新的肝素衍生物的制作方法

專利名稱：新的肝素衍生物的制作方法
技術領域：
本發明涉及新的具有藥理學性質的肝素衍生物，改良了普遍有利于銷售市場的肝素制劑及應用于抗凝血治療。新衍生物抗凝血酶活性和Xa因子活性和血小板因子4(PF4)的活性之間關系不同于肝素的這類關系。也就是說，它們的重要的對PF4親和性伴有抗凝血酶Ⅲ和凝血酶之間的反應活性的減小，這些反應活性可被肝素催化。
同樣，抗凝血酶Ⅲ和Xa因子在肝素自身催化下的反應對新衍生物來說更為敏感。由于它們對PF4及在對凝血酶和Xa因子的活性和肝素相比具有不同比例，新衍生物能避免血栓形成并可阻止血栓出血。這種現象可伴隨肝素對抗血栓形成而產生的，必須注意過量的凝血酶抑制劑作用能引起出血的活性。新衍生物的性能結合PF4，在低濃度的能催化被Xa因子活化的反應，及在高濃度下只能被凝血酶活化的反應，使得這些組合物可作為藥物應用于動脈和靜脈血栓。
該新的肝素衍生物及其鹽可通過將從大于6個碳原子的碳氫化合物衍生的醚化劑處理得到，在室溫或略高于室溫下與肝素的季銨鹽反應。將該季銨鹽溶于雜環有機溶劑中并經長時間反應，該雜環有機溶劑選自于N-烷基-吡咯烷基-2-酮，N-烷基-哌啶基-2-酮之類的化合物。可以取代或未取代的碳烷基取代，它們的衍生物可在雜環中被其他雜原子或雜基團選自于所基團-O-，-S，和-NH-的雜原子或雜基團所隔斷，或在存在于非質子傳遞溶劑中的這種化合物的濃溶液中，再在高溫下用一種有機或無機鹽水溶液處理，并分離在肝素衍生物得到游離化態產物或其堿鹽，且如果需要，可將化合物互相轉化成游離態，或堿性鹽或其它金屬以及或有機堿的鹽。
這種新的肝素衍生物，其上述的藥理性能不同于肝素，它改良了其化學結構和不同的分子量;其化學結構未完全確定，然而已經被查明如下a)由絕大多數的解聚產物的混合物組成，因而與原產物相比具有中等-低的分子量，豐富的分子量在相似窄小范圍的相似片段，以及具有比平均段偏小的最小片段。
b)與原產物相比，還顯著的地減少了艾杜糖醛酸型糖單元和葡糖醛酸型單元間的比例。
另一種肝素的化學結構修篩，可在新肝素衍生物中找到，這部分已經在一些由肝素酯的堿處理得到的肝素片段中描述，例如在不飽和單糖體存在下的脫硫酸根作用。
對新的肝素衍生物的鑒定可通過所述的化學測試完成，除了所述化學測試之外應用光譜，特別是核磁共振法(NMR)，尤其能從本文描述的肝素片斷中區分出新衍生物。
用一種醚化劑處理肝素季銨鹽，該醚化劑選自于通常所用試劑，也就是說，可衍生于一種低碳碳氫化合物，如低碳烷基，鹵化物，如乙基溴化物，并在習慣應用試劑中，如二甲亞砜或二甲基甲酰胺，引用肝素酯，如英國專利No.1501095中描述的。如在堿處理這些酯，那么可在本發明步驟第二步中使用，得到不同的肝素片斷，并可用NMR分析驗證。
實施例中所述的新的低分子量肝素衍生物包括一種有機產物，可主要根據NMR光譜數據高頻處數據體現(對質子用為400-500MHZ對C-13用為100-125MHz，它采用傳統的FT中一因次法，用至少二因次法(H-H和C-H關聯使用)證實，在可能情況下采用更先進方法(例TOCSY二全關聯光譜法)，在研究這些復雜產物中這些研究都是必要的。
對于所用方法所得結果的全面檢測，這是可能的得到下述結論1)該新“低分子量肝素”是一種復雜的寡糖混合物，在N及O位上硫酸化，反應出原肝素的多相性。其基本組成包括IdoA及Glc-nAc，不同地被硫酸化，且進一步包括次級結構(尤其是GlcA)相互連結在一起，提供了不同的順序關系。
2)對于起始原料的肝素來說，本發明目的是產物顯示了低的I-doA/GlcN率的比例，該減少可用NMR檢測出來。進一步說，典型的IdoA程序的異頭基部位的信號(2SO3)-ClcNSO3)(6SO3)(102和99.5為碳，5.18和5.32為質子)證實了強烈的降低作用。而這種變化在已知的低分子量肝素中不能察覺的，即使可能，也是在頗低程度。同時，顯著的強信號顯示了一種新的未取代的單糖單體(見第4點)。
3)另一種特征是新信號的顯示(在54.2和53.3ppm處為碳，相關聯的質子分別在3.73和3.68ppm處)，它們是相配伍的與本文中只在2位上具有GlcN殘余物，而在N原子上沒有SO3H基。這種特征經2-D核磁共振檢測證實在已知的低分子量肝素樣品中是實際上不存在的。
4)特別是，大多數的寡糖末端帶有不飽和的單糖單體、在1-2位三取代的上述低聚糖可通過NMR表示(信號在147和172ppm為C-13，在6ppm處雙峰為質子)這些信號在其他已知的低分子量肝素是不顯示的或極其衰弱。
因而必須盡可能明確指出，本發明步驟的第一步反應不是簡單的酯化反應，而更復雜的化學反應。
