破壞或抑制不需要的細(xì)胞或組織生長的方法

專利名稱：破壞或抑制不需要的細(xì)胞或組織生長的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種將電離輻射和某種苯并卟啉衍生物(BPD)，較好的化合物是苯并卟啉衍生物-一元酸環(huán)-A(BPD-MA)，結(jié)合起來使用，從而導(dǎo)致摧毀病態(tài)的或不需要的細(xì)胞或組織的方法。更具體地，本發(fā)明是這樣一種方法，其中將敏化劑化合物施用于病態(tài)的或不需要的細(xì)胞或組織，并用離子輻射(如60Co或χ-射線源產(chǎn)生的)進(jìn)行照射。用苯并卟啉衍生物看來能使靶細(xì)胞或組織敏化，這樣它們不會(huì)輕易地從輻射中復(fù)蘇過來。此外，該方法也可用來降低施用于特定靶組織的輻射有效劑量。
在治療病態(tài)的組織中將各種苯并卟啉衍生物與輻射(無論是可見光輻射還是電器輻射)結(jié)合使用是已知的。這些治療方法常常是對(duì)腫瘤有選擇性的，因?yàn)樵谀[瘤組織中許多卟啉衍生物的積累量可達(dá)到更高的濃度，超過了正常組織。
卟啉衍生物已用于采用光動(dòng)力治療(PDT)方法的腫瘤治療中。通常，PDT療程包括對(duì)靶組織施用敏化劑化合物，例如卟啉衍生物；然后用光處理該組織。通過產(chǎn)生單重態(tài)氧(Singletoxygen)和活化分子，而這些單重態(tài)氧和活化分子會(huì)破壞位于直接區(qū)域的組織，這樣PDT療程能選擇性地消滅位于光源的直接區(qū)域的病態(tài)組織。選擇性的得到是通過光敏化劑在快速代謝的組織中被優(yōu)選地保留而達(dá)到的，例如在腫瘤(Kessel,David,"TumorLocalizationandPhotosensitizationbyDerivativesofHematoporphyrin.AReview"IEEEJ.QUANTUMELECTRON.,QE23(10)1718-20(1987))，病毒感染的細(xì)胞(J.Chapmanetal,."InactivationofVirusesinRedCellConcentrateswiththePhotoSensitizerBenzoporphyrinDerivative(BPD)",TRANSDUSION31(suppl)47SAbstractS172,(1991)andJ.Northetal.,"ViralInactivationinBloodandRedCellConcentrateswithBenzoporphyrinDerivative",BloodCells,18129-140(1992))，白血病細(xì)胞(leukaemiccells)(C.H.Jamieson,"PreferentialUptakeofBenzoporphyrinDerivativebyLeukaemicversusNormalCells",Leuk.Res.(England)1990,14(3),pp209-210),牛皮癬斑(psroiaticplaque)(M.W.Rernsetal,"ResponseofPsoriasistoRedLaserLight(630nm)FollowingSystemicInjectionofHematoporphyrinDerivative"LasersSurgMed.1984,4(1)pp73-77),和動(dòng)脈粥樣硬化斑(atheroscleroticplaque)(S.Andersson-Engelsetal,"FluorescenceDiagnosisandPhotochemicalTreatmentofDiseasedTissueUsingLasersPartⅡ",Anal.Chem.62(1),19A-27A(1990).由此可見光導(dǎo)致的光敏化劑的活化僅發(fā)生在可見光存在的地方。很明顯，由光敏化劑導(dǎo)致的組織的破壞僅發(fā)生于所期望的治療部位。失活的光敏化劑是無毒的并且最終會(huì)從體內(nèi)消除出去。
在典型的PDT治療中，將PHOTOFRIN porfimer鈉鹽，BPD或BPD-MA注入病人體內(nèi)。參見，例如Ho et al.,"Activity and Physicochemical Properties of PHOTOFRIN ",Photochemistry and Photobiology,54(1),pp83-87(1991)；授于Dougherty等人的U.S.Pat.No.4,866,168。合適的劑量是，例如0.25-2.5mg/kg體重，取決于病組織和選用的光敏化劑。在施用光敏化劑后適當(dāng)?shù)臅r(shí)候，用適當(dāng)波長(對(duì)PHOTOFRIN 為630nm；對(duì)BPD為690nm)的光源照射病組織或部位，以活化光敏化劑。這種活化的藥物誘導(dǎo)形成單重態(tài)氧和自由基，它們會(huì)破壞周圍的組織。病態(tài)組織和供養(yǎng)它的脈管系統(tǒng)都會(huì)受影響，而不需要的組織或者直接被破壞，或者因?yàn)檠艿拈]塞而得不到氧氣和營養(yǎng)。在PDT治療結(jié)束之后，被治療的組織壞死，并且將被自然地清除掉或者由臨床醫(yī)生清除掉。
