專利名稱：膠原組織材料緩鈣化復合環氧交聯法的制作方法
技術領域：
本發明屬于人工生物心瓣膜及制造方法領域。將天然膠原組織經生化方法處理后，可對人體病變心臟瓣膜進行手術置換，使病患者免除痛苦，達到延年益壽的效果。
人工心瓣有生物瓣、機械瓣和塑料瓣三種。生物瓣具有類似于天然心瓣的中心血液流道。符合病員的生理要求，不需要長期服用抗凝藥物，有利于抗凝劑禁忌癥患者;心瓣功能的失效過程是逐漸發生的，這就有利于治療或重新換瓣;不會產生引起病員不適之感的噪聲;原料來源豐富，易于制作，成本低等優點。因此，人工心瓣膜的研究和發展很快。
60年代中期對病變心臟瓣的置換，最早是從血管的置換發展起來的。Ross.D.J.，J.ThoracCardiovasc.Surg47，713(1964)選用的生物瓣材料有同種心臟瓣膜或經甲醛處理的異種主動脈瓣，經過數年的研究和臨床實踐，因不能改善生物瓣的功能和對膠原的保護作用而被淘汰。
70年代初期至今由第二代膠原交聯劑戊二醛占統治地位。早在1968年A.Carpentier第一次用戊二醛取代甲醛處理豬主動脈瓣，戊二醛在膠原分子鍵間能形成較穩定的交聯鍵，因而經戊二醛處理的生物瓣的生物學和力學功能遠優于甲醛，使用也很方便。但在20多年的長期臨床考查中，逐漸發現戊二醛有著如下缺點(1)戊二醛與膠原的ε-NH2作用生成吡啶鎓鍵或戊二醛僅有一個醛與膠原作用，剩余的自由醛基和吡啶鎓鍵能引起內源性的膠原組織鈣化;(2)在固定生物瓣材料時，積存在組織中的戊二醇聚合物隨著生物瓣植入人體而在體內逐漸解聚，釋放出來的戊二醛單體所顯示的毒性，使進入瓣葉材料的血細胞和體液細胞失活，因而引起外源性的膠原組織鈣化。無論內源性或外源性鈣化，都嚴重地影響著生物瓣的使用壽命，(3)戊二醛在力的作用下不能改善生物瓣的原發性失功;(4)抑制參與膠原鈣化的堿性磷酸酶(AP)活性的能力不及Al+++離子強;(5)戊二醛處理的生物瓣材料的親水性，生物相容性和彈性等還有待提高，加之在貯期中色澤變黃等，充分證明戊二醛不是優良的膠原交聯劑。
影響生物瓣發展的致命弱點是生物材料瓣葉的鈣化和撕裂而導致瓣膜使用壽命縮短。引起鈣化和撕裂的原因是多方面的，其中涉及到各種生化處理對材料組織結構，力學行為等各方面因素。提高生物材料的強度取決于固定天然生物材料的交聯劑種類和交聯度。由于膠原的交聯反應應控制在極為溫和的條件進行，能用于高聚物領域的交聯劑多數都不能使用，只有蛋白交聯劑才有選用的可能性。我國學者樂以倫、萬昌秀等于1983年起對四川阿壩的牦牛心包的組織學、生物化學、免疫學、生物力學、物理化學和膠原的化學改性等方面開展了全面的基礎研究。與此同時，還對心包的固定工藝、縫瓣技術與保存方法等進行了系列的研究，并與華西醫科大學合作將牦牛心包生物瓣成功地用于臨床。《YPV-1牦牛心包瓣膜鑒定資料》之一至十二(1986年)，充分肯定了牦牛心包材料是一種很有前途的生物瓣材料，很有發展前景。
為了進一步提高心包材料的耐疲勞性能和防止鈣化作用的發生，本發明者還對親水性雙環氧化合物作為牦牛心包材料交聯劑的可行性研究。在室溫和中性條件下，該雙環氧化合物形成的低聚合度自聚物能在膠原分子鍵間與ε-NH2反應，形成膠原微纖維間橋鍵，從而提高膠原纖維的力學性能。親水性環氧交聯劑還能與膠原分子鍵上其它活性基團如
