博德特氏菌疫苗的制作方法

專利名稱：博德特氏菌疫苗的制作方法
技術領域：
本發明總地涉及疫苗組合物及其給藥方法。更具體地說，本發明是涉及博德特氏菌粘附抗原及其用于刺激抗博德特氏菌屬感染之免疫力的外膜蛋白質。
博德特氏菌屬(Bordetella)包括下列四個菌種，即百日咳博德特氏菌(B.pertussis)、付百日咳博德特氏菌(B.parapertusis)、支氣管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)及鳥博德特氏菌(B.avium)。鳥博德特氏菌可引起火雞和雞的上呼吸道疾病，其與人的百日咳博德特氏菌和付百日咳博德特氏菌感染(21、23、37、38)以及由支氣管炎博德特氏菌引起的豬鼻炎十分相似。鳥博德特氏菌感染引起的鳥的病癥與兒童的百日咳癥狀相符(26)。在感染后5至7天，鳥會出現抑郁、食欲下降、體重減輕、咳嗽、濕性羅音、外鼻道粘液積聚、呼吸困難及聲音沙啞等病癥(3、18、21、34、37)。小鳥對感染較敏感，而年長的鳥則有一定的抗御能力(36)。臨床癥狀可持續2周至幾個月(7.34)，且由病毒、細菌和真菌等病毒體引起的繼發感染常常是導致發病和死亡的主要原因(3、4、17、21、34)。因此，這類疾病可對農場造成很大經濟損失。迄今為止，還沒有一種普遍適用的鳥博德特氏菌疫苗。
所有博德特氏菌都對有纖毛的氣管上皮細胞表現有特異趨向性(2、41、5)。這些細胞是該細菌屬特有的靶細胞。鳥博德特氏菌在氣管中造成的組織病理學改變，與百日咳博德特氏菌感染的人和侖鼠氣管中所見病變相同(2，3，17，18，19，12，33，34)。在細菌附著寄生于有纖毛的氣管上皮細胞上之后，鳥博德特氏菌感染的鳥氣管和百日咳博德特氏菌感染的侖鼠氣管出現表面不規則、粘液積聚、白細胞滲出及纖毛氣管細胞進行性減少等征象。
因為所有博德特氏菌均粘附于氣管上皮細胞上，所以具有共同特征的表面結構均可參予粘附并可能在疫苗中用作抗原成分。與百日咳博德特氏菌的粘附有關的蛋白質包括菌絲血凝素(FHA)、凝集原(其可以是或不是菌毛)及百日咳毒素(PT)(有關綜述參見文獻44、9)。在體外細胞檢測試驗中，FHA-和PT-百日咳博德特氏菌突變株不能粘附于人纖毛上皮細胞上，而且抗FHA抗體可阻斷百日咳博德特氏菌在各種細胞上的粘附(42)。但FHA-細胞可與Hela細胞很好地結合，且與野生型毒性百日咳博德特氏菌相比，當鼻內感染幼雅小鼠時，無菌毛血細胞凝集素的百日咳博德特氏菌突變株并沒有降低毒力(45)。此外，支氣管炎博德特氏菌、付百日咳博德特氏菌和鳥博德特氏菌均不產生百日咳毒素(20)，鳥博德特氏菌和付百日咳博德特氏菌的大多數菌株也不產生FHA。
關于凝集原在博德特氏菌之粘附中的作用也有相反的觀點。百日咳博德特氏菌的凝集原2、3和6是菌毛抗原(參見文獻44)。抗2型菌毛的單克隆抗體可抑制同源血清型在Vero細胞上的粘附(16)，而抗凝集原1和2的抗體則抑制百日咳博德特氏菌在Hela細胞上的粘附(35，32)。反之，缺乏菌毛的百日咳博德特氏菌可粘附在無纖毛WiDr(43)和人纖毛細胞上。此外，某些有菌毛的菌株缺乏粘附能力(42)。
鳥博德特氏菌的表面上也有菌毛。同百日咳博德特氏菌一樣，已有證據表明鳥博德特氏菌的菌毛參予粘附過程，因為鳥博德特氏菌的菌毛抗體可阻斷該菌對火雞氣管組織分離塊的粘附(22)。但有關鳥博德特氏菌中菌毛介導的粘附的結論性證據尚未得到證實。因此，對于參予細菌在氣管上皮纖毛細胞上粘附之特異性蛋白質的認定仍是不明確的。
