造血促進細胞的制作方法

專利名稱：造血促進細胞的制作方法
技術領域：
本發明涉及哺乳動物的造血促進細胞。尤其是涉及造血促進細胞的分離、特征描述以及使用。通過其形態學、細胞表面表型和在體內的功能，可以將本發明的促進細胞與其它已知的骨髓細胞區分開。當與包括造血干細胞的其它骨髓細胞一起共同施用給受體時，促進細胞能增強它們的移植，而沒有明顯不利的生物學活性。因此，促進細胞可以有廣泛的應用，包括但不限于，經骨髓移植進行造血重建以治療癌癥、貧血、自體免疫、免疫缺陷、病毒感染和代謝紊亂以及其在促進固體器官移植方面的潛在效用。
固體器官移植的主要目的是移植供體器官，而受體不產生移植物排異免疫反應，同時又保留了受體抗其它外源抗原的免疫能力。一般用非特異性免疫抑制劑如環孢菌素、氨甲喋呤、類固醇和FK506來防止宿主的排異反應。但是，抑制所有免疫反應的非特異性免疫抑制劑由此很大程度上增加了受體對感染和疾病，包括癌癥的易感性。此外，盡管使用了免疫抑制劑，但在人的器官移植中，移植物排異反應仍是引起發病及死亡率的一個主要原因。(參見Powles，1980，Lancet，P.327;Ramsay，1982，NewEngl.J.Med.P.392)。大多數人類的移植在10年內就會失效。
在完全的全身性供體特異性移植耐受性發生的這種唯一已知的臨床狀態中，通過骨髓移植產生了組織嵌合現象。(參見Qinetal.，1989，J.Exp.Med.169∶779;Sykesetal.，1988，Immunol.Today.9∶23;Sharabietal.，1989，J.Erp.Med.169∶493)。這在總體淋巴樣輻射受體，接著用供體細胞進行骨髓移植的新生和成年動物模型及人中已經做到。骨髓移植的成功率部分取決于供體細胞主要組織相容性復合體(MHC)與受體的相近匹配的能力。MHC是一個基因復合體，它編碼大量在供體和宿主細胞表面表達的個體特有的糖蛋白，該糖蛋白是移植排異免疫反應的主要對象。在人類，MHC稱為HLA。如果用象同胞這樣的家庭成員與患者匹配達到HLA相同，那么最后成功的可能性相對高些。然而，在同種的兩個MHC錯配個體間完成同種異體骨髓移植時，可能會導致移植失敗，并且受體可能表現出很弱的免疫能力和移植物抗宿主疾病(GVHD)。
在骨髓移植中，GVHD是一種潛在的致死并發癥，在未處理的HLA相同的髓移植物受體中，發病率為約35-50%(Martinetal.，1985，Blood.66∶664)，并且對于HLA錯配骨髓的受體，高達80%。GVHD起因于供體移植物中免疫活性的成熟免疫細胞將宿主組織抗原識別為外源抗原并誘發有害免疫反應的能力，雖然混合的同種異體重建(其中移植供體和受體骨髓的混合物)會提高免疫能力并增強對GVHD的抗性，但并不能始終如一地達到成功的移入并且仍可能發生GVHD。
最近有關骨髓移植的研究表明，GVHD的主要起因是T細胞，這是由于從供體細胞制品中除去T細胞與GVHD發病率降低有關。(Valleraetal.，1989，Transplant，0.751;Rayfield，1984，Eur.J.Immunol.，P.308;Vallera，1982，J.Immunol.，P.871;MartinandKorngold，1978，J.Exp.Med.，P1687;Prentice，1984，LancetP，472)。在表明T細胞是動物模型GVHD的主要介導物后，人們開始研究有關人類供體骨髓T細胞消除(TCD)的攻擊性工具。雖然GVAD的發病率顯著地降低，但在失敗的移植中伴隨TCD的顯著增加，這說明在骨髓移植中，T細胞可能也起積極的作用。(SoderlingJ.Immunol.，1985，135∶941;Vallera，1982，Transplant.33∶243;Pierce，1989，Transplant.P.289)。人類受體中移植失敗的增加占全部患者的約5-70%，并且與供體和受體間MHC差異的程度有關(Blazar，1987，UCLASymp.，p.382;Filipovich，1987，Transplant.，p.62;Martinetal.，1985，Blood.66∶664;Martinetal.，1988，Adv.，Immunol.40∶379)。移植失敗的患者即使進行第二次骨髓移植，也通常會死亡。結果，在美國，大多數移植機構已放棄供體骨髓的TCD，因此，也就必須容忍會導致明顯發病和死亡的高水平GVHD。因此，作為一種治療形式，骨髓移植的應用僅限于潛在效果超過GVHD可能性的情況。
T細胞可能既參與有害的GVHD反應又具有有益的移植促進作用的推論是一個在學術界長期存在的謎。研究者開始尋找可能存在的、有利于骨髓移植但在TCD期間被除去的骨髓成份。這種促進成份的鑒定及純化可能允許設計移植工具以便選擇性地防止GVHD，而同時可保留能增強移植的細胞。
雖然大多數研究者推測促進成份是造血細胞而不是造血干細胞，但在本發明之前，還從未鑒定或結論性地描述過上述成分。事實上，所有跡象仍傾向T細胞某些形式的卷入。很迫切地需要鑒定這種成份的確切知識，這種成份可能促進受體中造血干細胞的移植，而不會發生GVHD。
本發明滿足了上述長期的迫切需要。本發明涉及哺乳動物造血促進細胞、分離這種細胞的方法、以及使用這種細胞促進用干細胞重建損傷或損壞的自體的、同基因的、同種異體的或異基因的造血系統的方法。
本發明部分是以申請人的發現為基礎，即鼠骨髓含有呈現表型為THY1+，MHC Ⅱ+型(僅為暗淡至中間水平的表達)CD45+，CD45R+和CD8+的細胞群，它們能夠促進受體中間種異體供體骨髓細胞的移入。涉及除去這些細胞的負選擇方法和涉及以高度純化或部分純化形式加入這些細胞的正選擇方法證實，它們具有移植促進活性并可從造成GVHD的T細胞中分辨出來。在形態學上，純化的促進細胞與所有其它造血細胞類型，包括淋巴細胞截然不同。此外，如果它們是與促進細胞一樣的MHC單模標本，那么在骨髓細胞最佳移植中的MHC特異性模式中，就能達到這些細胞的功能。在增強的混合嵌合現象中，本發明的促進細胞也可以介導跨越種屬障礙的異種骨髓移植。
用實施例描述本發明時，其中分離小鼠、大鼠和人的促進細胞，并描述它們的細胞表面表型特征。用分離的促進細胞成功地進行了供體骨髓細胞移入，而沒有表現出GVHD。本文描述的本發明包括了生血促進細胞的廣泛應用、包括但不限于，移植、治療癌癥、代謝紊亂、免疫缺陷、自體免疫、糖尿病、血紅蛋白病、肝炎、愛滋病及衰老。
本發明提供了從骨髓或造血細胞的其它生理性來源純化促進細胞的方法。用具有或沒有特異性標記為基礎的分離方法純化促進細胞。
通過利用促進細胞有利于移入骨髓或純化的干細胞并因此建立嵌合造血免疫系統的能力，本發明提供了賦予供體特異性移植耐受性并減少非特異免疫抑制劑需要的移植方法。
本發明的目的之一是提供含有純化或部分純化的造血促進細胞的細胞組合物。
本發明的另一目的是提供細胞組合物，該組合物含有純化或部分純化的造血促進細胞以及對促進細胞具有MHC特異性的純化或部分純化的造血干細胞。
本發明的另一目的是提供細胞組合物，該組合物含有純化或部分純化的造血促進細胞、對促進細胞具有MHC特異性的造血干細胞以及一種或多種對促進細胞具有MHC特異性的附加造血細胞成份。
本發明的另一目的是提供細胞組合物，該組合物含有造血促進細胞和造血干細胞，其中已經特異性和選擇性地除去了造成GVHD的T細胞。
本發明的另一目的是提供從造血細胞的生理來源中純化造血促進細胞的方法。
本發明的另一目的是提供在受體中建立混合的同種異體、混合的異種、完全的同種異體以及完全的異種的嵌合免疫系統的方法。
本發明的另一目的是提供將供體生理成份移植到具有供體特異性稱植耐受性的受體中的方法。
本發明的另一目的是提供用涉及促進細胞的骨髓移植治療各種疾病和失調的方法。
3.1定義本文所用的“受體”是指任何哺乳動物，包括人。
本文所用的“供體”是指任何哺乳動物，包括人。
本文所用的“MHC-特異性”細胞除明確提及其傳統理解的含意外，是指其主要組織相容性復合體不能阻止促進細胞促進移入的細胞，無論細胞主要組織相容性復合體實際上與促進細胞相同，或者就廣泛的促進細胞來說，完全不是移入的障礙。
本文所用的“純化”是指從其天然存在狀態富集或增加特定細胞的濃度，包括這些細胞的分離。
本文所用的“基本破壞”是指全部或幾乎全部破壞受體免疫系統。
本文所用的“致死輻射”是指通過輻射基本上破壞受體的免疫系統。
本文所用的“免疫抑制”是指抑制受體免疫系統的功能，包括抑制攻擊識別的外源細胞的傾向(即對移植物的排斥)。
本文所用的“細胞減弱”是指破壞受體免疫系統的部分細胞，以便給施用的免疫細胞提供生理空間。
本文所用的“供體生理成份”是指供體機體，包括器官、組織及細胞的任何部分或部分的結合。
本文所用的“嵌合體”是指一個含有來自受體的細胞和來自至少一個供體的細胞的受體。
本文所用的“同種”是指供體源中的供體在遺傳學上與受體相同。
本文所用的“同種異體”是指供體源中的供體與受體是同種的。
本文所用的“異種”是指供體源中的供體與受體是不同種的。
本文所用的“混合的嵌合免疫系統”是指一個受體疫系統含有約0.5%至99%的同種異體或異種細胞以及剩余百分比的同種細胞。
本文所用的“完全同種異體細胞嵌合免疫系統”是指通過施用同種異體和同種細胞產生的受體免疫系統，且實際上含有100%同種異體細胞但其中也可以存在一些提供有限數量免疫細胞譜系的殘余的同種細胞。
