酰化DNA序列的分離的SacII-BamHI片段做成鈍性末端，然后導入到pSV2dhfr載體的PVuII位點(Subramani，S.et al.，Mol.Cell.Biol.1，854-864，1981)獲得了pCMV-dhfr。最后含有人早前-TGF-β1cDNA，SV40多腺苷酰化序列，一個氨芐青霉素抗性基因和源自pBR322 DNA的Ori的pSVL-TGF-β1的XbaI-EcoRI片段與含有CMV啟動子序列和由SV40早期啟動子，鼠二氫葉酸還原酶(dhfr)編碼序列以及SV40多腺苷酰化序列組合的基因卡盒(gene cassette)的pCMV-dhfr的XbaI-EcoRI片段被連結在一起。獲得這種表達質粒pECβ攜有CMV啟動子，對于人早前-TGF-β1表達用的SV40多腺苷酰化信號序列，SV40早期啟動子和用于鼠二氫葉酸還原酶表達的SV40多腺苷酰化信號。
為了表達人前-TGF-β蛋白，使用了一株dhfr-細胞系，如CHO-DUKX B11(Chasin，L.A.and Ur laub，G.，PNAS USA 77，4216-4220 1980)。一個同等的dhfr-CHO細胞系是由ATCC公開提供的，如ATCC CRL 9096并能夠用于替代CHO-DUKX B11。這些細胞被培養在補充10%胎牛血清(FCS)的MEMα(-)培養基中。PECβ質粒DNA是采用磷酸鈣共同沉淀法轉染到細胞中的，并在含有15%透析過的胎牛血清(FCS)與上述相同的培養基中進行篩選。轉化體細胞進一步在含500nM氨甲喋呤的培養液中培養進行基因擴增。在轉化體的條件培養基內人前-TGF-β1的出現可用在實施例6詳細描述的CCL-64細胞生長抑制試驗和用兔多克隆抗人血小板純TGF-β1前區的抗體建立的免疫印跡法來測出(Kanzaki，etal.，前述)。在條件培養基中最高TGF-β1活性的細胞克隆被篩選出來，并命名為T23-7-11。
T23-7-11細胞系已于1993年10月22日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC C 93006。并已按布達佩斯協議保藏于日本發酵研究所，保藏號為FERM BP-4024。
實施例3在上述實施例2，所描述的T23-7-11細胞培養在補充有15%FCS和500nM氨甲喋呤的Ham′s F-12和Dulbecco′s改良Eagle′培養基(1∶1)中。按上述構建的質粒pDSVE2-BP和pSV2neo采用標準電穿孔法被轉染至該細胞中。具體地說，含有一個高濃度克隆化基因的質粒DNA被加到細胞懸液中，用200-600V/cm電場對該混合物進行電休克。通過電極釋放短暫電脈沖從而在細胞膜上鑿出洞，然而在含有1mg/ml G418和500nM MTX的相同培養基上篩選出成功轉染的克隆株。對G418和500nM MTX有抗性的7個克隆被挑出并檢測LL-TGF-β1復合體的分泌。
這些克隆再按下列程序進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和免疫印跡技術測定。在對G418抗性的細胞克隆培養在含有10%FCS培養基中，直到細胞長滿后，就用PBS為細胞洗二次，并進一步在含有5mg/l牛胰島素的無血清培養基上培養4天。4天后收集條件培養基，并超濃縮5倍。這些樣品在非還原條件下，于4-12%梯度膠上上樣進行SDS-PAGE，然后在一個含有20%甲醇、192mM甘氨酸和25mM Tris-HCl pH8.4的緩沖液中于100V下轉移至PVDF膜上。該PVDF膜置入含有1%變性明膠，0.1%Tween20和150mM NaCl的Tris-HCl緩沖液(pH7.4)中進行封閉，進一步為該膜在同一個緩沖液中與堿性磷酸酶結合的抗體(Ab39，LT-1)在4℃作用16小時。然后為PVDF膜清洗再用NBT/BCIP底物沉淀法顯色。圖2所示，與Ab39和LT-1多克隆抗體結合物的反應結果。這些結果指出，所有的7個細胞克隆都將LL-TGF-β復合體和前-TGF-β1分泌到無血清培養基內。LT3-1克隆分泌到培養基中的LL-TGF-β1水平最高，并被選定為候選的細胞克隆用于從條件培養基中純化LL-TGF-β1。
