專利名稱：含有表唾液酸復合碳水化合物的藥物的制作方法
技術領域：
本發明與一種使用表唾液酸復合碳水化合物(episialo complex carbohydrate)的血清診斷藥物有關，尤其是與一種癌癥血清診斷藥物有關。本發明還與一種癌癥疫苗有關，并且與一種血清診斷方法有關，尤其是與一種預防和治療癌癥的方法有關。
碳水化合物鏈是細胞表面上抗原性的重要成分，細胞表面上的碳水化合物鏈抗原發生異常就變為癌癥抗原。近來，使用抗癌癥抗原的單克隆抗體治療癌癥和對癌癥進行血清診斷的可能性受到人們的特別推崇。
進一步講，有可能通過檢查人體中抗癌癥抗原的抗體的存在來診斷癌癥。提供一種可與癌癥抗原反應的抗體是很必要的。
本發明的一個目的是提供一種與癌癥抗原反應的抗體。
本發明的另一個目的是提供一種使用這樣一種抗體的預防、治療和診斷的藥物。
本發明的發明者發現了在一種動物血清中存在一種能識別表唾液酸復合碳水化合物的抗體，并完成了本發明。
本發明與一種含有表唾液酸復合碳水化合物的血清診斷藥物有關，尤其是與一種癌癥血清診斷藥物有關，并且與一種包括使表唾液酸復合碳水化合物與血清反應的診斷方法有關，尤其是與一種癌癥的血清診斷方法有關。
本發明的另一個實施例是一種含有表唾液酸復合碳水化合物的癌癥疫苗。
圖1說明一種正常小鼠的血清與GM3和epiGM3的反應度。
圖2說明一種已植入癌癥的小鼠的血清與GM3和epiGM3的反應度。
圖3說明一種植入癌癥的小鼠的血清與GM3，epiGM3，GM4，epiGM4，GM5和epiGM5的反應度。
圖4說明N-乙酰神經氨糖酸對植入癌癥的小鼠的血清與epiGM3反應度的抑制作用。
以下將對本發明作更詳細的說明。
神精節苷脂是一種復合碳水化合物。存在于天然神經節苷脂中的乙酰神經氨糖酸的鍵合結構是α型的。然而，近年來通過一種神經節苷脂的化學合成方法已經合成了乙酰神經氨糖酸的鍵合結構為β型的所謂表唾液酸復合碳水化合物。
所有通常的碳水化合物鏈標記都具有乙酰神經氨糖酸的α型鍵合結構，并且表唾液酸復合碳水化合物可以起一種碳水化合物鏈癌癥標記作用這一點一直未被人們所了解。
最近人們才了解的碳水化合物的不完整性是由于在癌細胞中合成的碳水化合物鏈中碳水化合物的組合模式的異常所造成的。此外，最近有報道說如果發生癌，就出現N-羥乙酰神經氨糖酸(NeuGc)。人們的唾液酸除胎兒時期外都是N-羥乙酰基型。N-羥乙酰神經氨糖酸很容易通過將乙酰神經氨糖酸5位上的N-乙酰基變為羥基來獲得。這就是說，最近才為人們所了解的碳水化合物的不完整性是基于在碳水化合物鏈中取代基不同或碳水化合物組合模式不同。
這就是說，人們一直不知道出現了一種具有異常碳水化合物鏈的物質，這種異常是由于所述結構類型(例如本發明中所利用的表唾液酸復合碳水化合物)所造成的。
本發明是基于下述知識，即在以患有腫瘤的動物身上所獲取的血清中能識別表唾液酸復合碳水化合物的抗體的含量比未患腫瘤動物身上獲取的血清中的值要高。這使人們聯想到在正常細胞中沒有發現過的表唾液酸碳水化合物或許存在于患腫瘤的動物身上。
本發明的表唾液酸復合碳水化合物是這樣的神經節苷脂，其乙酰神經氨糖酸的鍵合結構是β型的。表唾液酸復合碳水化合物的例子包括epiGM1、epiGM2、epiGM3、epiGM4和epiGM5。
epiGM3是日本專利公告(KOKOKU)1-49354和美國專利4968786中所述的化合物(28)，并且是根據這些公開內容所述的方法制備的。GM3和epiGM3的化學結構如下
epiGM4是在日本專利公開(KOKAT)61-282391和美國專利4751290中所描述的那種化合物(27)，并且根據在這些公開內容中所描述的方法制備。GM4和epiGM4的化學結構如下