本文所用的“完全異種的嵌合免疫系統”是指通過施用同種和異種細胞產生的受體免疫系統，并實際上含有100%的異種細胞，但其中可存在一些提供有限數量免疫細胞譜系的殘余同種細胞。
4.附圖描述

圖1 純化的Ⅱ+型促進細胞的透射電子顯微圖。
5.本發明的詳細描述本發明涉及哺乳動物的造血促進細胞、分離并描述促進細胞特征的方法以及使用上述細胞的方法。
開始的負選擇研究導致了造血促進細胞是CD8-的觀點，本文所描述的后續研究已得出結論，即促進細胞的正確表型包括CD8+。本文所含的實驗數據導致了認為CD8-僅僅是為信息內容而保留的早期結論(參見第6部分，下文)，而經正選擇研究，現在的結論說明促進細胞是CD8+(參見第7部分，下文)。這些似乎矛盾的結論可能歸因于在第6部分所用的負選擇方法中，在用抗體加補體處理時，以低密度表達CD8的細胞沒有完全除去。在有關正選擇使用抗CD8單克隆抗體的流式細胞計數研究中，鑒別到少量的CD8+細胞，這些細胞表現促進活性。
另外，原來的設想是促進細胞群是Ⅱ型明亮部分，這一結論是根據以抗Ⅱ型抗體消除研究為基礎的推測得出的。在隨后的正選擇加上加回實驗中，說明促進細胞并不在Ⅱ型明亮部分，但在暗淡至中間著色水平的范圍內，代替表達的Ⅱ型分子。這是根據抗體染色和流式細胞計數確定的，其中，通過與作為對照的其它細胞類型比較，鑒別三個水平的著色密度。例如，Ⅱ-型細胞作為背景，則認為明亮著色的Ⅱ+型抗原呈現細胞如B細胞和樹突形細胞是Ⅱ亮型。此外，用電子顯微鏡，本文同時描述的形態學研究(第7部分，下文)認為Ⅱ型亮部分是淋巴細胞。因此，與B細胞相比，促進細胞是Ⅱ型正但不是Ⅱ型亮。
下文各分部分對本發明的詳細討論僅僅是為了描述而不是限制目的。為了清楚地討論，用鼠為例說明本文所述的具體過程和方法;但這僅僅是為了舉例說明本發明的實施。相似的方法和技術同樣適用于所有的哺乳動物種，包括人，在移植中按照使用人促進細胞作為供體，人受體接受上述細胞。因此，在本文所述的條件下，可以使用有相似表型和功能的人促進細胞。此外，也可以使用非人類的動物促進細胞以增強人類患者中異種細胞的移植。
5.1促進細胞的特征描述對于混合的嵌合現象模型，在致死的總體輻射后共同施用同種(宿主)加同種異體或異種(供體)的骨髓可鑒別促進細胞。處理供體骨髓接種物以進行清除或篩選，然后將各種細胞子群加回到用RAMB或THY1或各種CD標記物的單克隆抗體除去T細胞的骨髓中，表明對同種異體骨髓移植和混合同種異體骨髓的總水平有顯著的影響。如果完成混合骨髓接種物同種或同種異體成份的TCD，則會發生混合的多譜系淋巴造血嵌合現象。有同種和同種異體干細胞共同移植的證據，這是由于宿主和供體紅血細胞、血小板、T細胞、B細胞、骨髓譜系細胞和N細胞的混合物是可檢測的。由于淋巴樣嵌合現象的水平與其它譜系的不同，所以每個譜系是獨立調節的。然而，每個譜系的同種異體嵌合現象的百分比保持明顯的穩定，在受體的生存時間內有很小的波動，最高達12個月。
若除去骨髓接種的同種異體成份中表達THY1的細胞，則可觀察到混合的嵌合現象。作為鮮明的對照，如果施用未處理的同種異體骨髓，產生同種異體干細胞移植的促進作用，并發生100%的同種異種嵌合現象。這種效果是強烈的，這是由于劑量滴定研究表明如果TCD同種異體骨髓細胞不能移植時，那么移植促進效果是確實可得到的，產生排他的同種再生。如果除去CD4+、NK細胞、成熟的單核細胞和巨噬細胞或B細胞，那么會發生相似的同種異體干細胞移植促進作用。因此，混合的嵌合現象模型提供了一種體內模型，該模型能鑒別并特征性描述能夠具有移植促進活性的細胞。
本文所述的研究表明，促進細胞不是干細胞，這是由于(1)用抗RAMB處理除去嚙齒類中有關同種異體骨髓移植的促進效應，其中的移植比在人類中更容易發生，但產生混合的嵌合現象(與100%同種異體移植對比)，(2)同種異體小鼠骨髓除去THY1.2也消除促進效應，但在混合嵌合形式中，同種同種異體移植的平衡比RAMB處理后的稍微大一些。雖然很好地描述了一些RAMB除去骨髓干細胞的特征，但在用于其它實驗前的同種(A→A)重建研究中，排除了這種效應，這是由于從骨髓中除去全部干細胞可能導致死于移植失敗。
一種可能的解釋是，骨髓中的THY1.2除去，或RAMB除去，會導致選擇性地消除骨髓祖細胞。然而，當將不同量的TCD與未處理的同種骨髓細胞比較施用給致死輻射過的小鼠時，兩組的存活曲線相似。這說明兩組骨髓制備物有相似的重建能力。在這種同種重建的情況下，相對抗輻射的“促進細胞”在受體小鼠中生存。因此，抗體處理后的干細胞消除不同于造成嵌合現象降低水平的原因，降低水平的嵌合現象是在TCD與未處理同種異體骨髓比較的受體中見到的。
另外，本文所描述的造血干細胞和促進細胞有不同的細胞表面標記表達外形。美國專利No.5，061，620聲稱將骨髓干細胞的特征描述為大部分的CD34+、CD3-、CD7-、CD8-、CD10-、CD14-、CD15-、CD19-、CD20-、CD33-、Ⅱ+和THY1+。THY1標記在于小鼠的T細胞、NK細胞和一些骨髓樣細胞上，而在大鼠和人的成熟T細胞上沒有。當將純化細胞移植到遺傳學上相同的受體中時，通常會發生移入。然而，這些高度純化的細胞并不移入遺傳學上不同的同種異體或異種受體。
本文所描述的研究表明多能骨髓干細胞不是Ⅱ型陽性。用兩種不同的方法除去Ⅱ型陽性細胞(通過抗體加補體處理用負選擇流式細胞計數)，除去了有關同種異種干細胞移入的促進效應，消除完全的同種異體移入導致了多譜系混合嵌合現象。如果用這些消除方法除去了干細胞，則會發生排他的同種再生。
雖然由美國專利No.5，061，620描述的骨髓干細胞部分也是THY1，但THY1低陽性相對THY1亮陽性之間的區別是很重要的。參考這種區別，能提供一種富集干細胞的方法，因為直到目前，本領域專業人員仍不能鑒定干細胞上THY1抗原表達的水平(Spangrudeetal.，1988，Science241∶58)并且在分離涉及到的(更成熟的)干細胞子代與相比較的分化較低的細胞時，干細胞上THY1抗原表達水平是一個重要因素。(也參見Spangrude，1989，ImmunologyToday10∶344)。另外，最近的報告說明在具有THY1.2等位基因的小鼠的干細胞上，沒有表達THY1(SpangrudeandBrooks，1992，Blood80∶1957)。
作為鮮明的對照，促進細胞的純化取決于Ⅱ型陽性細胞部分的富集。此外，單獨這些細胞在沒有干細胞的情況下并不重建致死輻射過的同種(A→A)受體，而在小鼠中，僅50-100的同種干細胞就足以營救致死輻射。
詳細分析人骨髓，根據同樣的方法表明在流式細胞計數器上具有相似向前和側擴散的Ⅱ+細胞群是CD34-。認為這代表了人促進細胞群。象嚙齒類中相應的細胞一樣，人細胞對于B細胞(CD19，CD20)、單核細胞、巨噬細胞(CD14)及T細胞(CD4，αβ-TCR，CD3)標記是陰性。對于嚙齒類干細胞，等同于抗CD34的單克隆抗體不存在，所以不能完成用CD34著色與推測的促進細胞群之間的比較。
由于促進細胞是新的細胞群，可能促進細胞表達其它還未鑒別的標記。如果是這樣，在鑒別這些特有分子方面的上述失敗可能歸因于它們在其它造血細胞類型中降低的或沒有進行的表達。因此，可以用促進細胞生產抗其細胞表面抗原的抗體，以便鑒別并特征性描述上述未知的標記。上述抗體可以用于進一步特征性描述并純化這些細胞。
多克隆和單克隆抗體的生產也在本發明范圍內，所述的多克隆和單克隆抗體可識別由促進進細胞(特別是人和嚙齒類的)表達的新抗原標記。在分離這些細胞后，可以用現有技術已知的各種方法生產這些細胞的抗體。為了生產抗體，可以用能存活的、純化或部分純化的促進細胞、固定細胞或膜制品注射免疫各種宿主動物(包括但不限于兔、倉鼠、小鼠、大鼠等)。根據宿主種類，可以用各種佐劑以增強免疫反應，包括但不限于弗代氏劑(完全的和不完全的)、如氫氧化鋁的礦物凝膠、表面活性物質如溶血卵磷脂、環氧乙烷-環氧丙烷嵌段共聚物多元醇、聚陰離子、肽、油乳膠、鑰孔
血藍蛋白、二硝基苯酚以及強有效的人類佐劑如BCG(卡介苗菌株)和短小棒狀桿菌。
用培養中的連續細胞生產抗體分子的任何技術，可以制備抗促進細胞上新抗原的單克隆抗體。這些技術包括但不限于由Kohler和Milstein最早描述的(1975，Nature256，495-497)雜交瘤技術、最近的人B細胞雜交瘤技術(Kosboretal.，1983ImmunologyToday4∶72;Coteetal.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80∶2026-2030)和EBV雜交瘤技術(coleetal.，1985，Monoclonal.AntibodiesandCancerTherapy，AlanR.Liss.Inc.pp.77-96)。
可以用促進細胞免疫同種、同種異體及異種宿主，可以以活的形式、或固定的形式，或作為提取的膜片段來制備免疫用促進細胞。可以用與促進細胞，但不是與成熟巨噬細胞、粒細胞、樹突狀細胞、T，B細胞和干細胞的選擇性結合，分別篩選單克隆抗體。
可以用已知技術生產含分子結合位點的抗體片段。例如，上述片段包括但不限于用胃蛋白酶消化抗體分子產生的F(ab′)2片段以及通過還原F(ab′)2片段的二硫鍵產生的Fab片段。