可能有幾種以獨立或加和方式起作用的粘附抗原。如果是獨立起作用，則由于突變而缺失一種粘附蛋白(adhesin)時不會阻止粘附;如果是起加和作用的，則由突變而缺失一種粘附蛋白時將會降低粘附力(此與粘附的相對重要性成比例)。在這兩種情況下，由于抗體-抗原相互作用的空間特性可有效地阻止其它結合物與其受體相互反應，所以抗粘附蛋白抗體可阻止粘附作用。
TnphoA的轉座子誘變可用于鑒定細菌細胞的表面蛋白質。TnphoA轉座(27)到基因中可導致野生型蛋白質N末端部分與堿性磷酸酶之間的蛋白質融合，同時丟失插入區下游順序的表達。這些融合的蛋白質被定位到由野生型蛋白質限定的位點上(27)。因此，當將TnphoA插入編碼外膜蛋白質、周質蛋白質或分泌蛋白質的基因后，即可在細菌細胞上表達堿性磷酸酶活性(27)。將攜帶這些插入段的大腸桿菌菌落接種在含有呈色堿性磷酸酶底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-對位甲基聯苯磷酸鹽(XP)(作為唯一的磷酸鹽)的改良的Neidhardt氏MOPS培養基上培養時，即可根據其呈現的蘭色來鑒定這些插入的存在。因為只有存在于胞漿膜外的堿性磷酸酶才表現活性，所以插入到胞漿蛋白質基因中時不能出現蘭色菌落。因此，TnphoA誘變為鑒定必須定位于細菌表面的移植抗原(即粘附抗原)提供了一種有效的方法。但這種TnphoA融合可使基因失活，而且如果該基因限定(編碼)一種細菌存活所必須的蛋白質時，則將會丟失轉座子誘導的突變體。因為博德特氏菌缺少磷酸酶，故可將TnphoA誘變用作鑒定粘附抗原(該抗原用于制作抗博德特氏菌的疫苗)的可靠方法。
也可使用不一定是粘附蛋白的其他外膜蛋白質治療或預防博德特氏菌感染。具體地說，這些蛋白質或其抗體可以阻斷移植抗原在其受體上的附著，從而預防感染的發生。
還可使用抗博德特氏菌外膜蛋白質粗提物的抗體，按本文所述方法鑒定博德特氏菌外膜蛋白質及假定的粘附抗原。可用這些抗體篩選基因庫，以鑒定可產生反應性蛋白質的克隆。
已使用無毒的微生物在疫苗組合物中作為載體。可在這些菌株中引入某些突變，使之在宿主中失去存活能力，即這些菌株不能以一種能引起宿主發生損傷或病變的方式存活。在共同申請人的待批申請No.251，304(申請日1988年10月3日，Curtiss和Kelly(13))中已公開了這些突變體，且該文獻已列為本文參考文獻。
典型的是沙門氏菌突變株，其攜帶可損傷細菌合成腺苷酸環化酶(ATP焦磷酸裂解酶(環化)EC4.6.1.1)(Cya)和環ATP受體蛋白(crp)之能力的缺失突變。也已制成了攜帶天冬氨酸-β-半醛(asd)基因之點突變或缺失的突變體。該酶見于內消旋二氨基庚二酸(DAP)合成途徑中。DAP是粘肽的必要成分，前者可直接影響到細菌細胞壁的形狀和硬度。攜帶asd突變的細菌只能在小心控制的實驗室環境中存活。因此，可將編碼asd(Asd+載體)和有用抗原的重組載體導入Asd-載體細胞中。其中只有編碼所需抗原的細胞能夠存活。使用無毒力的微生物載體來控制博德特氏菌的外膜抗原即可能制成一種抗博德特氏菌感染的有效疫苗。
本發明是基于鑒定和分離在博德特氏菌對氣管上皮細胞之粘附中有重要作用的群集抗原和外膜蛋白質而完成的。該抗原可用于疫苗組合物中，以使受試者免于各種感染。此外，可用重組DNA技術生產該疫苗組合物。基于這些發現，本發明提出下列幾個實施方案。
在一個實施方案中，本發明涉及純化的博德特氏菌屬外膜蛋白質。另一實施方案則涉及得自鳥博德特氏菌的純化的外膜蛋白質。