血卟啉和PHOTOFRIN 在630nm附近有吸收光譜。絕大多數(shù)的血液和組織的吸收光譜同樣位于該相同的普通光譜區(qū)域內(nèi)。因此，絕大多數(shù)施加于被治療組織的能量被組織本身所吸收，從而事實(shí)上，限制了使用血卟啉和PHOTOFRIN 進(jìn)行PDT治療時(shí)所能達(dá)到的物理深度。BPD-MA的吸收光譜的峰值在更長波長處，例如690nm。這些化合物被視為PDT療法的改進(jìn)，因?yàn)榻M織不吸收那么多的光能，從而使得光穿透的深度得以增加。
盡管，對(duì)于體積大或位置深的腫瘤，或分布性廣的疾病，用PDT治療受到了光穿透深度只及數(shù)厘米的限制。本發(fā)明所要求的使用電離輻射將能治療位于比PDT療程中深得多的深度處的病態(tài)的或不需要的組織。
本發(fā)明的方法的另一優(yōu)點(diǎn)在于，苯并卟啉衍生物能比血卟啉和PHOTOFRIN 物質(zhì)更快速地從體內(nèi)清除掉。BPD在數(shù)天內(nèi)排出體內(nèi)；血卟啉和PHOTOFRIN 物質(zhì)可以保留數(shù)周，才排出病人的皮膚，使病人易在此期間被太陽曬傷(sun burn)。
在PDT中用γ-射線或χ-光替代可見光，經(jīng)調(diào)查有混合效應(yīng)。有時(shí)，卟啉似乎保護(hù)細(xì)胞免受輻射，有時(shí)卻使這些細(xì)胞更敏感，而有時(shí)這些化合物根本不起作用。
Mack等人于Cancer(1957)294529-39指出，在輻射治療之前注射血卟啉的病人的耐輻射能力有所提高，但是與單獨(dú)輻射治療的病人相比生命沒有延長。
Novosel′tsevaetal.,Radiobiologiia(1979)19(2):297-301,測試了人工合成的卟啉的輻射保護(hù)效應(yīng)。
但是，Cohenetal.,CancerResearch(1966)26Part1:1769-1773報(bào)導(dǎo)，在小鼠中血卟啉提高了橫紋肌內(nèi)瘤對(duì)χ-射線的敏感性。與銅復(fù)合的血卟啉不表現(xiàn)這種增加。
Schwartzetal.,DiagnosisandTherapyofPorphyrinsandLeadIntoxication(1976)pp229-31，顯示了在治療Katsumi狗腫瘤及多種人腫瘤中使用銅血卟啉作為輻射敏化劑。
Kostron et al.,Cancer,5:964-970和Kostron et al.,Jour.of Neuro-Onc.(1988)6185-191，都討論了用光或用60Co或者兩者的組合使用時(shí)，血卟啉衍生物在大鼠gloime模型中的效應(yīng)。沒有揭示在施用卟啉物質(zhì)之前進(jìn)行輻射。
O′Haraetal.,Int.J.RadiationOncologyBiol.Phys.(1989)16:1049-1052，討論了一組水溶的、中間取代的金屬卟啉與離子輻射結(jié)合，對(duì)于不同的腫瘤組織的效應(yīng)。
在Bellnieretal.,Int.J.Rad.Biol.(1986)50:659-664中可以找到相反的教誨。該文獻(xiàn)舉出了γ-射線的作用機(jī)理與HPO光敏化并不相互作用的證據(jù)，以及HPO并不增加χ-射線的效果的證據(jù)。
同樣，F(xiàn)ieletal.,Res.Comm.Chem.Path.andPharm.(1975)10(1):65-76發(fā)現(xiàn)，與預(yù)先輻射相比，在輻射之后加入時(shí)，中卟啉(mesoporphyrins)的金屬螯合物在淋巴細(xì)胞系中是部分有效的。
本發(fā)明是一種通過用BPD，較好是BPD-MA，和輻射共同治療組織，從而降低治療所需的輻射量，并增加放射治療病態(tài)的或不需要的組織的靈敏度和安全性的方法。典型的，BPD在輻射步驟之前施用于組織，但是在某些情況下，BPD可以在輻射步驟之中或之后施用，如果在輻射之后短時(shí)間內(nèi)該藥物便存在于細(xì)胞的表面的話。


圖1顯示了用于治療病態(tài)組織的多種卟啉的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖2顯示了用于治療病態(tài)組織的各種BPD輻射敏化劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖3A，3B和3C顯示了在體外用PHOTOFRIN 接著使用電離輻射治療腫瘤細(xì)胞[(P815和M1)和正常細(xì)胞(3905A)]的結(jié)果。
圖4A，4B和4C顯示了在體外癌細(xì)胞存活中若干可變參數(shù)的效應(yīng)。
圖5A，5B和5C顯示了在輻射之后接著施用PHOTOFRIN 血卟啉或本發(fā)明的BPD-MA對(duì)腫瘤細(xì)胞生存率的體外效應(yīng)。
圖6A和6B顯示了用不同的BPD-MA治療腫瘤的生長的體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果。
圖7顯示了在DBA/2小鼠的體內(nèi)試驗(yàn)中，先用輻射及隨后BPD-MA治療對(duì)體內(nèi)P815腫瘤的生長的效應(yīng)。
圖8顯示了先用BPD-MA及隨后輻射對(duì)DBA/2小鼠脾中的P815細(xì)胞存在的效應(yīng)。