，胍基和甲硫基等反應。因而在膠原微纖維之間形成橋鍵的機會多于戊二醛。低聚合度環氧交聯劑自聚物降解后的產物，是無毒或毒性很小的醇類產物。對材料的應力應變，彈性模量和應力松弛行為等力學性能的分析，證明環氧復合交聯處理的牦牛心包材料較傳統的戊二醛固定心包材料有更好的力學行為，更佳的親水性與生物相容性，和明顯優于戊二醛材料的緩鈣化效果。
本發明的目的是針對現有技術的不足而提供一種膠原組織材料緩鈣化復合環氧交聯法，其特點是在常溫條件下，采用親水性雙環氧復合交聯劑對生物組織材料，如牦牛心包等進行生化處理，獲得的人工生物瓣或縫制成其它器官，植入人體后有明顯的緩鈣化效果，使用壽命從7-8年延到15年以上，強度、應力松弛，生物相容性，緩鈣化和耐酶解等性能，優于戊二醛法處理的膠原組織材料，有利于病患者恢復健康和延年益壽。
本發明提供的膠原組織材料緩鈣化復合環氧交聯法是將天然膠原組織(可用牛心包、豬主動脈瓣、硬腦膜、潤筋膜、大動物動脈血管、蹄筋和羊腹膜等)進行生化處理后用于臨床或者縫制成器官植入人體內。
1、粗選在環境潔凈和接觸膠原組織的器材、藥液均按外科要求滅菌消毒的條件下，在半小時內立即將采集的新鮮膠原組織于室溫下去掉其表面的脂肪和網狀結締組織。
2、漂洗將粗選的新鮮膠原組織用滅菌生理鹽水(0.9%NaCl)溶液洗滌多次，直至無血水滲出為止。每次固液比為1∶10～50，即重量與體積之比。
3、浸泡萃取可溶性蛋白質萃取用不含鈣鹽的HanKs液，固液比同前(2)，洗至用茚三酮試劑檢驗無可溶性蛋白質浸出為止。
4、精選選取膠原組織的均勻部分，裁成一定尺寸的矩形片。
5、抗菌素滅菌每500毫升生理鹽水中加入4～8萬單位慶大霉素，固液比同前(2)。
6、交聯劑固定交聯劑用1-15%的多官能度的環氧化合物
，n＝1～10，與0.1N的碳酸鹽緩沖液的pH9-12)和5-50%(體積/體積)水溶性有機溶劑(可用乙醇、丙酮、二氧雜環己烷)作為助溶劑，防止膠原腫脹，加速反應進程，pH9-10，對膠原組織進行交聯固定，室溫下反應96小時以上。
7、儲放入保存液中備用用2%甲醛磷酸緩沖液和0.5-3%水溶性表面活性劑(可用聚乙二醇、聚丙二醇和十二烷基硫酸鈉)中滅菌保存。按上述方法制得的膠原組織材料除用于縫制生物心瓣膜外亦可用作心臟修補片、血管或其它醫用修復材料。
8、生物瓣的固定成型用0.05-5%的復合金屬鹽可用ZrOCl2、Al2(SO4)3、AlCl3、FeCl3、Cr2(SO4)3、CrCl3等一種或一種以上的混合物于生理鹽水溶液中，使縫制好的生物瓣快速固定成型為緩鈣化復合環氧交聯法產品，然后放入2%的甲醛磷酸緩沖液和表面活性劑中滅菌保存。
本發明的膠原組織材料緩鈣化復合環氧交聯法處理的牦牛心包與傳統的戊二醛法處理的牦牛心包的效果比較如下表1。實踐證明本發明克服了傳統的戊二醛處理膠原組織后帶來的一系列弊端和缺點。
復合環氧法與戊二醛法處理牦牛心包材料的性能測試
1、氨基酸分析復合環氧法處理樣品經四川省農科院中心實驗室進行氨基酸分析，戊二醛法處理樣品作對比，用日立835-50型高速氨基酸分析儀測定，
表2 兩種交聯劑處理牦牛包后氨基酸含量
每1000個總氨基酸中的氨基酸殘基環氧與酸性氨基酸形成的酯鍵在酸性水解條件下水解破壞。