LT3-1細胞系已于1993年10月22日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC C 93007。并已按布達佩斯協議于1992年9月29日保藏于日本發酵研究所，保藏號為FERMBP-4015。
實施例4為了獲得重組LL-TGF-β1的供應，將LT3-1細胞培養在含200ml選擇性培養基的轉瓶中并長滿，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)清洗培養物，進一步在添加有胰島素，轉鐵蛋白，單乙醇胺，亞硒酸鈉，抑蛋白酶肽和聚乙二醇6000等生長促進添加物(200ml/瓶)的無血清培養基F-12/DMEM中培養7天，7天后收集80升條件培養基。
圖3簡要地顯示純化程序。
為進一步闡明這一過程作如下說明，80升被收集的條件培養基濃縮并用分子載流為100KD大小的Millipore公司的超濾膜進行脫鹽，濃縮后的條件培養基加樣于用10mM pH7.2磷酸鈉緩沖液平衡的Q-瓊脂糖快速流動陽離子交換層析柱。結合在柱上的蛋白質再用200-660mM NaCl梯度液以8.0ml/min的流速洗脫。用SDS-PAGE和兔多克隆抗體Ab39免疫印跡法監測LL-TGF-β1復合物的出現。
含有LL-TGF-β1復合體的部分進一步通過用10mM，pH7.2磷酸鈉緩沖液平衡過的HP-10羥基磷灰石柱(50×100nm)。收集未吸附在柱上的部分，再通過用10mM，pH7.2磷酸鈉緩沖液平衡過的硫化精細纖維素柱(sulfated cellulofine Column)(30×100mm)。吸附在柱上的蛋白用0-200mM NaCl梯度以4.0ml/min流速洗脫。把含有LL-TGF-β1復合體的部分合并，對40mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)透析。透析后的樣品，再次加樣于用40mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)平衡過的DEAE-Toyopearl陰離子交換柱(15×100mm)洗脫，最后用0-250mM NaCl梯度以2.0ml/min流速洗脫。
合并含有高濃度LL-TGF-β1復合體的部分，用Amicon YM100超濾膜濃縮，濃縮后的樣品再加至用PBS平衡過的Sephacryl S-300HR凝膠過濾柱(20×100mm)，用平衡液洗柱，流速為0.5ml/min。
純化蛋白質用SDS-PAGE分析，并進一步用銀染色和免疫印染色分析(圖4示結果)，即表明從S-300HR中純化的蛋白質用4-12%梯度膠進行SDS-PAGE和有無二硫蘇糖醇的情況下銀染色檢查結果(圖4A)和有無二硫蘇糖醇的情況下用Ab39(A)或CT-1(B)抗體建立的免疫印跡染色，對此純化蛋白進行分析結果(圖4B)。
在沒有還原的條件下，純化LL-TGF-β1復合體含有2個蛋白帶，表現分子量分別為220KD和270KD。兩條帶均可被Ab39和LT-1抗體所識別。
在還原條件下，這些蛋白被分成4條帶，表現分子量為12.5KD，40KD，53KD和150-190KD。40KD和53KD蛋白帶能被LT-1識別，這說明這兩條帶含有β1-LAP。12.5KD和53KD蛋白帶可被針對成熟TGF-β1部分肽的兔多克隆抗體Ab57所識別。這暗示，這兩條肽可能含有一個成熟TGF-β1列序。150-190KD蛋白帶可被Ab39所識別。上述結果說明這些蛋白是由LTBP，前-TGF-β1，β1-LAP和成熟TGF-β1組成。
實施例5在還原條件下進一步用直接氨基酸序列分析每一組分的方法對重組LL-TGF-β1復合體進行鑒定。
待檢樣品先進行SDS-PAGE，然后轉移到PVDF膜上。在電印跡后，膜上的蛋白用的春紅.S(Ponceau.S)染料測定。剪下染色斑，在二硫蘇糖醇存在和電印跡下從PVDF膜上純化出蛋白質。
12.5KD組分的N-末端氨基酸測序結果表明該序列為Ala-Leu-Asp-Thr-Asn-Tyr-x-Phe-Ser-Ser，這和成熟的TGF-β1序列相同。40KD和53KD組分的N-末端氨基酸序列分析指出該序列為Leu-Ser-Thr-x-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu，這與TGF-β1的前體序列相同。
