專利名稱：聚肌胞復合物免疫佐劑及含有該佐劑的疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新免疫佐劑及含有該佐劑的疫苗，特別是涉及一種聚肌胞復合物免疫佐劑及其應用。
免疫佐劑是一種能提高抗原免疫反應的因子。由于這種因子的作用是加強幾乎所有T細胞依賴性抗原的免疫反應，所以免疫佐劑的作用是非特異性的。免疫佐劑又稱免疫增強劑，除了能提高抗原的免疫效果外，也用于非特異性地提高機體抗細菌、真菌、病毒、寄生蟲感染和腫瘤的能力。
眾所周知，疫苗是人類防治病毒病最有力的武器。在現有技術中，由于各種遺傳工程疫苗，合成多肽，亞單位疫苗以及一些小顆粒的全病毒滅活疫苗的免疫效果不好，通常都須用佐劑。目前國際上批準的人用佐劑只有鋁佐劑。鋁佐劑的缺點是不能刺激機體產生細胞免疫，也不能促進某些抗原的體液免疫以及其它一些弊病，因而遠遠滿足不了實際需要(AnthonyD.Chinnah，et.alVaccine，Vol，10Issue8，1992.551)為了克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種新型的佐劑以及含有該佐劑的疫苗。這種新型佐劑安全穩定，能誘生干擾素，白細胞介素Ⅱ，并抑制病毒繁殖，提高疫苗的效價，顯著提高機體IgM，IgG和中和抗體的產生。
本發明涉及含卡那霉素和鈣離子的聚肌胞(Polyriboinosinic-polyribocytididylicacid(PIC)containingKamamycinandcalcium)做為免疫佐劑的應用。本文中以下將所述的含卡那霉素和鈣離子的聚肌胞簡稱為PICKCa。
早在70年代國際上就已發現了PIC，雙鏈聚肌胞具有很好的誘生干擾素作用，在此之后又發現了其衍生物，即含多聚賴氨酸和羧甲基纖維素的聚肌胞(PICcontainingpolyL-LysinandCarboxymethycellulose，PICLC)。但是PIC不能用于靈長類從上的動物包括人體而PICLC的毒性太大也不能用于人體。于是人們繼續研究終于發現了PICKCa，這種藥品只是用于對某些病毒病的治療。本領域技術人員熟知感染和發病是完全不同兩個概念。PICKCa的發現是用于病毒感染后，并且確診患上病毒病時才使用。而且就PICKCa對病毒病的治療效果也不盡人意。特別應當指出的是至今為止沒有任何資料報道將該已知的藥品做為免疫佐劑來加以使用。
PICKCa的用量是公知，因此通常每支疫苗中，可加入1～2mgPICKCa，其它按不同疫苗的要求進行免疫注射。因此，本發明對PICKCa的用量不加以進一部的說明。
本發明涉及的佐劑PICKCa具有如下有益的效果1、PICKCa同病毒抗原或滅活疫苗結合后能顯著地提高該抗原或疫苗的免疫效果，即具有顯著的免疫佐劑的作用。
2、由于PICKCa本身在人體上已經使用，使得PICKCa很容易地被人們接受，并替帶目前使用的鋁佐劑而獨樹一幟，成為很有前途的新的佐劑。
3、單獨PICKCa用于病毒性疾病感染的潛伏期具有顯著的抗病毒效果。
4、PICKCa與病毒抗原或滅活疫苗結合后，用于病毒感染潛伏期的治療較單純應用PICKCa又進一步增加了治療效果。
由于免疫佐劑的非特異性，PICKCa將在病毒、細菌、寄生蟲感染治和抗腫瘤中產生重要作用;特別是將對多種疫苗產生顯著的免疫佐劑作用。本文所涉及的疫苗包括人用狂犬病疫苗，流行性出血熱疫苗，但并不限制于此。
圖表說明表1PICKCa誘生干擾素的測定。
表2PICKCa誘生白胞胞介素Ⅱ的測定。
表3用PICKCa來誘生小鼠體內IgG和中和抗體的測定。
表4PICKCa降低感染狂犬病病毒小白鼠的死亡率。
表5PICKCa與狂犬病毒抗原結合后，免疫OF1小鼠，在不同時間分離血清檢測其IgM、IgG和中和抗體的結果。