在增強供體細胞移入方面，促進細胞的活性也說明了一種涉及細胞-細胞間相互作用和/或細胞刺激素產生的機制。為了鑒別由促進細胞產生的可能的新細胞刺激素，可以建立長效的促進細胞或者用病毒或化學制品，將促進細胞轉化到腫瘤細胞中可以產生連續的細胞系。通過將培養上清液用于已知在生物檢測中對特定細胞刺激素有反應的、作為指示劑的各種細胞類型中，可以直接分析所述的細胞上清液。可以代謝標記細胞并將其上清液經生化分析。經SDS-PAGE和/或生物活性已經鑒定了一種主要的蛋白質，可用SDS制備性凝膠、離子交換層析及等電點聚焦凝膠純化這種蛋白質。用SDS-PAGE可以證實該蛋白質的純度，用蛋白質分析進行定量，在生物檢測中確認其活性，并將其作為免疫原用于生產多克隆和單克隆抗體。
在刺激和/或抑制不同組織類型的各種指示劑細胞系增殖的生物檢測中，進一步檢測這種純化的蛋白質。通過如親和標記方法，也可以鑒定放射標記蛋白質細胞表面受體。可以用細胞刺激素特異的抗體鑒定并定量分析細胞刺激素的膜形式和分泌形式，研究它們的生物合成途徑，親和純化蛋白質并免疫篩選編碼序列分子克隆的表達文庫。
5.2分離促進細胞本發明提供從骨髓或造血細胞的其它生理來源中純化促進細胞的方法。在富集后，促進細胞的活性可以以相對小的數量使用，不必絕對純化。用各種分離方法可以從它們所存在的任何組織中分離促進細胞。下文第7部分作為舉例介紹了用于從骨髓中分離促進細胞的上述方法的改良。根據本發明的目的，可以用是否存在特異性標記為基礎的分離方法分離促進細胞。
雖然骨髓是優選的，但也可利用造血細胞的其它生理性來源，如，脾、胸腺、血液、胚卵黃囊或胎兒肝臟。比較好的是從股骨或脛骨取骨髓，但也可從脊柱或其它骨腔取出。可以用本領域專業人員已知的各種方法從骨腔中取出骨髓，包括用生理性介質、平衡鹽溶液、生理性緩沖液的混合物，以及其它天然存在的因子沖洗骨頭。通常，經過過濾、離心并再懸浮骨髓。
一旦得到造血細胞源，就可以通過利用特異性抗體的各種方法得到造血促進細胞，所述的特異性抗體最好可結合特異性標記以選擇那些擁有或沒有各種標記的細胞。這些技術可包括，例如，使用熒光激活細胞分類術(FACS)和特異性熒光色素的流式細胞計數、使用與細胞表面標記特異性抗體共軛的生物素的生物素-抗生物素蛋白或生物素-抗生蛋白鏈菌素分離法，并且抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素與固相載體如親和柱基質或塑料表面結合、使用抗體包被磁珠的磁分離方法和破壞性分離法如與細胞毒素或放射性同位素結合的抗體和補體。
通過對抗原標記有特異性的抗體進行的分離方法可以是負或正選擇方法。在負分離法中，使用對不需的細胞上存在的標記有特異性的抗體。可以除去或溶解由抗體結合的細胞并保留剩余的所需混合物。在正選擇中，使用對所需細胞上的標記有特異性的抗體。分離并保留由抗體結合的細胞。可以理解可基本上同時或以一個連續的方式使用正和負分離方法。也應理解本發明包括任何能分離細胞的分離技術，所述的細胞是以本文所述的促進細胞的特征性表型為基礎的。
直到目前為止，以分離為基礎的有關抗體的最普通技術是使用如經FACS的流式細胞計數。通常，按如下所述完成用流式細胞計數的分離。將造血細胞的懸浮混合物離心、并再懸浮于介質中。加入與熒光色素結合的抗體以使抗體與特異性細胞表面標記結合。然后經一次或多次離心和再懸浮步驟洗滌細胞混合物。混合物進行FACS，FACS是以不同的、熒光特性為基礎分離細胞。在不同水平的性能和能力方面，FACS系統都可以利用，包括多色分析。可以用向前和側擴散的特征圖形鑒別促進細胞，所述的特征圖形受大小和粒度以及特定表面標記的正性和/或負性表達影響。
除流式細胞計數法外，其它分離技術也可以提供快速分離。一種上述方法是通過親和層析進行的、以生物素-抗生素蛋白為基礎的分離法。通常，將洗滌的骨髓和已與生物素配對、并對抗原標記有特異性的抗體一起培養，接著通過一個抗生物素蛋白柱，從而完成上述技術。生物素-抗體-細胞復合物經生物素-抗生物素蛋白間相互作用與柱結合，而其它細胞流過該柱。最后，通過干擾或其它方法可以釋放柱結合的細胞。生物素-抗生物素蛋白系統的特異性很適用于快迅正分離。
流式細胞計數法和生物素-抗生物素技術提供了分離細胞的高度特異性方法。如果需要的話，可以用特異性較低的技術開始分離，但這種技術能夠從造血細胞源中除去大量“非促進”細胞。例如，開始可以用磁珠分離法除去“非促進”分化的造血細胞群，包括T細胞、B細胞、自然殺傷(NK)細胞和巨噬細胞，以及包括巨核細胞、肥大細胞、嗜曙紅細胞和嗜堿細胞的小細胞群。希望可除去全部造血細胞的至少約70%且通常至少約80%。
優選的起始分離技術是密度梯度分離。其中，離心骨髓或其它造血細胞混合制備物并除去上清液。將細胞再懸浮于，如含10%ECS的RPMI1640培養基(Gibco)中，并放在用，如Ficoll或Percoll或Eurocollins介質制備的密度梯度中。然后經離心或用自動化的，例如，Cobel&CellSeparator′2991(cobev，Lakewood，Colorado)完成分離。根據造血細胞混合物的來源和其內含物，其它分離方法也是可行的。例如如果血液作為造血細胞來源，則在分離任何部分前可先溶解紅血細胞。
一般，促進細胞的特點在于是αβ-TCR-、γδ-TCR-、CD3-、CD4-、CD16-、CD19-、CD20-、CD56-、成熟髓樣譜系-(CD14-)、Ⅱ+型、CD45+，CD45R+、THY1+和CD8+。通過將造血細胞混合物正分離成含Ⅱ+和THY1+部分的促進細胞，可以得到高濃度的促進細胞。以著色明暗度為基礎，進一步分離Ⅱ+部分并除去Ⅱ型明亮群。
通過將造血細胞混合物正分離成含Ⅱ+型和CD45+部分的促進細胞，可以得到高濃度的促進細胞。通過將造血細胞混合物分離成Ⅱ+型、CD45+和THY1+部分，可以得到高濃度的促進細胞。
按上文所述，用以分離細胞的特異性標記取決于造血細胞混合物的來源。約1%到8%的骨髓是Ⅱ型陽性。通過使用本文所述的那些標記的負選擇法可除去至少80%的骨髓細胞，促進細胞沒有上述標記。如果造血細胞源是骨髓，用大量不同的負選擇序列，可以得到高濃度的促進細胞。將骨髓正分離成Ⅱ+型部分，可以得到高濃度的促進細胞。將Ⅱ+型進一步分離成CD19-部分，可得甚至更高濃度的促進細胞。
雖然公開了以特異性標記為基礎的分離方法，但就理解本發明包括任何(將產生細胞組合物的)以本文所述的促進細胞特征為基礎的分離方法，所述的細胞組合物含有高濃度的促進細胞，所述的分離方法是負分離法、正分離法，或者負和正分離法的結合，并且，所述的分離方法使用細胞分類或某些其它技術，如，抗體加補體處理、柱分離、Panning、生物素-抗生物素蛋白技術、密度梯度離心或本領域專業人員已知的其它技術。應知道，本發明包括那些在任何哺乳動物上使用的分離方法，所述的哺乳動物包括但不限于人、靈長目動物、狒狒、大鼠、小鼠和其它嚙齒動物。
由造血細胞混合物的來源可決定所需混合物的量以得到大量的促進細胞樣品。造血細胞混合物的來源也決定得到大量樣品所需要的時間。例如，與使用骨髓作為造血細胞混合物來源相比，促進細胞在血液中的濃度相對低且從血液中分離純化的促進細胞部分需要大量的血液，分離的時間也相對長些。
促進細胞占生理性造血細胞源中細胞的約0.5%和8%。象本文所公開的那些分離方法可生產細胞組合物，該細胞組合物含有比天然生理性造血細胞源中所發現的數量更大的促進細胞。例如，提供細胞組合物中至少約30%的細胞是具有上文所述特征的造血促進細胞，和提供了細胞組合物中至少約95%的細胞是具有上文所述特征的造血促進細胞。適當的抗原構記篩選可提供基本上純化的促進細胞群供體內使用。
5.3促進細胞的使用促進細胞在同種異體或異種受體中增強骨髓供體細胞移入的能力說明，可將其用于促進各種涉及移植方法的治療方案中。含有高濃度造血促進細胞的細胞組合物配方提供了一種解決GVHD問題和移入失敗的溶液。另外，除去了T細胞并保留了促進細胞的供體骨髓也可以用于移植。本發明提供了在建立混合的同種異體或混合的異種嵌合免疫系統和完全的同種異體或完全的異種嵌合造血系統方面，使用促進細胞。一般，本發明的方法涉及與MHC特異性供體細胞和任何所需的其它供體骨髓成分(但最好除去T細胞)一起，給受體施用含有純化的促進細胞的細胞組合物。如果需要混合的或完全的同種異體或異種嵌合體，則將含有促進細胞和干細胞的同種或自體細胞組合物與供體細胞組合物一起施用。但是，不需要將促進細胞與自體或同種的其它供體細胞一起用于宿主。同種異體或異種促進細胞可以與MHC匹配的骨髓細胞一起使用以重建受體，而不必共同施用自體或同種供體細胞。
造血促進細胞能夠促進移入干細胞和對促進細胞是MHC特異性的其它骨髓成份。可能持定的種或特定種的特定株具有促進細胞，所述的促進細胞也能促進移入干細胞和按傳統理解，對促進細胞是非MHC特異性的其它骨髓成份。為了方便起見，這些促進細胞稱為通用的促進細胞。含有上述細胞的細胞組合物也包括在本發明內。此外，可能此促進細胞和干細胞在其MHC整體上不必完全匹配。在MHC的Ⅰ型和Ⅱ型基因內，有亞區域。因此，這些區域中的僅一個區域匹配，對于增強干細胞移入的促進細胞來說就足夠了。最好在小鼠中，利用各種商業上可得到的MHC重組近親雜交小鼠品系完成直接針對確定上述重要的MHC亞區域的研究。