但企圖確定160-190KD組分的N-末端氨基酸序列沒有成功，這說明N-末端可能被封閉。因而純化的LTBP進一步用蛋白內切酶Asp-N消化，并在一個窄孔反相HPLC柱用乙腈/2-丙醇線性梯度分離。流出液用215nm監測，用SHIMADZU PSQ-1蛋白測序儀對有峰的各管進行氨基酸序列分析。獲得的序列可與Kanzaki等介紹的相比較(Kanzaki et al.，Cell 61，1051-1061 1990)。三個不同多肽的氨基酸測序結果表明序列為Asp-Ile-Asn-Glu-Cys-Leu-Glu(第10)，Asp-Gln-Gly-Tyr-Arg-Ala-Ser(第12)，Asp-Pro-Val-Lys-Le
u-Gln-Cys-Leu(第18)，參見圖5。這些序列除去第18肽Leu10殘基外，其它均與LTBP內部序列相同(Kanzaki et al.，Cell 61，1051-1060，1990)因此，150-190KD組分確定為LTBP。
純化的LL-TGF-β1復合體已發現是由分子量為12.5KD，40KD，53KD和150-190KD四種不同亞單位組成。它們分別對應于成熟TGF-β1，β1-LAP，前-TGF-β1和LTBP。
實施例6TGF-β1的活性可用3H-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入到水貂肺上皮細胞CCL-64試驗加以確定(Cone et al.，Anal.Bionhem，168，71-74，1988)。CCL-64細胞和待檢樣品被移入到含有10%FCS和抗生素的DMEM培養液的96孔組織培養液中。培養48小時后，細胞用0.5μCi3H-胸腺嘧啶脫氧核苷脈沖4小時。摻入到DNA的3H放射活性用液體閃爍計數儀進行測定。用一個Bio-Rad公司蛋白測定試劑盒定性純化蛋白。圖6表示生物活性圖譜。重組成熟TGF-β1是CCL-64細胞潛在生長抑制劑。
當重組LL-TGF-β1復合體被酸化活化后，它也是CCL-64細胞潛在的生長抑制劑。可是它的特異性活性大約是重組成熟TGF-β1的五分之一，相當于用6ng純化蛋白/ml觀察到的最大抑制作用的一半。這些結果與從人血小板分離到LL-TGF-β1復合體獲得的相似(Miyazono et al.J.Biol.Chem.263，6407-6415，1988)。重組LL-TGF-β1復合體以約200ng/ml達到一半最大抑制作用來抑制CCL-64細胞的效應要低得多，它的抑制曲線當和重組TGF-β1和酸活化LL-TGF-β1復合體相比較明顯的有一個輕微改變的斜坡度。以前還未見有報道天然LL-TGF-β1復合物抑制CCL-64細胞的分裂增殖。
在圖6中，DNA合成抑制作用按以下所述進行了評價。圖上符合(O)重組成熟TGF-β1，(
)重組LL-TGF-β1復合體(未處理)，(
)重組LL-TGF-β1復合體(酸活化的)。
所進行的試驗表明由LT3-1細胞分泌的重組LL-TGF-β1復合體很明顯與來自人血小板的天然LL-TGF-β1復合體完全相同，這可說明LT3-1細胞在研究LL-TGF-β1復合體的結構和功能中將是一個很有用的來源。然而，由LT3-1細胞產生的重組LL-TGF-β1復合體，重組小潛在TGF-β1復合體和重組成熟TGF-β1象所討論的在治療和生理學研究中將會大有用途。
實施例7生產重組LTBP的CHO細胞系已被建立，以申請者所了解的程度來說，這是第一份用重組DNA技術，以中等水平穩定生產LTBP的報告。
為了表達LTBP，在實施例2中所述的dhfr-細胞系CHO-DUKX-B11用實施例1中的LTBP表達質粒pDSVE2-BP進行轉染。細胞保持在補充有5%FCS的MEMα(-)培養基中，用20μg pDSVE2-BP質粒以磷酸鈣共同沉淀法轉染。Dhfr-表達轉化體通過用加有5%經透析的FCS MEMα(-)替換進行篩選。
