疫苗的制作方法

專利名稱：疫苗的制作方法
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本發(fā)明涉及新的后生動物寄生蟲抗原，以及它們在控制由蠕蟲和其他后生動物寄生蟲(尤其是家養(yǎng)動物中的蠕蟲和節(jié)肢動物寄生蟲)引起的疾病中的應(yīng)用。
每種家養(yǎng)動物都可以寄生有許多不同的寄生蟲，包括許多種蠕蟲和節(jié)肢動物，這一寄生過程通常引起疾病。這些疾病中有些在經(jīng)濟上是相當(dāng)重要的例如血矛線蟲病(haemonehosis)是由捻轉(zhuǎn)血矛線蟲這樣一種蠕蟲引起的疾病，這種線蟲寄生在各種反芻動物包括羊的皺胃或真胃。血矛線蟲的幼蟲和成熟蟲是吸血蟲，它通過嘴附著在胃粘膜內(nèi)的小血管上。有嚴(yán)重寄生蟲的羊可失去大量血液，導(dǎo)致貧血、不健壯和經(jīng)常死亡。血矛線蟲病主要發(fā)生于世界的熱帶和亞熱帶地區(qū)，因為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲在牧場的非寄生期易出現(xiàn)于低溫氣候，并且經(jīng)常是在溫和氣候下也不能過冬。
從經(jīng)濟觀點看也具有非常重要意義的是非吸血線蟲Ostertagia ostertagi和Ostertagia(Teladorsagia)circumcincta(O.circumcincta最近被再分類為T.Circumcincta，只是新的名稱尚未被廣泛應(yīng)用)。分別感染有O.ostertagi和O.circumcincta的牛和羊不能夠健康成長，如果不治療會引起死亡，胃線蟲病(Ostertagiosis)是當(dāng)今動物飼養(yǎng)中發(fā)生問題的主要蠕蟲感染之一。
其他有經(jīng)濟重要性的寄生蟲包括下列蠕蟲家族的各種寄生蟲毛圓線蟲屬，細(xì)頸線蟲屬，網(wǎng)尾(線蟲)屬，古柏線蟲屬，蛔蟲屬，惡絲蟲屬，鞭蟲屬，園線蟲屬，片吸蟲屬，結(jié)節(jié)線蟲屬，仰口(線蟲)屬，后圓線蟲屬。除家畜外，寵物和人也會被感染，常常出現(xiàn)致命的后果，并且蠕蟲感染和侵染會帶來相當(dāng)廣泛嚴(yán)重的世界性問題。
其他有意義的后生動物寄生蟲包括許多節(jié)肢動物種類，尤其是蜘蛛和昆蟲類的成員，特別是外寄生物如吸血(血液寄生)昆蟲(例如昆蟲外有翅亞綱和內(nèi)有翅亞綱的成員)，綠頭蒼蠅(綠蠅屬)和扁虱。
這方面特別提到的是扁虱品種和牛蜱屬(Boophilus，spp)、鈍眼蜱屬、軟蜱屬、扁頭蜱屬、璃眼蜱屬、鈍緣蜱屬、革蜱屬、硬蜱屬;蒼蠅，尤其是綠蠅屬和蠅蛆病，吸吮和叮咬蒼蠅，如廄螯蠅、羊狂蠅、Hydrotaea irritans、胃蠅屬、蚋屬、擾血蠅、黑角蠅屬、虻屬、金蠅屬、麗蠅屬、白蛉屬、舌蠅屬、皮蠅屬(hypoderma spp)、皮蠅屬(Dermatobia spp)、和旋錐蠅屬，虱，如，Haematopinus eurysternus、Linognathus Vittuli、Solenopotes Capillatus、Linognathus ovillus、和Menacanthus spp;螨，如癢螨屬、蠕螨屬、疥螨屬、皮疥螨屬、Psorergates spp、皮刺螨屬、禽刺螨屬、耳癩螨屬、和痂螨屬;蚤類如犬櫛頭蚤和貓櫛頭蚤;羊蜱蠅類如，羊虱蠅，和臭蟲如臭蟲屬。
除了它們本身寄生的影響，許多吸血節(jié)肢動物是傳播各種疾病的重要因素，例如，傳播有醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)意義的致病性原蟲或病毒。由于吸血節(jié)肢動物以及它們傳播的疾病使得牲畜飼養(yǎng)者每年損失很大。
對于畜牧場蠕蟲和節(jié)肢動物寄生蟲的控制，目前主要依靠使用抗蠕蟲藥、endectosides和/或殺蟲劑，并配合牧場管理。這種方法經(jīng)常是不令人滿意的，首先，因為必須經(jīng)常地使用藥物，再者對抗蠕蟲藥和殺節(jié)肢動物藥的抗藥性廣泛增加，第三某些牧場經(jīng)常不可能有合適的牧場管理，而且即使有，也是強調(diào)最好的利用可能的放牧。
曾試圖通過免疫方法控制家畜的寄生蟲。除極少數(shù)例外(如，牛肺蠕蟲，Dictyocaulus viviparus)已經(jīng)證實這種方法的不可行性，到目前為止，商業(yè)上尚沒有用于防止反芻動物胃腸道線蟲(包括血矛蟲屬和胃線蟲屬)和主要節(jié)肢動物寄生蟲的疫苗。
不過，最近幾年，有一些報道描述從血矛線蟲屬中分離出的新蛋白，并且有預(yù)防性抗原活性，不僅可抗血矛線蟲屬，而且還可以抗家畜的多種相關(guān)內(nèi)寄生蟲(描述見Emery和Wagland，1991，Parasitology Today 7，347-349)。
Munn于1977年(Tissue and Cell 1977，923-34)首次報道了與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲腸細(xì)胞腔表面相關(guān)的一種螺旋狀聚合細(xì)胞外蛋白-彎曲蛋白(Contortin)，而且后來作為粗制提取物大劑量(幾毫克)給藥時，表現(xiàn)可防止小羊發(fā)生血矛線蟲病(Munn 1987，Parasitology 94 385-397)。因為需要大劑量以及所注射制劑的不純，尚不清楚是否這些實驗中產(chǎn)生的保護(hù)作用實際上是由于彎曲蛋白(contortin)本身還是由于污染疫苗的其他抗原。的確進(jìn)一步的工作表明用這種彎曲蛋白制劑免疫的羊也具有抗腸膜蛋白對(doublet)H 110 D的抗體。后來表明用小劑量(幾百微克)的高純度H 11 D免疫的羊基本上可防止血矛線蟲病(Munn，WO 88/00835;Munn and Smith WO 90/11086)。H 110 D目前代表了當(dāng)今抗血矛線蟲屬最成功的疫苗成份。還發(fā)現(xiàn)了第三種具有預(yù)防性抗原特性的血矛線蟲腸膜蛋白并命名為H45(Munn and Smith WO 90/11086)。
現(xiàn)有技術(shù)中還有報道不成功的尚試，試圖在血矛線蟲屬和其他蠕蟲種類中識別預(yù)防性抗原。因此，如，已從成熟血矛線蟲屬中分離出一種45kd膜糖蛋白，將它作為免疫原用于由這種寄生蟲激發(fā)的荷蘭豬中時以蠕蟲數(shù)表示可表現(xiàn)出約50%的保護(hù)作用(Sharp，Wagland and Cobon WO 92/13889)。沒有描述它在羊身上的作用。沒有說明這種抗原在蠕蟲中的天然位置，確實也沒有說明它是一種腸腔表面蛋白。有報道說血矛線蟲屬膜提取物的更粗制品(幾乎肯定含有H 110 D)可減少羊卵蟲和蠕蟲數(shù)目分別達(dá)88和75%，不過也沒有提供資料說明分組樣本大小以及羊之間變異的情況。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲自然條件下不寄生于荷蘭豬。不象在其自然宿主如羊身上那樣可持續(xù)幾周，血矛線蟲屬感染荷蘭豬后在達(dá)到其成熟期前幾乎所有蠕蟲在感染后5到7天之間即被明顯地消除掉(Wagland，Abeydeera，Rothwell and Ouwerkerk 1989 International Journal for Parasitology 19 301-305)。在WO 92/13889中使用的荷蘭豬激發(fā)模型中，在激發(fā)后5或6天處死動物，這樣接種組和對照組之間的任何區(qū)別只反映了排斥現(xiàn)象加速了1或2天。這種非常微小的區(qū)別與本發(fā)明(也見上述的WO 88/00835和WO 90/11086)所述的羊身上的效果形成對照，并且對此文獻(xiàn)中的這種實驗室動物模型的價值產(chǎn)生了懷疑。后來本發(fā)明經(jīng)實驗證實了這種懷疑，發(fā)現(xiàn)一種血矛線蟲屬膜提取物的小麥芽植物血凝素結(jié)合部分對羊具有高度的保護(hù)作用，而在WO 92/13889中報道了一種基本相似的制劑在荷蘭豬模型中無作用。
WO 89/00163描述對一種41kd蛋白的編碼基因的克隆和表達(dá)，這種蛋白來源于蛇形毛圓線蟲，這種線蟲是與血矛線蟲相同分類家族的一個成員，并且是羊小腸的一種寄生蟲。這種蛋白尚沒有特征化，盡管由于用來源于表達(dá)這種基因的重組有機體的蛋白接種羊，在用血矛線蟲屬激發(fā)后與對照羊比較據(jù)稱可引起卵蟲和蠕蟲數(shù)目的減少，但這種減少沒有統(tǒng)計學(xué)的顯著意義，除非進(jìn)一步地改進(jìn)，所表現(xiàn)的保護(hù)程度在商業(yè)上是沒有使用價值的。
最近從捻轉(zhuǎn)血矛線蟲中分離出一種水溶性半胱氨酸蛋白酶，并且已克隆和表達(dá)了編碼這種酶的基因(Cox，Pratt，Hageman and Boisvenue 1990 Molecular and Biochemical Parasitology 41 25-34)。通過在還原條件下SDS-PAGE電泳判斷這種蛋白酶具有35kd的分子量，不過還識別了一種分子量為37kd的更重的糖基化轉(zhuǎn)化體。曾假定這種蛋白酶(推斷可除解纖維蛋白原)在血矛線蟲屬吸血時可防止宿主血液凝固，有可能增強血液的攝入和消化。據(jù)說用富含天然半胱氨酸蛋白酶的幾百微克樣本反復(fù)給羊注射，可預(yù)防血矛線蟲屬，因為在用2，500血矛線蟲屬幼蟲激發(fā)后與對照羊比較它們的糞便卵數(shù)減少并且所攜帶的蠕蟲也少(Boisvenue，Stiff，Tonkinson，Cox and Hageman 1990 Proceedings of the VIIth International Congress of Parasitology p.475)。盡管如此，在美國專利408339和48718)中公開的這些實驗的詳細(xì)內(nèi)容表明接種組和對照組之間蠕蟲和蟲卵數(shù)目的實際差異是勉強的，沒有統(tǒng)計學(xué)的顯著意義。
已經(jīng)從血矛線蟲三期幼蟲的外鞘體液中純化出一種44kd蛋白酶(Gamble，Purcell and Fetterer 1989 Molecular and Biochemical Parasitology 33 49-58)。這種蛋白酶，被定義為金屬蛋白酶，不能被胃酶抑素所抑制，可以引起蛻皮，沒有測試出它的預(yù)防功能。Maki和Yanagisawawa(Journal of Helminthology 1986，60，31-37)描述了在成熟曼氏血吸蟲、犬惡絲蟲、Angiostrongylus Cantonensis和Suum.蛔蟲中的羧基(天冬氨?；?和硫羥基蛋白酶活性。盡管如此，也沒有對這些活性以分子量的形式進(jìn)行分離或特征化，并且沒有試圖確定它們是否可用作預(yù)防性抗原。
已從三期O.circumcincta幼蟲中分離出一種31kd糖蛋白(McGillivery，Young，Riffkin and Adler 1989 International Journal for Parasitology 19 473-478)。用這種糖蛋白免疫的羊可部分地預(yù)防激發(fā)感染(WO 91/01150)。
已經(jīng)從蛇形毛圓線蟲(T.colubriformis)的排泄分泌產(chǎn)物中分離出11和17kd的兩種低分子量蛋白(Savin et al.，1990 Molecular and Biochemical Parasitology 41 167-176;Dolpheide et al.，1991，Molecular and Biochemical Parastology 45 101108)。據(jù)報道當(dāng)用這些抗原的重組轉(zhuǎn)化體免疫羊時，對用蛇形毛圓線蟲的激發(fā)可產(chǎn)生低程度或可變程度的預(yù)防(Emery and Wagland 1991)。
就節(jié)肢動物寄生蟲而言，現(xiàn)有技術(shù)很少報道有推薦的疫苗，這些報道主要集中在具環(huán)牛蜱，尤其是微小牛蜱上面。因此Johnson等人于1986年報道從成熟雌性蜱中得到的水溶性和非水溶性提取成份中可發(fā)現(xiàn)抗微小牛蜱的預(yù)防性抗原(Johnson et al.，1986，Int.J.Parasitol，16(1)27-34)。從那時起現(xiàn)有技術(shù)中出現(xiàn)了一些報道，建議使用從成熟蜱的內(nèi)臟提取物、蜱幼蟲提取物和唾液腺成份中得到的蜱抗原免疫牛以抵抗蜱(見，例如，Willadsen et al.，1989，Int.J.Parasitol.18(2)183-189;Wong et al.，1990，Parasite Immunology，1275-83;Jackson et al.，1990，Parasite Immunology，12141-151)。
目前仍然需要新的和改進(jìn)的后生動物寄生蟲疫苗，尤其是需要一種可對廣泛蠕蟲和/或節(jié)肢動物種類使用的疫苗。
因此本發(fā)明試圖提供新的抗原用作后生動物寄生蟲疫苗，尤其是作為預(yù)防性免疫原用于控制由蠕蟲和其他后生動物寄生蟲引起的疾病。
更具體的講，本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)H.Contortus的內(nèi)臟含有一種蛋白水解活性糖蛋白復(fù)合物，我們命名它為H-gal-GP(含血矛線蟲半乳糖的糖蛋白)，并且它能夠使動物具有抗血矛線蟲及相關(guān)寄生蟲的免疫能力。已分別從Ostertagia Ostertagi和Ostertagia circumcincta的提取物中分離出與H-gal-GP類似的糖蛋白復(fù)合物(我們稱之為Oo-gal-GP和Oc-gal-GP)，并且發(fā)現(xiàn)了在其他蠕蟲如毛圓線蟲中的類似蛋白水解活性。從它們所結(jié)合的膜上例如通過使用洗滌劑如Triton X-100分離下的這種復(fù)合物是新的，并且可用于生產(chǎn)抗蠕蟲感染的疫苗。在其他的后生動物寄生蟲如綠頭蒼蠅幼蟲中也發(fā)現(xiàn)了存在于蠕蟲中的酶。