因而從這些發現中可假定為本發明的肝素類產物是新的且不同于資料中已記載的肝素片斷例如，不同與歐洲專利NO.03020304中記載的片斷，通過肝素酯堿化處理得到，片斷適合于形成帶銅離子的復合物它具有生成血管的作用物的形成。同樣，在U.S專利NO4，440，926中記載的已經確實的肝素片斷通過原料嚴格限制的肝素酯經NaOH 0.1-0.5N在20到60℃間處理得到，不能確定為本發明的產物上述的本發明新的肝素衍生物性能可通過下列實驗鑒定，其所往事的方法記載于實施例中并且已知標號名稱為PE，在該實驗中，未分級的肝素(UFH)與低分子量肝素衍生物(CY216＝Frax-ipsrineR)為對比產物。這些產物是商業上可供應酸并能同樣適用于治療血栓形成。
示圖簡述下列實驗中的參考1表示與UFH和CY216相比的PE體外試驗中的抗凝血活性，所得的凝血酶時間(秒)數據表明每一測試物7-10次的重復所得的平均值。
圖2表示UFH和CY216相比的PE體內試驗抗凝活性經靜脈注射后對凝血酶時間影響，用于第一試驗產品用5個免子實驗所得平均值的數據。
圖3表示與UFH和CY216相比的PE體內抗凝活性抗FXa活性(皮下注射后未顯示的動力學)數據來于用于每一測試物的5只兔子試驗的平均數值。
圖4表示靜注后對PF4的體內活性，與UFH及CY 216相比對PE的親和性，1.在體外重建中的抗凝活性HUMAN PLASMA材料和方法產物測試(溶解度和濃度)測試下列產物-肝素衍生物PE-未分解肝素(UFH)-低分子量肝素衍生物(CY216-FraxiparineR)這些測試產物溶于無菌鹽水，并在濃度為0.5到12.5μg/ml范圍間測試。
參數1.凝血酶時間(作為抗凝活性的指示)2.抗FXa活性(作為抗凝活性的指示)結果1.凝血酶時間結果列于

圖1，表明-PE在濃度1.25μg/ml開始具有抗凝活性。
-PE的抗凝活性可認為是明顯地小于未分極肝素UFH。(與UFH相比，其所須凝血酶時間的濃度可比UFH大4-5倍。
并觀察到與CY216無重大不同。
2.抗FXa活性結果列于表1，初步數據表明-PE在濃度3μg/ml開始具有抗FXa活性。
-該抗FXa活性可清楚地比肝素為差。然而，也必須注意該活性也比CY216為差的這項性能但是與在UFH比較觀察中得到的結果相等，區別較UFH為小。
表1與未分級肝素和CY216相比PE在體外試驗中的抗FXa活性濃度 UFH CY216 PE(μg/ml)
0.5 0.336 - -1 - 0.331 0.3421.5 0.281 - -2.5 0.212 - -3 - 0.261 0.2963.5 0.179 - -5 - 0.200 0.2457 - 0.158 0.201數據在每一測試產物每個濃度測三次。
2.于體內試驗中經靜脈注射及皮下注射之后在兔子血漿中抗凝活性。
新的肝素衍生物PE的抗凝活性通過體內試驗法在兔子血漿上顯示。我們測試了尤其是a)凝血酶時間，用經靜脈中急性注入(i.v.)大丸劑測試用產物后的動脈血;
b)抗FXa活性，急性皮下注射(s.c.)后的動脈血測試。
這種方法具有高度的敏感性，表示了測試物的生物利用度，經皮下注射給藥后表示了監測產物消失的動力學產物。
將測試產物溶于無菌鹽水溶液且注射急性為靜脈注射0.86mg/kg的劑量和皮下注射1-2mg/kg劑量。
測試的敘述a)凝血酶時間本測試表明了經靜脈注射后注射大丸劑測試物后的在各種時間隔隙(2-5-10-20-30-40分鐘)下，取兔子動脈血實測凝血酶時間。
b)抗FXa活性通過測量抗FXa活性(用對極低濃度化合物敏感的染色體基因測驗)可以監測該測試物在循環很長時間內存在。動脈血的樣品(從耳朵的中樞動脈)發生在皮下注射后各種間隔內取樣，(1-2-3-4-5-6-7-8小時)。
結果a)凝血酶時間結果列于圖2，表示-PE在靜注中0.86mg/kg時具有低抗凝活性，確定了體外試驗數據。
-PE的抗凝活性也明確比UFH為差，但與CY216無明顯不同。
b)抗FXa活性圖3表示-PE(皮下注射1mg/kg后)UFH能在長時間內保持存在于循環中，當增加到2倍量時，即2mg/kg皮下注射。
因此肝素衍生物PE的消失動力學比UFH為慢但和CY216相似。
3.體內試驗中對血小板因子4(PF4)的親和力通過下述的實驗描述，我們可測得新的肝素衍生物PE對人體PF4的親和力，即，這些產物對PF4的結合性能。
在體內試驗中監測在不存在肝素及存在肝素下PF4在循環中消失的動力學。
我們已經知道肝素或葡糖胺基聚糖(GAGS)，先于PF4給藥，則明顯增加其動力學(G.Cella et al人體血小板因子4和兔子中含有葡萄胺基聚糖和硫酸魚精蛋白的相互作用物。Eur.J.ctin，Invest.17548-554;1987)。
結合PF4的化合物也因此能延長其在循環中的存在。這種效應與GAG注入量及其對PF4親和性成正比。