在每一個轉化體條件培養基中LTBP的存在可由免疫印跡法來測定。樣品加到5-20%梯度SDS-聚丙烯酰胺凝膠電流分離并轉印到硝酸纖維素膜上，非特異性蛋白吸附結合可由加入的0.05%Tween20，150mM NaCl，10mM Tris-HCl(pH7.0)和5%干奶粉中于室溫下1小時來封閉。然后把該硝酸纖維素膜在含有10mg/ml抗LTBP多克隆抗體Ab-39的相同緩沖液作用，再用相同緩沖液洗2次，加入抗兔IgG堿性磷酸酶的抗體結合物作用，洗膜之后，用NBT/BCIP底物沉淀反應顯色。
篩選在條件培養基中生產LTBP的細胞克隆并進一步在含有提高到50nM濃度氨甲喋呤的培養基中培養以擴增轉染進去的LTBP cDNA。BP1-1克隆被選出做進一步研究。
在含有200ml選擇培養基的轉瓶中讓BP1-1細胞長滿瓶壁。用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗細胞，然后用含有胰島素、轉鐵蛋白、單乙醇氨、亞硒酸鈉，抑蛋白酶肽和聚乙二醇6000作為生長促進添加物的無血清F-12DMEM(200ml/瓶)培養7天。7天后收集20升條件培養基。
濃縮收集條件培養基，并用截留分子范圍10KD大小的Millipore超濾膜脫鹽。濃縮的條件培養基對25mM含有0.5硫酸銨的磷酸鈉緩沖液(pH7.2)透析，然后加樣于上述相同緩沖液平衡過的Phenyl-Toyopearl 650M柱(50×100mm，Tosoh)。吸附的蛋白用0.5-OM硫酸銨梯度以5.0ml/min流速進行洗脫。LTBP的出現用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、免疫印跡和/或酶免疫法進行監測(使用兔多克隆抗體Ab-39)。含有LTBP的洗脫液合并，對10mMTris-HCl緩沖液(pH8.0)透析，進一步加樣于用相同緩沖液平衡過的Q-Sepharose FF陰離子交換柱(26×100mm)。吸附的蛋白用100-600mM NaCl梯度以流速3.0ml/min洗脫。將含有LBP的部分合并，濃縮后再加樣于用PBS平衡過Superose 12制備級柱(26×500mm)，用PBS以1.0ml/min的流速洗脫，收集合并含有LTBP的部分，再加入到用含0.1%TFA的10%乙腈平衡過的反相C4 HPLC柱(11×250mm)中層析，用10-50%乙腈梯度洗脫，流速為2.0ml/min。
純化的蛋白質經SDS-PAGE分離后，用銀染色和上述介紹過的抗-LTBP抗體Ab-39進行免疫印跡分析，再進行氨基酸序列分析。在還原和非還原兩種條件下，純化的蛋白經銀染色揭示為一單一的寬帶，表現分子量為110-130KD。如圖7所示，SDS-PAGE揭示一條擴散蛋白帶，表現分子量約在120-140KD。這個帶可由兔抗-LTBP Ab-39抗體所識別，這表明它就是-LTBP。純化蛋白的進一步確認靠還原條件下的氨基酸序列分析。該蛋白用蛋白內切酶Asp-N消化，加樣于反相HPLC，分離的多肽進行定序。獲得的氨基酸序列與從人血小板純化的LTBP報告中的氨基酸序列完全相同(Kanzaki et al.，Cell 61，1051-1061，1990)。
BP1-1細胞系已于1993年10月22日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC C 93008;并已按布達佩斯協議于1992年9月29日，保藏于日本發酵研究所，其保藏另為FERM BP-4014。
實施例8
LL-TGF-β2生產是LTBP cDNA和早前-TGF-β2cDNA共同在CHO細胞中完成表達的。早前-TGF-β2表達質粒被引入BP1-1細胞系在上面已經加以描述。
人TGF-β2完整核苷酸序列已經發表(DeMartin et al.，EMBO J.6，3673-3677，1987)。對于人TGF-β2的cDNA克隆可按實施例2中所描述的TGF-β1cDNA那樣獲得。哺乳動物表達質粒pME-TGF-β2是使用獲得的早前-TGF-β2cDNA構建的。該質粒在一個改良的SV40啟動子和SV40對于轉錄終止和多腺苷化的前區的控制下含有人TGF-β2cDNA。
pME-TGF-β2質粒和含有新霉素抗性選擇的pRSVneo質粒以電穿孔方式共同轉染進入BP-1細胞系。G418抗性轉化體被選出和檢測，并用CCL-64細胞的生長抑制試驗來測定TGF-β2的活性的產生(參見實施例6)，分離的幾株細胞克隆都能為TGF-β2活性分泌到細胞培養基中。這些克隆的鑒定方法學在實施例9中為加以描述。