本發明的另一實施方案，涉及到選自一組根據SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western免疫印跡分析，分子量分別為21KD、37KD、40KD、43KD、46KD和50KD的純化的鳥博德特氏菌蛋白質。
本發明的另一實施方案，涉及一種在醫藥上可接受的載體中配制的、含一種或多種博德特氏菌屬外膜蛋白質的疫苗組合物。
在本發明的另一實施方案中，所說的疫苗組合物含有選自一組根據用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法和Western免疫印跡分析，分子量分別為21KD、37KD、40KD、43KD、46KD和50KD蛋白質的一種或多種鳥博德特氏菌蛋白質，且其中加有醫藥上可接受的載體。
在本發明的另一實施方案中，所說的疫苗組合物含有一種分子量約46KD的鳥博德特氏菌粘附抗原。該抗原是在基本上不能產生功能性腺苷酸環化酶、功能性環AMP受體蛋白質和功能性天冬氨酸-β-半醛脫氫酶或其片段及編碼粘附抗原之基因的鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)無毒力衍生株中表達的。該無毒力衍生物包含一個攜帶編碼天冬氨酸-β-半醛脫氫酶或其功能性片段之基因和編碼粘附抗原之基因的載體。
本發明的另一實施方案，涉及到含有一種或多種鳥博德特氏菌蛋白質的疫苗組合物。所說的蛋白質選自一組根據SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測和Western免疫印跡分析，分子量分別為21KD、37KD、40KD、43KD、46KD和50KD的蛋白質。這些蛋白質是在基本上不能產生功能性腺苷酸環化酶、功能性環AMP受體蛋白及功能性天冬氨酸-β-半醛脫氫酶的鼠傷寒沙門氏菌之無毒力衍生物中表達的。該無毒力衍生株包含一個攜帶編碼天冬氨酸-β-半醛脫氫酶或其功能性片段之基因的載體，所說的功能性片段是與編碼一種或多種鳥博德特氏菌蛋白質的一個或多個基因相連接的。
在另一實施方案中，本發明涉及一種預防和治療脊椎動物上呼吸道疾病的方法，該方法包括給被試對象使用有效量的疫苗組合物，該組合物含有與醫藥上可接受的載體配制的博德特氏菌屬外膜蛋白質。優選的實施方案是，該蛋白質由鳥博德特氏菌產生，且該疫苗組合物的給藥對象為家禽。
在另一實施方案中，本發明提供了用于表達博德特氏菌屬外膜蛋白質的載體微生物，其包括病原微生物的無毒力衍生株，該衍生株實質上不能產生功能性腺苷酸環化酶和功能性環AMP受體蛋白，而能夠表達編碼該外膜蛋白質的重組基因。
在另一實施方案中，本發明提供了用于表達鳥博德特氏菌粘附抗原(分子量約為46KD)的載體微生物，它包括鼠傷寒沙門氏菌的無毒力衍生株。使無毒力衍生株實質上不能產生功能性腺苷酸環化酶、功能性環AMP受體蛋白及功能性天冬氨酸-β-半醛脫氫酶。該載體微生物含有一個攜帶編碼天冬氨酸-β-半醛脫氫酶之基因或其功能性片段及編碼該粘附抗原之基因的載體。
在另一實施方案中，本發明提供了用于表達鳥博德特氏菌屬蛋白質的載體微生物。所說的蛋白質選自一組用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測和Western免疫印跡分析確定分子量分別為21KD、37KD、40KD、43KD、46KD和50KD的蛋白質。該載體微生物包括鼠傷寒沙門氏菌的無毒力衍生株。該衍生株實質上不能產生功能性腺苷酸環化酶、功能性環AMP受體蛋白及功能性天冬氨酸-β-半醛脫氫酶。該載體微生物含有一個攜帶編碼天冬氨酸-β-半醛脫氫酶之基因或其連接到編碼一種或多種鳥博德特氏菌蛋白質的一個或多個基因上的功能性片段的載體。