epiGM5是在日本專利公開(KOKAT)63-452931和美國專利4730058中所描述的那種化合物(Ⅲ)，并且根據在這些公開內容中所描述的方法制備。GM5和epiGM5的化學結構如下
根據本發明，利用表唾液酸復合碳水化合物進行血清診斷，尤其是進行癌癥血清診斷是可能的。
使用表唾液酸復合碳水化合物的血清診斷可以借助于與傳統的血清診斷相同的方式來進行。這就是說，將表唾液酸復合碳水化合物與動物血清一起進行培養，然后借助于通常已知的檢驗方法，例如ELISA法和RIA法，來檢驗同所述表唾液酸復合碳水化合物反應的抗體的存在，并且，如果必要的話，檢驗所述抗體的數量。
最好是使用一種診斷藥物，使其在一種溶劑(例如乙醇或甲醇)中溶解表唾液酸碳水化合物。所述表唾液酸復合碳水化合物在所述溶劑中的濃度范圍要適當，例如在1ng/ml到1000ng/ml之間。
根據本發明的血清診斷方法，診斷癌癥、傳染病，遺傳疾病和免疫疾病是可能的。
此外，本發明還提供了一種含有一種或多種表唾液酸復合碳水化合物的癌癥疫苗。
這種癌癥疫苗本身就是所述的表唾液酸復合碳水化合物，或是所述表唾液酸復合碳水化合物和佐劑的混合物以及BCG的脂質體的混合物。
本發明的所述癌癥疫苗的接種最好是在1至4星期間進行4至8次，并且最好是每次接種1至1000μg所述表唾液酸復合碳水化合物。
根據使用所述表唾液酸復合碳水化合物的血清診斷方法，診斷癌癥、傳染病、遺傳疾病和免疫疾病是可能的。
使用本發明的癌癥疫苗，人們有可能提供抗癌免疫。
本發明的內容將參考下述例子加以介紹。
神經節苷脂表唾液酸復合碳水化合物GM3和神經節苷脂GM3都是根據在日本專利公開1-49354中所述的方法合成的。表唾液酸復合碳水化合物GM4和神經節苷脂GM4是根據日本專利公開61-282391中所描述的方法合成的。表唾液酸復合碳水化合物GM5和神經節苷脂GM5是根據在日本專利公開61-45293中所述的方法合成的。
小鼠使用由Charles River Japan Co.Ltd和Japan SLC Co.Ltd.買來的并保存在SPF環境中的各種近親繁殖系小鼠。
血清血清的獲得方法是使利用眼底法從小鼠身上采集的血凝固，并將所采集的血進行離心分離。
ELISA測定法ELISA測定法是按常規方法進行的。
將每一份100ng溶于乙醇的神經節苷脂加到一個96穴微量滴定板的每一個穴中，然后使之保持在37℃下，以便完全除去乙醇。將由含5%的牛血清清蛋白(BSA)以及類似物質的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)構成的封阻溶液加入所述的那些穴中，并且將所述點滴板在37℃下培養2小時。在除去封阻溶液后，將所采集的小鼠血加入每一個穴中，并將所述滴定板在37℃下培養1小時。每一個穴都用含1%的BSA的磷酸鹽緩沖溶液洗滌。加有過氧化物標記的抗小鼠IgG、IgM和IgA的抗體被加到每一個穴中，所述滴定板在37℃下培養1小時。每一個穴都用含有1%的BSA的磷酸鹽緩沖溶液洗滌。將含有400μg鄰苯二胺和0.001%的過氧化氫的底物溶液加入每一個穴中，并且使反應在室溫下進行15分鐘。加入8N硫酸使反應中止，然后利用一臺分光光度計測量微量培養板的每一個穴中的反應混合物在490nm波長下的吸收值。
結果(1)小鼠血清與epiGM3的反應度如圖1所示，使取自C57BL/6雌性小鼠(9周齡)的正常血清與epiGM3反應(用實線表示)。然而取自C57BL/6雌性小鼠的正常血清不與GM3反應(用虛線表示)。