實施例9為了用免疫學方法檢測出幾株具有TGF-β活性的轉化體條件培養基中LL-TGF-β2，先對細胞培養液用Centriprep 10濃縮儀進行濃縮，然后用SDS-瓊脂電脈(4-20%聚丙烯酰胺梯度膠)進行分析。隨后，用抗人體LTBP多克隆抗體Ab39進行的免疫印跡分析，指出具有4表現種分子量大小不同的分子100-110KDa，120-130KDa，150-160KDa，200-220KDa(參見圖7)。
200-220KDa是與前-TGF-β2相關的LTBP，而100-110KDa，120-130KDa和150-160KDa幾種可能是游離LTBP蛋白，因為這幾種也可在BP-1-1條件培養基中找到。該結果表明用含有編碼人早前-TGF-β2蛋白cDNA的質粒轉染的BP-1-1細胞分泌與LTBP相關的前-TGF-β2，生產一種LL-TGF-β2復合體。這也說明共同在CHO細胞中表達的LTBP和前-TGF-β2的關聯可以發生在每一種蛋白的合成期間。
生產LL-TGF-β2的細胞系被篩選出來并命名為LT2-14。細胞系LT2-14已于1993年10月22日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC C 93005;并按布達佩斯協議已于1992年9月29日保藏于日本發酵研究所，菌株保藏號為FERM BP-4016。
實施例10也已經發現LL-TGF-β1和LTBP能夠與Ca2+結合，從而導致產生一些通過結合該離子純化穩定LL-TGF-β的方法。下面提出的方法被進一步得到描述于Colosetti et al.，FFBS Letters 320140-144，1993中，該文獻的加收會使該方法的描述更加完整。
重組LL-TGF-β1(10μg，用不同濃度EDTA或CaCl2預處理)，人血小板LTBP(10μg)(從人血小板純化出LL-TGF-β1中分離的另外部分(Kanzaki等，Cell 611051-1061，1990)，重組小潛在TGF-β1復合體(SLC，10μg)和人血(B，2μl)全部都上樣于4-10%聚丙烯酰胺梯度SDS-PAGE，然后轉至硝酸纖維素膜，在和45CaCl2(1μCi/ml)過夜作用后、沖洗該膜，干燥后對其進行放射自顯影。
在圖9中出現的試驗資料表明無論游離LTBP和LL-TGF-β1都展示與45Ca2+清晰結合的情況。重組小潛在TGF-β1和用做對照的人血樣品雖然蛋白可由Ponceau S染色看到，但不能結合45Ca2+。
實施例11為了研究Ca2+結合對蛋白結構可能的影響，從用[35S]半胱氨酸標記的人前列腺細胞PC-3的細胞培養液中分離出的游離LTBP用Ab39抗體進行免疫沉淀，然后在2mM CaCl2或2mM EDTA存在下以恒溫37℃通過不同時間用胰蛋白酶對沉淀物進行蛋白消化。
消化反應可通過加入2μg大豆胰蛋白酶抑制劑而終止，用SDS-PAGE和熒光記錄儀分析樣品。可以觀察到Ca2+對LTBP的保護性效應，即在Ca2+存在下為獲得象在EDTA存在下獲得的相同程度的降解而需要20倍以上長的溫育時間。蛋白酶抗性片段的大小是相似的(參見圖10A)。
相似的試驗也用LL-TGF-β1進行過。在5mM CaCl2或5mM EDTA存在下進行胰酶消化。1μg重組LL-TGF-β1和在含有5mM EDTA或CaCl2的50mM Tris-HCl(pH7.4)的胰蛋白酶共同溫育，然后樣品用SDS-PAGE和銀染色進行分析。在CaCl2存在下幾乎未觀察到LL-TGF-β1的消化，而在EDTA存在下，和胰酶作用20分鐘后能看到8條帶(參見圖10B)。
實施例12Ca2+對LTBP分子的影響也在EDTA或CaCl2存在下用離子交換層析進行了研究，在5mM EDTA或5mM CaCl2存在下從PC-3的條件培養基中獲得的游離LTBP上樣于Q-Sepharose層析分析。