在另一實施方案中，本發明提供了含有表達暗盒的DNA構建物，該構建物由以下部分組成(a)編碼一個多肽的DNA順序，該多肽至少含有博德特氏菌屬或鳥博德特氏菌外膜蛋白質的一個抗原決定基;
(b)可操作地連接到編碼順序上的控制順序，從而使該編碼順序能在宿主細胞中轉錄和轉譯，而且DNA編碼順序或控制順序中至少一個是與宿主細胞異源的。
在另一實施方案中，本發明提供了生產這些融合蛋白質的方法，以及生產純化的、對這些外膜蛋白質特異之多克隆或單克隆抗體的方法。
本專業領域內的技術人員將會理解到本發明的其他一些實施方案。


圖1顯示克隆到pYA2402的XhoI限制性位點中的XhoIDNA片段的限制性酶切圖。其中B＝BamHⅠ，Bg＝BglⅡ，Cla＝ClaⅠ，E＝EcoRⅠ，H＝HindⅢ，Sal＝SalⅠ，S＝SatⅠ，P＝PstⅠ，X＝XhoⅠ，Xb＝XbaⅠ;
＝鳥博德特氏菌GOBL124的DNA;｜ ｜＝從pYA2402上切下的片段，再與Bg1Ⅱ酶切的pCP13連接，連接時可能有兩個方向。
圖2顯示Asd+載體，pYA292的有意義特征。
圖3顯示對鳥博德特氏菌突變株和親本菌株的溶菌產物進行免疫印跡分析的結果。泳道A顯示STL389的蛋白圖形;泳道B顯示STL258的蛋白圖形;泳道C顯示STL167的蛋白圖形;泳道D顯示STL6的蛋白圖形。泳道E顯示親本菌株GOBL124的蛋白圖形。泳道F代表分子量標準。
圖4顯示對攜帶含GOBL124DNA插入段之裝配型質粒(cosmid)pCP13的大腸桿菌LE392菌落的溶菌產物所作免疫印跡分析的結果。泳道A顯示LE392的蛋白圖形;泳道B顯示含有pCP13克隆之LE392的蛋白圖形，所說的克隆中有一個不與分離自非粘著突變株的探針反應的插入段;泳道C顯示含裝配型質粒pYA2402之LE392的圖形;泳道D、E和F顯示具有與分離自非粘著突變株之探針起反應的重組插入物的LE392菌株的蛋白圖形。最后泳道代表分子量標準。
圖5是非粘著突變菌株STL258的電鏡圖。從中可以看出，細菌外周有菌毛，箭頭則指示鞭毛的一個部分(放大30000倍)。
圖6顯示對鳥博德特氏菌外膜蛋白質的大腸桿菌LE392克隆溶菌產物所作免疫印跡分析的結果。用抗鳥博德特氏菌外膜蛋白質粗提物的抗體探測該溶菌產物。泳道1代表分子量標準。泳道2顯示鳥博德特氏菌GOBL124的圖形。泳道3-8分別顯示含裝配型質粒pYA2320、pYA2337、pYA2338、pYA2339、pYA2326和pYA2329之LE392的蛋白質圖形。泳道9表示分子量標準。
圖7顯示對用鳥博德特氏菌感染的火雞恢復期血清探測的溶菌產物進行免疫印跡分析的結果。泳道1顯示鳥博德特氏菌GOBL124的蛋白質圖形。泳道2-4分別顯示含有裝配型質粒pYA2320、pYA2333和pYA2329之LE392的蛋白質圖形。泳道5代表分子量標準。
圖8是顯示質粒pYA2336之有意義特征的酶切圖。該質粒含有編碼21KD蛋白質的6KDBamHⅠ-PstⅠ鳥博德特氏菌DNA片段。
圖9顯示對用抗鳥博德特氏菌外膜蛋白質粗提物抗體探測的細菌溶菌產物進行免疫印跡分析的結果。泳道1顯示鳥博德特氏菌GOBL124的蛋白質圖形。泳道3和4分別顯示攜帶pYA2336之大腸桿菌chi6097和鼠傷寒沙門氏菌chi3987的蛋白質圖形。泳道5和6分別顯示攜帶pYA292之大腸桿菌chi6097和鼠傷寒沙門氏菌chi3987的蛋白質圖形。