因此，根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了一種后生動物寄生蟲抗原或抗原片段，其成份或其前體，和具有抗一種或多種后生動物寄生蟲的預(yù)防性抗原活性的其功能等同衍生物、類似物或變異體，該抗原的特征在于(a)具有蛋白水解活性;
(b)天然形式是一種完整的膜蛋白或蛋白復(fù)合物，存在于寄生蟲內(nèi)臟的腸刷邊緣;
(c)能夠結(jié)合胃酶抑素;和(d)能夠結(jié)合小麥芽植物血凝素和對β-連接的N-乙酰半乳糖胺有特異性的植物血凝素。
本發(fā)明的另一方面提供了預(yù)防性抗原和抗原片段、其成份或前體及功能等同衍生物，類似物或變異體用于在人或非人類(優(yōu)選哺乳動物、特別是反芻動物)體內(nèi)激發(fā)抗后生動物寄生蟲的免疫應(yīng)答。
所說抗原的前體是一種較大蛋白，通過如蛋白水解處理可原位產(chǎn)生抗原。這種前體可以是酶原的形式，也就是酶的非活性前體，通過蛋白水解斷裂可使之活化，例如可以是胃蛋白酶/胃蛋白酶原系統(tǒng)或與血液凝固鏈相關(guān)的公知酶原的類似物。
本發(fā)明的新抗原不能被自然免疫動物血清所識別。換句話說，這些抗原在天然形式時通常不能接觸到感染宿主的免疫系統(tǒng)，因此稱之為“隱蔽”、“隱藏”或“秘密”抗原。
關(guān)于本發(fā)明新抗原的植物血凝素結(jié)合活性，已證實了與Con A、豌豆和蓮花植物血凝素的結(jié)合，這表明了甘露糖和/或巖藻糖殘基的存在。沒有發(fā)現(xiàn)與植物血凝素如Datura和Bandeiraea的結(jié)合，說明缺乏含N-乙酰葡糖胺的結(jié)構(gòu)，但是如上所述，與對N-乙酰半乳糖胺(特別是β-連接的N-乙酰半乳糖胺)有特異性的植物血凝素的結(jié)合是顯著的，尤其是與花生和jacalin植物血凝素的結(jié)合。
關(guān)于蛋白水解活性，盡管使用一般蛋白酶底物如偶氮膠原蛋白、偶氮酪蛋白、血紅蛋白、和明膠已經(jīng)證實了這一點，但還發(fā)現(xiàn)了更特異性的活性，最顯著的是天冬氨酰蛋白酶樣和中性內(nèi)肽酶樣活性。因此，例如，在H和O-gal-GP制劑和蠕蟲如毛圓線蟲中已證實了天冬氨酰蛋白酶樣活性。在含有本發(fā)明抗原的提取物中含有中性內(nèi)肽酶樣活性。而且，就所說的特異性抗原H-gal-GP而言，來源于編碼H-gal-GP成份的cDNA克隆的開始核苷酸序列數(shù)據(jù)表明了與已知中性內(nèi)肽酶的基本同源性。
因此，從不同角度看，本發(fā)明還提供了一種預(yù)防性后生動物寄生蟲抗原或抗原片段、其成份或其前體和具有抗一種或多種后生動物寄生蟲的預(yù)防性抗原活性的其功能等同衍生物、類似物或變異體，該抗原的特征在于具有天冬氨酰蛋白酶樣和/或中性內(nèi)肽酶樣活性，并且天然形式的抗原是一種完整的膜蛋白或蛋白復(fù)合物。
本發(fā)明抗原的另一個主要特征是它們可以結(jié)合胃酶抑素。胃酶抑素公知是一種天冬氨酰蛋白酶的抑制劑，據(jù)記載它還可以較小程度地結(jié)合膜金屬內(nèi)肽酶，包括中性內(nèi)肽酶。
發(fā)現(xiàn)胃酶抑素可抑制血矛線蟲屬、胃線蟲屬和毛圓線蟲屬中的蛋白水解活性。因此本發(fā)明的另一方面提供了預(yù)防性后生動物寄生蟲抗原或抗原片段、成份或其前體和具有抗一種或多種后生動物寄生蟲的預(yù)防性抗原活性的其功能等同衍生物、類似物或變異體，該抗原的特征在于能夠結(jié)合胃酶抑素，并且其天然形式是一種完整的膜蛋白或蛋白復(fù)合物。
等電子聚焦研究表明本發(fā)明糖蛋白抗原的等電點位于大約pH2至pH7.5區(qū)間。
對本發(fā)明的抗原已進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)研究。在還原和非還原凝膠上這種研究有不同的表現(xiàn)。特別是，在非還原凝膠上的較大譜帶當(dāng)在還原條件下再電泳時會分解成一個或多個小譜帶。正如下面將要詳細(xì)描述的，描述了對個體蛋白或復(fù)合譜帶的蛋白水解活性和預(yù)防性抗原活性，不過某些譜帶比其他譜帶更“活躍”。本發(fā)明的抗原可能代表了多聚酶復(fù)合物。
關(guān)于抗原H-gal-GP，PAGE研究結(jié)果在下面的實施例1中有詳細(xì)描述。因此，本發(fā)明的優(yōu)選抗原亞單位包括實施例1中所述的抗原(及其片段或成份)和它們的功能等同衍生物、類似物和變異體，包括其他屬或種的類似物。因此，本發(fā)明的優(yōu)選抗原可包括可從血矛線蟲屬或其他后生動物寄生蟲屬中分離、具有表1所列SDS-PAGE分子量的抗原。
關(guān)于抗H-gal-GP，預(yù)防性抗原活性表現(xiàn)與某些特定成份蛋白譜帶相關(guān)，更為詳細(xì)的描述見下面的實施例7，實驗5。
因此，本發(fā)明的另一方面還提供了一種預(yù)防性后生動物寄生蟲抗原或抗原片段、成份或其前體，和具有抗一種或多種后生動物寄生蟲的預(yù)防性抗原活性的其功能等同衍生物、類似物或變異體，該抗原是，或形成部分、或完整的膜蛋白或蛋白復(fù)合物，它可從血矛線蟲屬的內(nèi)臟獲得，并且在非還原條件下通過在5%凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE電泳測得它具有大約190至205kd的分子量或者是在非還原條件下通過在10%凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE電泳測得大約35或45至50kd的分子量。
本發(fā)明特別感興趣的后生動物寄生蟲包括特別是蠕蟲和節(jié)肢動物寄生蟲，對于后者，特別是吸血昆蟲寄生蟲、牛蜱和蠅蛆病蒼蠅。作為代表性的這種蠕蟲和節(jié)肢動物寄生蟲可以是，例如，上述列舉的不同種類。
本文所用術(shù)語“預(yù)防性抗原”定義為那些能夠產(chǎn)生宿主預(yù)防性(即免疫原性)免疫應(yīng)答的抗原，這種免疫應(yīng)答也就是一種宿主的反應(yīng)，它能產(chǎn)生免疫效應(yīng)因子分子、抗體或細(xì)胞以破壞、抑制或殺死寄生蟲，并且從而“防止”宿主或宿主種類發(fā)生臨床或臨床前期疾病以及繁殖能力的喪失。這種預(yù)防性免疫應(yīng)答通常會表現(xiàn)為產(chǎn)生抗體，這種抗體能夠抑制寄生蟲的代謝功能，導(dǎo)致發(fā)育遲緩，缺乏排卵和/或死亡。
對于某些后生動物寄生蟲，特別是蠕蟲和那些專性寄生的外寄生物，如虱和螨或那些在宿主上寄食一段時間的寄生蟲，如綠頭蒼蠅、鳴蒼蠅、旋蠅、和膚蠅幼蟲，有角牛/水牛蠅，和蜱，宿主預(yù)防性免疫應(yīng)答可引起感染動物的寄生蟲死亡、衰弱和/或驅(qū)除。換句話說感染動物的寄生蟲攜帶數(shù)減少了，感染動物本身直接從其自己的免疫應(yīng)答受益。但是在其他情況下，可發(fā)現(xiàn)一種“流行病學(xué)”效應(yīng)，此時直接宿主本身不必從其自己的免疫應(yīng)答明顯受益。例如，在免疫的宿主上寄食的結(jié)果，可使該地區(qū)的寄生蟲數(shù)量減少和/或減弱，從而保護(hù)了后者宿主群。保持該免疫過程經(jīng)過幾個季節(jié)將繼續(xù)減少寄生蟲病的威脅。這對于節(jié)肢動物外寄生蟲如蜱、蒼蠅等來說尤其正確，這些寄生蟲的寄食會很快地從一個宿主轉(zhuǎn)移到另一個宿主。通過這種方式，被寄生蟲攝入的抑制性抗體在寄生蟲離開該宿主之后會發(fā)揮其效應(yīng)，但通過殺死、使衰弱或減少寄生蟲的生殖力，宿主動物群中的其他成員得到保護(hù)。
正如下面將要詳細(xì)描述的，已經(jīng)證實了本發(fā)明抗原的預(yù)防性、免疫原性、活性。還進(jìn)一步表明，當(dāng)抗原變性(如通過分離和/或還原)時這種預(yù)防活性仍然保存。的確，如上所述，血矛線蟲抗原復(fù)合物H-gal-GP的某些成份表現(xiàn)出特別的預(yù)防性。
另一種觀點是，本發(fā)明還提供了前面所定義的后生動物寄生蟲抗原及其具有抗一種或多種后生動物寄生蟲的預(yù)防性抗原活性的成份、片段、前體和功能等同衍生物、類似物或變異體的用途。用它們制備一種疫苗組合物，用于在人或非人類、優(yōu)選哺乳動物、特別是優(yōu)選反芻動物中激發(fā)抗后生動物寄生蟲的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明還提供了一種用于在人或非人類、優(yōu)選哺乳動物中激發(fā)抗后生動物寄生蟲的免疫應(yīng)答的疫苗組合物，它包含一種或多種上述定義的抗原或其具有抗一種或多種后生動物寄生蟲的預(yù)防性抗原活性的成份、片段、前體和功能等同衍生物、類似物或變異體，還含有可藥用載體或稀釋劑。本發(fā)明還提供了在人或非人類、優(yōu)選哺乳動物中激發(fā)抗后生動物寄生蟲的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給所說的動物施用上面定義的疫苗組合物。
如上所述，這種新的糖蛋白抗原的功能等同衍生物、類似物和變異體包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本文所用“功能等同”是定義與天然酶蛋白相關(guān)或來源于天然酶蛋白的蛋白質(zhì)，其中已通過一個或多個氨基酸取代、加入和/或缺失對其氨基酸序列進(jìn)行了修飾，而且用它還定義已經(jīng)進(jìn)行了氨基酸化學(xué)修飾(包括脫糖基化或糖基化)、但仍保留預(yù)防性抗原活性如能夠激發(fā)宿主產(chǎn)生抗寄生蟲的預(yù)防性抗體和/或功能性免疫的序列。這種功能等同性變異體可以是自然生物變異，或者是使用已知技術(shù)制備。例如，可以使用對核酸的位點誘導(dǎo)性突變、隨機突變、或酶切割和/或連接這些已知技術(shù)制備功能等同性重組蛋白。涉及到類似抗原復(fù)合物H-gal-GP和O-gal-GP正如下面實施例詳細(xì)描述的，這些功能等同性類似物可以出現(xiàn)在不同的寄生蟲種類中。
本發(fā)明的抗原可以從廣泛的后生動物寄生蟲種類中獲得，包括例如線蟲血矛線蟲、胃線蟲和毛圓線蟲。(為避免出現(xiàn)疑問，本文所用術(shù)語“胃線蟲”包括Teladorsagia sp.)。優(yōu)選的是那些所謂的“廣譜”抗原，它們能夠激發(fā)宿主的預(yù)防性免疫應(yīng)答，除了能抵抗它們分離來源的寄生蟲外，還能抵抗廣泛的其他寄生蟲。因此，例如，血矛線蟲糖蛋白復(fù)合物H-gal-GP可以預(yù)防不同種類的胃線蟲，反之也一樣。
如上所述，本發(fā)明抗原產(chǎn)生其宿主預(yù)防性效應(yīng)的一種方式是激發(fā)產(chǎn)生抑制性抗體，該抗體能抑制寄生蟲的生長、維持和/或發(fā)育。這些可以是單一或多克隆的抗體及其抗原結(jié)合片段(如，F(xiàn)(ab)2，F(xiàn)ab和Fv片段，也即抗體“可變”區(qū)的片段，它包含抗原結(jié)合位點)構(gòu)成了本發(fā)明的另一部分內(nèi)容，這如同含有它們的疫苗組合物以及它們在制備疫苗組合物用于免疫宿主抗寄生蟲中的應(yīng)用一樣。可以使用基因型抗體激發(fā)這種抑制性抗體?？梢杂每够蛐涂贵w作為疫苗中的免疫原。
可以使用慣用的生物化學(xué)和外科方法從寄生蟲如蠕蟲中提取制備本發(fā)明的抗原，這種方法如均質(zhì)整個寄生蟲或只均質(zhì)其腸，然后用慣用的純化方法如離心，選擇性沉淀，色譜等分離所需的酶。優(yōu)選方法的優(yōu)點是通過利用在固相基質(zhì)上固定了特異配體的新合層析系統(tǒng)使靶分子具有特定的選擇結(jié)合活性。
因此本發(fā)明還提供了一種制備用于免疫人或非人類、優(yōu)選哺乳動物抗后生動物寄生蟲感染的疫苗的方法，所說的方法包括制備含有至少一種上面定義的預(yù)防性抗原的所說寄生蟲的提取物，通過將所說抗原結(jié)合到一種包含所說抗原的特異性結(jié)合配體的固定相上面，然后從所說固定相上洗脫所說的抗體這一過程從中純化所說抗原。合適的特異性結(jié)合配體包括底物類似物例如抑制劑胃酶抑素，和寡聚糖特異性植物血凝素如那些特異性結(jié)合半乳糖(特別是β-連接的N-乙酰-半乳糖胺)的植物血凝素。
的確，我們的研究已經(jīng)表明某些植物血凝素特別適合用親合層析中的配體以識別寄生蟲腸腔表面上的具有預(yù)防性抗原能力的糖蛋白。
因此，本發(fā)明的另一方面提供了一種識別寄生蟲中預(yù)防性抗原的方法，包括使用帶有一種或多種對N-乙酰-半乳糖胺有特異性的植物血凝素的固定相，對寄生蟲的完整膜部分進(jìn)行親合層析。
這些植物血凝素優(yōu)選花生或jacalin植物血凝素，或者是具有β-連接的N-乙酰-半乳糖胺特異性的其他植物血凝素。
使用現(xiàn)有技術(shù)中公知的方法可以容易地制備寄生蟲的完整膜部分，例如用Triton X-100進(jìn)行洗滌劑提取。
親合層析技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的，并且包括床和柱基質(zhì)系統(tǒng)。可以使用許多種可吸附植物血凝素的固相，例如凝膠如瓊脂糖或Sepharose。的確，帶有花生或Jacalin植物血凝素的瓊脂糖凝膠珠在商業(yè)上是可得到的(Vector Laboratories)。
另外，還可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法通過重組DNA技術(shù)制備該抗原，如由Sambrook等人所述的方法，1989，(Molecular Cloning，a laboratory manual 2nd Edition，Cold Spring Harbor Press)。
本發(fā)明的另一方面還包括含有編碼本發(fā)明抗原的核苷酸序列的核酸分子。
曾對與抗原H-gal-GP相應(yīng)的克隆初級序列進(jìn)行了研究。其中一種克隆的序列(命名為HG3)示于圖33(序列識別號1)。如圖34所示的氨基酸序列(序列識別號2)所表明的，這一序列與已知的哺乳動物中性內(nèi)肽酶序列表現(xiàn)出顯著的同源性。
因此，本發(fā)明的一種優(yōu)選核酸分子包含一種或多種與圖33所示核苷酸序列(序列識別號1)的全部或部分基本相對應(yīng)的核苷酸序列，或者是一種所說序列的降解序列或基本與之同源或與之雜交的序列。