氨基酸分析表明，經環氧交聯處理的材料較戊二醛處理的材料，引入了多種交聯鍵，交聯點數也有所增加。
2、力學性能測試經衛生部藥檢所采用Shimadzu-AG-5000A生物材料試驗機對復合環氧交聯處理材料與戊二醛法處理材料對比試驗如
圖1，圖2所示。
圖1，牦牛心包材料的應力-應變曲線＊1、新鮮樣品2，復合環氧法，3、戊二醛法＊試樣周向取向，試樣數n＝9，曲線上各點為平均值±標準誤差。
圖2，牦牛心包材料的應力松弛曲線＊1、新鮮樣品，2，復合環氧法，3、戊二醛法＊ 應力保持率＝ (σt)/(σ) ＝100，時間刻度log(t)，試樣數n＝10，曲線上各點為平均±標準誤差，載荷在550秒的情況下，復合環氧處理的牦牛心包材料的力學性能優于戊二醛處理牦牛心包材料。
由于環氧化合物能與膠原分子中多種氨基酸側基起反應，如ε-NH2，-COOH，-OH等，形成分布較為均勻的交聯鍵。此外，環氧交聯劑是帶醚鍵的柔性分子鏈。因此，在保持材料的抗張強度基礎上，環氧處理的斷裂伸長率也有顯著提高，對于體內受多變應力作用的瓣葉材料，是十分有利的。膠原組織的應力松弛主要來自纖維束間的滑移和纖維分子本身的粘彈性。經化學改性后，材料的應力松弛速率均有所下降，但以EP心包材料下降率較小。再次說明改性心包材料的應力松弛效應與材料的氨基酸分析結果吻合，即環氧在膠原分子間引入的交聯鍵數較戊二醛的交聯鍵多。
經復合環氧交聯劑處理的牦牛心包材料，其柔性較戊二醛處理的好，抗拉強度和斷裂伸長率增加，力學性能優于戊二醛處理材料。
3、材料的鈣化實驗在生物瓣失效的原因中，無毒退變(主要是組織的退變)占失效原因總數的74%，而組織退變多數與瓣葉的鈣化有關。研究緩鈣化材料是解決生物瓣使用壽命的關鍵問題。
參照Fishbein和Levy的方法，將樣品及對照包埋于大鼠背部皮下，21天后取出，烘干至恒重稱量，硝化，并用PE3030型原子吸收分光光度儀測定鈣含量。
復合環氧處理樣品的鈣含量與戊二醛樣品相比顯著下降，復合環氧處理材料具有明顯的緩鈣化作用。
4、材料的酶解實驗酶解法是以膠原組織材料在酶(I型膠原酶CollagenaseI，或鏈蛋白酶Pronase)作用下釋放出的羥脯氨酸(Hypro)量來表達的，羥脯氨酸值愈低，則材料的耐酶解能力愈強。
實驗證明復合環氧交聯法處理的牦牛心包材料在收縮溫度Ts℃較低的情況下，其羥脯氨酸值仍明顯低于戊二醛法處理的牦牛心包材料和巴西、美國的黃牛心包商品試樣。
本發明具有如下優點
經過生化處理的膠原組織材料植入人體后，生物相容性好，排異反應小，在醫學外科手術上的應用日漸廣泛，其中以人工生物心瓣用量最大，僅以國內外換瓣情況為例，全世界已有100多萬人換瓣，美國每年約10000人換瓣，1988年聯邦德國換瓣術已達5000多例，國際市場銷售量每年約增長6.9%。我國成人風心病患者約140萬，其中8萬人急需換瓣，根據以上增長率，我國每年還將增加5000急需換瓣者。目前國內已有100多家醫院開展換瓣手術，但產量遠遠滿足不了臨床需要，據華西醫科大學80年代初調查，四川一億人中0.8%患心瓣病，即80萬病員，其中10%應換心瓣，加上愿意或可能換的為應換心瓣的10%，則本省急等換瓣者也在近萬人之上。因此，本發明更有利于病患者在于1、減小或延緩膠原組織材料在體內的鈣化，從而大大延長生物瓣植入人體后的使用壽命，從7-8年提高到15年以上，有利于病患者恢復健康的延年益壽。