表6，表7PICKCa促進疫苗效價的結果。
表8說明PICKCa與狂犬病素抗原結合后，進一步降低感染狂犬病毒小白鼠的死亡率結果。表9對于PICKCa和疫苗結合后安全性的檢測。
表10所示PICKCa促進流行性出血熱滅活疫苗抗體的產生情況。
為了進一步理解本發明，以下將結合實施例詳細說明本發明的實質。下述的實施例并非意在限定本發明，只是幫助人們理解本發明。
實驗例1PICKCa誘生干擾素。取OF1小鼠20只肌注PICKCa，每只0.05～0.1mg。在不同時間分離小鼠血清，通過抑制VSV病毒在L929細胞產生的病變，然后通過顯色法測定血清干擾素的產生情況。測定方法見MossmanT.，RapidColormetricassayforcellulargrowthandSurvivalapplicationtoproliferationandcytotoxieiktyassays.J.Immun.Meth1983，65∶55-63。
該試驗的結果見表1。
該試驗結果表明PICKCa能誘生高滴度干擾素，并在注射2小時即可達到高峰。
實驗例2本實驗為PICKCa誘生白細胞介素Ⅱ(IL-2)及其測定。取C3H小鼠，用抗原，即滅活提純狂犬病毒(IPRV)和PICKCa免疫小鼠。每只腹腔注射0.1ml。取小鼠脾臟，用3H標記CTLL細胞法測定IL-2。該方法見Joffret ML，et al.Appraisal of Rabies Vaccine Potency by Determination of In vitro，Specific Interleukin-2 Production.Biologicals，1991.19(2)113-123。
說試驗的結果見表2。表明PICKCa能夠非特異性地提高IL-2產量。
實驗例3A/J小鼠用活的狂犬病毒野毒株RD9147感染后，用PICKCa治療，用ELISA法(PerrinP.TTechniguesforthepreparationofreabiesconjugatesinLaboratorytechniquesinrabies(4th，edittion)WHO或RFFIT方法(SmithJ.Arapidreproduciblefestfordeterminingrabiesneutralizingantibody。Bull。WldhithOrg.1973.48535-541)測定小鼠體內狂犬病毒IgG和中和抗體的滴度。每只小鼠體內狂犬病毒株0.1ml，然后在5小時，3天和7天各肌注PICKCa0.05ml/只，并于不同時間抽血檢測IgG和中和抗體的滴度，其結果見表3。
結果表明小鼠在受到RD9147感染后，用PICKCa治療其IgG和中和抗體的滴度大大降低。表明由于PICKCa顯著抑制了病毒的繁殖、而使之不能刺激機體產生抗體。
實驗例4PICKCa降低感染狂犬病小白鼠的死亡率。
將40只OF1小鼠隨機分成4組，每組10人，用狂犬病野毒株RD4077感小鼠，每只0.1ml感染后的6小時，第3.7，14和18天用PICKCa治療，每只0.05ml，肌注，觀察小鼠的死亡率;其結果見表4。
該結果說明PICKCa在狂犬病毒感染的潛伏期，能夠極其顯著地降低小白鼠的死亡率。
實驗例5PICKCa同狂犬病毒疫苗結合后的安全性測定。選用2組狂犬病毒疫苗分別加入PICKCa，分別對小鼠進行腦內和腹腔注射，觀察其死亡情況。
結果(見表9)表明安全。本試驗按“中國藥典”急性毒性試驗測量方法進行。
實施例1OF1小鼠46只隨機分成4組。本試驗是PICKCa與狂犬病毒抗原結合后，即制成疫苗，免疫OF1小鼠，以該抗原組和抗原加鋁佐劑組以及空白為對照，在不同的時間分離小鼠血清檢測IgM，IgG和中和抗體。其結果是表5。
本試驗中IgG和中和抗體的測定方法同實驗例3中所用的方法相同，IgM測定法是ELISA法測定。