測試物溶于無菌鹽水溶液及其注入量靜注0.8mg/kg。
測試的敘述測試物的給藥是急性的(靜脈大丸劑注射)，劑量0.86mg/kg。注射后2-3分鐘后從耳朵的中心動脈取血樣在第一大丸劑給藥用后5分鐘，再給藥含純人體PF4的第二次給藥(30μg/kg)。
實驗在PF4給藥后1.5-2.5-5-10-20-30分鐘取樣。取來后經離心分離儲存這些可用RIA試驗法(一般適用于小動物)測試人體PFA。
結果列于圖4，得到的數據表明-PE對血小板因子PF4具有親和性，并逐漸從循環中消失直到給藥后30分鐘到達低值。
-PE對PF4的親和性比UFH低(約低60%)，且和PF4的復合物的消失動力學遠比UFH快得多，但其與CY216相同。
4.兔子血栓模型中在體內試驗中抗血栓的形成活性。
下述的實驗確定了新肝素衍生物PE的體內抗血栓形成的活性。其目的是測驗產物效應以避免在兔子頸動脈中的動脈血栓的急性模型中的動脈血栓的形成的效果，以及內皮損傷和血管直徑的減小。
測試物溶于無菌鹽水，且靜注法給藥濃度在1.2-6mg/kg內。
模型的敘述實驗在用Nembutal(30mg/kg大丸劑靜注)麻醉的兔子上進行并切開氣管以強制呼吸。將一根管子植入股動脈及動脈以連續注射麻醉劑和藥物。監測全身血壓以及將頸動脈用流速計和圈套器固定。當系統穩定后，在一定時間間隔內進行動脈狹窄的測量。(不少于20分鐘后，可用外科手術鉗進行機械損傷，且在損傷的血管上形成動脈狹窄。
監測流量減少程度直到0值，相當地關閉血管。以同樣方法控制頸動脈。然后總計在8分鐘內，將測試物用靜脈輸，輸注后兩分鐘進行機械損傷。
流量經監測成保持恒量直到給藥后至少一小時，實驗結束后用可用過量麻醉劑殺死動物。
結果列于表2，數據表明-PE能徹底避免閉合血栓的形成其效應在靜注6mg/kg較顯著。
-PE的抗血栓形成效應比未分級肝素UFH差(約差5倍)，可觀察到低至mg/kg時形成閉合血栓，PE的藥物效應與CY216相同。
表2在兔子動脈狹窄模型中的與未分級肝素(UFH和CY216)相比較，PE的抗血所形成的活性。
產物 靜注用量 NO.閉合的動物數NO.處理過的動物數UFH 1.2mg/kg 2/12PE 6mg/kg 2/123mg/kg 6/8CY216 6mg/kg 2/123mg/kg 5/9
5.在體內試驗中靜脈血栓中抗血栓形成的活性。
下述實驗確定大鼠靜脈血栓模型中PE的靜注抗血栓形成活性。
通過阻止腔靜脈下位應用靜脈停滯技術，由于血流在連在左腎靜脈的腔靜脈分支的變化，該方法能導致主要纖維蛋白血栓的形成。
因而實驗模型證實了通過給藥及停滯作用對抗凝血素藥物的活性敏感度，特別是對肝素的抗血栓形成可得到證明是靈敏的(在閉塞作用及停滯使用后)。
將測試物溶于無菌鹽水，靜脈內注射劑量靜脈注射0.5-3mg/kg(在停滯發生前15分鐘)。
測試描述實驗在重175-200克的CD-COBS雄性大鼠身上進行。動物先用戊巴比妥鈉麻醉(40mg/kg腹腔注射)，其下側用乙醇消毒。在大鼠身上在腹部中央從肋骨開始切開4-cm口子。將沿股動脈的中部從共同骼骨動脈上，分離出腔并立即用棉線在連有左腎靜脈的分叉處束緊。并立即雙重閉塞在夾叉下面的左腎并必須保持恒定壓力約5秒鐘。然后縫合腹部。2小時后，再打開腹部以確證血栓形成情況。隔斷股動脈后，相當與共同骼骨動脈，循環中具有止血藥，閉塞后的血管用針縱向切開，取出血栓，浸入蒸餾水中，用紙吸干然后放入干燥箱內干燥24小時，測定干燥產物重量用克表示。
結果涉及靜脈停滯后2小時的血栓重量(mg)(表3)數據和血栓發生率1%(表4)的數據表明。
-PE具有抗血栓形成效應;其保護性效應(預處理)在1.5mg/kg靜注時顯露。
-PE的這個效應比未分級肝素UFH(其在0.5mg/kg靜注，即表現出這種效應)為差。
表3與UFH相比，靜脈停滯模型中PE在體內的抗血栓形成效應靜脈停滯2小時后得到的血栓重量(mg)(靜注測試物后15分鐘，所得到的效應)。
用量(mg/kg i.v)產物 0 0.5 1.0 1.8 2.0 3.0n＝15 n＝14 n＝24 n＝20 n＝14 n＝14PE 2.2 1.4 1.5 0.8＊0.0＊＊0.0＊＊UFH 2.2 0.7＊0.5＊＊0.02＊＊- -＊P＜0.05，＊＊＜0.01 Dunnett的測試n＝動物個數表4與UFH相比在靜脈停滯模型中PE體內的抗血栓形成效應靜脈停滯2小時后得到的血栓發生率(%)(在靜注給藥測試物后15分鐘所產生的效應)。
用量(mg/kg i.v)產物 0 0.5 1.0 1.8 2.0 3.0n＝15 n＝14 n＝24 n＝20 n＝14 n＝14PE 93.3 85.7 62.5 60.0 0.0 0.0