2、生物瓣與人工機械瓣相比造價低廉，血動力學功能接近人體生理功能，血液相容性好，不需要服用抗凝藥物，適合于我國和發展中國家的國情，本專利的實施將為人類心瓣病患者帶來福音。
3、我國具有豐富的生物組織材料資源，尤其四川省每年宰殺數以千萬計的生豬和數以萬計牦牛，有取之不盡，用之不竭的型號齊全的豬主動脈瓣和優良的牦牛心包材料，為發展生物瓣工業提供了可靠的保證。天然膠原組織材料，在經過交聯處理前，一般是屠宰加工廠廢棄不用之物，經過生化處理后變廢為寶造福人類，不僅可以救死扶傷，還可節匯創匯。例如國內廣州太平洋公司每張心包約100元，制成的生物瓣每只為1500元，而且是用傳統的戊二醛處理的材料。美國進口的生物瓣每只為1000美元，如果用本發明的方法生產的材料制造緩鈣化生物瓣，且質量比美國的好。若年產5000只，并以同樣價格銷售，則年產值可達750萬元，出口可創匯5000美元。
實施例1、粗選選擇3-5歲的健康小牛，宰殺后半小時內采集，要求環境潔凈、接觸心包的器材藥液按外科滅菌消毒，采集的新鮮牦牛心包于室溫，最佳溫度為4-10℃下去掉表面的脂肪和粗糙結締組織。
2、漂洗將粗選的新鮮牦牛心包用滅菌生理鹽水(0.9%NaCl)溶液洗滌多次，直至無血水滲出為止，每次固液比為1∶40重量比體積溫度為室溫，最佳溫度為4-10℃。
3、浸泡萃取可溶性蛋白質滅菌用不含鈣鹽的HanKs液，固液比同前(2)，洗至用茚三酮試驗無可溶性蛋白質浸出為止。
4、精選選取心前區均勻部分，裁成120×100毫米大小的矩形片。
5、抗菌素滅菌在500毫升生理鹽水中加入4-8萬單位慶大霉素，固液比同前(2)，溫度為室溫，最佳溫度4-10℃。
6、交聯劑固定交聯劑可用2-3多官能度環氧化合物
與0.1N的碳酸鹽緩沖液和20%乙醇作為助溶劑(pH9-10)對生物材料進行交聯固定，反應溫度為4-10℃，時間96小時以上。
7、儲放入保存液中備用用2%甲醛磷酸緩沖液和1%聚乙二醇中滅菌保存1個月左右。由此制得的緩鈣膠原組織材料除縫制生物瓣外，亦可用作心臟修補片、血管或其它醫用修復材料。
8、生物瓣的固定成型用0.2%的ZrOCl2于生理鹽水溶液中，使縫制好的生物瓣快速固定成型。然后放入2%的甲醛磷酸緩沖液和表面活性劑聚乙二醇中滅菌保存。
實施例21、粗選選取新鮮的狗動脈血管于室溫下去掉血管表面的肌肉和要求，同實施1的(1)。
2、漂洗將粗選的新鮮狗動脈血管用滅菌生理鹽水(0.9%NaCl)溶液洗滌多次，直至無血水滲出為止，每次固液比為1∶30重量比體積比，溫度為室溫。
4、浸泡萃取可溶性蛋白質，同實施例1的(3)。
4、精選選取均勻部分，切取一定長度的血管。
5、抗菌素滅菌同實施1的(5)。
6、交聯劑固定交聯劑可用2%雙官能度環氧化合物
，n＝3與0.1N的碳酸鹽緩沖液和20%丙酮作為助溶劑，pH9-10，對血管進行交聯固定，室溫下反應96小時。
7、儲放入保存液中備用用2%甲醛磷酸緩沖液和0.5%聚丙二醇中滅菌保存，即可直接用于置換病變的血管。
實施例31、粗選選取新鮮的豬主動脈瓣于室溫下去掉脂肪和不均勻部分，要求同實施例1的(1)。
2、漂洗3、浸泡萃取可溶性蛋白質，4、精選和5抗菌素滅菌皆同實施例2的(2)(3)(4)(5)。