該結果顯示抗原+PICKCa組能刺激機體提前和提高產生IgM，IgG，特別是中和抗體，而鋁佐劑卻使抗體產生置后，說明以PICKCa為佐劑，其效果大大地高于Al2O3的佐劑效果。
實施例2.3PICKCa促進疫苗的效價。
如表6所示，用NIH法WHOLaboratorytechniquesinrabies(3thedition)1973檢測，PICKCa可降低使用半數有效抗原量(ED50)5-10倍，而鋁佐劑僅降低1-2倍。
如表7表示，用NIH法測定PICKCa對人用狂犬病疫苗的佐劑效果。表明PICKCa可顯著提高人用狂犬疫苗的效力(國際單位)，使之均可從不合格而達到國際標準以上(2.5國際單位)。
實施例4PICKCa與狂犬病毒抗原結合后，骯注小白鼠又進一步降低感染狂犬毒小白鼠的死亡率。
本試驗的目的是當小鼠用野毒株感染后觀察PICKCa或Al2O3同滅活提純狂犬病毒結合后，對小鼠的保護作用。
如表8所示PICKCa與狂犬病疫苗結合后治療感染了狂犬病野毒株的小白鼠，較單純用PICKCa治療，又進一步降低了小白鼠的死亡率，單純滅活疫苗治療效果微乎其微，而加入鋁佐劑則完全不起作用。
實施例5PICKCa促進流行性出血熱滅活疫苗抗體的產生本試驗采用Al(OH)做對照。PICKCa與出血熱滅活疫苗等量混合后，肌注實驗家兔，1ml/只，隔周一次，在第14和21天抽血，用ELISA和RPHI檢測抗體產生情況。
其結果見表10。表明PICKCa促進流行性出血熱疫苗ELISA抗體效價4-8倍，RPHI抗體2倍，而鋁佐劑僅分別為0～4倍，對RPHI抗體反而降低。
表1PICACa誘生小鼠干擾素的測定時間(小時) 注射后干擾素滴度(國際單位×10-3)PICKCa0<51<52320324456<5
表2用PICKCa和滅活提純狂犬病毒(IPRV)免疫小鼠誘生白細胞介素-2的測定免疫PICKCa注射(μg)體外刺激IL-2的測定(cpm×10-8)培養液IPRVPICKCaPBS*01.11.10.9PBS750.50.60.91PRV00.613.92.71PRV753.715.72.0(0)**(12.0)**＊PBS磷酸鹽酸緩沖液＊＊與培養液IL-2的差值表3用ELISA或RFFIT法測定RD9147狂犬病野毒株感染后，并且PICKCa處理后A/J小鼠體內狂犬病IgG和中和抗體的滴度不同日期感染后PICKCaELISA測RFFIT測中和感染鼠的血清治療時間IgG的滴度抗體的滴度(MIU/ml)(IU/ml)RD91473天//0.28RD91473天第7小時/<0.28RD91478天/25281.60RD91478天第5小時,<224<0.25第3天和7天RD914715天/115203.38RD914715天第3小時,第3120<0.283,7,1014天PBS15天/68<0.28表明PICKCa顯著抑制了狂犬病毒在小鼠體內的繁殖。
表4PICKCa降低用RD4077狂犬病野毒株感染的OF1小鼠死亡率組RD4077死亡率潛伏期(天)稀釋度PICKCa純4/1017,18,20,2210-10/10對照組純10/1010,11,12,13,14,13,13,17,17,1710-110/10 11 13,14,14,17,17,17,19,
表5 用狂犬病毒抗原(V427)或同該抗原結合的PICKCa或者Al2O3免疫OF1小鼠，測定其狂犬病IgM，IgG和中和抗體的滴度免疫血清IgM滴度IgG滴度中和抗體滴度ELISA法ELISA法RFFIT法IU/mlAU/mlMIU/ml第4天Ag180870.25Ag+PICKCa4132641.01Ag+Al2O3231 97 <0.13第7天Ag61515221.01Ag+PICKCa>160041666.65Ag+Al2O3169 351 0.43第14天Ag47949002.54Ag+PICKa5222632017.24Ag+Al2O3408 12000 11.97