本發(fā)明之方法包括對(duì)病態(tài)的或不需要的組織施用BPD，BPD-MA或它們的等價(jià)物，然后用電離輻射對(duì)該組織進(jìn)行照射。因?yàn)橛肂PD或BPD-MA處理使得這些組織敏化，所以電離輻射可以在相對(duì)較低的劑量范圍內(nèi)施用。
本發(fā)明所用的輻射敏化劑是那些具有如圖1和圖2所示的化學(xué)式(formulas)的物質(zhì)，尤其是那些在圖2中所示的，最佳的是BPD-MA。這些化合物是眾所周知的并能輕易合成。
在本發(fā)明中有用的化合物的特定制劑或者它們的前體，在授于Levy等人的美國專利No.4,920,143中。正如在該專利及出版物所示，原卟啉-IX二甲基酯，當(dāng)和諸如四氰乙烯之類的強(qiáng)狄爾斯-阿德耳(Diels-Alder)親二烯體試劑反應(yīng)時(shí)，被衍生成氫化二苯并衍生物(hydrodibenzoderivative)。但是，當(dāng)乙炔被更弱的吸電子基衍生，并且用作Diels-Alder試劑時(shí)，形成氫化單苯并衍生物。當(dāng)產(chǎn)物直接從原卟啉和例如二甲基乙炔二羧酸酯(DMAD)的反應(yīng)中產(chǎn)生時(shí)，可以生成圖1中分子式1和2所示的化合物。在圖1中，R1和R2代表原來位于乙炔衍生的Diels-Alder試劑R1C≡CR2上的取代基。通常，R1和R2是低級(jí)烷基，芳基，烷基磺?；?，或取代的芳基；盡管較佳地它們是烷氧甲?；?即烷氧羰基)，如如甲氧甲?；蛞已跫柞；?。R3代表存在于反應(yīng)中所用的卟啉上的取代基或者從其衍生而來的取代基。通常，R1和R2是各自獨(dú)立的中等的吸電子取代基，而且更常見的是烷氧甲酰基，烷基或烷基磺?；?，或者其他任何活化的取代基(它們不具有足夠的從而能輕易地使A環(huán)和B環(huán)一起反應(yīng)而不是僅與其中之一反應(yīng)的吸電子能力)。R1和R2中的一者可以任選地為H，而另一者是具有足夠強(qiáng)度的吸電子取代基從而便于Diels-Alder反應(yīng)的進(jìn)行。
正如此處所用，羧基是-COOH，而烷氧甲?；?即烷酯基)是-COOR，其中R為烷基。烷基是1-6個(gè)碳原子的飽和的碳?xì)浠衔?，如甲基，乙基，異丙基，?已基，2-甲基戊基，叔-丁基，正-丙基及類似基團(tuán)。芳基或烷基磺?；糠志哂蟹肿邮絊O2R-，其中R為如上定義的烷基或者為芳基，其中芳基為苯基(例如苯基磺?；?SO2Ph))，任意地用1-3個(gè)各自獨(dú)立的取代基所取代的苯基，取代基選自鹵素(氟，氯，溴或碘)，低級(jí)烷基(C1-C4)或低級(jí)烷氧基(C1-C4)。此外，一個(gè)或多個(gè)R1或R2其自身可以是芳基，即是如上所述的任意取代的苯基。
此外，一個(gè)或多個(gè)酯化的羧酸基團(tuán)可以被水解。
如圖1所示，由R1C≡CR2與原卟啉-Ⅸ環(huán)系統(tǒng)反應(yīng)而形成的加合物(R3是2-羧基乙基的被保護(hù)形式，例如2-甲氧乙?；?-乙氧乙?；?；R4是CHCH2)是式1和式2之化合物，其中式1化合物得自對(duì)A環(huán)的加成，式2得自對(duì)B環(huán)的加成。在這些得到的式1和式2產(chǎn)物中，R4仍是CHCH2，但是，這個(gè)乙烯基團(tuán)因?yàn)闀?huì)加成于或者氧化式1中的B環(huán)或式2中的A環(huán)的乙烯環(huán)取代基，所以易于衍生成其他形式。加成產(chǎn)物可以被進(jìn)一步取代，如果加入的取代基在功能上是親核的，例如，Br可以被-OH，OR(R是C1-C6烷基，如前所述)，或-NH2，-NHR，-NR2等取代。在較佳實(shí)施例中，加入的取代基中的一種是氫，而另一種選自鹵素(氟、氯、溴或碘)，羥基，低級(jí)烷氧基，氨基或酰氨基，巰基或有機(jī)硫化物。或者另一種自身也可以是氫。因此，這些化合物含有如R4那樣不同的基團(tuán)，正如下面將進(jìn)一步描述的那樣。
原卟啉Ⅸ中的R3是2-羧基乙基(-CH2CH2COOH)。但是，R3的本質(zhì)(除非它含有π-鍵)通常并不與Diels-Alder反應(yīng)的進(jìn)程有關(guān)。例如，R3可以是低級(jí)烷基(C1-C4)，或ω-羧基烷基或烷酯基-烷基(C2-C6)。R3取代基也可以被上述的鹵素或其他非反應(yīng)性的取代基取代。但是，因?yàn)橛糜诒景l(fā)明的許多種化合物的便利的原料是天然生成的卟啉，所以R3的所期望的取代基是-CH2CH2COOH或-CH2CH2COOR，其中R是烷基(C1-C6)。
應(yīng)當(dāng)注意，盡管R3取代基的本質(zhì)使其通常不會(huì)通過改變二烯底物的性質(zhì)而影響Diels-Alder反應(yīng)的進(jìn)程，但是衍生反應(yīng)有必要通過提供合適的溶解性或者防止干擾反應(yīng)，從而促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。
在某些化合物中，發(fā)現(xiàn)使-CH2CH2COOR中的酯化的羧酸基團(tuán)水解或部分水解很有好處。水解速度遠(yuǎn)大于R1，R2的酯基團(tuán)的水解速度，而且生成的化合物的溶解性和生物學(xué)特性比那些未水解形成的更合乎要求。水解反應(yīng)產(chǎn)生二元酸或一元酸產(chǎn)物。