本發(fā)明的核酸分子可以是單股或雙股的DNA、cDNA或RNA，優(yōu)選DNA，并且包括能夠編碼所說抗原或抗原片段的降解、基本同源和雜交序列?！盎就础笔侵副憩F(xiàn)出至少60%，優(yōu)選至少70%或80%序列同源性的序列。本發(fā)明范圍內(nèi)的雜交序列是那些在非嚴(yán)格條件下(6×SSC/50%甲酰胺，室溫)結(jié)合，并以在低嚴(yán)格條件(2×SSC，室溫，更優(yōu)選2×SSC，42℃)或在高嚴(yán)格條件如2×SCC，65℃(其中SSC＝0.15M NaCl，0.015M枸櫞酸鈉，PH7.2)下沖洗的序列，以及那些可在上述條件下雜交的序列(密碼子的降解除外)。
可以使用現(xiàn)有技術(shù)中公知的慣用方法獲得能夠編碼本發(fā)明有抗原活性的抗原或抗原變異體的核苷酸序列衍生物。
可以通過在一種宿主細(xì)胞中表達(dá)制備重組形式的本發(fā)明抗原，所說宿主細(xì)胞中含有一種重組DNA分子，該分子含有一種上面廣義定義的并人工連接到一種表達(dá)控制序列上的核苷酸序列，或者該宿主含有一種重組DNA克隆載體或者是含這種重組DNA分子的載體。以這種方式表達(dá)的合成多肽構(gòu)成了本發(fā)明的另一方面內(nèi)容(本文所用術(shù)語“多肽”包括全長度蛋白和較短的肽序列)。
如此表達(dá)的抗原可以是一種融合多肽，該多肽包含有全部或部分的本發(fā)明抗原和另外一種由融合其上的重組分子DNA編碼的多肽。這可以是例如β-半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，肝炎核心抗原或通常在現(xiàn)有技術(shù)的融合蛋白中使用的任何其他多肽。
因此，本發(fā)明的其他方面包括含有編碼本發(fā)明抗原的DNA的克隆和表達(dá)載體，以及制備本發(fā)明重組核酸分子的方法，包括向載體核酸，如，載體DNA中插入編碼該抗原的核苷酸序列。這種表達(dá)載體包括合適的控制序列如翻譯(如起始和終止密碼子，核糖體結(jié)合位點)和轉(zhuǎn)錄控制成份(例如，啟動子-操縱子區(qū)，末端終止序列)，并且這些成份在配對閱讀框架中與本發(fā)明的核酸分子連結(jié)。
本發(fā)明的載體可以包括根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中的公知技術(shù)和文獻(xiàn)記載的質(zhì)粒和病毒(包括噬菌體和真核病毒)，并且可以在各種不同表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。這些系統(tǒng)也是現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)記載和公知的。合適的病毒載體包括桿狀病毒，和腺病毒以及牛痘病毒。許多其他的病毒載體在現(xiàn)有技術(shù)中有所記載。
可以用各種已知的技術(shù)將這些載體導(dǎo)入原核或真核細(xì)胞用于表達(dá)，或?qū)肱呦祷蝮w細(xì)胞以形成轉(zhuǎn)基因動物。合適的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳細(xì)描述。
本發(fā)明還包括含有上面定義的本發(fā)明核酸分子的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細(xì)胞，或轉(zhuǎn)基因生物。這種宿主細(xì)胞可以例如包括原核細(xì)胞例如大腸桿菌、真核細(xì)胞如酵母或桿狀病毒昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)、轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動物和植物。特別提到的是轉(zhuǎn)基因線蟲(見，例如，F(xiàn)ire，1986，EMBO J.，5.2673以便討論線蟲Caenorhabditis的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng))。
本發(fā)明的另一方面內(nèi)容提供了制備前面定義的本發(fā)明抗原的方法，包括培養(yǎng)一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞含有編碼全部或部分所說抗原的核酸分子，培養(yǎng)條件是指能夠表達(dá)所說抗原的條件，該方法還包括回收如此生產(chǎn)的所說抗原。
還可以通過化學(xué)方法，如已知的Merrifield固相合成方法制備本發(fā)明的抗原及功能等同抗原變異體。
上述新抗原的水溶性衍生物構(gòu)成了本發(fā)明的另一方面內(nèi)容?？梢酝ㄟ^蛋白水解消化，如使用彈性蛋白酶，來獲得這種水溶形式。一般地說酶消化抗原產(chǎn)生兩部分產(chǎn)物，一部分是洗滌劑可溶性成份(它保留在膜上)，另一部分是水溶性成份。
通過疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域中的公知方法，根據(jù)本發(fā)明可制備一種疫苗組合物。傳統(tǒng)的疫苗制劑包括一種或幾種本發(fā)明的抗原或抗體，并且在合適條件下，還含有一種或多種合適的佐劑如氫氧化鋁、皂草苷、quil A、或它的更純化形式、胞壁酰基二肽、礦物油或植物油、Novasomes或非離子阻斷共聚物或DEAE葡聚糖，并含有一種或多種可藥用載體或稀釋劑。合適的載體包括液體基質(zhì)如適合于用作載體以將肽或多肽引入動物或病人的鹽溶液。還可以包括其他成份如防腐劑。
另一種疫苗制劑可以含有一種病毒、或宿主細(xì)胞如微生物(如牛痘病毒、腺病毒或沙門菌)，這些微生物可以是成活的、滅活的或減毒的，并且在其中已插入本發(fā)明的核酸分子(如，DNA分子)，以用于激發(fā)一種免疫應(yīng)答，抵抗由插入的核酸分子所編碼的多肽。
該疫苗組合物的給藥可以通過任何慣用途徑，如口服或非腸道給藥如肌內(nèi)注射，給藥間隔是可選擇的如，在7-35天間隔注射兩次。
本發(fā)明的抗原可以與從相同或不寄生蟲種類中獲得的其他預(yù)防性抗原結(jié)合使用。因此，本發(fā)明的疫苗組合物可以含有一種或多種上述定義的抗原如H-gal-GP，并且一同含有上述抗原H110D和H45。這種結(jié)合的疫苗組合物比單一的疫苗制劑(只含有所需的抗原)含有更小量的各種不同抗原。
受益于本發(fā)明的動物可以是任何的人或非人類動物，但優(yōu)選的是伴生動物(尤其是狗和貓及家畜)，特別是反芻動物。特別優(yōu)選的是羊、牛、豬、鹿和山羊。
本發(fā)明將對來源于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(H.Contortus)O.ostertagi和O.circumcincta的分別命名為H-gal-GP、Oo-gal-GP和Oc-gal-GP的抗原進(jìn)行更為詳細(xì)的討論。如上所定義的在不限制本發(fā)明主題的同時，應(yīng)當(dāng)明白的是H-gal-GP、Oo-gal-GP和Oc-gal-GP和/或其分離成份在蠕蟲疫苗制劑中的應(yīng)用及抗原和疫苗本身構(gòu)成本發(fā)明的特別優(yōu)選內(nèi)容。
蛋白H-gal-GP是血矛線蟲屬腸細(xì)胞刷緣線內(nèi)的完整膜蛋白。它已被糖基化，并且選擇性地結(jié)合到對N-乙酰半乳糖胺有特異性的植物血凝素上。它表現(xiàn)出可被胃酶抑素(一種天冬氨酰蛋白酶的特異性抑制劑)抑制的蛋白酶活性。在還原條件下于SDS-聚丙烯酰胺凝膠上它可跑出8條主要譜帶。鑒于此原因，它被命名為血矛線蟲屬含半乳糖糖蛋白復(fù)合物或H-gal-GP。
在下面的非限制性實施例中，圖的含義代表

圖1表示H-gal-GP、H11OD和H-45復(fù)合物在10%丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE的比較。
泳道1至3和4至6 分別是非還原和還原樣品，泳道1和4 一種富含H11和H45復(fù)合物的混合物的部分泳道2和5 H45復(fù)合物泳道3和6 H-gal-GP對泳道3中47和50kd帶的N末端氨基酸序列進(jìn)行了測定。
圖2表示H-gal-GP在非還原條件下于5%凝膠上的SDS-PAGE概括。每個泳道含有不同的H-gal-GP含量。字母表示從羊?qū)嶒?(見實施例7和圖22)中的抗原上切下的樣本帶，如下A＝15組的230kdB＝16組的190-205kd 彌散帶C＝17組的170kdD-18組的染色前譜帶圖3表示了在非還原條件下預(yù)先分離的主要H-gal-GP帶的還原條件下分析。
泳道1 H-gal-GP泳道2 230kd)這些表現(xiàn)分子量的譜帶泳道3 170kd)從一種5%凝膠(如圖2)切下泳道4 染色前)和還原的再電泳對泳道3中的45和48kd譜帶的N末端氨基酸序列進(jìn)行了測定;
圖4.表示制備H-gal-GP復(fù)合物的三種方法的流程圖。
圖5.表示H-gal-GP復(fù)合物在單Q基質(zhì)上進(jìn)行離子交換色譜后獲得的樣本的SDS-PAGE(10%凝膠，還原條件)。
a)預(yù)先由花生植物色凝素中分離的起始材料。
泳道1 裝上柱子的起始材料泳道2 未結(jié)合的部分泳道3-5 用140mM NaCl洗脫的部分泳道6和7 用400mM NaCl洗脫的部分。
b)預(yù)先由jacalin植物血凝素分離的起始材料。
泳道1 裝上柱子的起始材料泳道2 末結(jié)合的部分泳道3-5 用140mM NaCl洗脫的部分泳道6和7 用400mM NaCl洗脫的部分泳道8 用500mM NaCl洗脫的部分泳道9 用1M NaCl洗脫的部分;
圖6.表示了已結(jié)合到花生、Vicia、蓮、大豆、或Dolichos根物血凝素上的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲膜的Triton X-100提取成份的SDS-PAGE比較。
將等份的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲膜的Triton X-100提取物過柱，柱子中含有過量的下列瓊脂糖偶含的植物血凝素-1)花生，2)Vicia Villosa，3)蓮Lotus tetranoglobulus，4)大豆或5)Dolichos biflorus。用合適的糖(表2)洗脫結(jié)合的物質(zhì)，并裝載于非還原條件下的5%丙烯酰膠凝膠上，對泳道以相同順序編號。
圖7表示H-gal-GP亞成份與一組生物素化植物血凝素的結(jié)合。使H-gal-GP于還原條件下在10%凝膠上進(jìn)行電泳，并在固定(immobilon)膜上點樣。將點樣樣本切成標(biāo)號的條狀，然后分別與下列生物素化的植物血凝素一起孵育-1無(陰性對照)，2伴刀豆球蛋白A，3小扁豆，4小麥芽，5花生，6Jacalin，7大豆，8琥珀?；男←溠?，9 helix pomatia。第10條用考馬斯(Coomassie)藍(lán)進(jìn)行蛋白染色。
圖8表示了用偶氮酪蛋白作為底物的PH最佳值;(橫座標(biāo)表示PH，縱座標(biāo)表示405nm的吸光率●H-gal-GP，▲Oc-gal-GP，+Oo-gal-GP);
圖9表示以血紅蛋白為底物的PH最佳值;(橫座標(biāo)表示PH，縱座標(biāo)表示562nm的吸光率●H-gal-GP，▲Oc-gal-GP，+Oo-gal-GP);
圖10表示H-gal-GP復(fù)合物與花生植物血凝素的結(jié)合(10%凝膠，還原條件)泳道1 裝于花生植物血凝素柱上的血矛線蟲的S3提取物泳道2-5 用0.3M半乳糖從柱子上洗脫的蜂值部分;
圖11表示H-gal-GP復(fù)合物與Jacalin植物血凝素的結(jié)合(10%凝膠，還原條件)泳道1 裝于Jacalin植物血凝素柱上的物質(zhì)(從小麥芽植物血凝素中洗脫并結(jié)合的血矛線蟲S3的部分)泳道2 未結(jié)合部分＝富含H11OD泳道4-7 用0.8M半乳糖從柱子中洗脫的峰值部分注意起始物質(zhì)中的一條主要譜帶是H11OD。它不與Jacalin結(jié)合，并且恰好在這些條件下被鑒別為比能與Jacalin結(jié)合的H-gal-GP的130kd成份略小。
圖12表示了H-gal-GP與胃酶抑素瓊脂糖的選擇性結(jié)合(10%凝膠，非還原條件)泳道1 在低PH(5.5)下裝于胃酶抑素瓊脂糖上的血矛線蟲S3泳道2 富含H11OD的未結(jié)合物質(zhì)泳道3 在PH8.5洗脫的物質(zhì)泳道4 用1%SDS(PH7.4)洗脫的物質(zhì)泳道5 H-gal-GP(陽性對照);
圖13 表示H-gal-GP與胃酶抑素瓊脂糖的選擇性結(jié)合和47及50Kd譜帶(用抗H-gal-GP血清檢測并在非還原條件下從10%凝膠電泳得到的免疫印跡)的親合力。
泳道1 富含H11OD的未結(jié)合物質(zhì)泳道2 在PH8.5洗脫的物質(zhì)泳道3 用1%SDS(PH7.4)洗脫的物質(zhì)泳道4 1%SDS洗脫步驟之后仍然結(jié)合到胃酶抑素瓊脂糖上的物質(zhì)(-由未裝載柱子釋放，并用含有SDS和DTT的SDS PAGE樣本緩沖液煮沸瓊脂糖)
泳道5 H-gal-GP(陽性對照);
圖14 表示了用熒光標(biāo)記的花生植物血凝素染色的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的恒冷切片。
圖15 表示了用熒光標(biāo)記的小麥芽植物血凝素染色的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的恒冷切片。
圖16 表示了用抗H-gal-GP血清染色的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的恒冷切片;
圖17 表示了從用H-gal-GP免疫的羊中獲得的并用對羊免疫球蛋白有特異性的抗血清染色的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的恒冷切片;