可用本領域內普通技術人員熟知的常規細胞培養及分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學方面的技術(除特別說明者外)實現本發明。有關技術可參見下列文獻Maniatisetal;MolecularCloningALaboratoryManual(1982);DNACloning(1985)vol.ⅠandⅡ，D.N.Glover(eds.);Perbal，B.，APracticalGuidetoMolecularCloning(1984);MethodinEnzymology(theseries)，AcademicPress，Inc.;VectorASurveyofMolecularCloningVectorsandTheirUses(1987)，R.L.Rodriguez，etal.，(eds.)，Butterworthes;以及Miller，J.H.，etal.，ExperimentsinMole-cularGenetics(1972)，ColdSpringHarborLaboratory。
上文或下文中提到的所有專利、專利申請及其他出版物均以其全文列為本文的參考文獻。
A.定義“抗原”是指含有一個或多個抗原決定基的分子，其可刺激宿主的免疫系統使之產生分泌的、體液和/或細胞的抗原特異性反應。該術語也可與“免疫原”交互使用。
“半抗原”是指含有一個或多個抗原決定基的、自身不能刺激宿主免疫系統產生分泌的、體液或細胞反應的分子。
“抗原決定基”是指抗原或半抗原上能結合特異性抗體分子的部位。這一術語也可與“抗原性決定簇”或“抗原決定位點”通用。一個抗原決定基通常至少包含3個，較多見的是5個，更常見的是有8-10個識別空間構象所必需的氨基酸。
對組合物或疫苗的“免疫學反應”是宿主體內發展的對目的組合物或疫苗的細胞和/或抗體介導的免疫反應。通常這種反應包括使受試對象產生針對目的組合物或疫苗中一種或多種特異抗原的抗體、B細胞、輔助T細胞、抑制性T細胞和/或細胞毒性T細胞。
“疫苗組合物”是指用于刺激活生物體的免疫系統以使之免受進一步損傷的藥劑。“免疫”是指誘導生物體產生持續高水平抗體和/或細胞免疫反應的方法，其中T淋巴細胞可殺死病原體和/或激活其他細胞(如巨噬細胞)，這些免疫反應是針對所說的生物體先前接觸的病原體或抗原的。雖然術語“免疫系統”可包括單細胞生物體對外來因子的反應這一含意(如干擾素的產生)，但在本申請中該術語只限于多細胞生物體產生特異抗體的特性和機制，所說的抗體可對抗侵入該生物體的細胞或細胞外液的抗原物質。如此產生的抗體可以是A、D、E、G或M等各類免疫球蛋白。
其中特別有用的是可刺激產生免疫球蛋白A(ⅠgA)的疫苗，因為它是溫血動物之分泌系統產生的主要免疫球蛋白。已對抗原的免疫反應作了深入研究，并已有許多這方面的報導。有關免疫學的綜述可參見Barrett，JamesT.，TextbookofImmunologyFourthEdition，C.V.MosbyCo.，St.Louis.Mo(1983)。鳥類具有包括消化道相關淋巴組織[稱為GALT或派伊爾氏斑(Peyer′spatches)]、支氣管相關淋巴組織(BALT)及位于眼球上部中間編后部位的哈德氏腺(Harder′sgland)在內粘膜免疫網絡。當抗原浸入這些組織時，會激發體內分泌組織和腺體中B細胞的增殖和分化，最終產生分泌型IgA(SIgA)(6、10、25、28、47、15、30、31)。SIgA能阻止特異性表面抗原粘附或侵入粘膜表面(39、48)。