能從引用的文獻(xiàn)中描述的Diels-Alder反應(yīng)中直接得到的氫化單苯并卟啉，也可以用適當(dāng)?shù)脑噭┨幚矶怪悩?gòu)化，例如用溶于二氯甲烷中的三乙胺(TEA)或者1，5-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一碳-5-烯(DBU)，形成圖1中式3和式4所示的同分異構(gòu)體化合物。產(chǎn)物的立體化學(xué)可以通過選用試劑所確定出。
在圖1中的化合物3和4中的描繪并沒有顯示相對(duì)于R2取代基的環(huán)外甲基基團(tuán)的相關(guān)位置(式1的A環(huán)和式4的B環(huán))。用TEA重新排列產(chǎn)生對(duì)角向的甲基和R2為順式的幾何異構(gòu)體，而用DBU處理產(chǎn)生反式產(chǎn)物。顯而易見，順式產(chǎn)物是動(dòng)力控制的，因?yàn)橛肈BU處理順式產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致進(jìn)一步的重新排列，從而產(chǎn)生通常更穩(wěn)定的反式立體化學(xué)異構(gòu)體。因此，圖1中式3和4顯示了分別由TEA或DBU催化導(dǎo)致A環(huán)和B環(huán)重排時(shí)通常得到的重排產(chǎn)物。
此外，Diels-Alder產(chǎn)物能被選擇性還原，例如存在位于活性炭上的鈀時(shí)用氫處理，從而得到飽和的環(huán)類似物，如圖1中式5和6所示，分別對(duì)應(yīng)于A環(huán)和B環(huán)的Diels-Alder產(chǎn)物。
上述對(duì)式1和式2化合物的，有關(guān)通過轉(zhuǎn)化保留的乙烯取代基(R4)而衍生的描述，以及對(duì)-R3易變性的描述，同樣可以用于式3，4，5和6化合物。
式3和式4化合物，尤其那些在R3中具有水解的或部分水解的烷酯基基團(tuán)的，可以以游離酸形式制備，或者以與有機(jī)或無機(jī)堿形成的鹽的形式制備。
應(yīng)注意，圖1的許多化合物含有至少一個(gè)手性中心，因而有光學(xué)異構(gòu)體存在。本發(fā)明的結(jié)合物及方法包括具有兩種手性碳原子構(gòu)型的化合物，無論其是以單一的立體異構(gòu)體的分離物或是以對(duì)映體和/或非對(duì)映體的混合物的形式提供。非對(duì)映體混合物的分離可以用任何傳統(tǒng)的方式實(shí)現(xiàn)；對(duì)映體混合物的分離可以通過常用的技術(shù)，即將其與任意的活性(active)制劑進(jìn)行反應(yīng)，然后分離得到的非對(duì)映體，此外也可以使用手性載體(supports)進(jìn)行色譜層析分離。
還應(yīng)指出，反應(yīng)產(chǎn)物可以是未分離的A環(huán)和B環(huán)的混合物，例如式1和式2的混合物，或式3和式4的混合物，或式5和式6的混合物。或者是分離的形式，即單獨(dú)的式3或單獨(dú)的式4，或者是以任何比率混合的混合物，都能用于此處提及的診斷和治療方法中。
名稱“二氫”-單苯并卟啉描述了卟啉環(huán)系統(tǒng)與R1C≡CR2的Diels-Alder反應(yīng)的直接和重排的產(chǎn)物；“四氫”-單苯并卟啉描述前述的式5和式6的還原產(chǎn)物；“六氫”-單苯并卟啉描述含有被完全還原的環(huán)外的“苯并”環(huán)的類似物。通常，用氫化-單苯并卟啉包括所有三類氧化狀態(tài)。
此外，本發(fā)明涉及使用圖1所示的化合物，其中R1和R2如上所定義，每個(gè)R3各自地為-CH2CH2COOR3′，其中R3′是H或烷基(1-6C)。
R4是CHCH2，CHOR4′，COOR4′，CH(OR4′)CH3，CHCOR4′CH2OR4′，-CH(SR4′(SR4′)CH3，-CH(NR4′)CH3，-CH(CN)CH3，-CH(COOR4′)CH3，-CH(OOCR4′)CH3，-CH(鹵代)CH3，和-(CH(鹵代)CH2(鹵代)，其中R4′是H，烷基(1-6C)，或所示的＜12C的有機(jī)基團(tuán)的衍生物，和其中當(dāng)R4是CHCH2時(shí)，兩個(gè)R3不能是2-烷氧甲酰乙基。
式3和式4化合物，及其混合物都是合適的；正如那些R1和R2相同并且是烷酯基(尤其是甲酯基和乙酯基)的化合物；同樣合適的還包括那些R4是-CHCH2，-CH(OH)CH3，或-CH(鹵代)CH3的化合物。
圖1中各式所示的化合物包括那些R4是通過加成于起初的原卟啉產(chǎn)物的乙烯基團(tuán)而形成的。因此，R4可以是任何在流暢的加成反應(yīng)中的取代基。因此，兩種加入的取代基可以是，例如，OH或鹵素(halo)，而且這些取代基可被進(jìn)一步取代。
乙烯基也可被氧化得到如CH2OH、-CHO，或-COOH及其鹽和酯之類的R4。
因此，通常，R4代表任何取代基，而乙烯基團(tuán)，-CH＝CH2，能輕易地通過氧化或加成而轉(zhuǎn)變成該R4取代基。典型的R4取代基包括 CH(OH)CH3，-CHBrCH3，-CH(OCH3)CH3，-CH(溴化吡啶鎓)CH3，-CH(SH)CH3及其二硫化物，-CHOHCH2OH，和-CHO.