一般，純化或部分純化的促進細胞可促進移入對促進細胞是MHC特異性的干細胞，以便提供更高存活率的嵌合免疫系統。干細胞和促進細胞可能來自普通供體或遺傳學上相同的供體。然而，如果供體屬于一個擁有通用促進細胞的種或種的品系，那么干細胞對促進細胞不必是MHC特異性的。用正選擇、負選擇或正和負選擇的結合，分別純化促進細胞，然后，將它們與MHC特異的干細胞和任何所需的其它骨髓成份一起施用給受體，可以除去引起GVHD的T細胞而不用害怕移入失敗。結果，可以達到混合的或完全的或全部同種異體或異種再生。
建立同種異體或異種嵌合免疫系統方法的實施方案包括基本上損壞受體的免疫系統。通過本領域已知的技術可以完成上述方案。這些技術導致基本上全部除去受體的骨髓干細胞。然而，還有一些仍然存活并繼續產生特異性免疫細胞的抗性受體干細胞。這些技術包括，如，用選擇性輻射水平的致死輻射受體、給受體施用特異性毒素、施用附著到毒素或放射性同位素上的特異性單克隆抗體，或這些技術的結合。
從供體的長骨中收集骨髓。對于同種異體嵌合體，供體和受體是同種的;對于異種嵌合供，供體和受體是不同種的。用上文5.2部分中公開的方法，從其它供體骨髓中分離含高濃度促進細胞的細胞組合物，可以從剩余的供體骨髓中分離含有高濃度造血祖干細胞的分離細胞組合物。可以用純化促進細胞的那些技術(但以不同的標記為基礎)完成含高濃度干細胞細胞組合物的分離。最著名的CD34干細胞分離技術包括美國專利No.5，061，620中描述的方法，以及由CellPro，IncorporatedofBothell，Washington生產的獨立的LCLaboratoryCellSeparationSyatem，CD34藥盒。然后最好以任何比例將純化的供體促進細胞組合物和純化的供體干細胞組合物混合。但混合這些細胞組合物不是必須的。
如果用部分或所有在促進細胞上不表達的本文公開的標記，通過負選擇純化促進細胞，那么，所得的細胞組合物將含有干細胞以及促進細胞和其它未成熟的祖細胞。可以用針對T細胞特異性標記的抗體如抗-CD3和抗-TCRαβ特異性地除去GVHD-產生細胞，而剩下的造血促進和干細胞不必進行實質性純化。在上述情況下，這一種細胞組合物可以代替上文所述的含有純化促進細胞和純化干細胞的兩種細胞組合物。
然后將純化的供體促進細胞和純化的供體干細胞施用給受體。如果這些細胞組合物是分開的組合物，則最好同時施用它們，但可以在相當近的時間內分別施用。施用的方式最好但不限于靜脈注射。
一旦施用，認為細胞會回到受體體內各種造血細胞位點，包括骨腔、脾、胎兒或成年人的肝臟和胸腺。細胞在適當的位點扎根。細胞移入并開始建立嵌合系統。由于按傳統的理解，非通用促進細胞必須是MHC特異性的，它們促進干細胞的移入，所以是干細胞和促進細胞結合在一起扎根在適當的移入位點。
同種異體移入或異種移入的水平是一種滴定效應。取決于同種細胞和同種異體或異種細胞的相對數量并取決于受體所處狀態的類型和程度。如果用TCD方法或其它技術已經除去了同種成份的促進細胞，并施用了臨界量的同種異體或異種促進細胞，那么應該發生完全的同種異體或異種嵌合現象。在尋找基本上等水平的同種和同種異體或異種移入。根據受體的具體種類，計算應施用的各種細胞數量。例如，在小鼠中，所施用的除去T細胞的骨髓成份一般在每個受體約1×107個細胞和5×107個細胞之間。在大鼠中，所施用的除去T細胞的骨髓成份一般在每個受體約1×106個細胞和5×106個細胞之間。在人類中，所施用的除去T細胞的骨髓成份一般在每個受體約1×108個細胞和3×108個細胞之間。
在小鼠中，施用的純化促進細胞量最好在每個受體約1.5×105和4×105個促進細胞之間。在大鼠中，施用的純化促進細胞量最好在每個受體約1×106和30×106個促進細胞之間。在人類中，施用的純化促進細胞量最好在每公斤受體約1×106和10×106個促進細胞之間。
在小鼠中，施用的干細胞數量最好在每個受體約100和300個干細胞之間。在大鼠中，施用的干細胞數量最好在每個受體約600和1200個干細胞之間。在人類中，施用的干細胞數量最好在每個受體約1×105和1×106個干細胞之間。所用的特定細胞數量取決于許多因素，包括受體健康狀態。另外，用各種細胞刺激素共同施用的細胞可進一步促進移入。
除總體輻射外，可通過免疫抑制和細胞減弱改變受體的條件，細胞減弱是使用與損壞受體免疫系統相同的技術，包括，如，輻射、毒素、與毒素或放射性同位素結合的抗體，或者這些技術的結合。但是，免疫抑制和細胞減弱時所用的試劑水平或數量基本上比損壞免疫系統時所用的小。例如，基本損壞受體剩余的免疫系統經常涉及用950拉德(R)的總體輻射(TBI)致死輻射受體，無論受體的種屬是什么，該水平的輻射是十分恒定的。用750RTBI可得到相容的異種(大鼠→小鼠)嵌合體，用600RTBI可得到相容的同種異體(小鼠)嵌合體。通過PBL分型和由混合淋巴細胞反應(MLR)和細胞毒素淋巴細胞(CTL)反應確定的耐受性建立嵌合體。
如前文所述，可以用上述公開的方法建立同種異體嵌合體和異種嵌合體。當所述的供體和受體是不同種類時，可以建立異種嵌合體。已經建立了大鼠和小鼠之間、倉鼠和小鼠之間以及黑猩猩和狒狒之間的異種嵌合體。人和其它靈長目之間的異種嵌合體也是可能的。人和其它哺乳動物之是的異種嵌合體同樣是可存活的。
可以理解，雖然上文公開的方法涉及一個受體和一個供體，但本發明包括如所公開的那些方法，其中可以將來自兩個供體的干細胞和純化促進細胞移入一個受體內。
可以理解，通過基本損壞受體的免疫系統或免疫抑制和細胞減弱受體的免疫系統，然后給受體施用含有同種或自體純化的促進細胞和干細胞的細胞組合物，本發明也提供了重建受體造血系統的方法，所述干細胞與促進細胞是MHC相同的。
建立成功的同種異體或異種嵌合體的能力大大提高了移植的存活率。本發明提供了移植供體生理性構件，如器官、組織或細胞的方法。用這些方法在大鼠和小鼠內及其之間功移植的實例包括，如島細胞、皮膚、心臟、肝、甲狀腺、甲狀旁腺、腎上腺皮質、腎上腺髓質及胸腺。受體的嵌合免疫系統是完全耐受供體器官、組織或細胞的，但完全排斥第三方移植物。也就是說，骨髓移植賦予器官、組織或細胞移植物以隨后的耐受性，所述器官、組織或細胞移植物與在先移入的骨髓在遺傳上相同。
移植的供體器官、組織或細胞在受體中足以行使其功能。例如，移植的島細胞能勝任其功能，且由此給糖尿病提供有效的治療。另外，用本發明方法移植的骨髓能消除胰島素-依賴發生前的自身免疫性糖尿病特性。用涉及造血促進細胞的本發明方法，可以成功地完成人和動物這間的固體器官移植。例如，在診斷了疾病或胰島素依賴性發作后，將來自其他種的島細胞移植到人類中以治療人類受體中的糖尿病。來自動物供體如豬、牛、魚的主要器官可以解決目前供體不足的問題。本發明人已經證實在來自遺傳上相同供體的骨髓移植異種嵌合體中，可永久接受內分泌組織移植物(甲狀腺、甲狀旁腺、腎上腺皮質、腎上腺髓質和小島)。因此，用本發明方法建立的混合異種嵌合體或完全異種嵌合體可用于治療內分泌紊亂以及自體免疫，如糖尿病。
本發明的方法涉及用本領域專業人員已知的方法移植特定的供體生理成份，并且與使用移植供體作為純化的供體促進細胞組合物和供體干細胞組合物的供體，在受體中建立嵌合免疫系統結合起來。混合的嵌合免疫系統是優選的。可以在移植前、期間或之后完成建立混合嵌合免疫系統的方法，但最好是在移植前進行，特別是由于，按本文所公開的，免疫抑制和細胞減弱或免疫損壞在嵌合免疫方法中是必需的。公開的方法可用于同種異體移植和異種移植。由于本文公開的方法提供了供體特異性免疫耐受，因此以前對抗供體器官、組織或細胞排異所必需的許多方法就沒有必要了。例如可以用本文公開的方法移植活骨和軟骨。
細胞處理(farming)技術可以提供很容易得到供應的促進細胞、干細胞和遺傳匹配的生理性供體成份。例如可以在體外培養基中繁殖用于得到促進細胞的富集骨髓細胞和/或將其貯存用于將來的移植。同樣可以貯存來自相同供體的細胞材料以便將來用作移植物。
除移植外，建立成功的同種異體或異種嵌合生血系統或建立同種或自體生血系統的能力可以提供始愈由于存在GHVD，目前不能由骨髓移植治療的各種其它疾病或紊亂。自身免疫疾病是指其自身的免疫系統攻擊其器官或組織。在這種疾病中，免疫系統認為器官或組織是外源的。然一旦建立了嵌合免疫系統，機體就會重新認識什么是外源的和什么是自身的。按所公開的那樣建立一個嵌合免疫系統，可以確實地中止引起疾病的自身免疫攻擊。也就是說，按前文所述在免疫抑制和細胞減弱或用同種或自體細胞組合物免疫損壞后，通過重建受害者的免疫系統可以停止自身免疫攻擊。用該方法可以治療的自身免疫疾病包括，如Ⅰ型糖尿病、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化、類風濕性關節炎、牛皮癬和結腸炎。
由于嵌合免疫系統包括來自供體免疫系統的造血細胞，用非缺陷型的供體免疫系統可以減輕受體免疫系統中的缺陷。血紅蛋白病如鐮形細胞貧血、球形紅細胞貧血癥或地中海貧血和代謝紊亂如亨特氏疾病、赫爾勒氏疾病、酶缺損，所有這些均是由受害者造血系統中的缺陷引起的，可以通過使用正常供體的純化供體造血促進細胞和供體干細胞，在受害者中建立嵌合免疫系統來治愈上述疾病。嵌合免疫系統最好應是至少10%的供體源(同種異種或異種的)。