圖18 表示了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲膜的PBS(S1)，吐溫(S2)和Triton X-100(S3)提取物中H-gal-GP的分布;
泳道1、2和3含有從同一批蠕蟲中得到的順次PBS、吐溫和Triton X-100的提取物。使樣本還原，在10%凝膠上電泳，點樣，過碘酸鹽處理使糖類基團變性，并用抗H-gal-GP的抗血清檢測;
圖19 表示了H-gal-GP和H11OD與小麥芽植物血凝素的結(jié)合(10%凝膠，還原條件)泳道1 裝于柱子上的血矛線蟲屬的S3提取物泳道2-8 用0.5M N-乙酰葡糖胺洗脫的峰值，富含H11OD和H-gal-GP的連續(xù)餾份;
圖20 表示了H-gal-GP與胃酶抑素瓊脂糖的結(jié)合(5%或10%丙烯酰胺凝膠，非還原條件)。
泳道1 裝于胃酶抑素瓊脂糖柱子上的H-gal-GP泳道2 用溶于10mM Tris-HCl、50mM NaCl(PH8.0)的1%SDS從柱子上解吸附的物質(zhì);
圖21 表示了H-gal-GP的水解活性的底物凝膠分析。對含有0.1%明膠作為底物的7.5%非還原丙烯酰胺凝膠的放大觀察。
泳道1 預(yù)先用胃酶抑素孵育的H-gal-GP泳道2 未處理的H-gal-GP圖22 表示了使實施例7中所述的羊保護(hù)實驗中所用免疫原分級分離的方案。
圖23 表示了實施例7實驗1的結(jié)果組平均糞便蟲卵數(shù)●小麥芽(1)，▲對照(2)(橫座標(biāo)表示感染后的天數(shù);縱座標(biāo)表示平均卵數(shù)/g(+/-SE));
圖24 表示了實施例7的實驗2結(jié)果組平均糞便卵數(shù)●除去了H11(3)的小麥芽，▲未結(jié)合的植物血凝素(4)，+對照(5)(橫座標(biāo)表示感染后的天數(shù);縱座標(biāo)表示平均卵數(shù)/g(+/-SE));
圖25表示了實施例7的實驗3的結(jié)果組平均糞便卵數(shù)●H11OD(6)，▲花生(7)，+對照(8)(橫座標(biāo)表示感染后的天數(shù);縱座標(biāo)表示平均卵數(shù)/g(+/-SE));
圖26 表示了實驗4的結(jié)果組平均糞便卵數(shù)●天然(9)，▲對照(12)，+SDS(10)，◇SDS+DTT(11)(橫座標(biāo)表示感染后的天數(shù);縱座標(biāo)表示平均卵數(shù)/g(+/-SE));
圖27 表示H-gal-GP與來源于O.circumcincta和O.ostertagi的等同蛋白間的相似性。將樣本在5%非還原丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，并點樣到固定(immobilon)膜上。用生物素化的花生植物血凝素檢測左側(cè)的印跡，用抗H-gal-GP血清檢測右側(cè)的印跡。用抗血清檢測的印跡預(yù)先用50mM過碘酸鹽孵育，以使可能交叉反應(yīng)的碳水化合物表位變性。在用正常血清孵育的對照印跡上沒有發(fā)現(xiàn)染色。
泳道1 H-gal-GP泳道2 O.circumcincta-gal-GP泳道3 O.ostertagi-gal-GP;
圖28表示了O.circumcincta-gal-GP與胃酶抑素瓊脂糖的結(jié)合;
將等量的O.circumcincta-gal-GP加入到含瓊脂糖珠的試管中，該瓊脂糖珠已偶合到胃酶抑素、花生植物血凝素或dolichos植物血凝素之一上，并且將試管在4℃下輕微震蕩3小時。沉淀小珠，保留未結(jié)合的上清液。洗滌三次之后，將珠子在最小量的SDS PAGE樣本緩沖液中煮沸，并沉淀。使從這一步驟得到的、含有已結(jié)合到瓊脂糖上的的上清液與未結(jié)合的上清液一起在非還原5% SDS PAGE凝膠上進(jìn)行電泳，并點樣在固定(immobilon)膜上，用生物素化的花生植物血凝素檢測。
該結(jié)果表明O.circumcincta-gal-GP特異性地結(jié)合到花生植物血凝素和胃酶抑素瓊脂糖上，因為它不與結(jié)合了另一種配體(dolichos植物血凝素)的瓊脂糖結(jié)合。
泳道1 未結(jié)合的Dolichos泳道2 結(jié)合的Dolichos泳道3 未結(jié)合的花生泳道4 結(jié)合的花生泳道5 未結(jié)合的胃酶抑素泳道6 結(jié)合的胃酶抑素圖29 表示用于進(jìn)一步免疫試驗的O.circumcincta的完整膜蛋白抗原制劑的SDS-PAGE圖(10%丙烯酰胺凝膠;還原條件)。
泳道1 從完整蠕蟲得到的O.circumcincta膜的Triton X-100提取物(S3)。
泳道2 在實施例8實驗1中用于免疫羊的S3的ConA結(jié)合部分泳道3 不與ConA結(jié)合的S3部分剩余的泳道含有分子量標(biāo)記物;
圖30 是以組平均糞便卵數(shù)表示的、在對照小羊和用O.circumcincta完整膜蛋白的伴刀豆球蛋白A(ConA)結(jié)合部分免疫的小羊中用5000 O.circumcincta幼蟲激發(fā)后的結(jié)果(橫座標(biāo)表示激發(fā)后的天數(shù);縱座標(biāo)表示組平均糞便卵數(shù)，平均數(shù)e.p.g(+/-SE));
圖31 表示實施例8實驗1中ConA結(jié)合部分的印跡(5%丙烯酰胺凝膠;非還原條件)，表明有Oc-gal-GP的存在。
泳道1 用花生植物血凝素檢測的O.circumcincta的ConA S3部分泳道2 分子量標(biāo)記物泳道3 用ConA植物血凝素檢測的O.circumcincta的ConA S3部分圖32 表示用熒光素共軛的花生植物血凝素對一般成熟O.circumcincta的恒冷切片的熒光染色;
圖33 表示克隆HG3的核苷酸序列;
圖34 表示派生的克隆HG3的氨基酸序列和人中性氨基肽酶的排列序列。兩種序列都是從cDNA推斷的。氨基酸一致程度是33%，相似水平是65%。使用威斯康星(Wisconsin)大學(xué)GCG庫的BESTFIT程序可產(chǎn)生該排列序列;
圖35 表示了證明克隆HG11與來源于各種后生動物寄生蟲的并用Eco RI消化的基因組DNA雜交的Southern印跡。雜交在中等嚴(yán)格條件下進(jìn)行。
泳道1 血矛線蟲屬泳道2 綠蠅屬泳道3 細(xì)頸線蟲屬泳道4 牛蜱屬實施例1H-gal-GP復(fù)合物的描術(shù)和生化特征1)SDS-PAGE概況。
通過花生植物血凝素親合層析，并在脫鹽步驟之后，用單Q基質(zhì)(Pharmacia)進(jìn)行陰離子交換色譜濃縮，從成熟血矛線蟲屬的Triton X-100提取物中分離用于此分析的H-gal-GP復(fù)合物(如下面的實施2和圖4中所詳細(xì)描述的)。保留在100和350mM NaCl之間的洗脫部分。一般典型的產(chǎn)量是Triton X-100提取物中總蛋白的約2%，等于每克蠕蟲大約200μg的蛋白質(zhì)。
當(dāng)把H-gal-GP復(fù)合物在7.5或10%凝膠上、在非還原條件下進(jìn)行電泳時，蛋白的組成是一組大約200kd或更大的多肽和大約47和50kd的淺染色譜帶對(圖1，泳道3)。盡管如此，如果使丙烯酰胺濃度降至5%，該高分子量物質(zhì)就會分解成兩個大約230和170kd的主要譜帶(圖2)。這些跨越一個不太清楚的205kd多肽和一個彌散染色區(qū)(圖2)。較小的多肽見圖1，3道在或接近染色前跑出的是未分解的帶。
在還原條件下，未分級分離的H-gal-GP復(fù)合物在10%丙烯酰胺凝膠上分解成約8條帶。大部分蛋白分解成45和50kd之間的3條帶，但是在大約33、35、37、90和130kd也可見不清楚的帶(圖1，6道)。
對表1總結(jié)的未還原的多肽組合物進(jìn)一步分析，方法是從5%非還原凝膠上(也即、在圖2的230kd、170kd和染色前)切下3條主要帶，在電洗脫和濃縮之后，將它們在還原條件下于10%丙烯酰胺上再電泳(圖3)。該170kd帶清楚地還原成2條大約45和48kd的重染色成份(圖3，3道)。最大的譜帶(230kd)更復(fù)雜，分離成分子量大約為130，90，48，40，和33kd的大約5個亞單位成份(圖3，2道)?！叭旧啊弊V帶分解成大約50，47和35kd的3個成份(圖3，4道)。其中前兩個也在上面當(dāng)非還原條件下于7.5或10%凝膠上電泳完整H-gal-GP復(fù)合物時的圖1，3道中有描述。
上述譜帶的蛋白全部代表本發(fā)明H-gal-GP成份。
表1對以kd表示表現(xiàn)分子量的H-gal-GP還原和非還原多肽的總結(jié)在非還原條件下電 在電洗脫和還原電泳之泳后觀察到的成份 后的分解成份10%凝膠 5%凝膠 10%凝膠(230# =130,90,48,40,33((205)#)200-250= (190-200):#) 無數(shù)據(jù)((170# = 48*,45*,50*))47*) 染色前# = 50*,47*,35)35)＊這些多肽的N-末端氨基酸序列是確定的。
＃這些譜帶被測試為實施例7羊?qū)嶒?中的免疫原。注意205和190-200多肽是結(jié)合為一個部分進(jìn)行測試的。
因此H-gal-GP含有一種最小量的10個清楚成份和在非還原條件下觀察到的205和190-200kd物質(zhì)。
2)4條譜帶的N-末端氨基酸序列制備含有與圖3的3道和圖1的3道相同成份的凝膠并在膜上(ProBlott-Applied Biosystems)電泳。用考馬斯(Coomassie)藍(lán)染色之后，從膜上切下含有圖1和3識別的多肽對的條并在Applied Biosystems Model 477 A 肽測序儀上測定每條的N-末端氨基酸組成，得到下列序列-圖3，3道 45kdVal-Asp-Asn-Val-Phe-？-Pro-Asn-Val-Gly-Leu.(序列識別號3和4)48kdVal-Glu-Arg-Thr-Asp-Ala-Arg-Met-Asn-(也即-Glu-或-Asn-)(序列識別號5和6)圖1，3道 47kdVal-Phe-Pro-His-Pro-Ile-Tyr-Asp-Tyr-Gln(序列識別號7)50kdAla-？-Gln-Thr-Val-Phe-Pro-His-Lys(序列識別號8)計算機檢索沒有發(fā)現(xiàn)與各種數(shù)據(jù)庫儲存的序列有任何顯著同源性3)離子交換層析當(dāng)在含有0.1%(V/V)Triton X-100的10mM Tris-HCl(PH7.4)中時，H-gal-GP復(fù)合物結(jié)合到已經(jīng)用相同緩沖液平衡的Mono Q離子交換基質(zhì)上。140和400mM NaCl之間的大部分H-gal-GP復(fù)合物被從柱子中洗脫出(圖5a和b)。即使將其用于小擴大步驟，也沒有發(fā)現(xiàn)此范圍鹽內(nèi)亞成份譜帶的分離。
4)植物血凝素結(jié)合a)在天然條件下使用各種與固相如瓊脂糖珠交聯(lián)的植物血凝素通過親合層析從血矛線蟲屬膜的Triton X-100提取物中可分離H-gal-GP復(fù)合物(圖10和11及實施例2)。
天然H-gal-GP復(fù)合物對特定植物血凝素的估計相對親合力概述于表2。除Dolichos biflorus之外，對N-乙酰半乳糖胺有特異性的植物血凝素選擇性地保留H-gal-GP。對Dolichos的陰性結(jié)果說明這種親合力是對β而不α連接的N-乙酰半乳糖胺有特異性。
ConA、豌豆和蓮植物血凝素也能保留H-gal-GP復(fù)合物這一發(fā)現(xiàn)說明它包括了帶有甘露糖和/或巖藻糖的糖蛋白，而曼陀羅屬和Bandeiraea的陰性結(jié)果表明它缺少含N-乙酰葡糖胺的結(jié)構(gòu)(表2)。盡管如此，能夠保留H-gal-GP的所有植物血凝素可以結(jié)它的全部成份，而不表現(xiàn)出對其亞成份的任何傾向性親合力，如圖6所示。
b)在分解和還原條件下為了確定H-gal-GP的哪一個亞成份是糖基化的，通過SDS PAGE使該復(fù)合物還原和分解，點樣，用一組生物素化的植物血凝素檢測。結(jié)果(圖7)表明某些植物血凝素(如扁豆)結(jié)合大部分的譜帶而其他的(如花生，helix Pomatia和琥珀酰小麥芽)更有選擇性。除大豆外都很強地表現(xiàn)出130kd譜帶和一種稍小的成份，給人的感覺是此區(qū)域內(nèi)有兩條帶;某些，特別是扁豆、ConA和小麥芽在90kd譜帶區(qū)中有一彌散染色區(qū);其他的，特別是小麥芽、花生、jacalin、琥珀酰小麥芽和helix Pomatia，可散在地與考馬斯藍(lán)淺染色的大約60kd糖蛋白反應(yīng);ConA，jacalin，小麥芽和扁豆也很強地結(jié)合50kd譜帶，而47kd譜帶只能由扁豆表現(xiàn)出。
5)蛋白酶活性當(dāng)用偶氮酪蛋白或血紅蛋白作底物時H-gal-GP復(fù)合物表現(xiàn)出PH最佳值為4.0或6.0的蛋白酶活性(圖7和8)。這一活性可被能強有力結(jié)合H-gal-GP的胃酶抑素所抑制。可利用后一特性通過親合層析富集H-gal-GP復(fù)合物。
6)等電點在一種Miniphor制備性自由流動設(shè)備中用線性控制的PH梯度(2到9PH單位范圍)使H-gal-GP復(fù)合物等電子聚焦。大部分復(fù)合物在PH2和7.3之間洗脫出。這一寬范圍是典型的糖蛋白，其中可變性糖類殘基將一個異種電荷引入該分子。
從捻轉(zhuǎn)血矛線蟲制備H-gal-GP復(fù)合物的兩種方法這些方法概述于圖4的流程圖中，并在實施例2和3中有更詳細(xì)的敘述。
基本上按Munn和Smith(WO90/11086)所述制備血矛線蟲屬膜(S3)的一種洗滌劑提取物。
實施例2在乙酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖的鹽水中，于含有1mM EDTA和1mM PMSF作為蛋白酶抑制劑的酸性或中性條件下，使成熟的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲在4℃均質(zhì)化。在標(biāo)準(zhǔn)條件使勻漿以10，000g離心20分鐘，用0.1%吐溫20提取如此形成的沉淀物，并再次離心。重復(fù)此過程，然后用2% Triton X-100提取如此形成的沉淀小丸，并在標(biāo)準(zhǔn)條件下離心。使上清液以100，000g超速離心1小時，并將上清液(S3)通過一個0.22微米的過濾器，并用含有0.5M NaCl、0.01%NaN3、PH7.4的稱之為10mM Tris-HCl的緩沖液稀釋4倍。