圖2顯示了本發(fā)明的4種特別優(yōu)選的化合物。這些化合物是綜合地指定的苯并卟啉衍生物(BPD)，并是具有圖1中式3或式4的化合物的形式。這些物質(zhì)是式3和式4的重排產(chǎn)物的水解或部分水解的形式，其中兩個(gè)被保護(hù)的R3的羧基基團(tuán)中一個(gè)或兩個(gè)被水解。R1和R2處的酯基團(tuán)的水解相對(duì)較慢，從而能輕易地轉(zhuǎn)變成圖2中所示的形式。
出于說明的目的，R3為-CH2COOR3′。正如圖2所示，在優(yōu)先的化合物BPD-DA中每個(gè)R3′是H，R1和R2是烷酯基，而衍生發(fā)生在A環(huán)；BPP-DB是當(dāng)衍生發(fā)生在B環(huán)時(shí)的相應(yīng)化合物。BPD-MA代表BPD-MA的部分水解形式，而BPD-MB是衍生發(fā)生在B環(huán)時(shí)的相應(yīng)化合物。BPD-MA代表BPD-DA的部分水解形式，而BPD-MB是BPD-DB的部分水解形式。因此，在這些后者的化合物中，R1和R2是烷酯基，一個(gè)R3′是H而另一個(gè)R3′是(1-6C)烷基。式BPD-MA，BPD-MB，BPD-DA和BPD-DA和BPD-DB之化合物都可用于本發(fā)明方法。
另一方面，本發(fā)明涉及圖2中所示的各式的化合物，其中R1和R2是烷酯基，尤其是甲酯基或乙酯基。
正如上面所指出的，尤其優(yōu)選的是那些R1和R2是烷酯基，尤其甲酯基或乙酯基的BPD-MA的衍生形式。在每一個(gè)例子中，R1和R2的一個(gè)或另一個(gè)可以是H。
BPD-MA也可以與特定的與靶目標(biāo)有反應(yīng)性的配體(ligands)相結(jié)合，例如受體特異的配體或免疫球蛋白，或免疫球蛋白的免疫特異部分，從而得到它們能在所期望的特定的靶組織或物質(zhì)中達(dá)到更高的濃度。這種結(jié)合可以進(jìn)一步降低電離輻射劑量水平，正如下面所論述那樣。本發(fā)明涉及可將細(xì)胞毒性物質(zhì)置于或放于靶組織的方法。
此外，BPD-MA可以形成如IG-L-BPD-MA之類的結(jié)合物，其中IG代表免疫球蛋白或其免疫活性部分，而L代表連接這些組份的共價(jià)鍵或者共價(jià)地與每一個(gè)IG和BPD-MA相連的連接部分。當(dāng)然，在這種結(jié)合物中IG可以被其他能與BPD分子共價(jià)結(jié)合的載體，如PVA和葡萄糖所替代。
在需要降低輻射劑量和需要一種安全有效的卟啉輻射敏化劑的場合下，使用BPD使病態(tài)組織輻射敏化的方法很有用。該化合物沒有直接的生物效應(yīng)，因而是無毒的。據(jù)信，該化合物是通過抑制修復(fù)因輻射影響而損傷的病態(tài)組織而起作用的。
該治療方法適用的典型適應(yīng)癥包括摧毀實(shí)體腫瘤中的腫瘤組織；溶解血管中的斑(塊)；治療表面腫瘤或皮膚疾病，包括乳頭瘤病毒感染；以及治療生物體液，例如白血病或感染的血液。輻射敏化劑可以單獨(dú)使用，也可以配制成藥物組合物，從而通過已有技術(shù)中通常公知的技術(shù)施用于實(shí)驗(yàn)者或者用于體外靶目標(biāo)。這種藥物組合物的概述可以找到，例如，在Remington′sPharmaceuticalSci-ences中。該方法可以在體外進(jìn)行，例如，以體內(nèi)取出已在體內(nèi)或體外用BPD，BPD-MA或等價(jià)物處理過的體液(如血液)，經(jīng)輻射后再將其送回體內(nèi)。
BPD，BPD-MA以及它們結(jié)合物可以全身施用也可以局部施用。它們可以單獨(dú)使用也可以作為混合物的組份而使用。
注射可以是靜脈注射，皮下注射，肌內(nèi)注射，甚至腹腔內(nèi)注射。注射物可以制備成傳統(tǒng)的形式，或者液體溶液或懸浮液，在注射前適合配成溶液或懸浮液的固體形式，或乳劑。尤其，最合乎需要的脂質(zhì)體或親脂體的配方。如果使用懸浮液或乳劑，合適的賦形劑包括水，鹽水，右旋糖，甘油和類似物。這些組合物可以含有少量無毒的，輔助性物質(zhì)，如濕潤劑或乳化劑，pH緩沖劑及類似物。口服配方在某些情況下同樣適用，即在輻射敏化劑可以通過該途徑輕易地施用于病態(tài)組織的場合。
如果治療是限制在局部的，例如治療外表腫瘤或皮膚癌，那么BPD，BPD-MA，它們的等價(jià)物或結(jié)合物可以使用標(biāo)準(zhǔn)的用于表面的組合物，如油膏、懸浮劑或糊劑進(jìn)行表面施用。施用的輻射敏化劑的量取決于治療的條件，施用的方式，各個(gè)受試者以及實(shí)際醫(yī)生的判斷。受該制劑的特異性的決定，需要稍大或較小的劑量。對(duì)于對(duì)靶組織有高特異性的組合物而言，例如那些含有輻射敏化劑與高特異性的單克隆免疫球蛋白制劑或特異受體配體形成的結(jié)合物的組合物，建議的劑量為0.05-1mg/kg。對(duì)于對(duì)靶組織特異性較差的組合物而言，高達(dá)1-10mg/kg的較高劑量是合乎要求的。前面所述的盡管僅僅是建議性的，因?yàn)閷?duì)于每個(gè)人的治療方式中的可變因素的數(shù)目是巨大的，而且可以預(yù)望對(duì)這些建議值有相當(dāng)?shù)钠品秶?br> 在本方法中所期望的電離輻射的劑量優(yōu)選的少于500拉德(rad)，更優(yōu)選的在10-200rad之間。電離輻射可以是X-光，但是優(yōu)選的是如來自60Co源的γ射線。所需的水平比絕大多數(shù)輻射方法所需的水平低。
事實(shí)上，使用BPD，BPD-MA，它們的等價(jià)物及結(jié)合物(無論是在輻射之前還是在輻射后短時(shí)間內(nèi)立刻用于靶細(xì)胞)大大降低了所需的輻射劑量，并能分離以至破壞不需要的細(xì)胞或抑制它們的生長。
下列實(shí)施例用于闡述本發(fā)明的效用并有助于實(shí)施本發(fā)明。它們只是例子而已，并不以任何方式限定本發(fā)明。