第30天Ag10718003.01Ag+PICKCa1501360015.63Ag+Al2O3190 4000 6.86第60天Ag11750002.10Ag+PICKCa1501880015.96Ag+Al2O398 6000 7.64空白對照1640-
表6 用NIH試驗測定注射PICKCa或Al2O3后的小鼠對滅活狂犬病毒的保護作用佐劑注射劑量(μg)注射日期半數有效量07無00221PICKCa1001002280080040Al2O33000 3000 9310001000132
表7用NIH試驗測定PICKCa對人用狂犬病疫苗的激刺效價編號試驗組ED50效價CVSLD50疫苗81163+PICKCa4℃下4周2.184.33IU/2ml5137℃下4周1.962.64IU/2ml5疫苗891634℃下4周1.801.82IU/2ml537℃下4周1.711.48IU/2ml5參照品84-52.534.9IU/安瓶5疫苗890842+PICKCa4℃下4周1.994.58IU/2ml5237℃下4周1.742.60IU/2ml5疫苗8908424℃下4周1.531.58IU/2ml5
參照品84-52.324.9IU/安瓶5參照品84-5+PICKCa2.4914.1IU/安瓶32參照品84-52.034.9IU/安瓶32
表8 PICKCa，Al2O3及其與狂犬病毒抗原結合后，對感染狂犬病毒小鼠的治療效果用IPRV治療后(注射量μg)的死亡率其它治療0140560無95(19/20)*95(19/20)20(7/10)PICKCa30(3/10)95(19/20)70(7/10)Al2O3100(10/10) 95(19/20) 70(7/10)＊.小鼠死亡數/感染狂犬病毒小鼠數表9狂犬病疫苗與PICKCa結合后對18克體重的小白鼠安全性測定實驗組數組別0.03mli.c0.5mli.p1疫苗89163存活率2/2存活率5/5+PICKCa2疫苗89163存活率2/2存活率5/5+PICKCa
表10PICKCa或鋁佐劑在家兔體內對流行性出血熱疫苗抗體測定兔號免疫組別14天血清21天血清ELISARPHIELISaRPHI1 疫苗+Al(OH)32048 / 2048 /+PICKCa2 疫苗+Al(OH)3+PICKCa2048/1024/3疫苗+PICKCa4096324096324疫苗+PICKCa4096324096325 疫苗Al(OH)31024 / 512 86 疫苗Al(OH)32048 / 1024 87疫苗51216512168疫苗5121651216
ELISA酶聯免疫吸附測定RPHI反應被動血凝抑制試驗
權利要求
1.含卡那霉素和鈣離子的聚肌胞(PICKCa)做為免疫佐劑的應用。
2.含卡那霉素和鈣離子的聚肌胞(PICKCa)佐劑疫苗。
3.含卡那霉素和鈣離子的聚肌胞(PICKCa)做為免疫增強劑的應用。
4.如權利要求2和3所述的應用，其特征在于所述的應用是指含卡那霉素的鈣離子的聚肌胞(PICKCa)在哺乳動物或人在病毒感染期的應用。
5.如權利要求2所述的疫苗，其特征在于所述疫苗在哺乳動物或人在病毒感染期的應用。
全文摘要
本發明涉及一種含卡那霉素和鈣離子的聚肌胞(PICKCa)做為免疫佐劑或增強劑的應用特別是涉及含PICKCa的疫苗及將PICKCa應用于哺乳動物或人的病毒感染期。
文檔編號A61K39/39GK1095951SQ9310586
公開日1994年12月7日 申請日期1993年5月31日 優先權日1993年5月31日
發明者林海祥 申請人:林海祥