15ml PC-3細胞條件培養基和5mM EDTA(A)或5mM CaCl2(B)結合，再上樣于用分別用150mM NaCl，20mM Tris-HCl，pH7.5，用5mM CaCl2或EDTA預先平衡過Q-Sepharose柱層析，流速為150ml/hr。150-600mM NaCl梯度洗脫(45min)用于解附作用洗柱。用280nm光吸收值來監測LTBP開始洗下的位置，5ml的洗脫液進行SDS-PAGE和用Ab39血清免疫印跡法分析(參見圖11)。
當樣品在沒有CaCl2或EDTA加入時分析樣品，LTBP在約460mM NaCl時開始洗下，在5mM EDTA存在時，LTBP洗下要拖后，即約500mMNaCl。如果Ca2+離子存在可觀察到在約420mM NaCl時有一個更前的洗脫。在Ca2+存在下，LTBP對陰離子交換劑的更低的親和力可能是由于在Ca2+結合后LTBP有一個電荷變化或由于Ca2+誘導該分子的構象改變。
也已觀察到Ca2+結合蛋白的這種效應具有可逆轉性如果LTBP在EDTA或CaCl2存在下進行層析，然后再加入CaCl2或EDTA，就可觀察到洗脫的位置就會漂移。
實施例13按實施例3預先的程序可從已經制備的rLL-TGF-β中分離出大量的rL-β1-LAP。用一種常規變性劑(如脲)處理LL-TGF-β復合體以從LL-TGF-β復合體中分離出L-LAP。
通過第一次用含8M脲的20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)透析1mg rLL-TGF-β來制備L-β1-LAP。透析的蛋白被濃縮后加樣于Superose12制備級凝膠層析柱。該柱用含有8M脲和500mM NaCl的20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)平衡，而后用同一緩沖液洗脫樣品。圖12顯示在Superose12上凝膠過濾純化rL-β1-LAP。這種分離是基于這兩者的相對大小，第一峰是用樣品8-16洗脫下的L-β1-LAP部分，第二峰是成熟的TGF-β部分。
收集含有rL-β1-LAP的部分，然后對磷酸緩沖鹽水透析，最后經0.22μm濾膜過濾。純化蛋白再用SDS-PAGE分析，象圖13所示，純化的rL-LAP移行的分子量約在180-200KDa。
LL-TGF-β復合體特異的抗體可通過將該復合體接種到實驗小鼠，再篩選出對該復合體應答的血而獲得。標準方法可以生產出單克隆抗體。
抗體對LL-TGF-β復合體異常生產的檢測是非常有用的。
成熟的TGF-β目前正在研究用于治療許多疾病，(Sporn et al.JAMA，262938-941，August 16，1989);但成熟的TGF-β1有一些潛在的副作用，如體重下降，貧血和血小板減少癥。據推測使用LL-TGF-β1可能會克服一些這類副作用。
目前TGF-β1也正在被研究用于治療一些骨髓疾病，例如，骨質疏松癥和骨折愈合，因為已知TGF-β影響著骨形成。TGF-β是一種潛在Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的潛在誘導劑，Ⅱ型膠原和蛋白聚糖形成了軟骨的細胞外基質(Sporn et al.，同上)。亦已發現TGF-β是重要地作用于軟骨細胞或骨細胞和其他類型的細胞肽生長因子(Pfeilschifter et al.，PNAS 842024-2028，1987)。已經發現涉及軟骨和骨的胚系形成，存在于長骨的生長板中。大量的TGF-β也發現于成骨中。事實上，TGF-β2可從成年牛骨中分離出來。
LL-TGF-β也可用作自身免疫病和器官移植時的免疫抑制劑。TGF-β是已知淋巴細胞增殖和功能最有潛力的內源抑制劑，作為自動分泌的“停止”信號抑制白細胞介素和其它細胞活素(如腫瘤壞死因子)的作用，這些活素都對淋巴細胞功能有刺激作用。因此，TGF-β抑制了由白介素介素1和2刺激活化的T細胞增殖，抑制由幾種活化因子中的任何一種刺激的B淋巴細胞的增殖和抗體產生，抑制了自然殺傷細胞的殺細胞活性以及抑制了細胞毒性T細胞和淋巴活素活化的殺傷細胞的產生(Sporn et al.，同上)，這些效應在體外研究中已被證實，但體內研究仍處在早期階段。這些早期試驗表明，心臟同種異體移植排斥在小鼠是通過主要組織相容性障礙的結果。目前的研究在肝，胰島和腎的移植，以及在實驗關節炎和臨床類風濕病的情況下抑制活化T細胞驅動的炎性過程。