實(shí)施例1對(duì)照實(shí)施例表示，在體外將PHOTOFRIN 施用于癌細(xì)胞和正常的牛內(nèi)皮細(xì)胞，接著暴露于電離輻射。
在該實(shí)施例中，細(xì)胞(a.P815腫瘤細(xì)胞---DBA/2小鼠中的肥大細(xì)胞瘤；b.M1腫瘤細(xì)胞---3-甲基膽蒽誘導(dǎo)的DBA/2小鼠的橫紋肌肉瘤；C.3905A細(xì)胞---來自中主動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì)胞)在96孔的平板上，在含有10%胎牛血清(fetal calf serum,FCS)培養(yǎng)基中用PHOTOFRIN 培養(yǎng)5或24小時(shí)。測試的濃度范圍為0.5-20μg/ml。在保溫之后，立即將細(xì)胞暴露于60Co源的輻射下。選擇的劑量低于LD50的劑量。不同濃度的PHOTOFRIN 培養(yǎng)并且不經(jīng)輻射的細(xì)胞被用來確定藥物毒性的基準(zhǔn)線。存活的細(xì)胞在輻射之后48-96小時(shí)來用比色法(MTT)進(jìn)行測量。藥物的輻射敏化作用通過將存活的經(jīng)輻射的細(xì)胞(在有藥物存在下培養(yǎng))與存活的經(jīng)輻射的細(xì)胞(于無藥存在下培養(yǎng))相比較而得出。
圖3A，3B和3C顯示了這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。很明顯，PHOTOFRIN 在體外使腫瘤細(xì)胞輻射敏化。盡管，結(jié)果表明，單獨(dú)的PHOTOFRIN 的較高濃度時(shí)有某些降低P185腫瘤細(xì)胞的存活率的傾向(在20μg/ml時(shí)，80%存活)，但是隨后的輻射，無論是100rad或200rad60Co源的輻射劑量，都以更大程度地降低存活率。正如圖3A所示，空心方塊(100rad)和空心三角形(200rad)表明存活百分比僅為40-50%。
類似地，正如圖3B所示，M1腫瘤細(xì)胞在96小時(shí)的存活率，在那些細(xì)胞經(jīng)100rad或200rad輻射的例子中低于在含10%FCS的培養(yǎng)基中用PHOTOFRIN 保溫24小時(shí)的同樣細(xì)胞的成活率。用POTOFRIN 僅保溫5小時(shí)的細(xì)胞會(huì)存活，無論是否經(jīng)輻射。
圖3C顯示，在體外，當(dāng)用PHOTOFRIN 處理不同時(shí)間時(shí)，如3905A牛內(nèi)皮細(xì)胞之類的非腫瘤細(xì)胞有高的存活率，無論是否用大劑量的輻射處理。在96小時(shí)之后，幾乎所有的細(xì)胞在用200rad60Co源處理后都能存活。
實(shí)施例2該實(shí)施例顯示了體外鼠的肥大細(xì)胞瘤對(duì)γ-射線的敏化作用的各參數(shù)的研究。
將單獨(dú)的P815細(xì)胞，或者與不同劑量BPD-MA一起，在DME加10%FCS中培養(yǎng)24小時(shí)。在24小時(shí)時(shí)，更換培養(yǎng)基然后將細(xì)胞再培養(yǎng)24小時(shí)，在此期間用實(shí)施例1中所述的MTT分析測定生長。經(jīng)輻射的細(xì)胞在0時(shí)刻受到300rad輻射，并且和未經(jīng)輻射的對(duì)照細(xì)胞一樣以相同的方式處理。但是，輻射時(shí)間選定于4小時(shí)，以便于細(xì)胞攝入卟啉。正如圖4A所示，BPD-MA的劑量和輻射劑量一樣影響P815細(xì)胞的存活率。在該圖中，對(duì)照例僅接受BPD-MA而不受輻射，存活率很高(大于80%)。當(dāng)與BPD一起預(yù)保留的細(xì)胞受到200rad或300rad輻射時(shí)，存活率在某種程度上線性地隨濃度的增加而下降。與之相反，在受300rad輻射后接受BPD的細(xì)胞(圖4A中的實(shí)心點(diǎn))，存活的百分比依然相當(dāng)?shù)?。這表明，加入的時(shí)間，以及BPD的濃度對(duì)于細(xì)胞的存活有極其不同的影響。已經(jīng)清楚，暴露于BPD(10μg/ml)和300rad下的P815細(xì)胞基本上都消滅了，但是，那些僅單獨(dú)暴露于輻射或單獨(dú)暴露于藥物的細(xì)胞并沒有顯出受實(shí)質(zhì)性的破壞效應(yīng)。
圖4B顯示了在輻射后不同時(shí)間內(nèi)加入BPD-MA的結(jié)果。在該實(shí)驗(yàn)中，P815腫瘤細(xì)胞受到300rad60Co輻射。在輻射之后的5-120分鐘之間的間隔內(nèi)將BPD-MA加入至P815細(xì)胞。可以看見明顯增加了殺傷力。當(dāng)輻射之間立刻加入時(shí)，BPD-MA加入是最有效的。這提示，BPD以某種方式干擾了輻射后細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制。
圖4C顯示了pH對(duì)BPD-MA的敏化作用的影響。在該系列的測試中，P815用不同方法進(jìn)行處理。在每個(gè)例子中，細(xì)胞暴露于300rad的60Co輻射，接著在介質(zhì)中于pH6.5-8.5之間暴露于不同劑量的BPD-MA(5，8和10μg/ml)達(dá)24小時(shí)。在24小時(shí)時(shí)，用常規(guī)培養(yǎng)基更換生長培養(yǎng)基，然后細(xì)胞再培養(yǎng)24小時(shí)，在此期間用MTT分析測定細(xì)胞的成活率。圖4C表明，對(duì)于所有的培養(yǎng)，所有的受輻射細(xì)胞在pH等于7或低于7時(shí)，在某種程度上受負(fù)影響。
實(shí)施例3在該實(shí)施例中，比較相關(guān)的卟啉，PHOTOFRIN ，血卟啉Ⅸ和BPD-MA的效應(yīng)，表明BPD-MA與其他卟啉相比有特殊的功效。