6、交聯固定交聯劑可用2%的雙官能度的環氧化合物
n＝10與0.1N的碳酸鹽緩沖液和10%二氧環己烷作為助溶劑，pH9-10，對該主動脈瓣進行交聯固定，室溫下反應96小時。
7、儲放入保存液中備用用2%甲醛磷酸緩沖液和0.5%十二烷基硫酸鈉中滅菌保存。
權利要求
1.膠原組織材料的緩鈣化復合環氧交聯法其特征在于(1)粗選在環境潔凈和接觸膠原組織的器材、藥液均按外科要求滅菌消毒的條件下，在半小時內立即將采集到的新鮮膠原組織于室溫下去掉其表面的脂肪和網狀結締組織。(2)漂洗將粗選的新鮮膠原組織用滅菌生理鹽水(0.9%NaCl)溶液洗滌多次，直至無血水滲出為止，每次固液比為1∶10～50，即重量與體積之比。(3)浸泡萃取可溶性蛋白質萃取用不含鈣鹽的HanKs液，固液比同前(2)，洗至用茚三酮試劑檢驗無可溶性蛋白質浸出為止。(4)精選選取膠原組織的均勻部分，裁成一定尺寸的矩形片。(5)抗菌素滅菌每500毫升生理鹽水中加入4-8萬單位慶大霉素，固液比同前(2)。(6)交聯劑固定交聯劑用1-15%的多官能度的環氧化合物與0.1N的碳酸鹽緩沖液(pH9-10)和5-50%(體積/體積)水溶性有機溶劑作為助溶劑，對膠原組織進行交聯固定，室溫下反應96小時以上。(7)儲放入保存液中備用用2%甲醛磷酸緩沖液和0.5～3%水溶性表面活性劑中滅菌保存。按上述方法制得的膠原組織材料除用于縫制生物心瓣膜外，亦可用于心臟修補片、血管、肌腱或其它醫用修復材料。(8)生物瓣的固定成型用0.05-5%的復合金屬鹽于生理鹽水溶液中，使縫制好的牛心包或豬主動脈生物瓣快速固定成型為緩鈣化復合環氧交聯法產品。然后放入2%的甲醛磷酸緩沖液和表面活性劑中滅菌保存。
2.按照權利要求1所述膠原組織材料的緩鈣化復合環氧交聯法，其特征在于該交聯法的膠原組織材料為牛心包，豬主動脈瓣，人體硬腦膜、潤筋膜、大動物動脈血管、蹄筋和羊腹膜。
3.按照權利要求1所述膠原組織材料的緩鈣化復合環氧交聯法，其特征在于該交聯法的多官能環氧交聯劑為
，n＝1～10同系化合物。
4.按照權利要求1所述膠原組織材料的緩鈣化復合環氧交聯法，其特征在于該交聯法的水溶性有機助溶劑為乙醇、丙酮和二氧雜環己烷。
5.按照權利要求1所述膠原組織材料的緩鈣化復合環氧交聯法，其特征在于該交聯法的水溶性表面活性劑為聚乙二醇，聚丙二醇和十二烷基硫酸鈉。
6.按照權利要求1所述膠原組織材料的緩鈣化復合環氧交聯法，其特征在于該交聯法的復合金屬鹽為ZrOCl2、Al2(SO4)3、AlCl3、FeCl3、Cr2(SO4)3、CrCl3的一種或一種以上的混合物。
全文摘要
膠原組織材料的緩鈣化復合環氧交聯法是用復合環氧交聯劑處理天然膠原組織如牛心包，豬主動脈瓣，大動物主動脈血管等，使這類膠原組織的強度，應力松弛、生物相容性、緩鈣化和耐酶解等性能均優于戊二醛處理的膠原組織產品，其中用復合環氧膠原組織牛心包和豬主動脈材料縫制的生物瓣膜植入人體后，該生物瓣有明顯的鈣化的功能，使用壽命從7—8年延長至15年以上，病人換瓣后，能恢復健康和延年益壽。
文檔編號A61F2/24GK1093566SQ9311096
公開日1994年10月19日 申請日期1993年4月16日 優先權日1993年4月16日
發明者樂以倫, 萬昌秀, 唐正貴, 韓波 申請人:成都科技大學