用結(jié)合到瓊脂糖珠上的各種植物血凝素使如此形成的稀釋上清液S3進(jìn)行植物血凝素親合層析。在把稀釋的上清液裝柱之后，用幾倍柱體積的緩沖液洗滌，然后用合適的糖洗脫植物血凝素結(jié)合的物質(zhì)。
如圖6所示例的在SDS-PAGE凝膠上觀察測定結(jié)合到11種不同植物血凝素的每一種上的H-gal-GP的相對量。表2中的結(jié)果表明盡管幾種植物血凝素可結(jié)合H-gal-GP，但只有對β連接的N-乙酰半乳糖胺有特異性的那些才可以特異性的結(jié)合H-gal-GP，并且這些當(dāng)中花生和Jacalin可最有效地特異性結(jié)合。沒有證明用任何植物血凝素可分離H-gal-GP的亞成份。
用花生或Jacalin植物血凝素，使蛋白H11OD和H45以及其他物質(zhì)一起洗滌掉，而使H-gal-GP復(fù)合物仍被結(jié)合。它基本上以純的形式由0.3或0.8M半乳糖從花生和Jacalin柱子中分別洗脫出(圖10和11)。
使用小麥芽植物血凝素在用0.5M N-乙酰葡糖胺洗脫后可得到類似結(jié)果，例外的只是結(jié)合了一些H11OD并且H-gal-GP復(fù)合物一起被洗脫出(這是圖11中裝于Jacalin柱子時1道所示的物質(zhì))。
實施例3證明胃酶抑素是H-gal-GP的一種特異性和有親合力的配體使存在于低PH、高離子強度緩沖液(即20mM乙酸鈉，1M NaCl，PH5.5)中的上清液S3通過一個含有結(jié)合到瓊脂糖珠上的胃酶抑素的柱子。大部分多肽，包括H11OD，不與這種基質(zhì)結(jié)合(圖12的1和2道)。用幾倍柱體積的這種酸緩沖液洗滌之后，通過增加PH至8.5洗脫出小量的H-gal-GP和其他松散結(jié)合的物質(zhì)。如果用含有低濃度、高電荷量洗滌劑(如1%十二烷基硫酸鈉-SDS)的緩沖溶液洗脫柱子，所洗脫出的多肽的組成與H-gal-GP非常相似，只是通常在10%非還原凝膠上觀察到的大約45kd的譜帶對消失了(圖12，4道)。如將柱子裝載物取出，把等量份的瓊脂糖在二硫蘇糖醇(DTT)存在下與5%SDS一起孵育，洗脫出一富含此遺失譜帶的餾份，表明這些譜帶的留滯是非常親合的(圖13，4道)。在洗脫出的物質(zhì)中沒有檢測出蛋白酶活性，表明該酶在SDS存在下無功能。
進(jìn)行對照實驗，從柱子中取出瓊脂糖，在上述的酸洗滌階段之后，通過反復(fù)離心洗滌，并再懸浮于單獨的緩沖液中或是含有多達(dá)2%脫氧膽酸鹽或多達(dá)0.1%SDS的緩沖液中。所有這些處理都沒有從瓊脂糖中去除大量的H-gal-GP，表明此現(xiàn)象不只是由于在柱子頂部物理吸附了不溶性蛋白。H-gal-GP不與某些植物血凝素瓊脂糖柱子結(jié)合這一發(fā)現(xiàn)(表2，圖5，2道)還證明與胃酶抑素瓊脂糖的結(jié)合是有配體特異性的。
實施例4證明H-gal-GP位于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲腸細(xì)胞刷狀緣表面，并且它在此處是一種完整的膜糖蛋白。
(a)腸刷狀緣定位ⅰ)用一組熒光標(biāo)記的植物血凝素對成熟捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的恒冷切片進(jìn)行染色。發(fā)現(xiàn)花生和小麥芽植物血凝素都可選擇性地使腸刷狀緣染色(圖14和15)。某些植物血凝素(如ConA)可染色大部分結(jié)構(gòu)而另一些(如，Ulex)染色很少或不染色。這一結(jié)果說明腸細(xì)胞刷狀緣比血矛線蟲屬的其他解剖結(jié)構(gòu)含有更高密度的小麥芽和花生植物血凝素結(jié)合位點。由于H-gal-GP結(jié)合花生和小麥芽植物血凝素，可能這種糖蛋白存在于腸細(xì)胞的刷狀緣。
ⅱ)將成熟捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的恒冷切片與用H-gal-GP和弗氏完全佐劑一起免疫的羊的血清或與只用佐劑注射的對照羊的血清一起孵育(見實施例7，實驗3和4有詳細(xì)描述)。完全洗滌之后，將切片與用熒光素異硫氰酸鹽結(jié)合的抗羊免疫球蛋白的馬抗體一起孵育。進(jìn)一步洗滌之后，通過熒光顯微鏡觀察切片。
該切片與抗H-gal-GP血清的孵育顯現(xiàn)出表皮下層及腸刷狀緣膜的特異性熒光(圖16)。用對照羊血清染色的切片沒有發(fā)現(xiàn)特異性染色。這些結(jié)果說明H-gal-GP位于血矛線蟲屬的刷狀緣膜上和皮下組織中。
ⅲ)從用H-gal-GP和弗氏完全佐劑一起免疫的羊或只用佐劑注射的羊身上獲得的成熟血矛線蟲屬制備恒冷切片(見實施例7，實驗3和4)。
將這些切片與熒光素異硫氰酸鹽結(jié)合的抗羊免疫球蛋白的特異性抗體一起孵育。完全洗滌之后，如上所述在熒光顯微鏡下觀察。
經(jīng)過H-gal-GP免疫的某些(盡管不是全部)蠕蟲切片顯現(xiàn)出特異性熒光。這熒光位于腸細(xì)胞的刷狀緣(圖17)。對照羊的血矛線蟲切片沒有發(fā)現(xiàn)染色。
這一結(jié)果表明某些經(jīng)H-gal-GP免疫的蠕蟲在其腸細(xì)胞刷狀緣膜上有羊免疫球蛋白包裹。因此這種膜上必定存在有H-gal-GP。沒有觀察到在前面一節(jié)所述“體外”試驗中觀察到的表皮下染色?？赡苁且驗椤绑w內(nèi)”宿主免疫球蛋白不能與寄生蟲的這部份解剖部位接觸。
b)完整膜糖蛋白當(dāng)用實驗3中激發(fā)的抗-H-gal-GP血清對用過碘酸鹽處理的含完整蠕蟲的PBS、吐溫和Triton X-100提取物的點樣(也即，分別是圖1.4中所述的S1，S2和S3)進(jìn)行檢測時，只在Triton X-100提取物中檢測出H-gal-GP(圖18)。這一結(jié)果通過一相對敏感的方法推斷H-gal-GP既不是以可溶性胞質(zhì)蛋白存在，也不是以外周膜蛋白存在，而且它需要Triton X-100的作用將其從細(xì)胞膜上游離下來。
該結(jié)果與植物血凝素結(jié)合性質(zhì)總結(jié)于表2中，該結(jié)果足以證明H-gal-GP是完整的膜糖蛋白。
實施例5證明H-gal-GP復(fù)合物不同于蛋白對H11OD(WO90 11086)、蛋白復(fù)合物 H45(WO 90/11086)、45kd膜蛋白(WO 92/13889)或纖維蛋白溶解蛋白酶(EP-A-434909)a)H-gal-GP復(fù)合物、H11OD和蛋白復(fù)合物H45之間的區(qū)別ⅰ)植物血凝素結(jié)合H-gal-GP復(fù)合物、H11OD和H45復(fù)合物對某些植物血凝素的估計相對親合力概述于表2中。除Dolichos biflorus不結(jié)合他們當(dāng)中的任何一個外，對N-乙酰半乳糖胺有特異性的植物血凝素保留H-gal-GP復(fù)合物但不保留H11OD或H45復(fù)合物。
ⅱ)等電點H-gal-GP復(fù)合物比H11OD或H45復(fù)合物具有更低的等電點，可以通過離子交換層析與它們分離開。例如，很少H45復(fù)合物結(jié)合到已用10mM Tris-HCl(PH7.4)平衡的含有0.1%(V/V)Triton X-100的Mono Q上，這與Smith，Munn，Graham，Tavernor和Greenwood(International Journal for Parasitology 1993 23 271-280)的結(jié)果相一致。保留下的小部分可以用50mM NaCl在H11OD之前洗脫出。全部的H11OD由200mM NaCl解吸附，這在大部分的H-gal-GP復(fù)合物開始洗脫之前解吸附。
ⅲ)SDS-PAGE概況當(dāng)在還原或非還原條件下電泳時在110kd處保持不變的H110D對(圖1，1道和4道)，在兩個位置(圖1，1道與3道和4道與6道)與H-gal-GP復(fù)合物明顯不同。盡管如此，因為還原條件可以明顯地改變H45復(fù)合物的電泳形狀(圖1，2道與5道)，所以當(dāng)將樣本在未還原條件下(圖1，2道與3道)而不是在還原條件下(圖1，5道與6道)比較時，它與H-gal-GP復(fù)合物之間的區(qū)別更明顯。
ⅳ)胃酶抑素結(jié)合H11OD或H45都不與胃酶抑素瓊脂糖(一種H-gal-GP復(fù)合物容易結(jié)合的基質(zhì))結(jié)合。
b) H-gal-GP復(fù)合物與WO 92/13889中的45kd膜蛋白之間的區(qū)別ⅰ)植物血凝素結(jié)合在自然條件下H-gal-GP復(fù)合物與小麥芽植物血凝素結(jié)合(表2，圖19)。在WO 92/13889中所提供的預(yù)防性抗原不與此植物血凝素結(jié)合，發(fā)明人專門利用此特性純化45kd膜蛋白。
ⅱ)N-末端氨基酸序列WO 92/13889中公布的45kd膜蛋白的N-末端氨基酸序列與實施例1、部分2中所述的H-gal-GP復(fù)合物的45、47、48或50kd成份中的任何一個不具有類似的等同數(shù)據(jù)。
ⅲ)甚至當(dāng)用SDS分離和用二硫蘇糖醇還原之后變性時，變性抗原H-gal-GP復(fù)合物的預(yù)防能力可對羊有保護(hù)作用(見實施例7，實驗4和5)。WO 92/13889中所述的45kd膜蛋白在荷蘭豬中測試其變性形式時失去了它的預(yù)防性抗原能力。
c)H-gal-GP復(fù)合物與纖維溶解蛋白酶之間的區(qū)別ⅰ)底物特異性Cox、Pratt、Hageman和Boisvenue(Molecular and Biochemical Parasitology 1990 41，25-34)描述了一種來源于血矛線蟲的纖維溶解蛋白酶，盡管只是從2個小羊試驗得到不可信的數(shù)據(jù)，它們要求該酶具有預(yù)防性抗原能力(Cox，G.N.，Milhausen M.and Hageman R.1990 European Patent Application No.434909)。H-gal-GP復(fù)合物沒表現(xiàn)出任何抗纖維蛋白原的蛋白水解活性(見表4和實施例6V)。
ⅱ)溶解度從血矛線蟲的鹽水提取物中獲得由Cox等人1990年所述的纖維溶解蛋白酶。相對而言在鹽水提取物中未檢測出H-gal-GP復(fù)合物，該復(fù)合物只能用洗滌劑如Triton X-100從寄生蟲中提取(圖4.5)。
實施例6證明H-gal-GP具有天冬氨酰蛋白酶活性ⅰ)PH最佳值在初步試驗中發(fā)現(xiàn)由花生植物血凝素純化的H-gal-GP可水解偶氮酪蛋白尤其是偶氮膠原蛋白。用重迭0.1M乙酸鹽、磷酸鹽或Tris緩沖液確定此活性的最佳PH在4-9的PH范圍(圖8)。發(fā)現(xiàn)最佳活性在PH4.5和6.5之間。
ⅱ)抑制劑敏感性用花生植物血凝素純化的H-gal-GP的4個分離制劑測試蛋白酶活性的抑制劑敏感性。在測試的所有制劑中酶活性幾乎完全被胃酶抑素所抑制，這表明蛋白水解是由于一種天冬氨酰蛋白酶(表3)。
表3 與H-gal-GP和來源于O.circumcincta和O.ostertagi的等同酶相關(guān)的蛋白酶活性的抑制劑敏感性。
所表示的蛋 在抑制劑存在下抑制劑 白酶的類別 的百分活性保留H-gal-GP Oc-gal-GP Oo-gal-GPPMSF 絲氨酸(硫羥基) 100 104 84E64 硫羥基 87.8 101 1011,10鄰二氮雜菲 金屬 97 94 99EDTA 金屬 97.8 ND ND胃酶抑素 羧基(天冬氨?；? 8.5 23 0
(結(jié)果是用H-gal-GP 的4次分離觀察和用每個Ostertagia種類的2次觀察所得平均值，ND＝未測定)。
ⅲ)在胃酶抑素瓊脂糖上的親合層析使H-gal-GP(如實施例1部分1所述純化的)通過一個用含有1M NaCl和0.1% V/V還原Triton X-100的 25mM乙酸鈉緩沖液(PH4.5)平衡過的胃酶抑素瓊脂糖柱子(Do.et al 1987，J.Biol.Chem.262 1037-1043)。在4.5-10PH范圍廣泛洗滌，解吸附很少的蛋白質(zhì)。然而，用1%SDS洗脫可解吸附大部分的H-gal-GP(圖20)。H-gal-GP不與結(jié)合有一個“陰性對照”配體(如Dolichos植物血凝素)的瓊脂糖結(jié)合。這些結(jié)果，連同前面實施例3中所述的那些結(jié)果一起，說明H-gal-GP對胃酶抑素有很強的特異性，經(jīng)證明是天冬氨酰蛋白酶的一個特征，至少是膜金屬內(nèi)肽酶的特征(Zoller，H1990，Handbook of enzyme inhibitors，Published by VCH，Weinheim，Germany)。在結(jié)合胃酶抑素瓊脂糖之前或之后，H-gal-GP在5或10%非還原凝膠上的電泳表現(xiàn)是相同的(圖20)。這一結(jié)果說明H-gal-GP是一種多聚酶復(fù)合物，一種胃酶抑素結(jié)合性蛋白酶的混合物，或者是這些酶及其前體的混合物。
ⅳ)底物凝膠分析預(yù)先在存在或不存在胃酶抑素的情況下孵育H-gal-GP，并在非還原條件下在含0.1% W/V明膠的7.5% SDS-PAGE凝膠上分離。電泳之后，通過在過量的Triton X-100中洗滌洗脫SDS，并且在磷酸鹽緩沖液(PH6.0)中于37℃下使該凝膠保溫過夜。通過考馬斯蘭反染色(Counterstaining)觀察蛋白水解區(qū)。
結(jié)果是不穩(wěn)定的，但是有一次蛋白水解與H-gal-GP復(fù)合物的主要高分子量譜帶和大約45kd的較小成份均相關(guān)。所有活性區(qū)對胃酶抑素都是敏感的。另一次該活性似乎只于該復(fù)合物的170kd譜帶，并且明顯被胃酶抑素抑制(圖21)。以往曾對天冬氨酰蛋白酶的這種可變觀察結(jié)果有所敘述，并認(rèn)為是由于對明膠的底物親合力較弱的原因(Simkin，K.G.，Chapman，C.R.and Coles，G.C.1980.Experimental Parasitology 49.281-387)。因此可能 H-gal-GP具有與在非還原條件下觀察到的該復(fù)合物的全部譜帶相關(guān)的天冬氨酰蛋白酶活性。