如圖2所示，還使9周齡的C57BL/6雌性小鼠(該小鼠已于兩周前植入B16黑色素瘤細胞)的若干份血清與epiGM3反應(用實線表示)。該反應的強度顯著地增加了。然而，這些血清不與GM3反應(用虛線表示)。在圖2中，●、△、▲和□分別表示相應于取自直徑為5mm或小于5mm、6mm、8mm和16mm的腫瘤的那些血清的數據。
將圖1的結果同圖2加以比較，可以清楚地看出取自植入腫瘤細胞的小鼠的血清與epiGM3的反應度要比取自正常小鼠的血清與epiGM3的反應度要強。
圖1和圖2中所示數據是通過扣除本底值并取三個穴的平均值得到的。
(2)小鼠血清同神經節苷脂的反應度(而不是同epiGM3的反應度)
將下述血清稀釋200倍，并試驗與GM3，epiGM3、GM4、epiGM4、GM5和epiGM5的反應度，所述血清是取自帶有6mm腫瘤的小鼠，并且該血清在取自在上述過程(1)中已植入B16黑色素瘤的C57BL/6雌性小鼠(9周齡)的血清之中顯示出最強反應度。如圖3所示，與epiGM3的反應度為最強，與epiGM4的反應度為其次。
圖3所示數據是通過扣除本底值并且取三個穴的平均值得到的。
(3)用乙酰神經氨糖酸抑制小鼠血清與epiGM3的反應度。
將具有各種濃度的N-乙酰神經氨糖酸鈉溶液加入與上述過程(2)中所使用的血清相同的小鼠血清中。試驗血清同epiGM3和同GM3的反應度，并且把它們表示在圖4中(實線表示血清與epiGM3的反應度，虛線表示同GM3的反應度)。圖4所示數據是通過扣除本底值并且取三個穴的平均值獲得的。為了避免在反應溶液中pH值降低的影響，使用了乙酰神經氨糖酸的鈉鹽。
如以圖4中的結果中所看到的那樣，小鼠血清與epiGM3的反應度受到了β型羥基結構的N-乙酰神經氨糖酸的抑制。這樣我們顯然可以假定小鼠血清同epiGM3的強反應度是由epiGM3中乙酰神經氨糖酸基團的β型結構所造成的。
權利要求
1.一種血清診斷藥物，該藥物含有至少一種表唾液酸復合碳水化合物。
2.根據權利要求1所述的血清診斷藥物，其特征在于所述表唾液酸復合碳水化合物是選自epiGM3、epiGM4和epiGM5。
3.一種用于癌癥的血清診斷藥物，該藥物含有至少一種表唾液酸復合碳水化合物。
4.根據權利要求3所述的血清診斷藥物，其特征在于所述表唾液酸復合碳水化合物是選自epiGM3、epiGM4和epiGM5。
5.一種癌癥疫苗，該疫苗含有至少一種表唾液酸復合碳水化合物。
6.根據權利要求5所述的癌癥疫苗，其特征在于所述表唾液酸復合碳水化合物是選自epiGM3、epiGM4和epiGM5。
7.一種血清診斷方法，該方法包括使血清與一種表唾液酸復合碳水化合物的反應。
8.根據權利要求7所述的血清診斷方法，其特征在于所述表唾液酸復合碳水化合物是選自epiGM3、epiGM4和epiGM5。
9.一種診斷癌癥的方法，該方法包括使血清與一種表唾液酸復合碳水化合物反應。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于所述表唾液復合碳水化合物是選自epiGM3、epiGM4和epiGM5。
全文摘要
一種血清診斷藥物，尤其是一種用于癌癥的血清診斷藥物，含有一種表唾液酸復合碳水化合物，例如epiGM
文檔編號A61K31/70GK1055819SQ9110172
公開日1991年10月30日 申請日期1991年2月19日 優先權日1990年2月19日
發明者永井克孝, 須田功, 日野明弘, 杉本守, 田中誠, 伊藤正善, 小川智也 申請人:美克德株式會社