“脊椎動物”是指脊椎動物亞門中的任一成員，脊索動物門的主要分類包括魚類、兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳動物，它們的特征是具有分節的骨或軟骨質脊髓腔。所有脊椎動物均具有功能性免疫系統，并通過產生抗體而與抗原反應。
“禽類”是指家禽、野鳥和狩獵鳥，如公雞和母雞、火雞和其他鶉雞類鳥以及其他鳥。它們可以是任何令期的鳥。
“微生物的無毒力衍生株”是指用特定的無毒力微生物感染時基本上不會使宿主患病的生物體。無毒力并非指該屬或種微生物在任何情況下都不是病原體，而是所用的特定微生物對被處理的特定動物來說是無毒力的。該微生物可屬于正常致病性菌屬或菌種，但必須是無毒力的菌株。“致病性”是指導致疾病或破壞正常生理功能的能力。與有毒力的致病菌相比，無毒力菌株不能引起呈現全部病征的疾病。本文所用的術語“微生物”，包括細菌、原生動物和單細胞真菌。
“載體微生物”是上文限定的無毒力微生物，它含有并表達編碼所需蛋白質如博德特氏菌屬外膜粘附抗原或外膜蛋白質的重組基因。
“外膜粘附抗原”是指位于細菌細胞外膜上并參予病原菌對宿主靶細胞粘附的抗原。博德特氏菌屬的宿主靶細胞是氣管上皮細胞。該粘附抗原的例子是見于鳥博德特氏菌的分子量約為46KD的蛋白質。本文定義的“外膜蛋白質”是指能與抗鳥博德特氏菌外膜蛋白質粗提物抗體(按實驗部分所述方法分離并提取的)反應的蛋白質。這些外膜蛋白質包括但不只限于以下述SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分子量分別為21KDa、37KDa、40KDa、43KDa、46KDa和50KDa的蛋白質。外膜粘附抗原也可以是外膜蛋白質。外膜蛋白質可以是或不是粘附抗原。由這些蛋白質產生的抗體可預防博德特氏菌感染。另一方面，由此產生的這些蛋白質或抗體可通過干擾這些抗原或細胞表面受體的結合而阻斷粘附抗原的作用。
“純化的蛋白質或抗原”是指基本上無其他雜質的蛋白質或抗原。例如，蛋白質A實質上不含B，B是其他細胞成分與蛋白質的混合物，則純化的蛋白質是指A至少為A+B之總量的30%;較好是至少占50%，更好是至少占75%，最好是占90-95%，甚至99%(重量)。“純化”不是指蛋白質的生產方法。因此，純化的蛋白質可通過DNA重組方法、合成方法或直接由自然界含該蛋白質的生物體中分離得到。
術語“多肽”有很廣的含義，即可以是通過肽鏈連接的任何氨基酸聚合物(二肽或更多肽)。因此，“多肽”包括蛋白質、寡肽、蛋白質片段、類似物、天變蛋白質、融合蛋白質等。這一術語還包括突然和重組的蛋白質。
“天然的”蛋白質或多肽是指從天然來源中發現的蛋白質或多肽。因此，“天然博德特氏菌蛋白質或多肽”包括天然存在的博德特氏菌蛋白質及其片段。
“重組”多肽是指由重組基因表達的多肽，即由編碼所需多肽的外源DNA構建物轉化的細胞所產生的多肽。
“重組基因”是較大多核苷酸分子內的可鑒別的多核苷酸片段，它與天然大分子無關。
“復制子”是指任何遺傳成分(如質粒、染色體、病毒)，它能在體內作為DNA復制的自主單位，即能在其自身控制下復制。
“載體”是一種復制子，如質粒、噬菌體或粘性質粒，它上面可接有另一個DNA片段，從而可與被連接的片段一起復制。