ⅴ)H-gal-GP對天然血蛋白的親合力使H-gal-GP與纖維蛋白原、白蛋白和血紅蛋白以及偶氮酪蛋白一起孵育(全部都是1mg/ml，在緩沖液中，PH5.5)，然后加入等體積的1M高氯酸沉淀未消化的蛋白。通過使用水合茚三酮測試方法(Mathews，B.E.1977，Symposium of British Society of Parasitology 15103-119)檢測釋放的游離α-氨基氮監(jiān)測蛋白水解。
結(jié)果表明H-gal-GP對血紅蛋白具有明顯的特異性(表4)，并且此活性的最佳PH是4.0(圖9)。
表4 H-gal-GP對天然血蛋白和偶氮酪蛋白的親合力底物 蛋白水解(在563nm的吸光率)纖維蛋白原 0.00血紅蛋白 5.12白蛋白 0.77偶氮酪蛋白 0.55
ⅵ)免疫羊的血清對H-gal-GP蛋白水解活性的抑制。
將如實施例7實驗3中所述的用H-gal-GP或佐劑免疫的小羊血清與等份的H-gal-GP一起孵育。接著用偶氮酪蛋白作為底物測定混合物中的蛋白水解活性。結(jié)果(表5)表明用H-gal-GP免疫激發(fā)抗H-gal-GP蛋白水解活性的特異性抑制應(yīng)答，可能是由于抗體的作用。
表5 H-gal-GP的免疫血清抑制血清 蛋白水解的%抑制測試1 測試2對照小羊 0 2免疫小羊A 58 55免疫小羊B 51 59實施例7證明用H-gal-GP免疫的羊可抵抗捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的激發(fā)用捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的不同部分進(jìn)行一系列保護(hù)試驗。圖22是概括用于制備5個實驗中每組羊所用免疫原的方案的流程圖。
保護(hù)實驗的設(shè)計按照下面列出的時間順序?qū)?9組羊進(jìn)行5個免疫激發(fā)實驗。在每個實驗中實驗組要使性別和體重平衡。
每組的計劃動物數(shù)是6或7只，但是在激發(fā)前第9組和10組中各有一只羊因尿路結(jié)石死亡。用于免疫每組的抗原見表6和圖22。每只羊用等劑量的蛋白免疫3次，而對于所有的對照組，只用佐劑加鹽水，然后所有動物用5，000捻轉(zhuǎn)血矛線蟲幼蟲激發(fā)。弗氏完全佐劑用于全過程，每一個接種是在每只后腿上以1或2ml的劑量肌內(nèi)給藥。如表7所詳細(xì)描述的，每個實驗之間小羊的年齡和處理的時間略有不同。
實驗1目的是測定完整蠕蟲膜的Triton X-100提取物的小麥芽植物血凝素結(jié)合部分的預(yù)防能力。
在激發(fā)對照羊中發(fā)現(xiàn)此免疫原可非常有效地抑制糞便蟲卵數(shù)(圖23)。同樣，在宰殺時免疫組比對照組含有明顯少的蠕蟲，對照組含有顯著高于正常的雄性與雌性比(表6)。
此結(jié)果與WO 92/13889的實驗中所述的結(jié)果相反，在該實驗中小麥芽植物血凝素結(jié)合部分對荷蘭豬具有很差的保護(hù)作用。這種區(qū)別可能反映了所用激發(fā)系統(tǒng)類型間的區(qū)別或者反映了這樣一個事實，即H11OD[大量H11OD也不能結(jié)合小麥芽(圖19)]實際上是WO 92/13889實驗中的主要預(yù)防性成份。
雌性血矛線蟲比雄性對免疫作用更敏感這一發(fā)現(xiàn)以往在其他內(nèi)臟膜抗原實驗中曾有所報道(如，Smith，1993 Res Vet Sci 54 94-101)，并認(rèn)為是由于這樣一個事實，即由于雌性蠕蟲較大，它比雄性攝取血液的速度的要快，從而接受了更高劑量比的毒性抗體?；蛘?，這一發(fā)現(xiàn)的原因可能是由于這樣一個事實，即雌性動物因排卵造成的合成代謝需求使得它們更易于阻滯營養(yǎng)收集酶。通過檢查所回收蠕蟲的性別比可為檢測由這種方法成功免疫引起的作用提供其他的參數(shù)。
實驗2由于已知組1中所用的小麥芽植物血凝素結(jié)合部分含有一些H11OD，它是一種已經(jīng)表現(xiàn)出對血矛線蟲具有高度預(yù)防作用的蛋白(Munn and Smith 1990)，因此本實驗的主要目的是測試經(jīng)離子交換層析已去除掉H11OD的小麥芽結(jié)合部分。為了檢查非糖基化預(yù)防性膜蛋白存在的可能，再用不與小麥芽或Con A植物血凝素結(jié)合的部分免疫第二組(圖22)。
兩個免疫組比對照組一樣具有更低的平均蟲卵數(shù)(圖24)，但是只有在小麥芽組，在大多數(shù)取樣天數(shù)中有顯著區(qū)別。沒有一組免疫動物比對照組含有顯著少的蠕蟲，但在小麥芽組中所攝帶蠕蟲的雄性數(shù)比雌性數(shù)明顯多(表6)。
在此實驗中對照羊的組平均蟲卵和蠕蟲數(shù)與其他4個實驗中(圖24和23、25、及26，和表6)的對照值相比有實質(zhì)性降低，有兩只動物具有非常低的數(shù)值。這種很大的可變性(這可能反映了使用年長羊的原因)使得難于確定組3中表現(xiàn)出的保護(hù)作用(如果有的話)的顯著性，組3需要重復(fù)實驗。
實驗3因此本實驗?zāi)康氖菫榱嗽贉y試年輕的、更易于感染的小羊中不含H11OD的小麥芽結(jié)合部分的功效。同時還發(fā)現(xiàn)由于此配體不與任何可檢測的H11OD結(jié)合，因此用花生植物血凝素通過親合層析可以更簡單地制備該相同部分(圖22)。因此，在此實驗中對花生結(jié)合部分(也即H-gal-GP)和H11OD的預(yù)防能力進(jìn)行了比較。
兩組免疫小羊的糞便蟲卵數(shù)與對照組比較大大地降低(圖25)，并且從它們中回收的蠕蟲數(shù)顯著減少，雄性蠕蟲與雌性比異常地高(表6)。
可以得出結(jié)論即H-gal-GP是對血矛線蟲的一種預(yù)防性抗原。
實驗4本實驗的目的是證實用天然H-gal-GP獲得的預(yù)防性結(jié)果，并確定該復(fù)合物在分離或在還原和分離狀態(tài)下是否保留預(yù)防活性。
因此，通過與0.5% SDS(2.5∶1W/W SDS∶蛋白)在25℃下保溫1小時來分離等份的H-gal-GP。通過用相同量的SDS與2.5mM二硫蘇糖醇(DTT)結(jié)合作為還原劑一起在100℃保溫5分鐘進(jìn)行分離使第二批相同等份量的H-gal-GP變性。組10和11用以這些相關(guān)方式處理的H-gal-GP免疫，而組9接受相同但未處理的等份天然H-gal-GP(表6)。
在全部三個免疫組(圖26;表6)和對照組中發(fā)現(xiàn)糞便蟲卵排泄量和蠕蟲數(shù)顯著減少，但是此效果在天然和只有SDS的組中最顯著。如前述一樣，雌性蠕蟲比雄性對免疫作用更敏感?？梢缘贸鼋Y(jié)論，當(dāng)用SDS分離該復(fù)合物或用SDS分離并用DTT還原使之變性時，H-gal-GP的預(yù)防性表位在很大程度上都沒有受到影響。這一結(jié)果與WO 92/13889中用45kd膜糖蛋白獲得的結(jié)果相反，說明H-gal-GP的亞單位多肽可以在其分離和在SDS丙烯酰胺凝膠上提取之后單獨地測試。
實驗5因此本實驗?zāi)康氖菧y試已經(jīng)通過非還原SDS-PAGE分離的H-gal-GP不同多肽亞成份的預(yù)防性抗原能力。
采用按上述實驗4所述的用SDS分離的500和200μg的H-gal-GP復(fù)合物分別免疫組13和14。組15至18用在非還原條件下由SDS-PAGE分離復(fù)合物之后、從5%凝膠上切下的H-gal-GP單一成份免疫(圖22)。如圖2中所示。用230kd譜帶成份注射組15，用彌散190-205kd區(qū)成份注射組16，用170kd譜帶成份注射組17，和用染色前譜帶注射組18(圖2)。將含有合適譜帶的凝膠塊再懸浮于一合適體積的稀釋劑中并與等體積的佐劑均化。計算分級分離的H-gal-GP的量以便使組15至18接受的與其相應(yīng)的多肽劑量等于它們存在于500μg H-gal-GP中的量(也即等于組13)。只用佐劑免疫激發(fā)對照組(組19)。
除一只動物(4號羊)之外，用SDS分離的H-gal-GP免疫的兩個陽性對照組都可以抵抗激發(fā)感染。這表現(xiàn)在與對照組比較蟲卵數(shù)和蠕蟲數(shù)減少以及雄性蠕蟲比例增加，如果4號羊不計算在內(nèi)的話，對組13的保護(hù)數(shù)據(jù)是-蠕蟲79%和蟲卵87%(18-35天的平均數(shù))。對于組14，相同結(jié)果是蠕蟲70%和蟲卵84%?？梢缘贸鼋Y(jié)論，即組14所用劑量減少沒有引起任何差異，并且組13的結(jié)果與上面實驗4獲得的結(jié)果相似。
在用H-gal-GP的不同亞單位譜帶免疫的組中發(fā)現(xiàn)有更大的個體差異性。盡管如此，結(jié)果表明用從凝膠上切下的個體亞單位譜帶可以獲得保護(hù)。在這些組中，組16(190-205kd彌散帶)和18(染色前)得到最佳保護(hù)。
在最佳亞單位組中的保護(hù)作用似乎比用完整復(fù)合物免疫的組中的保護(hù)具有更小的一致性。這可能是因為電泳分離過程在某種程度上損傷了預(yù)防性表位或者因為必須是一個以上的亞單位結(jié)合使用才能獲得一致性效果。
從這5個實驗可以得出結(jié)論，H-gal-GP不論是在其天然狀態(tài)下還是分離狀態(tài)或甚至是在還原和分離狀態(tài)下，都是一種新的對血矛線蟲的一致性有效預(yù)防性抗原復(fù)合物。
表6羊保護(hù)實驗1-4回收的血矛線的組平均蠕蟲數(shù)和性別比率實驗編號組 只數(shù)抗原劑量*平均數(shù)±SE %·雄性1 1 7 小麥芽結(jié)合 200 1086±326a62.3±1.9a2 7 無(對照) - 3068±416b48.6±1.5b3 6 無 H110D的小麥芽 140 1809±115a63.1±2.8a2 4 7 未結(jié)合的植血凝素 140 1387±350a49.6±4.1b5 7 無(對照) - 1644±344a51.5±1.3b6 7 H110D 100 518±133a66.8±5.4a3 7 7 花生植物血凝素(H-gal-GP) 200 1765±167b64.2±3.1a8 7 無(對照) - 3744±187c50.1±0.4b9 5 天然H-gal-GP 200 1052±424a75.5±6.2a10 5 H-gal-GP+SDS 500 902±295a65.7±3.2a4 11 6 H-gal-GP+SDS+DTT 500 1466±476a70.6±5.4a12 6 無(對照) - 3705±627b56.1±5.4b＊每只羊每次免疫所注射的μg蛋白。
每個實驗的每欄中有不同標(biāo)記的數(shù)值有顯著性差異。
表7羊?qū)嶒炘敿?xì)設(shè)計中的區(qū)別實驗編號小羊的月齡a加強劑時間b激發(fā)間隔c處死日期d1 2 4和7 1 232 8 3和6 2 283 2 3和6 2 344 5 3和6 2 355 3 3和6 2 34或35a第一次注射時以月表示的月齡;b第一次“疫苗接種”后的周數(shù);
c在第三次“疫苗接種”和激發(fā)之間的周數(shù);d當(dāng)處死羊時的激發(fā)后天數(shù)。
實施例8胃線蟲屬種類中的相同酶通過圖4所示方法提取Ostertagia Circumcincta或Ostertagia ostertagi，然后用花生植物血凝素進(jìn)行親合層析，產(chǎn)生的蛋白復(fù)合物通過其SDS-PAGE方案(圖27)判斷它與H-gal-GP有廣泛相似性。象H-gal-GP一樣，兩種提取物都對偶氮酪蛋白和羊血紅蛋白表現(xiàn)出蛋白酶活性，其pH最佳值在4和6.0之間(圖8和9)，并且該活性可被胃酶抑素特異性抑制(表3)。
將等量的Oc-gal-GP加入到試管中，該試管中含有已結(jié)合到胃酶抑素或花生植物血凝素或dolichos植物血凝素上的瓊脂糖珠，使試管在4℃下輕輕振蕩3小時。沉淀小珠，并保留未結(jié)合的上清液。經(jīng)3次洗滌后將小珠在最小體積的SDS-PAGE樣本緩沖液中煮沸，并使之沉淀。將從這一步驟得到的含有已結(jié)合到瓊脂糖上的物質(zhì)的上清液與未結(jié)合的上清液一起在非還原的5% SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳，并印跡到固定(immobilon)膜上，用生物素化的花生植物血凝素檢測。
圖28中所述結(jié)果表明Oc-gal-GP可特異性地結(jié)合到花生植物血凝素和胃酶抑素瓊脂糖上，因為它不與已結(jié)合了陰性對照配體(dolichos植物血凝素)的瓊脂糖結(jié)合。
用按實施例7實驗1和2中所述的H-gal-GP免疫的羊血清與每種胃線蟲復(fù)合物的蛋白表位交叉反應(yīng)(圖27)。
綜合這些結(jié)果說明，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲、O.circumcincta胃線蟲和O.ostertagi胃線蟲具有一個共同的含胃酶抑素可抑制性蛋白酶活性的抗原相關(guān)性含半乳糖糖蛋白復(fù)合物的家族。
在下面的實驗中描述了更具體的結(jié)果。
實驗1證明用Ostertagia circumcincta胃線蟲的完整膜蛋白免疫的小羊可預(yù)防用此寄生蟲的激發(fā)設(shè)計一種實驗，其中對用Ostertagia circumcincta完整膜蛋白的伴刀豆蛋白A(ConA)結(jié)合部分免疫的小羊用該寄生蟲的感染性幼蟲激發(fā)，并測定實驗中產(chǎn)生的與激發(fā)對照組相關(guān)的保護(hù)程度。