建立成功的異種嵌合體的能力可提供治療或預防病原體-介導的疾病狀態的方法，包括，種特異性抗性起作用的病毒疾病。例如，受滋病是由反轉錄病毒(HIV)感染淋巴造血系統引起的。某些動物，如狒狒具有對愛滋病的天生免疫性或抗性。用狒狒或其它受滋病抗性和/或免疫動物作為供體，通過在受體中建立異種免疫系統，人類受體的造血系統可以獲得供體動物的愛滋病抗性和/或免疫性。使用對引起疾病的特定病原體免疫或有抗性的動物，用上述方法可以治愈或預防其它病原體-介導的疾病。由于在跨種差異的干細胞移入中，促進細胞起主要作用，因此，這種方法取決于骨髓接種物中促進細胞的存在。
已經表明，促進細胞的除去實質上損害了跨越種差異的移入。然而，不理想的方法是，如果施用了足夠的細胞，也可移入未處理的異種骨髓。在這種情況下，可以用衍生細胞的骨髓與或不與富集的促進細胞一起治療或防止愛滋病。以前的研究證實，跨越種屬障礙時，可能發生GVHD。因此，優選的方法是使用含有(經本文所公開的方法)純化的供體促進細胞的細胞組合物或除去T細胞的組合物，建立異種嵌合免疫系統。
此外，一些動物，如狒狒具有對肝炎的天生免疫力或抗性。用本發明的方法，將來自狒狒或其它肝炎抗性動物的肝移植給肝炎患者，其中，用純化的供體促進細胞加上干細胞;在患者體內建立異種嵌合免疫系統，供體肝沒有患肝炎的危險，且受體可以耐受移植物，由此消除需要的非特異性免疫抑制劑。未加工的骨髓或純化干細胞可足夠作為充當造血組織的肝并可含有促進相同供體干細胞移入的促進細胞。
已經發現所建立的混合嵌合免疫系統是抗癌的。(Sykesetal.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87∶5633-5637)。雖然還不了解這種機制，但這可能歸因于由供體和受體免疫系統細胞結合所產生的，免疫細胞腫瘤特異性的多重性。
通常，混合嵌合體是優選的。但在特定的情況下，完全的同種異種或完全的異種嵌合體也是優選的。例如，本發明提供了治療白血病或其它淋巴造血系統惡性腫瘤的方法，包括基本損壞患者的免疫系統并用本文描述的方法建立完全的同種異體嵌合免疫系統。由于患者自身的免疫系統是癌性的，所以最好用非癌性的供體同種異體細胞完全取代同種細胞。
本發明也提供了抗生理性衰老效應的方法。目前的研究表明，衰老與激素變化有關，如，生長激素的降低。這些變化可能導致降低生理性和/或物理化性保護，如抗游離基團的保護。
用本發明的方法，通過移植垂體、垂體和下丘腦或其它內分泌組織可提供恢復的激素水平。
本發明也提供實施基因療法的方法。近期已證明，有時經遺傳方法修飾的自體細胞也可能受到受體的排斥。利用本發明的方法，用造血細胞可在受體中建立嵌合免疫系統，用與遺傳修飾其它移植細胞相同的方法，用遺傳工程方法修飾所述的造血細胞。這將給用遺傳工程方法修飾的細胞提供受體耐受性，無論這些細胞是自體的、同種的、同種異體的或異種的。
應理解，本發明公開了含有純化的促進細胞的細胞組合物、純化促進細胞的方法、建立全部的、完全的或混合同種異體或異種嵌合免疫系統的方法、重建同種免疫系統的方法、利用純化的促進細胞組合物治療或預防特定疾病、病態或紊亂的方法。也應理解，本發明公開了通過施用未純化的促進細胞的異種細胞，治療或預防特定的病原體介導的疾病。
已經在前文描述了用于說明目的的具體實施方案，在未違背權利要求所限定的本發明的范圍情況下，可以完成的大量詳細改變對于本領域專業人員是顯而易見的。
6.實施例除去促進細胞會減弱同種異種骨髓移入6.1材料和方法6.1.1制備混合的同種異體嵌合體為了制備混合的嵌合體，收集來自同種小鼠和同種異體小鼠長骨的骨髓。用CO2麻醉無痛殺死小鼠，用70%乙醇制備，除去長后骨(股骨和脛骨)。用22-規格針，50μl/ml慶大霉素補充的培養基199(Gibco Laporatories Life Technology，Ine Grand Is-land，New York)從骨中沖洗髓。通過18-規格針經緩慢抽吸用培養基混合物(MEM)機械再懸浮骨髓，通過無菌尼龍篩紗網過濾懸浮液。在100rpm經10分鐘離心使細胞成小球，將其再懸浮于MEM，并計數。在標準的同種異體重建中，將RAMB用于T細胞消除(在4℃，30分鐘，以1∶40或適當稀釋成108個細胞/ml)。在MEM中洗滌細胞，以1000rpm旋轉10分鐘，并在37℃再懸浮于豚鼠補體中30分鐘(Gibco Laboratories Life Technology，Ine Grand Island，New York)。將細胞洗滌2次，計數并以適當濃度再懸浮于MEM中以便給每個動物注射1ml的總體積。在輻射受體動物后4-6小時內，用27-規格針徑側尾脈注射細胞。
6.1.2動物從JacksonLaboratory(BarHarbor，Maine)購買6到8周齡的雄性C57BL/loSnJ(B10)、B10.BR/SgSn(B10.BR)和BALB/c小鼠。從HarlanSpragueDawley，Inc.(Indianapolis，Indiana)購買4到8周齡的雄性Fischer34(F344)、ACI和WistarFurth(WF)大鼠。將動物安置在UniversityofPittsburghBiomedicalScienceTower無特定病原體的裝置中。
6.1.3從骨髓中除去細胞子集在完成細胞子集消除后，以相似的方式收集骨髓。用抗-CD4(L3T4，IgD2b，ATCC)、抗-THY1.2(20-20-5IgM;ATCC)和抗-Mac-1(ZgG2b;ATCC)或抗-ⅡIAK型(IgM;ATCC)加上由新西蘭白色退休種兔制備的、并在實驗室預先篩選的兔補體(C′)進行處理。有關抗體處理，在37℃培養45分鐘，接著洗滌并在37℃用C′處理30分鐘;再洗滌2次。使用前用抗體和補體對剩下的細胞進行第二輪清除。
由于抗-NK1.1抗體不固定C′，所以用流式細胞計數法，經負選擇完成NK細胞的清除。以常規的無菌方式收集骨髓，并在加入2%FCS及慶大霉素的Hanks緩沖鹽溶液中用單克隆抗體抗-NK1.1著色。收集與NK1.1抗體不發生顏色反應的細胞部分，并作為NK-負細胞群。
兔-抗-小鼠-大腦(RAMB)是用勻漿小鼠大腦免疫制備的多克隆抗血清。在過去幾十年中，RAMB經常被用作清除T細胞的試劑。
6.1.4用流式細胞計數法描述嵌合體的特征用流式細胞計數法特征性描述用同種、異種、同種異體、同種和異種或同種和同種異體供體淋巴樣成份移植的受體，以確定帶MHC I型(H-2b或H-2k)和Ⅰ型(RtI)大鼠抗-F344[[RtIA′]，WF[RtIAm″]或ACI(RtIA
]表面標記的外周血白細胞(PBL)的百分比。將外周血收集到肝素化的塑料血清小瓶中。完全混合后，在1.5ml室溫淋巴細胞分離培養基(LSM)(Organon Technical，Kensington，Maryland)中將懸浮液分層并在20℃以1700rpm離心30分鐘。從鹽水-LSM分界面吸出啉巴細胞層并用培養基洗滌。紅細胞經ACK-溶解(氯化銨/碳酸鉀溶解緩沖液)并在4℃用適當的單克隆抗體(mAbs)經30分鐘使剩余的細胞著色，并且如果需要，用夾層復染。
用熒光激活細胞分類術(FACS)(FACS Ⅱ Becton Dickinson and Company，Mountain View，California)完成脾和胸腺淋巴樣細胞分析。抗-WF和抗-F344-生物素的單克隆抗體是大鼠的，并用于大鼠細胞的Ⅰ型著色。將抗-H2bmAb(28-8-6S)(IgG2a;HB31;American Type Cucture Couection，Rockvicle，Maryland)用于Ⅰ型著色。將抗-CD4-PE小鼠、抗-THY1、2PE、抗-CD8-FITC小鼠(Becton Dickinson and Company)、抗-TCR-αβ-FITC小鼠(Becton Dickinson and Company)、抗-TCR-αβ-FITC、抗-TCR-γβ、抗-B220(抗B細胞)以及抗-Ⅱ型(IAK或IEK)(Pharmangen，San Diego，California)用于部分細胞著色。
將數據顯示為細胞頻度直方圖，其中在水平軸上表示log熒光明暗度，在垂直軸上表示相對細胞數。用從負和正對照群(B10小鼠和F344大鼠)的對照熒光圖確定的正截距計算用相關mAb著色后，被認為是正性的細胞百分比。另外，通過使用向前及側擴散的流式細胞計數法確定細胞的相對大小和粒度。較小且粒度較低的淋巴細胞和其它細胞位于一個特征區，而較大且更大的顆粒細胞如巨噬細胞和粒細胞位于另一區域。
6.2結論在下列部分描述的實驗利用了一種混合嵌合模型，其中的受體是經致死輻射的并用同種加變化劑量以及經同種異種或異種供體細胞子集移植。將同種異體嵌合體的百分比，即混合嵌合體的水平作為供體細胞移入效率的讀出數據。用TCD同種(宿主型)加TCD同種異體(供體型)骨髓(A+B→A)重建致死輻射的受體，可產生混合的多譜系淋巴生血嵌合體(表1;A組)。若骨髓接種物的唯一同種成份是RAMB的TCD時，則可產生完全的同種異體移入(表1;B組)。因此，TCD不能消除同種骨髓干細胞，但為促進其移入的細胞。
表Ⅰ從混合的骨髓接種物的同種異體成份中消除T細胞或MAC-1細胞對同種異體嵌合水平的影響流式細胞計數分類