UFH 93.3 57.1 50.0 14.3 - -n＝動物個數6.對大鼠出血時間的影響下述實驗確定的靜脈注入測試物15分鐘后PE對出血時間效應。
測試物溶于無菌鹽水，其靜脈給藥濃度在1-3mg/kg范圍間。
測驗描述該實驗在CD-COBS雄鼠(175-200gr)身上進行，測試實體經靜脈急性給藥。
在切割、尾部的標準模板法15分鐘后觀察出血時間(用秒計)(Dejana et al大鼠出血時間不同實驗條件的比較。Thromb Haemo-stat 48108-111;1982)結果所得數據(表5)表明-PE對“出血時間”的影響在2.0mg/kg i.v.時顯著增加。
-PE的效應明顯比未分級肝素低(后者出血值在1mg/kg靜注時即顯著增加)，但與CY216相近(數據未報導)。
令人感興趣的是要得到出血時間相同值PE的給藥量必須至少比UFH大三倍。
表5靜注測試物15分鐘后，PE與UFH對出血時間(秒)影響的比較。
用量(mg/kg e.v.)產物 0 1.0 1.5 2.0 3.0
n＝14 n＝14 n＝14 n＝14 n＝14PE 130 146 147 250＊389＊＊UFH 130 413＊＊487＊＊- -＊P＜0.05;＊＊P＜0.01 Dunnett的測試n＝動物個數7.在小鼠內用靜注及皮下注射體內法后的耐受性本實驗是觀察在鼠體內經靜注及皮下給藥化合物DE后的最大耐受性。
測試物溶于無菌鹽水，測試濃度為125-2000mg/kg之間用靜注及皮下注射。
測試描述實驗在CD-1雄鼠和雌鼠(C.River(25-35gr)身上時間，包括兩步。
1)篩選組省經下列之一的劑量治療的一個雄鼠和一個雌鼠125，250，500，1000和2000mg/kg。觀察治療七天內的死亡率。
2)組包括5只雄小鼠和5只雌小鼠用(每一化合物及每一種給藥途徑)治療，在篩選組基礎在具有最大耐受劑量。觀察14天，期間可觀察動脈活動的死亡率及存在，和一般中毒癥狀。在死亡率實例中從最小劑量開始，直到發現最大耐受劑量。如可能，可在所述動物身上進行尸體解剖。
結果1.靜注耐受量如表6和表7的本測試化合物最大耐受量值證實如下-PE1000mg/kg靜注-未分級肝素UFH125mg/kg靜注
-CY216 1000mg/kg靜注因此可注意到PE耐性未分級肝素UFH大。解剖在治療后死亡的動物經未分級肝素UFH在500和250mg/kg治療后死亡的動物，肉眼未發現可見物，除在某些動物中，可能在腸中存有內出血殘留物。
2.皮下注射耐受性所得結果列于表8和表9，表示測試和產物的最大耐性如下-PE2000mg/kg s.c.
-未分級肝素UFH125mg/kg s.c.
-CY2162000mg/kg s.c.
似靜脈給藥途徑，PE的耐性遠比未分餾肝素(UFH)大，與CY216相似。
較重要地指出-在所有用CY216 2000mg/kg治療的動物(10/10)中可在背部觀察到皮膚表面有壞死的圓形面積，相應于注射部位，其大小在各動物上不同(最大直徑約1cm)。解剖發現壞死只限于表皮，因此并不影響其下層肌肉。
-在用PE2000mg/kg s.c.治療的動物中觀察到無異常現象。
-經UFH250mg/kg治療后死亡的動物在背部皮下存在過敏性傷痕，當其部位是經治療時。
因而皮下耐性受數據表明了化合物PE與CY216的不同進一步說，盡管他們最大耐受性用量相同，但是CY216皮膚壞死區域出現在注射位置，表明CY216的局部耐受性比PE小(后其未出現異常現象)。
表6經單次靜脈注射后，化合物PE，CY216及未分級肝素的致死率(篩選)治療 死亡動物 治療動物(mg/kg靜注) 雄性 雌性PE2000 0/1 0/1PE1000 0/1 0/1PE500 0/1 0/1PE250 0/1 0/1PE125 0/1 0/1CY216 2000 1/1 0/1CY216 1000 0/1 0/1CY216 500 0/1 0/1肝素UFH 2000 1/1 1/1肝素UFH 1000 1/1 1/1肝素UFH 500 0/1 0/1肝素UFH 250 0/1 0/1肝素UFH 125 0/1 0/1表7經單次靜脈注射藥物后PE，CY216及未分級肝素的致死率治療 死亡動物/治療動物 死亡時間(mg/kg靜注) 雄性 雌性 治療后天數立刻 1 2 3 4
PE2000 3/7 1/5 2 - 1 - 1PE1000 0/5 0/5 - - - - -CY216 1000 0/5 0/5 - - - - -肝素500 0/5 2/5 - 2 - - -UFH250 3/5 0/5 - 3 - - -125 0/5 0/5 - - - - -＊在治療分鐘內表8單次皮下注射藥物后的化合物PE，CY216及未分級肝素UFH的致死率(篩選)治療 死亡動物 治療動物(mg/kg s.c.) 雄性 雌性PE2000 0/1 0/1PE1000 0/1 0/1PE500 0/1 0/1PE250 0/1 0/1PE125 0/1 0/1CY216 2000 0/1 0/1