除另有說明外，全部的抗原制備過程是在冰上或4℃進(jìn)行，離心步驟是以10，000g離心15分鐘。使冷凍的成熟O.circumcincta融化，并在緩沖液(磷酸鹽緩沖的鹽水，PH7.4，含下列蛋白酶抑制劑-1mM EDTA、1mM PMSF和1mM N-乙基順丁烯二酰亞胺)中勻漿。使勻漿離心，把沉淀小丸再懸浮于含0.1%(v/v)吐溫20的勻漿緩沖液中。再重復(fù)一次此步驟，使洗滌過的含蠕蟲膜的小丸再懸浮，然后通過在含2% Triton-X-100、但不含EDT的勻漿緩沖液中充分混合2小時進(jìn)行提取。使提取物再次離心，并使得到的上清液以100，000g超速離心1小時。使這種稱作S3(圖29，1道)并含有溶解的完整膜蛋白的上清液通過一個0.22μm孔的濾器，用緩沖液(10mM Tris-HCl pH7.4，含0.5m NaCl和0.01% w/v NaN3)稀釋4倍，并裝入ConA-瓊脂糖柱上。除去未結(jié)合的物質(zhì)(圖29，3和4道)。完全洗滌之后，用200mM α-甲基甘露糖苷/α-甲基葡糖苷洗脫結(jié)合的部分。(用29，2道)。通過凝膠過濾(Sephadex G-25，Pharmacia)使此餾份脫糖和脫鹽，通過在Mono Q(Pharmacia)上離子交換進(jìn)行濃縮，并在冷的磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)中稀釋，然后用等體積的弗氏完全佐劑乳化。
將在設(shè)計可除掉線蟲寄生蟲的條件下圈養(yǎng)的14只Suffolk雜交小羊分成2組，每組平衡性別和體重，分成6只免疫的和8只對照小羊。在大約7個月齡時用100μg抗原給免疫組的每只羊注射，而對照組只注射佐劑。在每只后腿的半膜肌和半腱肌中注射1ml疫苗。3和6周之后每組再接受相同的接種。在最后一次加強之后兩周，使全部小羊口服5，000個三期O.circumcincta幼蟲進(jìn)行激發(fā)。在激發(fā)后的2周開始每周計數(shù)兩次糞便蟲卵數(shù)，在激發(fā)后5周處死動物以計數(shù)總?cè)湎x數(shù)。
在整個實驗中免疫小羊的組平均糞便蟲卵數(shù)比對照組中的蟲卵數(shù)明顯低(表8和圖30)。對實驗的21天和35天之間的組平均數(shù)進(jìn)行比較表明免疫組的蟲卵排出量減少了80%以上。對皺胃內(nèi)容物和粘膜消化物的亞樣本(5-10%)進(jìn)行蠕蟲檢查。所找到的蠕蟲沒有接近4期的幼蟲，所有的蠕蟲已成長到第5期或成熟期。對組蠕蟲攜帶數(shù)進(jìn)行比較表明免疫羊中的攜帶數(shù)低大約60%，有統(tǒng)計學(xué)的顯著區(qū)別(表8)。
表8免疫和對照羊中糞便蟲卵數(shù)和總胃線蟲攜帶數(shù)激發(fā)感染后的天數(shù)組羊 14 18 21 25 28 32 35 蠕蟲數(shù);a免疫的 1 0b45 198 30 108 30 162 26732 0 0 1 8 36 24 15 3213 0 0 1 12 27 15 48 9054 0 0 2 24 33 15 36 3225 7 207 315 162 108 63 207 25636 0 1 63 72 198 135 189 2914平均數(shù) 1.17 42.2 96.7 51.3 85.0 47.0 109.5 1616對照 7 0 342 459 72 495 387 450 38308 6 198 450 297 720 432 558 49799 13 261 585 297 603 927 603 329210 11 432 441 252 252 693 612 399311 7 279 405 207 378 486 * 380612 9 396 297 369 1134 495 459 418913 3 27 189 108 72 162 198 208814 27 333 486 450 288 531 639 4568平均數(shù) 9.62 283.5 414.0 256.5 493.0 514.1 502.7 3843P值 <0.05 <0.01 <0.01 <0.01 <0.02 <0.01 <0.01 <0.01
a-總?cè)湎x數(shù)b-每克糞便中的蟲卵數(shù)＊-無樣本P值-T檢驗得出的免疫組和對照組相關(guān)平均數(shù)間的差異顯著性實驗2證明該預(yù)防性抗原包括含有Ostertagia circumcincta半乳糖的糖蛋白復(fù)合物(Oc-gal-GP)a)將實驗1中用于免疫羊的ConA結(jié)合部分在10%還原SDS-PAGE凝膠上電泳，并印跡到固定(immobilon)膜上。用生物素化的花生植物血凝素檢測該印跡，所用的花生植物血凝素是一種對Oc-gal-GP有特異性的配體(圖28+29)。陽性結(jié)果(圖31)表明Oc-gal-GP存在于預(yù)防性抗原制劑中。
b)為了制備Oc-gal-GP，就S3期對成熟O.circumcincta進(jìn)行處理，按照上面實驗1所述將其泵入并通過一個含有花生植物血凝素瓊脂糖的柱子。用幾倍體積的緩沖液洗滌柱子，然后用0.5M的半乳糖洗脫結(jié)合的物質(zhì)得到Oc-gal-GP。
如上所述制備Oc-gal-GP的印跡，不同的是首先用高碘酸處理它們以破壞糖類表位，并減少可能的交叉反應(yīng)。(Wood ward，Young and Bloodgood，1985，Journal of immunological Methods143-153)。用實施例8、實驗1的免疫血清或者用從O.circumcincta自然免疫的羊獲得的胃淋巴樣本(Smith，Jackson，Jackson，and Williams 1985，Journal of Comparative Pathology 95235-275)檢測該印跡。從實驗1得到的抗ConA-結(jié)合抗原的抗血清與Oc-gal-GP反應(yīng)但對于從自然免疫動物中得到的淋巴樣本未見有反應(yīng)。這些結(jié)果支持上述實驗2(a)中的發(fā)現(xiàn)，即Oc-gal-GP存在于用來免疫該羊的ConA結(jié)合部分中，并且表明Oc-gal-GP也是一種“隱蔽”抗原。
實驗3證明Oc-gal-GP是一種內(nèi)臟膜蛋白制備O.circumcincta的恒冷切片并用熒光素結(jié)合的花生植物血凝素染色。在內(nèi)臟上發(fā)現(xiàn)有強熒光，但對于未鑒別的內(nèi)部結(jié)構(gòu)也有不太強的染色(圖32)。由于花生植物血凝素特異性地結(jié)合Oc-gal-GP，此結(jié)果表明Oc-gal-GP是一種內(nèi)臟膜蛋白。
實施例9存在于毛圓線蟲屬種類中的等同酶在胃酶抑素存在下使成熟透明毛圓線蟲提取物中的蛋白水解活性減少40%。另外，在非還原條件下通過明膠底物凝膠分析觀察到的蛋白水解活性配對物(Mw大約為205kd)活性在胃酶抑素存在下明顯減少。這些發(fā)現(xiàn)表明透明毛圓線蟲也含有與血矛線蟲(Haemonchus spp.)和胃線蟲(Ostertagia spp.)中相似的天冬氨酰蛋白酶活性。
實施例10證明 H-gal-GP含有一種中性內(nèi)肽酶1、檢測與H-gal-GP相關(guān)的中性內(nèi)肽酶樣活性方法用偶氮酪蛋白作為底物在一種微量檢測系統(tǒng)中測定蛋白酶活性。使H-gal-GP(大約5μg的20μl溶液)與200μl無菌的不含有抑制劑(對照)或含最終濃度為1mM抑制劑的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)在37℃下預(yù)先保溫30分鐘。所用的抑制劑制備成100mM的水溶液原液，例外的是使4-羥基汞基苯甲酸鹽(4HMB)和胃酶抑素溶于甲醇中。試驗用的抑制劑是二硫蘇糖醇(DTT);L-半胱氨酸;還原的谷胱甘肽;4HMB;N-乙基馬來酰亞胺;EDTA;1，10菲咯啉和胃酶抑素，并且全部購自Sigma公司。預(yù)先孵育之后，加入20μl偶氮酪蛋白(5mg/ml無菌蒸餾水;Sigma)并使反應(yīng)混合物在37℃下保溫過夜。在每個抑制劑試驗中還包括含無菌水而不含H-gal-GP的平行空白對照。檢測進(jìn)行兩次。加入等體積的1M高氯酸(BDH化學(xué)公司)終止反應(yīng)，并保留在冰上15分鐘以沉淀未消化的蛋白，然后用微量離心機以11000g短暫離心。用“Monarch”微離心分析儀(Instrumentation Laboratory，Warrington，UK)測定上清液的OD405。減去合適試劑空白之后，抑制程度表示為與對照反應(yīng)相比剩余的百分活性。
2、分離中性內(nèi)肽酶編碼λgt11克隆并特征化1.從成熟蠕蟲中分離多聚腺苷酸+mRNA從實驗性感染的羊的皺胃獲得成熟的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲，用鹽水洗滌，即刻在液氮中冷凍。用已預(yù)先冷凍到-70℃的杵和研缽將冷凍的寄生蟲研磨成細(xì)粉，并溶于5ml提取緩沖液(4M異硫氰酸胍、25mM枸櫞酸鈉、0.5%(w/v)肌氨酸(sarcosyl)和0.7%(v/v)2-疏基乙醇的蒸餾水溶液)中。加入5ml酚/氯仿之后通過使溶液渦流5分鐘，將其劇烈混合，然后在冰上保溫10分鐘。通過在4℃下以10000g離心30分鐘分離水相和有機相，保留水相，并加入等體積的異丙醇，在-20℃冷卻1小時，使RNA沉淀。將RNA沉淀成小丸，再溶于提取緩沖液中，然后按上述方法再沉淀。用70%乙醇洗滌小丸，干燥，溶于0.5ml無菌蒸餾水中。
采用Efstratiadis等人(1976，Cell，7 279-288)所述的方法，通過寡聚-脫氧胸苷-纖維素色譜分離多聚腺苷酸+mRNA。用乙醇沉淀多聚腺苷酸+mRNA，干燥，再溶于10至20μl無菌蒸餾水中。
2.cDNA合成和λgt11庫的制備使用從Amersham公司購買的藥盒按廠家說明從1μg多聚腺苷酸+mRNA制備雙股cDNA。使用AMV反轉(zhuǎn)錄酶和用隨機六核苷酸引物引導(dǎo)的反應(yīng)來合成第一條鏈。用RNase H和大腸桿菌DNA聚合酶1合成第二條鏈。最后，用T4 DNA聚合酶使cDNA末端變鈍。用Amersham藥盒(RPN 1280)將cDNA連接到噬菌體λgt11(λgt11)上。簡言之，就是把EcoR1轉(zhuǎn)接體連結(jié)到cDNA庫，通過凝膠過濾去除未聯(lián)結(jié)的轉(zhuǎn)接體分子，保留＞500bp的cDNA用于連接到λgt11臂上。在使用T4多核苷酸激酶的反應(yīng)中使“轉(zhuǎn)接”的cDNA末端磷酸化，并將不同量(100，75和40ng)的這種cDNA末端連接到λgt11臂上(1μg)。將連接反應(yīng)混合物體外存放(Boehringer)，在異丙基硫代吡喃型半乳糖(IPTG)和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃型半乳糖苷(X-gal)存在下把等份的混合物在大腸桿菌Y1090上平面培養(yǎng)，以能夠測定重組體滴度。每個連接反應(yīng)產(chǎn)生大約2×105個重組噬菌體。使用羊抗H-gal-GP抗血清通過免疫篩選105重組噬菌體，選擇表達(dá)H-gal-GP成份的噬菌體。
3.免疫篩選把λgt11 cDNA表達(dá)文庫以每升瓊脂/青霉素培養(yǎng)基1000噬菌體的密度接種于90mm佩特里細(xì)菌培養(yǎng)皿中的大腸桿菌(E.coli)Y1090的平坦培養(yǎng)基上。使培養(yǎng)皿在42℃下保溫直至出現(xiàn)可見的菌斑(4小時)，然后加上一層已預(yù)先在10mM IPTG中飽和并空氣干燥的硝化纖維素濾紙。使帶有濾紙的培養(yǎng)皿在37℃保溫過夜。第二天去掉濾紙，在TBST(50mM Tris-堿，150mM NaCl，pH8.0，含有0.05% v/v吐溫-20)中充分洗滌，然后在5%馬血清的TBST液中孵育1小時使其阻滯。然后將濾紙與用含5%馬血清的TBST稀釋1/500的羊抗-H-gal-GP抗血清一起孵育4小時。用TBST進(jìn)一步充分洗滌之后，將濾紙與過氧化物酶結(jié)合的馬抗羊免疫球蛋白抗血清(1/200 TBST)一起孵育2小時，洗滌，并與DAB顯影液(10mg二氨基聯(lián)苯胺-HCl的50ml H2O溶液，含有50μl 30%過氧化氫，Sigma)一起孵育觀察免疫陽性噬菌體。將免疫陽性噬菌斑挖出并再接種，通過連續(xù)性的再接種/免疫篩選循環(huán)使噬菌斑純化。篩選105噬菌體產(chǎn)生7個陽性噬菌體。通過抗體洗脫對此進(jìn)一步分析。
4.抗體洗脫將重組噬菌體以每90mm平板103的密度在E.coli Y1090上接種，并在42℃下保溫4小時。在平板上覆蓋一層IPTG飽和硝化纖維素濾紙，并在37℃保溫過夜。去掉濾紙，用TBST充分洗滌，再與羊抗H-gal-GP血清一起孵育4小時。通過兩次使用洗脫緩沖液(5mM甘氨酸，500mM NaCl，0.2%吐溫20，pH2.3)每次2分鐘洗脫結(jié)合抗體。加入200μl 1M Tris-HCl(pH7.4)使產(chǎn)生的抗體溶液(4ml)呈中性，用5%馬血清的TBS液(不含吐溫20的TBST)稀釋3倍，并與通過7.5% SDS-PAGE分離的H-gal-GP Western印跡條一起孵育過夜。進(jìn)一步的洗滌，與第二種抗體的孵育和用DAB溶液的觀察都如上所述。
5.對免疫陽性噬菌體中cDNAs插入物的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)放大的Southern印跡分析使用正對λgtll中EcoR1克隆位點旁側(cè)區(qū)的引物(saiki et al，1988 Science 239 487-491)通過PCR放大反應(yīng)獲得制備量的插入cDNA。簡單地說，就是從挖出的噬菌斑中洗脫噬菌體顆粒到一0.5ml oppendorf試管中的50μl無菌蒸餾水中。在一個冷凍/融化循環(huán)之后，按Saiki等人(1988)所述將25μl的這種上清液用于PCR反應(yīng)。使引物在55℃退火。使PCR產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠上或在7.5%連續(xù)聚丙烯酰凝膠塊上分級分離，并通過溴化乙錠染色(瓊脂糖)或銀染色(聚丙烯酰胺)觀察產(chǎn)物。