5×106RAMB處理的B10細胞+15×106B10.BR細胞→B10宿主。
·是制備的10個實驗組中的一個。所有同種骨髓均是經RAMB處理的。
Ψ在重建后6星期，用PBL確定動物的嵌合體類型。
＊用流式細胞計數沒有峰值。數量已標準化到100%。
由于在同種重建研究中，無論施用未處理的還是TCD骨髓，所移入的細胞數滴定度表明了相似的存活曲線，所以TCD幾乎肯定不是干細胞清除效應。當施用處理的RAMB骨髓或利用抗THY-1單克隆抗體加C′處理時，可得到相似的結果。在使用混合同種異體嵌合體模型的進一步研究中，表明使用單克隆抗體加C′除去CD4+，CD8+，CD4+加CD8+，和MAC-1+的細胞并不會減弱同種異種移入，即產生100%的同種異體嵌合體(表1;C組到F組)。這一發現在臨床上特別重要，表達這些標記的細胞看來引起人、小鼠及大鼠中的GVAD。CD4+細胞、CD8+細胞、B細胞和在很小程度上的NK細胞已經卷入致死和非致死的GVHD。除去這些部分，因此將消除GVHD而不是促進細胞。
通過使用非交叉反應的單克隆抗體或飽和夾層抗體技術(如果得不到抗相同抗體的非阻斷第二抗體)的流式細胞計數法，確定表1中混合同種異體嵌合模型清除的適宜程度。在重建后6星期，用抗-Ⅰ型(H-2K和H-2b)單克隆抗體和PBL，根據同種異體和同種嵌合水平測定受體動物的類型。在2、4和6個月，根據嵌合體動力學，再測定某些動物的類型。
用抗-THY1.2加C′處理同種異體骨髓接種物以除去THY1.2+細胞，會導致促進作用減弱，用代替完全的同種異體移入物的混合型來表示。用抗-THY1.2的效果不如用RAMB的效果顯著，這可能是抗-THY1.2不能完全消除所有THY1.2+細胞造成的。這種處理不能除去同種異體干細胞，因為觀察到了一些同種異體移入物;因此，在施用未處理的骨髓時，必須已經除去所發生的促進作用(表2)。完成每個實驗的補體對照，且結果與未處理骨髓的相似。
表2從混合骨髓接種物的同種異體成份中消除T細胞對同種異體嵌合水平的影響嵌合體同種異體供體(B10.BR)%同種異體序號骨髓的處理 (H-2k)嵌合體1RAMB38.32RAMB40.33RAMB2.44RAMB1.75THY1.282.86THY1.279.47THY1.282.48THY1.279.59THY1.288.810THY1.286.4· 5×106RAMB-未處理的B10細胞+15×106B10，BR細胞→B10宿主。
Ψ用一種顏色流式計數法在PBL上完成分型。完成同型特異性對照。在6個星期中測定嵌合體類型。
在特征性描述促進效應潛力并估計該效應所需細胞數的進一步研究中，進行供體細胞滴定以確定消除促進效應的劑量，此由混合嵌合體或同種再生證明(參見表3A)。施用5×106RAMB處理的同種異體骨髓細胞時，根本不發生同種異體骨髓細胞的移入(表3A;1-4組)，施用5×106未處理的(表3A;15和16組)或CD4清除的(表3A 6-8組)或CD8清除的(表3A，9-11組)，或CD4+CD8清除的(表3A;12-14組)(同種異體骨髓細胞時，100%的動物是完全嵌合的。除去MAC-1+細胞(表3A 17組)或B220+細胞(表3A，19組)時，產生相似的結果。由于除去CD4+和CD8+細胞會富集干細胞，而施用＜5×106的同種異體細胞時，完全的同種異體嵌合現象開始消失。
表3A滴定在混合骨髓移植物的同種異體成份中的細胞數組合物對嵌合水平的影響組動物數B10.BR骨髓的%同種異體嵌合體No處理平均值(范圍)1 6 15×106RAMB-處理的B10.BR 17(2-40)2 5 10×106RAMB-處理的B10.BR 16(0-31)3 5 5×106RAMB-處理的B10.BR 3(0-8)4 5 1×106RAMB-處理的B10.BR 05 4 15×106ThY1-清除的B10.BR 81(80-83)6 5 15×106CD4-清除的B10.BR 97(96-98)7 5 10×106CD4-清除的B10.BR 98(94-100)8 5 5×106CD4-清除的B10.BR 98(94-99)9 5 15×106CD8-清除的B10.BR 100(99-100)10 5 10×106CD8-清除的B10.BR 99(98-100)11 5 5×106CD8-清除的B10.BR 98(96-100)12 7 15×106CD4-加CD8清除的B10.BR 98(96-99)
13 7 10×106CD4加CD8清除的B10.BR 84(6-99)14 7 5×106CD4加CD8清除的B10.BR 81(0-99)15 4 10×106未處理的B10.BR 99(97-99)16 4 5×106未處理的B10.BR 77(47-93)17 5 15×106Mac-1-清除的(Mac-1) 100(99-100)18 2 15×106NK-清除的 99(99)19 5 15×106B-細胞-清除的(B220) 100(99-100)表3B同種異體(B10.BR)細胞子集的負選擇對促進同種異體干細胞移入的影響(5×106RAMB B10+15×106處理的B10.BR→B10)組N混合骨髓接種物同%同種異體供體嵌種異體成份的處理合體平均值(范圍)1 10 15×106RAMB-處理的 50(2-76)2 5 10×106RAMB-處理的 16(0-31)3 8 5×106RAMB-處理的 17(0-30)4 16 15×106未處理的 99(98-100)5 12 10×106未處理的 99(97-99)6 12 5×106未處理的 77(47-93)7 5 15×106CD4-清除的 97(96-98)8 5 10×106CD4-清除的 98(94-100)9 5 5×106CD4-清除的 98(94-99)10 5 15×106CD8-清除的 100(99-100)11 5 10×106CD8-清除的 99(98-100)12 5 5×106CD8-清除的 98(96-100)13 7 15×106CD4加CD8-清除的 98(96-99)14 7 10×106CD4加CD8-清除的 84(6-99)
15 7 5×106CD4加C8-清除的 81(0-99)16 5 15×106Mac-1-清除的(Mac-1) 100(99-100)17 2 15×106NK-清除的 99(99)18 5 15×106B-細胞-清除的(B220) 100(99-100)1.在重建后6星期，用抗-H-2b和抗-H-2kmAb在PBL上，用流式細胞計數分析完成分型。從上次結束那天到4個月將一些動物進行第二次和第三次分型。按我們以前的經驗，對于個體動物，同種異體嵌合的百分比保持穩定。
2.按前述，用總體輻射處理后，全部小鼠均接受5×106RAMB-處理的同種B10加15×106可變處理的同種異體骨髓細胞(5×106RAMB B10+15×106處理的B10.BR→B10)的混合物。用單克隆抗體加兔補體(2個循環)處理完成負選擇研究的代表性總結。
已經報告了自然殺傷(NK)細胞對同種異體骨髓移植物的移入有影響。這些細胞在小鼠中表達THY1和NK1.1標記，在小鼠和大鼠上表達NKRP1，在人中表達CD16和CD56。由于抗-NK1.1抗體不能結合補體，所以用流式細胞計數法負選擇NK1.1+細胞，并將剩余的NK1.1-同種異體骨髓接種物用作供體細胞以便制備混合的同種異種嵌合體。對4個受體中的4人測試接受混合5×106RAMB處理的B10和5×106清除B10.BR的NK1.1骨髓的情況，觀察到完全的同種異體重建(100%B10.BR)，說明促進細胞不是NK細胞。
用抗-Ⅱ(Ⅱ-Ak)型單克隆抗體加補體處理，完成相似的抗體加C′清除。但很清楚，這種方法殺傷的Ⅱ型不如抗-Ⅰ型或針對子集的抗體介導的細胞毒性作用有效。這些數據表明使用mAb加C′的Ⅱ型消除除去了與RAMB相似的方法中的同種異體促進作用。然而，在這種情況下，mAb+C′處理不是最佳方法，所以按下文部分7中的討論，完成使用流式細胞計數法和用于正細胞分類的直接標記的單克隆抗體負選擇實驗。
表4從同種異體骨髓接種物中清除Ⅱ+型細胞對同種異體嵌合水平的影響混合重建動物(5×106RAMB B10+--) No. 繁殖15×106RAMB B10.BR 130 混合的15×106RAMB B10.BR 131 混合的15×106RAMB B10.BR 132 混合的15×106RAMB B10.BR 133 混合的15×106II型-清除的B10.BR 138 同種的15×106II型-清除的B10.BR 139 混合的15×106II型-清除的B10.BR 140 混合的15×106II型-清除的B10.BR 141 混合的10×106II型-清除的B10.BR 142 完全的同種異體的10×106II型-清除的B10.BR 143 同種的10×106II型-清除的B10.BR 144 同種的10×106II型-清除的B10.BR 145 完全的同種異體的5×106II型-清除的B10.BR 146 同種的