DNA“編碼順序”是一段DNA順序，當該順序被置于合適的調控順序控制下時，它能在體內轉錄或轉譯成多肽。該編碼順序的邊界是由位于5′(氨基)端的起始密碼子和3′(羧基)端的轉譯終止密碼子確定的。編碼順序可包括但不僅限于原核生物順序、來自真核生物mRNA的cDNA、來自真核生物(如哺乳動物)DNA的基因組DNA順序及合成的DNA順序。轉錄終止順序通常位于編碼順序的3′端。
“啟動子順序”是指細胞中能結合RNA聚合酶并啟動下游端(3′方向)編碼順序轉錄的DNA調節區。為更清楚地限定本發明，該啟動子順序系結合于編碼順序之轉譯起始密碼子(ATG)的3′端，并向上游(5′方向)延伸以含有最小數目的、高于本底之可檢測水平的啟動轉錄所必需的堿基或單元。在啟動子順序中含有轉錄起始位點(通常由核酸酶S1的酶切圖所限定)，以及結合RNA聚合酶的蛋白質結合區(共感順序)。真核生物啟動子常常(但不總是)含有“TATA”和“CAT”暗盒。原核啟動子除含有-10和-35區的共感順序外還含有SD(Shine-Dalgarno)順序。
DNA“控制順序”總體說來是指啟動子順序、核糖體結合位點、聚腺苷酸化加尾信號、轉錄終止順序、上游調節區及增強子(enhan-cers)等。它們均可使編碼順序在宿主細胞中得以轉錄和轉譯。
當RNA聚合酶與啟動子順序結合并將編碼順序轉錄成信使核糖核酸(mRNA)，然后再將mRNA轉譯成該編碼順序所編碼的多肽時，編碼順序在細胞內即被“可操作地連接到”控制順序上或處于控制順序的“控制下”。
“重組宿主細胞”、“宿主細胞”、“細胞”及其他代表微生物的這類術語均可互換使用。它們是指能或已用作重組載體或其他被轉移DNA之接受體的細胞，并包括原始被轉染細胞的后代。應該明確的是，由于偶然或人為的突變，單個親代細胞的后代在基因組或總DNA互補性上不一定與親代完全相同。親代細胞的后代包括那些就相關特性(如用連接于編碼所需基因產物之結構基因上的已克隆的基因取代編碼重要酶的天然基因)與親代十分相似的細胞。
“克隆”是由單個細胞或共同祖細胞經細胞分裂所產生的細胞群體。細胞系是指能在體外穩定生長許多代的原始細胞的克隆。
“基因庫”是指已克隆之基因的集合體，通常包含許多或所有的特定基因。其構建程序是，首先用選定的限制性內切酶處理DNA，然后將酶切片段克隆到合適的載體中。用得自相關生物體的同源DNA順序探查基因庫，以鑒定該庫內含有所需基因的克隆。
DNA構建體的“異源”區是指DNA分子中或與其連接的其他DNA分子(與自然界中存在的其他分子無關)中的可鑒定的DNA片段。因此，當異源區編碼細菌基因時，該基因側接的通常不是來源細菌之基因組中細菌基因的側冀DNA。異源編碼順序的另一個例子是一種構建體中的編碼順序本身并不是自然界存在的(如與天然基因有不同密碼子的合成基因)。等位基因變異或自然發生的突變不會產生本文所說的DNA異源區。
“轉化”在本文中是指將外源多核苷酸插入宿主細胞所使用的方法，如直接攝入、轉導或連接等方法。所說的外源多核苷酸可以象質粒一樣得以保留，或被整合到宿主基因組內。
B.一般方法本發明包括發現可將博德特氏菌屬的外膜粘附蛋白，以及能夠與抗鳥博德特氏菌外膜蛋白粗提物之抗體起反應的蛋白質，可用于抗博德特氏菌感染的疫苗組合物中。由于粘附蛋白質存在于細菌外膜上，所以使用TnphoA進行轉座子誘變便為鑒定本發明的抗原提供了一種方法。可通過與大腸桿菌供體接合而將TnphoA導入博德特氏菌的細胞中(詳見下文所述)。當TnphoA轉座到博德特氏菌染色體中時，它總是獲得抗卡那霉素抗性，如果TnphoA插入編碼穿越胞漿膜運輸之蛋白質的基因中，則可產生堿性磷酸酶。通常堿性磷酸酶是博德特氏菌屬所沒有的。因此，可在含卡那霉素的培養基中選擇出轉座子誘導的突變體，并通過水解加在培養基中的顯色底物5-溴-4-氯-3-碘-對位甲苯磷酸銨(XP)，來檢測堿性磷酸酶基因的表達。在使用雞和火雞的氣管環進行體外試驗中篩選能在氣管上皮細胞上附著的突變株。可按下述方法用各種菌株接種合適的動物，從而在體內研究粘附和非粘附菌株的群集情況。