CY216 1000 0/1 0/1CY216 500 0/1 0/1肝素UFH 2000 1/1 1/1肝素UFH 1000 1/1 0/1肝素UFH 500 1/1 0/1肝素UFH 250 0/1 0/1肝素UFH 125 0/1 0/1表9單次皮下注射用藥物后的化合物PE，CY216及未分級肝素(UFH)的致死率治療 死亡動物/治療動物 死亡時間(mg/kg靜注) 雄性 雌性 治療后天數立刻 1 2 3 4PE2000 0/5 0/5 - - - - -CY216 2000 0/5 0/5 - - - - -肝素250 1/5 2/5 - 2 1 - -UFH125 0/5 0/5 - - - - -結論前面的體外及體內結果描述出肝素衍生物PE的令人感興趣藥理性能全貌，并與未分級肝素(UFH)區分，使它的藥理結果更有價值。
PE的活性略不同于CY216，后者是法國市場上普遍使用的最好的低分子量肝素之一，并表明尤其是在鼠身上進行皮下注射后的較佳局部耐受性進而言之，盡量其最大耐受性用量相同，所用經CY216(2000mg/kg s.c.)治療的動物在其皮膚注射部位存有明顯壞死，而經PE治療的動物皮膚無反應。
藥物體內及體外活性例中，可發現PE具有-抗凝血活遠比UFH低;
-皮下注射藥物后的生物利用度遠比UFH大，對于相同藥理效應，每天只需給予少量藥物;
-與UFH相比，有其較小的出血時間及在注射部位不存在皮膚壞死表明其副作用較小，與CY216相比(法國市場上最好的小分子量肝素)，CY216能引起所有徑其治療的動物的局部不能耐受現象(壞死);
-體內抗血栓形成活性表現在大鼠靜脈停滯模型及兔子動脈血栓模型中。產物在1.5和6mg/kg之間的靜注劑量間能有效地防止這些疾病發生，更佳地，不引起任何顯著變化的副作用。
特別是，對于靜脈部位的抗血栓活性，用量為1.5mg/kg靜注的衍生物PE不會引起出血時間變化，與UFH不同。
本發明的新的，低分子量肝素衍生物可作為抗凝血和血小板凝結抑制劑以取代未分級肝素所有特征應用。其用量適用每一特殊例子，用靜注途徑，正規量為1-7mg/kg每天。
在本發明操作中所述的前面步驟中所用的肝素可為任何類型或各種起始原料，例如肝素可取于豬、牛、羊的腸和牛心臟，尤其是任何種類在商業上可提供的普遍適用或文獻中記載的各一產物具有較寬范圍分子量，例如2，000和30，000D之間，特別是未分級肝素UFH，也可以用從標準肝素中分級(2000-10，000D)的低分子量肝素。以及，分子量為500-10，000D的肝素片斷可用化學或酶方法從部分解聚肝素得到。用于所述步驟的原材料季銨鹽可用已知方法制備，例如通過肝素鈉鹽或鉀鹽的水溶液，如帶有季銨基的磺酸型樹酯處理。出來的季銨鹽可通過冷凍干燥流出液得到。作為季銨鹽，主要應用衍生于低碳烷基的四烷基銨鹽，特別是帶有最大值為6個碳原子的烷基，也有可能力烷基芳基銨鹽，如帶有長支鏈烷基基團。在四烷基銨中，四丁基銨鹽特別通用本發明步驟中原材料季銨鹽可通過上述方法運用堿鹽從離子交換液中得到，例如常用類型的肝素的鈉或鉀鹽，即將中性鹽與過量季銨鹽離子反應以得到相應的中性鹽。
季銨鹽是溶解性的可溶于上述的雜環溶劑，和對質子有惰性的極性有機溶劑，如二甲亞砜放二甲基甲酰胺。按工藝的第一步反應，與醚化劑的反應可在上述的雜環溶劑或與對質子有惰性的有機溶劑之一的溶液中進行，較佳在濃溶液中。上述雜環溶劑中，較佳為上述所有環結構未取代的溶劑，即，N-烷基-O-芳基-2-吡咯烷酮，或其環結構上含雜環原子的衍生物，如相應的咪唑、哌嗪或嗎啉衍生物。
雜環溶劑的N-烷基基團較佳衍生于帶最大值六個碳原子的低碳烷基，芳基主要為苯基，可能被1到3低碳烷基取代，特別是甲基。較佳為N-甲基-2-吡咯烷酮。
衍生于具有大于6個碳原子碳氫化合物的醚化劑為一種帶相應碳氫基的化合物，如含相應碳個數的醇和有相應數量、酸反應成酯基，可為脂肪族或芳脂族醇，較佳地帶有最大值為18個碳原子，如己醇，庚醇，辛醇，壬醇。酯試劑可衍生物無機或有酸，如氫酸，硫酸或亞硫酸，烷基或芳基磺基，如甲基磺酸或鄰甲苯磺酸。氫酸酯可為氯化物，溴化物和碘化物。
季銨鹽與上述醚化劑的反應在室溫或略高于室溫下進行，如不超過60℃，保持反應若干小時，如16小時。
反應產物經分離后進入工藝的第二步反應，即堿化處理。或直接轉化成最終產物，可直接在溶液中進行堿化處理，可能的話，濃縮第一步反應產物第一步反應后在溫和條件下蒸發溶劑且在殘留物中進行堿化處理。因而可能成為本發明步驟的“-鍋煮”方法。