5×106II型-清除的B10.BR 148 同種的5×106II型-清除的B10.BR 149 混合的5×106II型-清除的B10.BR 150 同種的1×106II型-清除的B10.BR 151 混合的1×106II型-清除的B10.BR 152 混合的1×106II型-清除的B10.BR 153 混合的1×106II型-清除的B10.BR 154 混合的這些數據表明有關CD4、CD8、串聯排列的CD4和CD8、NK1.1、Mac-1或B220的特異性抗體不能溶解促進細胞。因此，負選擇具有這些標記的細胞可以除去產生GVHD的細胞并富集促進細胞。該過程后，除去至少全部細胞的80%。具有這些標記的細胞負選擇法是一種臨床上可行的保留并富集促進細胞而除去GVHD-產生細胞的方法。使用正選擇的隨后研究表明促進細胞是CD8+(參見下文第7部分)。這些似乎矛盾的結果可能歸因于在負選擇方法中不能完全消除C8+細胞，即，用抗體和補體處理時，在促進細胞表面，沒有足夠的用于細胞毒素作用的CD8分子。因此，用抗-CD8抗體試圖除去產生GVHD的細胞以保留促進細胞，可能不是一個理想的方法。
7.實施例促進細胞的加入可增強同種異體骨髓移入7.1材料和方法7.1.1促進細胞的正選擇用上文實施例6描述的方法，從B10小鼠供體和B10.BR供體中收集骨髓。用上述的RAMB和豚鼠補體清除B10骨髓的T細胞。將B10.BR骨髓再懸浮于每500ml(加入2%FCS的)濃度為70×106個細胞/ml的5ml Hepes(1摩爾)。將細胞離心且隨后加入用MEM+FCS以1∶10稀釋的熒光素共軛的(FITC)抗-Ⅱ型單克隆抗體以處理50×106個細胞/ml。在4℃將細胞培養45分鐘，然后在HBSS+2%FCS混合物作為分類培養基中，以1000rpm經5分鐘洗滌細胞兩次。然后，將細胞再懸浮于培養基中并通過尼龍紗網過濾，用熒光激活細胞分類術(FACS)分析。雙激光系統可提供4個熒光參數和2個光擴散參數以記錄每個所分析的細胞。用光掃描和碘化Propidium著色法可以排除殘留的紅細胞和雙重細胞和殘片。調整對熒光素和藻紅蛋白、熒光素和碘化Propidium空間重疊的抵消。
為了進行細胞分類，在整個分類過程中，將著色樣品一直保持在4℃。將分類滴液收集在含10%FCS的MEM中。經FACS分離細胞群后，用MEM以1∶1稀釋樣品，以1000rpm離心10分鐘，輕輕倒出上清液，將細胞小球再懸浮于0.5ml MEM中。將懸浮液計數并將其調至可用于靜脈注射到致死輻射受體的濃度。在這些研究中，輻射的B10小鼠接受經5×106RAMB處理的B10.BR骨髓細胞+正或負分類的B10.BR部分。進行滴定以確定同種與同種異體骨髓細胞的比率，其中大多數受體增殖為同種細胞或＜10%的同種異體細胞。當RAMB處理的同種骨髓細胞RAMB處理的同種異體骨髓細胞是1∶1(5×106RAMB處理的B10+5×106處理的B10.BR→B10)時，57%的受體再生為同種細胞，而同種異體PBL嵌合體的總平均值是17%。
7.2結果根據上文第6部分描述的負選擇實驗，表明(1)從同種異體骨髓接種物中除去Ⅱ+型種群消除了促進作用，并且(2)單獨施用Ⅱ+型種群不會導致同種異種骨髓的移入，這表明干細胞不是Ⅱ+型。相反，用抗體加補體清除不需要的細胞類型，可以得到最多70-80%純度的促進細胞加干細胞部分，可以用細胞分類器選擇含純度約為96-99%、且細胞存活率＞95%的部分。來自正選擇和加回研究的數據表明促進細胞是Ⅱ+但不是Ⅱ型明亮部分。用電子顯微鏡同時進行的形態學研究將Ⅱ型亮細胞鑒定為淋巴細胞，可能是成熟的B細胞;而促進細胞表現一種獨特的非淋巴樣形態學。因此，可以將Ⅱ型亮部分作為進一步的負選擇標記。
如果在受體中施用來自中間向前擴散口(gate)和低側擴散(淋巴樣)口的Ⅱ型暗/中間的、CD45+、CD45R+或CD8+供體特異性的分類細胞，則安全并重復地發生同種異體干細胞移入的促進作用。然而，具有髓樣口特征的、來自向前和側光擴散圖型的供體特異性Ⅱ型暗/中間的細胞并不促進移入，也不是推測的負性部分。此外，用于相同推測標記分類的，MHC-不同的BALB/C(H-2d)第三組細胞在4個實驗中的4個均不能促進同種異體干細胞移入。
這些數據表明CD8+，CD45+，CD45R+，Ⅱ型亮，Ⅱ型暗/中間的，而不是具有“淋巴樣口”大小和粒度特征的同種異體骨髓細胞群能促進同種異體干細胞的移入。這可能代表一個細胞類型或者一個小的但異源的細胞群。雖然用抗體加補體清除CD8陽性細胞后并不能除去促進作用，但使用用于細胞分類和加回實驗的相同mAb表明，細胞群確定表達C8，但抗體加補體處理顯然不溶解所述細胞群。現有技術中已很了解，抗體清除細胞需要細胞表面存在高密度的相應抗原，因此，抗體不能有效地消除表達低水平抗原的細胞，而可以用相同的抗體結合并正選擇相同的細胞群。
為了得到純度更高的促進細胞群，在各種組合中，結合上述推測的細胞表面標記，完成兩色細胞分類法和加回實驗。象在負選擇和加回實驗中一樣，將5×106RAMB B10加5×106RAMB B10.B骨髓細胞與推測的正或負選擇細胞群一起輸入(表6)。安全并重復地接受匹配量(RAMB處理的)B10.BR骨髓細胞的其它對照組沒有促進作用(n＝196)。用這種方法，可以得到純度范圍在87到99%的細胞部分。促進細胞部分位于“淋巴樣口”中的CD45R+CD8+、Ⅱ+型CD45+部分。在表6的(e)中，用抗-CD4-FITC加抗-CD8-FITC給細胞著色，因此結果包括CD4+CD8-、CD4+CD8+及CD4-CD8+細胞。在一個3色分類研究中，表明促進細胞是CD8+、CD45R+和αβ-TCR-。象50，000個這樣少的分類細胞足以介導促進作用。
促進細胞和樹突狀細胞具有相同的表型標記，但在其它細胞中不同。Ⅱ型和CD45R在促進細胞上的共同表達說明，這樣的細胞代表了部分樹突型譜系細胞。然而，樹突狀細胞呈現一種(明顯區別于本文所述促進細胞的)，細長交指突起和細胞表面表型的典型組織形態學。此外，作為強抗原呈現細胞的樹突狀細胞從未表現出能促進移入。
表5細胞子集的正選選擇和加回對移入促進作用的影響細胞分類實驗(5×106RAMB B10+5×106RAMB B10.B+分類部分)
1.用總體輻射(TBI)處理所有小鼠并使其接受5×106RAMB-處理的B10+5×106RAMB處理的B10.BR骨髓細胞加上骨髓細胞的正或負分類部分(RAMB B10+RAMB B10+分類部分→B10)。為了對照細胞數，對照組接受匹配量的附加(RAMB-處理的)B10.BR骨髓細胞(5×106RAMB B10+5×106RAMB B10.BR+ZRAMB B10.BR→B10)。在這些對照組中沒有發生明顯的促進作用(n＝163)。細胞分類純度從87%到99.1%。每個實驗重復至少兩次。(N是指實驗完成的次數)。在全部實驗中，分類細胞劑量代表了所施用細胞的平均值和范圍(最小→最大)。
2.口(gate)表示中間向前擴散和低側擴散(淋巴樣口)以及高度向前和側擴散(髓樣口)的典型向前和側擴散圖。
3.按上文所述，將PBL嵌合百分比正規化到100%。這表示全部實驗中同種異種嵌合體的平均值(范圍)。
4.表示平均值和范圍(最小-最大)。
表6特征性描述促進細胞細胞表面表型的2個和3個正選擇和加回研究
1.這一組實驗的設計與表5完全一樣(5×106RAMB B10+5×106RAMB B10.BR+分類部分→B10)。用淋巴樣口的向前和側擴散特性特征性完成全部分類。收集兩部分雙陽性和第二單陽性或負性部分。每個值代表一個受體。每個實驗至少做2次。為了對照細胞數，其它對照組接受匹配量的RAMB處理的B10.BR骨髓細胞。如在表5中一樣，在這些對照組中，不發生移入的促進作用。
2.將CD4-FITC和CD8-FITC用于著色。因此，正性部分可能代表CD4+CD8-或CD4+CD8+及CD4-CD8+細胞。
3.在該3色分類中，排除了αβ-TCR-細胞，然后收集兩部分CD45R+CD8+和CD45R+CD8-。
用透射電子顯微鏡分析正分類Ⅱ型暗/中間的細胞群的形態學(圖1)。存在一個直徑約8-10微米的很均一的種群。細胞有一個相對沒有顆粒的周胞質裙和大量在中央部位并稠密堆集的顆粒。大多數這些顆粒有一個使人想起血小板α顆粒的稠密核心。淺裂的核表現出髓樣譜系的特征，但顆粒不同于勻一密度的嗜中性細胞顆粒或嗜曙紅細胞的類結晶顆粒特征。大量高密度顆粒和馬蹄形核的存在使其完全不可能是T細胞或B細胞群，由于淋巴樣細胞有一個具有少量顆粒胞質的圓核和一個高核胞質比率。此外，促進細胞不同于來自骨髓的前體樹突狀細胞或成熟樹突狀細胞。分類為Ⅱ亮型群表現出一種(明顯不同于促進細胞的)成熟T/B淋巴樣細胞群的典型形態學。由于小鼠T細胞不表達Ⅱ亮型，所以Ⅱ型種群很大程度上似乎代表成熟的β淋巴細胞。
總之，通過使用正選擇法和加回實驗，表明促進細胞的特征在于是THY1+、CD4+、CD45R+、Ⅱ暗/中間的型和CD8+。在形態學上，這種細胞不同于淋巴細胞或前面所述的任何其它細胞類型。因此，促進細胞是一種不同的細胞群，它們表達一種特有的白細胞標記組合。很明顯，MHC特異性配體間的相互作用影響同種異體移入的成功。通過對比，B細胞、巨噬細胞/單核細胞、NK細胞、C4+和Ⅱ亮型細胞均不表現促進活性。
8.實施例促進細胞增強異種骨髓移入