圖5A顯示了按0.5-10μg/ml不等濃度將PHOTOFRIN 加入至用300rad60Co輻射的P815細(xì)胞或未經(jīng)300rad60Co輻射的P815細(xì)胞。PHOTOFRIN 在輻射之后立即加入至細(xì)胞。正如圖5A所示，PHOTOFRIN 結(jié)合隨后的輻射和不結(jié)合輻射存在時(shí)，細(xì)胞存活的差異并不大。因此，可以斷定，在PHOTOFRIN 中的許多二卟啉在體外并不具有與BPD-MA相同的輻射敏化作用。
圖5B顯示了類似的說明，其中P815腫瘤細(xì)胞先用300rad60Co輻射，然后立即用不同濃度的血卟啉Ⅸ處理。藥物濃度為0.1,1,5和10μg/ml。同樣，在經(jīng)輻射并且早已用血卟啉處理的細(xì)胞和僅用血卟啉培養(yǎng)的細(xì)胞之間進(jìn)行比較，僅能看出勉強(qiáng)夠格的差別。
圖5C顯示了在γ-輻射之后接著用BPD-MA處理的敏化效應(yīng)。在該例子中，P815腫瘤細(xì)胞用300rad60Coγ-輻射進(jìn)行輻射。在輻射之后5-10分鐘內(nèi)將不同濃度的BPD-MA加入受試細(xì)胞。將同樣濃度的BPD-MA加于對(duì)照的非輻射細(xì)胞。在輻射之后24小時(shí)用MTT比色分析法測定細(xì)胞的存活率。很明顯，BPD-MA的輻射敏化功效遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于在圖5A和5B所示的兩種卟啉物質(zhì)中的任何一種。濃度為5μg/ml時(shí)，存活率僅為30%，而濃度為10μg/ml時(shí)，P815腫瘤細(xì)胞的存活率接近2%。
實(shí)施例4基于在實(shí)施例1-3中所示的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)是合適的。
在該實(shí)施例4，若干組DBA/2小鼠被皮內(nèi)注射M1細(xì)胞(橫紋肌肉瘤細(xì)胞系)，當(dāng)腫瘤細(xì)胞長至可觸知的約5mm2時(shí)，將這些動(dòng)物用不同的方法處理并監(jiān)測腫瘤大小。動(dòng)物被隨機(jī)地用下列方法處理(a)無藥-無輻射(b)每千克體重靜脈施用10μgBPD-MA(c)對(duì)身體輻射400rad(d)在400rad60Co輻射之前，靜脈施用BPD-MA(10μg/千克體重)。
(e)在靜脈施用10μgBPD-MA/千克體重之前，進(jìn)行400rad的輻射。
隨后用盲法(ablindedprocedure)每天測量腫瘤。
圖6A顯示了腫瘤的相對(duì)大小與時(shí)間的函數(shù)。圖6A表明，與既無藥也無輻射的小鼠中的腫瘤相比，單獨(dú)的輻射會(huì)減緩腫瘤的生長。使用BPD-MA而不用輻射，在5-10天內(nèi)似乎會(huì)加速腫瘤的生長。無論在輻射之前或之后施用BPD似乎能顯著地減緩腫瘤生長。
圖6B顯示了第二個(gè)實(shí)驗(yàn)，它與上面的實(shí)驗(yàn)的差別僅在于輻射劑量。圖6B中所示的結(jié)果是用500rad輻射劑量得出的，而不是上面所示的400rad。正如在圖6B中所見，在用500rad劑量輻射時(shí)任何腫瘤之間沒有實(shí)質(zhì)上的差別。據(jù)信，這一組結(jié)果是因?yàn)檩椛鋭┝恳呀?jīng)充分大，從而在此之前或之后施用BPD-MA的疊加效應(yīng)無法看出。
實(shí)施例5該實(shí)施例顯示了BPD-MA和輻射對(duì)DBA/2小鼠的體內(nèi)P815腫瘤的生長的效應(yīng)。
在該實(shí)施例中，剃毛小鼠再次注射腫瘤細(xì)胞。在該例子中，動(dòng)物被皮下注射104的P815細(xì)胞。當(dāng)腫瘤生成約5mm2?？杀鎰e時(shí)，用不同方法處理動(dòng)物并且監(jiān)測腫瘤大小。動(dòng)物隨機(jī)分成三組，并用下列方式處理(a)無藥-無輻射(b)用200rad輻射(c)在200rad輻射之前靜脈注射BPD-MA(10mg藥物/千克體重)。
正如圖7所示，用200radγ-射線輻射導(dǎo)致與無藥/無輻射處理幾乎相同的腫瘤生長。在施用藥物及接著用200rad60Co輻射的試驗(yàn)表明高至10天在所有時(shí)間內(nèi)(10天時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)束)顯著降低了腫瘤的大小。
實(shí)施例6
該實(shí)施例也表明了BPD-MA和隨后的輻射治療對(duì)DBA/2小鼠體內(nèi)的P815細(xì)胞生長的效應(yīng)。
在該實(shí)施例中，DBA/2小鼠被靜脈注射5×104P815細(xì)胞。兩天后，小鼠按10mg/kg被注入脂質(zhì)體的BPD-MA，接著，在1小時(shí)后，受到來自60Co源的200rad/小鼠水平的全身輻射。兩個(gè)對(duì)照組也同樣形成用P815細(xì)胞注射小鼠，并不再進(jìn)一步處理；以及用P815細(xì)胞注射小鼠再進(jìn)行200rad60Co輻射。在輻射之后四天和七天，每天從各組中選三只小鼠，將其殺死并用有限稀釋法測定它們脾中的P815的數(shù)目。然后對(duì)培養(yǎng)的P815細(xì)胞群落進(jìn)行估價(jià)和計(jì)數(shù)。確定出每組中P815細(xì)胞的總量。
圖8顯示了在第七天時(shí)來自不同的組的小鼠的脾中的P815細(xì)胞的總量。很清楚，對(duì)于用本發(fā)明的方法治療的負(fù)載量(load)比兩個(gè)對(duì)照組要好。
本發(fā)明通過直接描述和實(shí)施例加于敘述，正如前面所指出，實(shí)施例僅僅作為實(shí)施的例子，并不以任何有意義的方式限定本發(fā)明。此外，本領(lǐng)域一般熟練技術(shù)人員，在參閱本說明書及所附的權(quán)利要求書之后，會(huì)意識(shí)到存在與本發(fā)明所提出權(quán)利要求的那些方面的等價(jià)物。本發(fā)明包括這些在提出權(quán)利要求的本發(fā)明的合理范圍之內(nèi)的等價(jià)物。