TGF-β也可通過抑制干細胞為血細胞提供免遭細胞活性抑制藥物的作用保護。依LL-TGF-β的免疫抑制特性的優點，對于那些選擇使用化學藥品作為免疫抑制治療的疾病病人，為保護骨髓細胞可在治療之前注射LL-TGF-β。
TGF-β也對參與組織損傷修復的成纖維細胞有一些重要的作用。TGF-β可刺激產生細胞外基質主要成份的生產，如膠原，纖維連接素和蛋白聚糖，抑制破壞新形成結締組織的蛋白水解酶的作用(Sporn et al.，J.Cell Biol.1051039-1045(1987);Keski-Oja et al.，J.Cell Biol.106451-459(1987)。因此，這些作用導致在TGF-β的部位上形成新顆粒組織。進而，TGF-β已經表明可提高膠原的基團轉錄(Heine et al.，J.Cell Biol.1052861-2876(1987)，在提供愈合創傷的結構強度上起一個極其重要的作用。而且還可作為骨和軟骨基質的核心部分。TGF-β已表明也可提高動物創傷愈合(Roberts et al.，RecentProg.Horm.Res.44157-197，1988)，有一個這樣的例子，就是兔視網膜的重新粘連的刺激。此外，LL-TGF-β1也可以用于刺激軟組織愈合，即，皮膚潰瘍和消化道潰瘍。
TGF-β亦已表明對于大多數上皮細胞是一個潛在抗增殖因子，這可被用于腫瘤病的抗增殖藥。
大潛在性相關肽(L-LAP)可以用于成熟TGF-β分子的拮抗劑。為了防止TGF-β治療中可能的毒性副作用，可使用L-LAP在治療或診斷方法中以控制，調節TGF-β治療或存在時的有害或不希望出現的副作用。用L-LAP可以克服TGF-β治療的缺點，可以降低或消除TGF-β的潛在毒性副作用。在治療其它TGF-β相關疾病，如纖維變性紊亂，腎小球性腎炎，肝纖維化病，瘢痕形成和癌腫轉移期間可注射L-LAP以提供一種保護效應。
對L-LAP的特異性抗體可通過將所述的肽引入實驗動物并篩選對該組合體有應答的血液來獲得。單克隆抗體可由標準技術方案獲得。這些抗體可用作診斷輔助。
正在進行的試驗表明有可能通過引入一個LTBP DNA序列到能表達前-TGF-β的T23-7-11 CHO細胞中就可生產出重組的LL-TGF-β1。通過構建一個含有LTBP的質粒，用此質粒轉染CHO細胞，很可能表達重組LL-TGF-β1。
試驗也表明通過引入一個含有TGF-β2的cDNA的質粒到含有一個擴增過的LTBP cDNA序列的BP-1-1細胞很可能會生長出重組LL-TGF-β2。
現行的試驗還表明LTBP和LL-TGF-β可以結合Ca2+和通過加入Ca2+離子到生產出的重組LL-TGF-β復合體會導致蛋白質穩定性的提高和抵抗蛋白酶活性的增加。
本試驗還表明L-β-LAP可通過用變性劑處理rLL-TGF-β復合體就可分離制備出L-β-LAP。
如要期望的是上述描述的生產重組LL-TGF-β1和LL-TGF-β2復合體的方法可以被廣泛應用到生產重組LL-TGF-β復合體，包括但不僅僅限于在重組TGF-β3，因為已經很了解TGF-βS家族的每個成員間在肽序列和生物活性上非常相似。TGF-β同分異構體表示出可比特性，因此可希望有相似的作用。
上述描述的試驗暗示生產LL-TGF-β復合體和相關構成物的方法，用不同的質粒和其它載體，也可在其它真核細胞上表達。這種質粒和載體的選擇可由熟練技術人員來實現。
亦已認為如果不是脫離了本發明的精神和范圍，其它具體化的東西也可被列入本發明內。本發明無任何企圖被限于僅僅所描述的那些具體化的東西。這些具體化的東西被做適當修飾將也會被那些操作技術人員所承認。然而，本發明還應以所附的權利要求的范圍為限定。
權利要求
1.生產大潛在TGF-β(LL-TGF-β)的方法，包括在轉化真核細胞內共同表達1)編碼LTBP的核酸分子；2)編碼前-TGF-β的核酸分子和在適宜生產大潛在TGF-β的條件下培養所說的細胞。
2.按權利要求1的方法，其中，這里所指的TGF-β是TGF-β1。
3.按權利要求1的方法，其中，這里所指的TGF-β是TGF-β2。
4.按權利要求1的方法，其中，這里所指的TGF-β是TGF-β3。
5.穩定LL-TGF-β的方法，即以足以穩定所說的LL-TGF-β的量加入一定量的Ca2+到含有LL-TGF-β的樣品中。