另外，在瓊脂糖凝膠上對cDNA插入物的PCR放大產(chǎn)物進(jìn)行分級分離，并通過Maniatis等人所述的毛細(xì)管轉(zhuǎn)移技術(shù)(1982，in Molecular Cloninga Laboratory manual Cold Spring Harbour Laboratory)將其Southern印跡到尼龍膜上(Hybond-N，Amersham)。如上所述通過PCR放大噬菌體HG3制備用于檢測印跡的DNA(100ng)，并用毛地黃毒苷(Digoxygenin)方法按照廠家說明(核酸標(biāo)記和檢測藥盒，Boehringer)進(jìn)行標(biāo)記。在高度嚴(yán)格條件下(5×SSC，0.5%W/V阻斷劑，0.1% W/V N-月桂基肌氨酸，0.02% W/V SDS的50%甲酰胺溶液)于42℃雜交過夜。在雜交溶液中加入最終濃度為25ng/ml的探針DNA。在高度嚴(yán)格洗滌(最后洗滌2.1×SSC，0.1% SDS，65℃下15分鐘)之后，通過使用堿性磷酸酶結(jié)合的抗-毛地黃毒苷進(jìn)行免疫檢測和酶催化的顯色反應(yīng)(Boehringer)觀察雜交反應(yīng)情況。
6.序列分析按照廠家詳細(xì)說明把PCR放大的cDNA插入物亞克隆到PCR1000載體(In-Vitrogen)中。利用雙脫氧鏈終止方法(Sanger et al，1977，Proceedings of National Academy of Science 79 5463-5467)測定DNA序列。用Pharmacia T7測序藥盒進(jìn)行測序反應(yīng)，并嚴(yán)格按藥盒詳細(xì)說明進(jìn)行引物退火和測序反應(yīng)。用Tris/乙酸鹽/EDTA電泳緩沖液在6%聚丙烯酰胺、50%尿素凝膠平板上以50W恒定功率對反應(yīng)產(chǎn)物分級分離多達(dá)6小時。電泳之后，將凝膠浸泡于乙酸∶甲醇∶水(5∶5∶90)中40分鐘，在Whatman 31濾紙上干燥，然后于室溫下通過放射自顯影過夜檢測分解的DNA片段。將DNA和推斷的氨基酸序列與GENBANK和EMBL數(shù)據(jù)庫中存在的序列比較。
結(jié)果1、H-gal-GP中的中性內(nèi)肽酶-生化檢測使用偶氮酪蛋白作為底物通過鑒別蛋白酶抑制劑敏感性檢測與H-gal-GP相關(guān)的中性內(nèi)肽酶樣活性。典型分析的結(jié)果見表9。
表9 在PH7條件下由H-gal-GP進(jìn)行的偶氮酪蛋白蛋白水解對一組蛋白酶抑制劑的敏感性抑制劑 %活性保留無抑制劑對照 100 100二硫蘇糖醇 48 44半胱氨酸 0 0谷胱甘肽 87 854-羥基汞基苯甲酸鹽 88 91
N-乙基馬來酰亞胺 74 77EDTA 25 101,10菲咯啉 26 23胃酶抑素 75 85%抑制表示為與無抑制劑對照組相比剩余的百分活性。兩種分離分析的結(jié)果是對同一批H-gal-GP表示的。
該酶活性可被螯合劑EDTA和1，10菲咯啉以及硫醇類試劑二硫蘇糖醇和半胱氨酸所抑制。其活性不受4-羥基汞基苯甲酸鈉、N-乙基馬來酰亞胺、胃酶抑素和谷胱甘肽的影響。這種抑制的表現(xiàn)與以前報道的哺乳動物來源的中性內(nèi)肽酶的抑制(由Kenny報道，1977，InProteinese in mammalian Cells and tissues，EdBarret，A.J.Elsevier)是一致的。
2.H-gal-Gp陽性λgt11重組體的分子分析免疫篩選105λgt11重組體產(chǎn)生7個免疫陽性噬菌體?？贵w洗脫實驗表明只有從命名為HG3的重組噬菌體中洗脫出的抗體才可清楚地識別從還原SDS-PAGE凝膠制備的Western印跡條上的H-gal-GP。從非重組λgt11中洗脫的抗體不識別表明HG3反應(yīng)特異性的H-gal-GP成份。用從HG3放大的插入DNA探測從其他免疫陽性噬菌斑放大的插入DNA的Southern印跡，重組HG11給出一陽性雜交信號。在HG3和HG11中的cDNA插入物的大小分別為212bp和1019bp。
測定了HG3的全部核苷酸(圖33)和氨基酸(圖34)序列。HG3與人中性內(nèi)肽酶表現(xiàn)出33%的一致性和65%的相似性，也即非常顯著的同源性。對HG11的序列測定仍在繼續(xù)進(jìn)行，但已識別出與HG3對應(yīng)的區(qū)，并且表現(xiàn)出96%核苷酸水平的一致性。因此HG11似乎是HG3的變異體。這種變異可能是由于在不同菌株和蠕蟲不同生長周期之間存在有自然生物變異的原因。而且，還可能存在在不同來源的菌株中或在寄生蟲發(fā)展過程中特異表達(dá)的多酶形式(同功酶)。
實施例11表明在各種后生動物寄生蟲中存在有中性內(nèi)肽酶-編碼基因;克隆HG11與從EcoRI消化的后生動物寄生蟲中獲得的基因組DNA雜交為了從各種后生動物寄生蟲(血矛線蟲屬、綠蠅屬、細(xì)頸線蟲屬、和牛蜱屬)中制備基因組DNA，將2克已在液氮中快速冷凍的每種寄生蟲在液氮中研磨成細(xì)粉。將細(xì)粉緩緩加入到25ml的溶解緩沖液中(0.05M Tris-HCl(pH8.0)，0.1M EDTA，1% W/V肌氨酸(sarkosyl)，0.05mg/ml蛋白酶K)，并在65℃下保溫兩小時。用1倍體積的酚和氯仿提取該懸浮液兩次，再用兩倍體積的氯仿提取兩次，然后乙醇沉淀。將沉淀物再懸浮于20ml的Tris、EDTA緩沖液(TE，PH8.0)中，于4℃在振蕩床上過夜，然后在一升TE中透析兩次。再與最終濃度為20μg/ml的無DNase的I型RNase A(Sigma)在37℃下保溫1小時，然后如上所述用酚-氯仿提取1次，用氯仿提取1次，然后乙醇沉淀除去RNA。用70% V/V乙醇洗滌沉淀物兩次，并如上所述再懸浮于1ml的TE中。
在37℃下用EcoRI消化5μg的基因組DNA過夜，然后在1% W/V瓊脂凝膠上于Tris-乙酸鹽緩沖液中以每道5μg進(jìn)行電泳。按Maniatis等人所述(1982)通過毛細(xì)管轉(zhuǎn)移到Hybond-N膜(Amersham International)上對凝膠進(jìn)行Southern印跡分析。根據(jù)廠家的建議用紫外光將DNA固定在膜上。
用SacI和BamHI消化HG11克隆，使其電泳，回收一種750bp的片段。用一種購自Promega Bioteoh的Nick Translation藥盒根據(jù)廠家的說明用32P-dCTP放射標(biāo)記該插入物。通過旋轉(zhuǎn)柱色譜將標(biāo)記的DNA與未結(jié)合的標(biāo)記物分離。
使Southern印跡在雜交溶液(6×SSC，50%甲酰胺，5×Denhardt′s溶液，0.1%SDS)中于28℃下預(yù)先雜交3小時，然后在放射標(biāo)記探針的存在下于28℃、中等嚴(yán)格條件下雜交過夜。在室溫下洗滌印跡10分鐘，接著于42℃下第二次洗滌1小時，均是在2×SSC、0.1%SDS中洗滌。放射自顯影之后，在0.4N氫氧化鈉中于42℃下孵育30分鐘以去除探針印跡。探針的去除可通過放射自顯影過夜得到證實。
然后用相同的探針在低嚴(yán)格條件下與印跡再雜交。如上所述進(jìn)行預(yù)雜交和雜交，不同的是使用24℃的溫度。洗滌也如同上述，不同的是第二次洗滌在24℃下進(jìn)行30分鐘。
用HG11探針進(jìn)行Southern印跡分析表明不僅與血矛線蟲屬來源的DNA結(jié)合，而且也與其他后生動物寄生蟲血矛線蟲屬、綠蠅屬、細(xì)頸線蟲屬、牛蜱屬的DNA結(jié)合，如圖35中的1-4道所分別表示的。這可以在中等和低嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交得到證實。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防性后生動物寄生蟲抗原或其抗原片段、成份或前體以及其具有抗一種或幾種后生動物寄生蟲的預(yù)防性抗原活性的功能等同衍生物、類似物或變異體，該抗原的特征在于能夠結(jié)合胃酶抑素，并且其天然形式是一種完整膜蛋白或蛋白復(fù)合物。
2.一種如權(quán)利要求1所述的抗原或其抗原片段、成份、前體或功能等同衍生物、類似物或變異體，其進(jìn)一步的特征在于(a)具有蛋白水解活性;(b)其天然形式位于寄生蟲內(nèi)臟的腸刷狀緣;和(c)能夠結(jié)合小麥芽植物血凝素和對β-連接的N-乙?；肴樘前酚刑禺愋缘闹参镅?。
3.一種如權(quán)利要求1所述的抗原或其抗原片段、成份、前體或其功能等同衍生物、類似物或變異體，其天然狀態(tài)能夠結(jié)合ConA、豌豆、蓮、Helix Pomatia，花生和Jacalin植物血凝素。
4.一種如權(quán)利要求1至3中任何一項所要求的抗原或其抗原片段、成份或前體或其功能等同衍生物、類似物或變異體，其中該抗原的進(jìn)一步特征在于具有天冬氨酰蛋白酶樣和/或中性內(nèi)肽酶樣活性。
5.一種如權(quán)利要求1至4中任何一項所要求的抗原或其抗原片段、成份或前體或其功能等同衍生物、類似物或變異體，可以從血矛線蟲屬、胃線蟲屬或毛圓線蟲屬的蠕蟲中獲得。
6.一種如權(quán)利要求1至5中任何一項所要求的抗原或其抗原片段、成份或前體或其功能等同衍生物、類似物或變異體，具有表1中所列出的SDS-PAGE分子量分布，或其成份。
7.一種如權(quán)利要求1至6中任何一項所要求的抗原或其抗原片段、成份或前體或其功能等同衍生物、類似物或變異體，該抗原可以從血矛線蟲的內(nèi)臟獲得，并且具有在非還原條件下于5%凝膠上通過SDS-PAGE測定為大約190至205kd的分子量，或具有在非還原條件下于10%凝膠上通過SDS-PAGE測定的大約為35或45至50kd的分子量。
8.一種如權(quán)利要求1至7中任何一項所要求的抗原或其抗原片段、成份或前體或其功能等同衍生物、類似物或變異體，可用于在人或非人類動物中激發(fā)抗后生動物寄生蟲的免疫應(yīng)答。
9.一種如權(quán)利要求1至7中任何一項所要求的一種后生動物寄生蟲抗原和其成份片段前體和功能等同衍生物、類似物或變異體的用途，可用于制備疫苗組合物，以用于在人或非人類動物中激發(fā)抗后生動物寄生蟲的免疫應(yīng)答。
10.一種可用于在人類或非人類動物中激發(fā)抗后生動物寄生蟲的免疫應(yīng)答的疫苗組合物，包括一種或多種如權(quán)利要求1至7中任何一項所要求的抗原或其成分、片段、前體或功能等同衍生物、類似物或變異體，還包括可藥用載體或稀釋劑。
11.一種如權(quán)利要求10的組合物，包括一種或多種所說的抗原和一種或多種選自抗原H11OD和H45及其成份的其他抗原。
12.一種激發(fā)人或非人類動物體內(nèi)抗后生動物寄生蟲的免疫應(yīng)答的方法，包括給所說動物施用如權(quán)利要求10或11所定義的疫苗組合物。
13.一種抗體或其抗原結(jié)合片段，它能夠選擇性地結(jié)合如權(quán)利要求1至7中任何一項所定義的抗原或其抗原片段、成份或前體或其功能等同衍生物、類似物或變異體，或結(jié)合所說結(jié)合抗原抗體的基因型。
14.一種制備用于激發(fā)人或非人類動物體內(nèi)抗后生動物寄生蟲感染的疫苗的方法，所說的方法包括制備含有如權(quán)利要求1至7中任何一項所定義的至少一種預(yù)防性抗原的所說寄生蟲的提取物，通過將所說抗原結(jié)合到一種包含該抗原特異性結(jié)合配體的固定相上并從所說固定相中進(jìn)一步洗脫所說抗原，可從中純化所說抗原。
15.一種在后生動物寄生蟲中識別預(yù)防性抗原的方法，包括使用一種攜帶有對N-乙?；肴樘前酚刑禺愋缘囊环N或多種植物血凝素的固定相將所說寄生蟲的完整膜部分進(jìn)行親合層析。
16.一種如權(quán)利要求14或15中所述的方法，其中所說的特異性結(jié)合配體或植物血凝素是花生或jacalin植物血凝素。
17.一種核酸分子，包括一種編碼如權(quán)利要求1至7中任何一項所定義的抗原或其抗原片段、成份或前體或其功能等同衍生物、類似物或變異體的核苷酸序列。
18.一種如權(quán)利要求17所要求的核酸分子，它包括一種或多種基本上與圖33(序列識別號)所示的全部或部分核苷酸序列對應(yīng)的核苷酸序列或包括一種與所說序列基本同源或與所說序列雜交或其變性的序列。
19.一種含有如權(quán)利要求17或18所定義的核酸分子的表達(dá)或克隆載體。
20.一種含有如權(quán)利要求17或18所定義的核酸分子的宿主細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因生物。
21.一種制備如權(quán)利要求1至7中任何一項所要求的抗原或其抗原片段、成份或前體或其功能等同衍生物、類似物或變異體的方法，包括在可表達(dá)所說抗原的條件下，培養(yǎng)一種含有可編碼全部或部分所說抗原的一種核酸分子的宿主細(xì)胞，并回收如此產(chǎn)生的所說抗原。
22.一種預(yù)防性后生動物寄生蟲抗原或其抗原片段、成份或前體和其具有抗一種或多種后生動物寄生蟲的預(yù)防性抗原活性的功能等同衍生物、類似物或變異體，該抗原的特征在于具有天冬氨酰蛋白酶樣和/或中性內(nèi)肽酶樣活性，并且其天然形式是一種完整的膜蛋白或蛋白復(fù)合物。
23.一種預(yù)防性后生動物寄生蟲抗原或其抗原片段、成份或前體和其具有抗一種或多種后生動物寄生蟲的預(yù)防性抗原活性的功能等同衍生物、類似物或變異體，該抗原是(或構(gòu)成部分的)可從血矛線蟲內(nèi)臟獲得的完整膜蛋白或蛋白復(fù)合物，并且具有在非還原條件下于5%凝膠上通過SDS-PAGE測定的大約190至205kd的分子量或具有在非還原條件于10%凝膠上通過SDS-PAGE測定的大約35或45至50kd的分子量。
全文摘要
本發(fā)明提供了新的后生動物寄生蟲抗原、編碼，它們的核酸及其在控制由蠕蟲和其他后生動物寄生蟲、尤其是家畜動物中的蠕蟲和節(jié)肢動物寄生蟲引起的疾病中的應(yīng)用。本發(fā)明特別提供了預(yù)防性后生動物寄生蟲抗原或其抗原片段、成分或前體和其具有抗一種或多種后生動物寄生蟲的預(yù)防性抗原活性的功能等同衍生物、類似物或變異體。該抗原的特征在于能夠結(jié)合胃酶抑素，并且其天然形式是一種完整的膜蛋白或蛋白復(fù)合物。本發(fā)明還提供了具有天冬氨酰蛋白酶樣和/或中性內(nèi)肽酶樣活性特征的抗原。
文檔編號A61P33/00GK1088217SQ9311688
公開日1994年6月22日 申請日期1993年7月21日 優(yōu)先權(quán)日1992年7月21日
發(fā)明者W·D·史密斯, S·K·史密斯, J·默里, S·利德爾, D·P·諾克斯 申請人:皮特曼-穆爾公司