權(quán)利要求
1.一種破壞或抑制不需要的細(xì)胞或組織的生長的方法，其特征在于，包括以下步驟通過施用一種或多種選自BPD，BPD-MA，它們的等價(jià)物或結(jié)合物的輻射敏化劑，使那些不需要的細(xì)胞或組織敏化；再用電離輻射照射那些細(xì)胞或組織。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，輻射敏化劑是如圖2所示的BPD-MA，其中R1和R2各自選自烷酯基和氫基團(tuán)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，其中R1和R2選自-COOH或-COOR，其中R是烷基，芳基或取代芳基。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，R是烷基，并且選自甲基，正-已基，2-甲基戊基，叔-丁基，正-丙基，或者是苯基，或烷基磺?；?，或取代的芳基，用1-3個(gè)各自地選自鹵素、低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基的取代基取代的苯基。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，R1和R2是烷酯基。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，R2選自甲酯基和乙酯基。
7.一種破壞在體液中不需要的細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟通過施用一種或多種選自BPD，BPD-MA，它們的等價(jià)物或結(jié)合物的輻射敏化劑至體液，在體內(nèi)或體外使那些不需要的細(xì)胞敏化；將體液從體內(nèi)取出；和用電離輻射照射那些細(xì)胞或組織。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，輻射敏化劑是如圖2所示的BPD-MA，其中R1和R2各自地選自烷酯基和氫基團(tuán)。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，其中R1和R2選自-COOH或-COOR，其中R是烷基，芳基或取代芳基。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，R是烷基，并且選自甲基，正-已基，2-甲基戊基，叔-丁基，正-丙基，或者是苯基，或烷基磺酰基，或取代的芳基，用1-3個(gè)各自地選自鹵、低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基的取代基取代的苯基。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，R1和R2是烷酯基。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，R2選自甲酯基和乙酯基。
13.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的體液是在體內(nèi)用BPD，BPD-MA，它們的等價(jià)物或結(jié)合物處理。
14.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的體液是在體外用BPD，BPD-MA，它們的等價(jià)物或結(jié)合物處理。
15.一種抑制輻射后不需要的細(xì)胞的復(fù)蘇的方法，其特征在于，包括以下步驟通過施用一種或多種選自BPD，BPD-MA，它們的等價(jià)物或結(jié)合物的輻射敏化劑到這些細(xì)胞的外膜，使那些不需要的細(xì)胞或組織敏化；和用電離輻射照射那些細(xì)胞或組織。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，輻射敏化劑是如圖2所示的BPD-MA，其中R1和R2各自地選自烷酯基和氫基團(tuán)。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，其中R1和R2選自-COOH或-COOR，其中R是烷基，芳基或取代芳基。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，R是烷基，并且選自甲基，正-已基，2-甲基戊基，叔-丁基，正-丙基，或者是苯基，或烷基磺酰基，或取代的芳基，用1-3個(gè)各自地選自鹵素、低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基的取代基取代的苯基。
19.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，R1和R2是烷酯基。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，R2選自甲酯基和乙酯基。
全文摘要
本發(fā)明是一種將電離輻射與某種苯并卟啉衍生物(BPD)結(jié)合使用，優(yōu)選的是苯并卟啉衍生物一元酸環(huán)A(BPD-MA)，從而破壞病態(tài)的或不需要的細(xì)胞或組織的方法。具體地講，本發(fā)明是這樣一種方法，其中全身地或局部地將敏化劑化合物施用于病態(tài)的或不需要的組織，然后用電離輻射進(jìn)行輻射。用苯并卟啉衍生物治療能敏化靶細(xì)胞或組織，因?yàn)檫@些細(xì)胞不能輕易地從輻射中復(fù)蘇。此外，該方法還能降低施用于特定的靶組織的輻射有效量。
文檔編號(hào)A61N5/10GK1099612SQ9311675
公開日1995年3月8日 申請(qǐng)日期1993年9月3日 優(yōu)先權(quán)日1992年8月17日
發(fā)明者A·里克特, J·G·利維, D·多爾芬 申請(qǐng)人:夸德拉邏輯技術(shù)股份有限公司