6.按權利要求1的方法，其中，這里所說的真核細胞是CHO(中國倉鼠卵巢細胞)細胞系。
7.按權利要求2的方法，其中，這里所說的真核細胞是LT3-1(CCTCC C 93007)。
8.按權利要求3的方法，其中，這里所說的真核細胞是LT2-14(CCTCC C 93005)。
9.按權利要求1的方法，包括用至少含有一個編碼LTBP的核酸分子和編碼前-TGF-β的所說核酸分子的真核質粒轉化所述的真核細胞。
10.按權利要求2的方法，包括，用至少含有一個編碼LTBP的核酸分子和編碼前-TGF-β的所說核酸分子的真核質粒轉化所述的真核細胞。
11.按權利要求3的方法，包括，用至少含有一個編碼LTBP的核酸分子和編碼前-TGF-β的所說核酸分子的真核質粒轉化所述的真核細胞。
12.按權利要求4的方法，包括，用至少含有一個編碼LTBP的核酸分子和編碼前-TGF-β的所說核酸分子的真核質粒轉化所述的真核細胞。
13.按權利要求10的方法，其中，這里所說的真核質粒是pDSVE2-BP。
14.按權利要求11的方法，其中，這里所說的真核質粒是pME-TGF-β2。
15.真核質粒pME-TGF-β2。
16.治療骨質疏松癥，炎癥和免疫紊亂類疾病的方法，包括當病人需要所說的治療時使用藥學有效劑量的大潛在TGF-β1。
17.治療創傷的方法，包括當病人需要所說的治療時使用藥學有效劑量的大潛在TGF-β1。
18.誘導由細胞抑制藥物影響的干細胞抑制的血保護作用的方法，包括當病人需要所說的治療時使用藥學有效劑量的大潛在TGF-β1。
19.治療腫瘤病的方法，包括用一定量足以治療所說的腫瘤疾病的大潛在TGF-β1，當病人需要所說的治療時，使用它進行病人治療。
20.生產LL-TGF-β的細胞系，該細胞系擁有一段編碼LTBP的異源DNA分子和染色體融合的編碼前-TGF-β的異源DNA分子。
21.按權利要求20的細胞系，其中所述的TGF-β是指TGF-β1。
22.按權利要求21的細胞系，其中所述的LT3-1。
23.按權利要求20的細胞系，其中所述的TGF-β是TGF-β2。
24.按權利要求23的細胞系，其中所述的是LT2-14。
25.生產LTBP的方法，包括在一個真核細胞上表達一段編碼LTBP的異源DNA分子，其中，這里所說的異源DNA分子是指染色體上摻入的，和在適宜于生產LTBP的條件下培養所說的細胞。
26.按權利要求25的生產方法，其中所說的細胞是CHO細胞。
27.按權利要求25的生產方法，其中所說的真核細胞是BP-1-1(CCTCC C 93008)。
28.生產LTBP的細胞系，該細胞系具有一段在染色體上摻入的編碼LTBP的異源DNA分子。
29.按權利要求28的細胞系，其中所述的細胞系是BP-1-1。
30.分離L-LAP的方法，包括(a)按權利要求1中的方法生產LL-TGF-β;(b)在適宜于分離L-LAP的條件下用一種變性劑處理所說的LL-TGF-β;(c)并從中分離出L-LAP。
31.分離出由SDS-PAGE測定具有約180-約200KDa分子量的L-LAP。
32.分離出的由SDS-PAGE測定具有約180-約200KDa分子量的L-LAP，由下述而獲得(1)按權利要求1中的方法生產LL-TGF-β;(2)在適宜于分離L-LAP的條件下用一種變性劑處理所說的LL-TGF-β;(3)并從中分離出L-LAP。
全文摘要
本發明提供了一種將編碼LTBP和前-TGF-β的核酸序列引入到真核細胞來生產重組大潛在TGF-β的方法，及將LTBP的DNA序列引入到一個表達前-TGF-β的真核細胞來生產重組LL-TGF-β的方法。本發明揭示一種構建LTBP表達質粒pDSVE2-BP和將該質粒轉染到CHO細胞，即CHO T23-7-11細胞的方法在此做了特別的說明。將最高水平表達大潛在TGF-β復合體的克隆篩選出來用于純化LL-TGF-β(LTB3-1克隆)。
文檔編號A61K38/00GK1088616SQ9311915
公開日1994年6月29日 申請日期1993年10月26日 優先權日1992年10月26日
發明者卡爾-亨里克·赫爾丁, 宮園浩平, 帕斯卡爾·科洛塞弟, 烏爾夫·赫爾曼, 大橋秀哉, 石井保之 申請人:麒麟麥酒株式會社, 路德維格癌癥研究所