肝素季銨鹽與醚化劑的反應產物的堿處理次在高溫下進行，較佳為50℃到120℃，最佳為約70℃，反應約2小時。使用堿金屬水合物，如NaOH或KOH，或其他無機和/或有機堿，較佳濃度為0.1到1M間。所用堿存在于水或乙醇溶液中，而其他溶劑可用水或水-酒精混合物混和，如，用于上述“-鍋煮”方法例子中的第一步殘留溶劑。
也可選擇分離第一步產生產物，通過加入有機極性溶劑沉淀完成，較佳為脂肪族醇，如甲醇或乙醇，較佳地可加入堿緩沖劑，尤其是羧酸堿金屬鹽，如乙酸或丙酸的鈉或鉀鹽。還可用其他堿緩沖劑，如堿性硫酸氫鹽或堿性磷酸鹽。沉淀產物較佳地用沉淀作用中使用的極性溶劑洗滌，如甲醇。再經重沉淀一次以上或多次以進一步提純沉淀產物，也就是，將產物溶解在水中并用乙醇沉淀之。
由低分子量肝素衍生物組成具具有上述性質的反應產物可按常規以金屬鹽或有機堿游離形式生成。要得到堿鹽可在第二步反應中使用堿水合物，溶液并用酸中和，如氯化氫2M，溶液用不混有水的機有溶劑萃取純化，如二氯甲烷，復重操作多次，用蒸餾水及氯化鈉透析并冷凍干燥。
所用新產物主要形式為其金屬鹽或有機堿鹽。寧可得到金屬鹽而不用堿式鹽可在上述堿化反應中存在相應的堿性水合物離子，可能的話可采用已知技術即應用離子交換法。同樣，還分離肝素產物的酸型，加入由一定計算量的釋強酸至得到的堿鹽，如鹽酸或硫酸，并用適當有機溶劑提取產物，分離出肝素游離態產物且將其轉化成所述鹽。
根據本發明所用的金屬或有機堿鹽中，尤其重要的是藥物在治療上的接受能力，例如堿性或堿土金屬，如鈉、鉀、鈣、鎂鹽，或可能用金屬鹽，如銅或鐵鹽;有機堿鹽可衍生物伯，仲或叔，脂肪族，芳族或雜環胺，如甲基胺，乙胺，丙胺，哌啶，嗎啉，麻黃素，糠醛胺，膽堿乙烯二胺，胺乙醇。
本發明還包括所述的不能直接用于治療的鹽可用于提純新產物，如一些重金屬鹽。
本發明的一部分還包括含通過所述方法制得的低分子量肝素衍生物活性組分的藥物制劑，尤其是其所述的藥物可接受鹽。可用于非腸道，如皮下或靜脈內服用，或局部使用，如乳膏狀或油膏狀，或栓劑，或噴鼻劑。因而可作活性化合物溶液或活性化合物冷凍干燥粉末存在，用一種或多種藥物上可接受的適用于上述應用的賦形劑或稀釋劑混和且具有滲透性它是能和生物流體配伍使用。
本發明除了新的低分子量肝素衍生物外，還包括上述其制備方法。也包括制備方法的單步的實施，即肝素季銨鹽與上述限定醚化劑在所述溶劑之一中進行反應及反應產物的堿化處理。本發明實施例如下。
1)注射藥物配方1.1PE mg 10 20 30 40注射用水加至 ml 0.1 0.2 0.3 0.4裝有含用于皮下注射的無菌溶液的待用注射器。
1.2-PE mg 150 300其他組份
注射用水加至 ml 4 8將有含用于靜脈內注射的無菌溶液的小瓶。
1.3PE mg 10 20 30 40其他組份氯化鈉 mg 0.3 0.6 0.9 1.2注射用水加至 ml 0.1 0.2 0.3 0.4裝有含用于皮下注射的無菌溶液的待用注射器。
1.4PE mg 150 300其他組份氯化鈉 mg 35 70注射用水加至 ml 5 10裝有含用于皮下注射的無菌溶液的小瓶。
1.5PE mg 150 300其他組份氯化鈉 mg 35 70焦亞硫酸鈉 mg 5 10氯丁醇(＊) mg 25 50注射用水加至 ml 5 10裝有含用于各種劑量靜脈內注射的無菌溶液的小瓶。
(＊)1.5實施例中存有殺菌劑氯丁醇可用下列取代芐醇 mg 50 100或氯甲酚 mg 5 102)口服用制劑配方
2.1(丸劑或膠囊劑)PE mg 30 60 120其他組份磷脂酰膽堿+磷脂酰絲氨酸(＊) mg 80 160 320乳糖 mg 50 100 200微晶纖維素 mg 10 20 40滑石 mg 3 6 12膠狀硅膠 mg 3 6 12(＊)配方中磷脂酰膽堿與磷脂酰絲氨酸的比率可以不同。
2.2(丸劑或膠囊劑)PE mg 30 60 120其他組份磷脂酰膽堿+磷脂酰絲氨酸(＊) mg 80 160 320膽甾醇 mg 2 4 8乳糖 mg 50 100 200微晶纖維素 mg 10 20 40滑石 mg 3 6 12膠狀硅膠 mg 3 6 12(＊)配方中磷脂酰膽堿與磷脂酰絲氨酸的比率可以不同。
2.3(粉末的急救包)PE mg 60 120 180其他組份磷脂酰膽堿+磷脂酰絲氨酸(＊) mg 250 500 750膽甾醇 mg 5 10 15
乳糖 mg 100 200 300氣味及如果需要加甜味劑蔗糖(＊＊)至 mg 2000 4000 6000(＊)配方中磷脂酰膽堿與磷脂酰絲氨酸的比率可不同(＊＊)蔗糖可用果糖取代2.4(延長效果的片劑)PE mg 30 60 120其他組份磷脂酰膽堿+磷脂酰絲氨酸(＊) mg 80 160 320乳糖 mg 30 60 120微晶纖維素 mg 5 10 20羥丙基甲基纖維素 mg 10 20 40滑石 mg 3 6 12膠狀硅膠 mg 3 6 12(＊)配方中磷脂酰膽堿與磷脂酰絲氨酸的比率可以不同。