8.1材料和方法8.1.1異種的重建動物(A+B→A)在小鼠+大鼠→小鼠嵌合體中，除非另外說明，小鼠接受5×106(消除T細胞的)小鼠骨髓細胞加4×107未處理的大鼠骨髓細胞。用抗TCRαβ抗體加補體完成TCD，或用抗體結合的免疫磁珠達到相似的結果。在小鼠→大鼠嵌合體中，大鼠接受250×106未處理的或處理的小鼠骨髓細胞。
這些情況已經表明，在小鼠+大鼠→小鼠嵌合體中的大多數大鼠T細胞是來自大鼠骨髓干細胞前體，而不是骨髓接種物中污染的T淋巴細胞，由于T細胞成熟是在胸腺的發育調節模型中開始的。另外，在小鼠+大鼠→小鼠嵌合體中的大多數T細胞是小鼠衍生的。制做輻射對照組以確定輻射的適當程度。
8.1.2人髓的收集量從尸體供體的椎骨中得到人骨髓。將椎骨移入用500，000單位多粘菌素、500，000單位桿菌肽和10%人血清清蛋白補充的營養豐富的培養基(Ex-Vivo;Whitacker Company)。將每個椎骨劈成4塊。所有實驗過程在室溫下進行。用rongeur鑿下軟松質骨并將所有東西緩沖搖蕩90分鐘，移出骨髓細胞。每隔10分鐘，使染色的上清液通過雙層篩網(孔大小為420微米;180微米);并加入500ml新鮮培養基。將所有部分混合，以1000rpm離心10分鐘，計數，并再懸浮到20×106個細胞/ml的濃度。用這種技術，每5個椎骨可得到40×109到60×109個細胞。然后按上文，實施例6中所述，進行流式細胞計數以確定其表型。
8.2結果促進細胞對跨越種障礙的骨髓移入，如大鼠→小鼠或小鼠→大鼠，有相似的作用。當大鼠骨髓是使用兔-抗-大鼠腦(RARB)清除的TCD時，致死輻射的小鼠受體不能重建并產生100%的死亡率。如果施用未處理大鼠骨髓或除去CD4++CD8+細胞或αβ-TCR正細胞的大鼠骨髓時，要以完成重建并且＞90%的受體可存活180天以上。應注意，大鼠促進細胞可能是CD8+，與相應小鼠細胞的表型相似。因此，使用抗-CD8的負選擇觀察到的結果，可能再次歸因于它們不完全消除。由于使用免疫磁珠清除這些細胞后，不能消除促進作用，因此，有關異種移入的促進細胞是αβ-TCR-和CD4-。
已經發展了一種從人椎骨中可分離大量骨髓細胞的技術。使用與用于嚙齒類相似的技術完成骨髓細胞的單克隆抗體染色以便鑒定相應的細胞群。用FACS分析人骨髓的向前擴散和側擴散圖鑒定的細胞認為在表型方面與嚙齒類骨髓中的促進細胞相似。
完成2色染色以使檢驗相似的細胞群是否是Ⅱ亮型、Ⅱ中間和暗型、B細胞譜系(LEU12)負，各種CD45異構和T細胞標記負。在這些研究的其中之一，在染色前用骨髓的密度梯度分離以富集不同密度的細胞群。表明人骨髓含有與嚙齒骨髓促進細胞相似的Ⅱ型正、B細胞譜系標記負細胞群。另外，也看見過Ⅱ亮型、B細胞群。
為了確定存在于人骨髓中的(與嚙齒類促進細胞具有細胞表面標記相似性的)細胞部分是否能增強人骨髓干細胞的移入，使用一種混合異種嵌合體(小鼠+人→小鼠)模型。制備嵌合體，其中將TCD同種(B10小鼠)加未處理的人(80×106個細胞)施用給用950拉德總體輻射處理的受體。重建后1星期，處死動物，并分析它們的骨髓、脾和胸腺組織是否存在帶細胞表面標記HLA-DR(Ⅱ型)、CD4、CD8、CD19和CD14的人細胞。在骨髓中存在混合人嵌合體的證據(＜10%)，在脾中存在＜5%的嵌合體。在接下來的4個月中，動物骨髓中繼續有低但可檢測水平的人細胞。在小鼠中觀察到的低水平嵌合體和并不存在的人血細胞，可能歸因于在宿主中人血細胞不能應答小鼠的細胞刺激素。因此，同時施用特定的生長因素如白細胞介素-1和3、各種菌落刺激因子、干細胞因子和促紅細胞生成素可能會保證人細胞在小鼠中的生長和成熟。另外，可以用其它動物，如在系統發育上比嚙齒類與人更近的狒狒檢驗存在推測的促進細胞的情況下，在人骨髓細胞異種移入方面的促進作用。
9.實施例混合的同種異體嵌合體預防自體疫糖尿病和反向胰島炎9.1材料和方法9.1.1小鼠自體免疫模型從TaconicLaboratories得到非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠，并安置在PittsburghCancerInstitute的無病厚體裝置中，6個月末，雌性NOD小鼠以65%的比率發生自發的急性發作糖尿病，8個月時，發病率為80%。6個星期時，檢測的所有動物均為胰島炎。為了建立混合的同種異體嵌合體，用同種骨髓細胞加上來自B10.BR或AKR小鼠的同種異體骨髓細胞移植致死輻射的NOD小鼠。在重建后的特定時間點完成這些動物的免疫組織化學分析。
9.2結果用本文描述的混合嵌合模型防止NOD小鼠發生糖尿病。用同種異體骨髓細胞移植的上述小鼠，直到7個月時呈現混合的同種異體嵌合現象并且在所有檢測動物中可防止糖尿病的發作。重建后5個月時，小鼠的免疫組織化學分析表明小島沒有胰島炎。相反，僅用同種骨髓細胞重建的13個小鼠中的4個發生了急性糖尿病并且所有的小鼠均有胰島炎。這些結果表明選擇性清除造成GVHD的T細胞并保留可增強同種異體骨髓移的促進細胞的能力提供了給各處疾病狀態移植骨髓的廣闊前景，由于GVHD，目前所述各種疾病狀態不適合于該模型。同時施用造血促進細胞和干細胞也可能使受體受到較低侵害性的細胞減弱以便進行移入。用該模型可治療的疾病包括但不限于自體免疫病、免疫缺陷型和病毒感染，如愛滋病。
本發明并不限于所舉證的實施方案，這些實施方案是為了說明本發明的具體方面。根據前文的描述和附圖，除本文所示和描述之外，本發明的各種改變對于本領域專業人員是顯而易見的。上述改變也包括在所附權利要求的范圍內。
本文引述的所有公開文獻均全文引入本文作為參考。
權利要求
1.表現LHY1+和MHCⅡ+型表型的分離的哺乳動物促進細胞，它們能夠促進供體骨髓細胞在受體中的移入。
2.權利要求1的造血促進細胞，其MHCⅡ型的表達是在暗淡或中間范圍內，由抗體著色和流式細胞計數法確定。
3.權利要求2的造血促進細胞是CD8+。
4.權利要求3的造血促進細胞是CD45+。
5.權利要求4的造血促進細胞是CD45R+。
6.權利要求1的造血促進細胞對于B細胞、T細胞、單核細胞/巨噬細胞和自然殺傷細胞標記是陰性的。
7.一種細胞組合物，含有表現為THY+和MHC Ⅱ+型表型的造血促進細胞，能促進供體骨髓在受體中的移入。
8.權利要求7的細胞組合物，其中造血促進細胞是基本上同型的種群。
9.權利要求8的細胞組合物，其中促進細胞在暗淡中間范圍內表達MHCⅡ型，由抗體著色和流式細胞計數法確定。
10.權利要求9的細胞組合物，其中造血促進細胞是CD8+。
11.權利要求10的細胞組合物，其中造血促進細胞是CD45+。
12.權利要求11的細胞組合物，其中造血促進細胞是CD45R+。
13.權利要求7或8的細胞組合物，對于B細胞、T細胞、單核細胞/巨噬細胞和自然殺傷細胞標記是陰性的。
14.一種分離哺乳動物造血促進細胞的方法，包括使混合的造血細胞群經抗Thy-1、MHCⅡ型、CD8、CD45或CD45R或其混合物的抗體進行親和分離。
15.一種分離哺乳動物造血促進細胞的方法，包括使混合的生血細胞群經抗B細胞、T細胞、單核細胞/巨噬細胞和自然殺傷細胞標記的抗體進行負選擇。
16.權利要求14或15的方法，其中首先用密度梯度離心分離混合的造血細胞群以得到在單核細胞部分中的細胞。
17.權利要求14或15的方法，其中促進細胞是從骨髓中得到的。
18.權利要求14或15的方法，其中促進細胞是從胸腺中得到的。
19.權利要求14或15的方法，其中促進細胞是以外周血中得到的。
20.權利要求14或15的方法，其中促進細胞是從胎兒的肝中得到的。
21.權利要求14或15的方法，其中促進細胞是從胚卵黃囊中得到的。
22.一種使用造血促進細胞重建哺乳動物骨髓的方法，包括給受體施用有效量的促進細胞加骨髓細胞。
23.權利要求22的方法，其中用總體輻射處理受體。
24.權利要求22的方法，其中用免疫抑制劑處理受體。
25.權利要求22的方法，其中用細胞減弱劑處理受體。
26.權利要求22的方法，其中經靜脈內施用所說的細胞。
27.權利要求22的方法，其中受體是人。
28.權利要求22的方法，其中受體患自體免疫疾病。
29.權利要求28的方法，其中自體免疫疾病是糖尿病。
30.權利要求28的方法，其中自體免疫疾病是多發性硬化。
31.權利要求28的方法，其中自體免疫疾病是系統性紅斑狼瘡。
32.權利要求32的方法，其中受體是人免疫缺陷性病毒感染的。
33.權利要求22的方法，其中受體是由肝炎病毒感染的。
34.權利要求22的方法，其中受體患造血性惡性腫瘤。
35.權利要求22的方法，其中受體患貧血。
全文摘要
本發明涉及哺乳動物造血促進細胞，尤其是涉及造血促進細胞的分離、特征描述以及使用。通過其形態學、細胞表面表型和在體內的功能，可以將本發明的促進細胞與其它已知的骨髓細胞區分開。當與包括造血干細胞的其它骨髓細胞一起共同施用給受體時，促進細胞能增強它們的移入，而沒有明顯不利的生物學活性。因此，促進細胞可以有廣泛的應用，包括但不限于，經骨髓移植進行造血重建以治療癌癥、貧血、自體免疫、免疫缺陷、病毒感染和代謝紊亂以及其在促進固體器官移植方面的潛在效用。
文檔編號A61P43/00GK1091955SQ9311687
公開日1994年9月14日 申請日期1993年7月10日 優先權日1992年7月10日
發明者S·T·伊爾斯塔, R·L·西蒙斯, C·里科迪, S·M·倫, C·考夫曼 申請人:匹茲堡大學