2.5(耐胃液的片劑)PE mg 30 60 120其他組份磷脂酰膽堿+磷脂酰絲氨酸(＊) mg 80 160 320乳糖 mg 50 100 200微晶纖維素 mg 10 20 40滑石 mg 30 60 120膠狀硅膠 mg 3 6 12甲基丙烯酸共聚物 mg 15 30 60
(＊)配方中磷脂酰膽堿與磷脂酰絲氨酸的比率可以不同。
2.6(耐胃液延長效果的片劑)PE mg 30 60 120其他組份磷酸酰膽堿+磷脂酰絲氨酸(＊) mg 80 160 320乳糖 mg 50 100 200微晶纖維素 mg 10 20 40羧丙基甲基纖維素 mg 5 10 20滑石 mg 30 60 120膠狀硅膠 mg 3 6 12甲基丙烯酸共聚物 mg 15 30 60(＊)配方中磷酰酸膽堿與磷脂酰絲氨酸的比率可以不同。
2.7(用于頭服用滴劑)PE mg 30 60 120其他組份檸檬酸 mg 7.5 15 30純水 ml 0.25 0.5 12.8(顆粒劑＊)PE mg 30 60 120其他組份檸檬酸 mg 7.5 15 30蔗糖 mg 30 60 60五味淀粉 mg 12.5 25 25滑石 mg 5 10 10聚乙烯基 mg 4 8 8吡咯烷酮
(＊)每一硬膠丸中含3粒顆劑2.9(耐胃液顆粒劑＊)PE mg 30 60 120其他組份檸檬酸 mg 7.5 15 30蔗糖 mg 30 60 60谷物淀粉 mg 12.5 25 25滑石 mg 5 10 10聚乙烯基 mg 4 8 8吡咯烷酮甲基丙烯酸 mg 10 15 15共聚物(＊)每一明膠丸中含3粒顆劑3.用于鼻或肺的配方3.1PE白細粉末 mg 20 40作為細的白色粉末，其活性細份包含在明膠膠囊中當準備服用時，打開并裝入適當器皿中以吸入。
3.2(用以吸入的粉末)PE細白粉末 mg 20 40磷酸酰膽堿+磷脂酰絲氨酸＊mg 30 60作為細的白色粉末，其活性組份包含在明膠膠囊中，當準備服用時，打開并裝入適當器皿中以吸入。
(＊)配方中磷酸酰膽堿與磷脂酰絲氨酸的比率可不同。
4.施用于直腸結存的配方
4.1PE mg 30 120半合成甘油脂 mg 1940 18804.2PE mg 30 120磷酸酰絲氨酸+ mg 30 120磷酸酰膽堿 mg 100 200半合成甘油酯 mg 1840 1680概況地說，本發明的低分子量肝素衍生物及其鹽通過溶于雜環有機溶劑的的肝素的季銨鹽，該雜環有機溶劑選用于N-烷基-吡咯烷基-2-酮，N-烷基-哌啶基-2-酮，可未取代或被低磺烷基取代，反應被其他雜原子或其他雜基團如選自基團-O-，-S-和-NH-隔斷的衍生物，或存在于非質子傳遞溶劑中的所述化合物的濃溶液中，與衍生于具有6到30個碳原子，較佳為8到18個碳原子的碳氫化合物的烷基化劑(醚化劑)在約20℃(室溫)到60℃溫度下反應較長時間，例如，約5到20小時。然后在5°-120℃溫度間，較佳約70℃下，將反應產物與無機或有機堿性水溶液反應。然后，將堿化反應后的產物分離或游離態或其堿金屬或堿土金屬鹽。也可通過互相轉化得到其其他金屬鹽或有機堿式鹽。較佳地，在第二步反應步驟中，反應產物與堿性氫氧化物水溶液反應。產物低分子量肝素衍生物及其鹽用于藥物治療方面，如，作為抗血栓形成劑。
權利要求
1.一種制備低分子量肝素衍生物和/或其鹽的方法，其特征在于，(1)將溶于雜環有機溶劑的肝素的季銨鹽，雜環有機溶劑選自于N-烷基-吡咯烷基-2-酮，N-烷基-哌啶基-2-酮，可未取代或被低碳烷基取代，或反應被其他雜原子或其他雜基團如選自基團-O-，-S-或-NH-隔斷的衍生物，或存在于非質子傳遞溶劑中的所述化合物的濃溶液中，與一種衍生于具有6到30個碳原子的碳氫化合物的烷基化劑，在室溫或略高于室溫的溫度下反應，(2)將反應產物與一種無機或有機堿性水溶液在5°到120℃溫度間反應，和(3)分離肝素衍生物得到其游離態或其堿金屬或堿土金屬鹽。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括轉化所述肝素衍生物或鹽得到其他金屬鹽或有機堿式鹽。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括轉化所述的游離態肝素衍生物為藥物上可接受的鹽或轉化所述鹽為游離態肝素衍生物。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，反應(2)中所述的反應產物與一種堿性氫氧化物水溶液反應。
5.如權利要求1或4所述的方法，其特征在于，烷基化劑與肝素的季銨鹽反應的反應產物是在與無機或有機堿反應前分離出。
6.如權利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述的具有分子量變化范圍2，000到30，000道爾頓的肝素的季銨鹽作為原材料使用。
7.如權利要求1或4所述的方法，其特征在于，未分級肝素的季銨鹽作為原材料使用。
8.如權利要求1或4所述的方法，其特征在于，經具有分子量2，000到10，000道爾頓的肝素分級得到的低分子量肝素的季銨鹽和經肝素不完全化學或酶促解聚得到分子量為500到10，000道爾頓的肝素片斷作為原材料使用。
9.如權利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述的季銨鹽為其中烷基具有1到6個碳原子的四烷基銨鹽。
10.如權利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述的季銨鹽為四丁基銨鹽。
11.如權利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述雜環有機溶劑中的N-烷基為一種具有1到6個碳原子的低碳烷基。
12.如權利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述的雜環有機溶劑為N-甲基-吡咯烷酮。
13.如權利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述的烷基化劑為一種帶6到30碳原子的脂肪族或芳族醇的酸式烷基化劑。
14.如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述的烷基化劑具有8到18個碳原子。
15.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述的烷基化劑為碘化物，溴化物或氯化烷基或烷基或芳基磺酸的酯。
16.如權利要求1或4所述的方法，其特征在于，烷基化劑與溶于所述雜環有機溶劑中的季銨鹽在20°到60℃溫度下反應。
17.如權利要求1或4所述的方法，其特征在于，烷基化劑與肝素的季銨鹽反應的反應產物加入極性有機溶劑沉淀后分離得到。
18.如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述的極性有機溶劑為一種脂肪族醇。
19.如權利要求18所述的方法，其特征在于，將堿性緩沖劑加入于所述的脂肪族醇。
20.如權利要求19所述的方法，其特征在于，所述的堿性緩沖劑為一種羧酸堿鹽。
21.如權利要求17所述的方法，其特征在于，沉淀產物用相同的有機溶劑反復沉淀多次。
22.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反應(2)的反應產物是與堿性氫氧化物或另一種無機和有機堿在濃度為0.1到1M水溶液或醇水溶液中，5°到120℃溫度間反應。
23.如權利要求22所述的方法，其特征在于，堿反應步驟是通過用0.1-1M氫氧化鈉水溶液在約70℃溫度下，足夠長時間分離后完成以得到所述的低分子量肝素衍生物和/或其鹽。
24.如上述權利要求之一所述的方法，其特征在于，從反應(2)得到的反應產物用堿性水溶液中和，再用不溶水混和的有溶劑萃取，和用蒸餾水及氯化鈉透析分離得到。
25.一種制備低分子量肝素衍生物和/或其鹽的方法，其特征在于，(1)將具有分子量為15，000道爾頓溶于N-甲基-吡咯烷酮的肝素的季銨鹽與1-碘辛烷在室溫下反應約16小時，(2)將反應溶液倒入加有乙酸鈉的甲醇中沉淀出反應產物，(3)通過從加有乙酸鈉的甲醇中重沉淀多次而提純產物，(4)將干產物與0，5N氫氧化鈉水溶液在近似70℃溫度下反應約2小時，(5)用2M鹽酸中和反應溶液，(6)用二氯甲烷萃取溶液多次，(7)用蒸餾水和0.1M氯化鈉透析溶液，和(8)凍干所得溶液。
全文摘要
低分子量肝素衍生物及其鹽通過溶于雜環有機溶劑或非質子傳遞溶劑中的肝素季銨鹽與具有6到30個碳原子的烷基化劑在20℃到60℃溫度下反應足夠長時間，并在5到120℃溫度下，將反應生成物與無機或有機堿如堿性氫氧化物水溶液反應，再分離所得肝素衍生物為其游離態或其堿鹽。本發明制得的肝素衍生物包括絕大多數為具有狹窄分子量范圍的解聚產物的混合物。這些產物作為抗血栓形成劑使用。
文檔編號A61KGK1062537SQ9111185
公開日1992年7月8日 申請日期1991年12月20日 優先權日1990年12月20日
發明者弗朗切斯科·德拉·瓦萊, 奧雷羅·羅米歐, 居特·基施納 申請人:菲迪安股份公司