可用普通的限制性內切酶部分消化來自證明損傷粘附力之突變株的染色體DNA。可使用瓊脂糖凝膠分離各限制性片段。由于TnphoA長約7.5Kb，故可由該凝膠中切上長度大于7.5Kb的片段，用電洗脫法洗脫，并連接于合適的經消化的質粒中(詳見下文)。可用這些構建體轉化大腸桿菌并選擇具有卡那霉素抗性的菌落。可用含有從突變株中分離之DNA的質粒作為探針，檢測由野生型博德特氏菌制得的基因庫中粘附基因的存在。
可按實驗部分所述的方法，對突變株和野生株的溶菌產物進行Western免疫印跡分析，并鑒定粘附抗原。可用常規方法分離這些蛋白質。
各種博德特氏菌外膜粘附蛋白質有著高度的同源性。很可能用攜帶編碼這樣一種蛋白質基因之TnphoA片段的質粒來檢測其他博德特氏菌屬的相似粘附蛋白。而且，抗一種博德特氏菌外膜粘附抗原的多克隆抗體(詳見下文)很可能與其他種博德特氏菌的外膜粘附抗原產生交叉反應。
另外，可用博德特氏菌外膜蛋白質的粗制劑制備抗體，該抗體又可用于重組體表達的篩選。從而可鑒定并進一步定性能表達與這些抗體起反應之蛋白質的克隆，并試驗這些蛋白質與氣管上皮細胞結合的能力。這些蛋白質也可以是粘附抗原。
可用本領域內熟練技術人員已知的各種方法測定已分離的蛋白質順序。例如，可重復進行Edman降解，然后用HPHC法分析氨基酸。反復多次后，即可測出純化之蛋白質中目的蛋白質的氨基酸順序。其他檢測氨基酸順序的方法是本技術領域中已知的。
可用依據上述方法測定的氨基酸順序設計寡核苷酸探針，該探針含有一部分已確定的氨基酸順序的密碼子，用于從DNA庫中篩選目的蛋白質的基因。制備寡核苷酸探針和構建DNA庫以及用核酸雜交法進行篩選的基本戰略，是本領域中熟練技術人員已知的(如參見DNACloningVol.Ⅰ，上述文獻;NuclecicAcidHybridization，上述文獻;OligonucleotideSynthesis，出處同上;Maniatis，T.，etal，上述文獻)。
首先構建DNA庫。該庫可由博德特氏菌屬的基因組DNA庫構成。一旦構建了該庫，即制備探測該庫的寡核苷酸，并用于分離編碼外膜蛋白質的基因。可用任何合適的方法合成寡核苷酸。選出特定的核苷酸順序，以使其與編碼所需博德特氏菌抗原的已知氨基酸順序的密碼子相一致。由于遺傳密碼子的簡并性，通常必須合成幾條寡核苷酸才能覆蓋所有的或一定數目的核苷酸順序(以足夠編碼蛋白質的某個特定區域)。因此，最好選擇不含密碼子有高簡并性之氨基酸區域來設計探針。在某些情況下，本領域技術人員發現，須制備相當長的探針和/或與包含的氨基酸順序區域相應的核酸順序有高度的重復性，特別是當目的蛋白質具有這樣的特征性長度和/或重復區的情況下。可以在一次雜交試驗中使用兩個(或一組)探針，各探針用于探查基因的不同區域。寡核苷酸的自動化合成使得制備家族探針的工作更為簡化。雖然對所用探針的確切長度要求并不嚴格，但一般認為，約14-20個堿基對的探針是有效的。不過也可以使用約25-60個堿基對的較長探針。
按標準方法用標記物如放射性核苷酸或生物素標記選定的寡核苷酸探針。然后將已標記的一組探針用于篩選步驟，其中包括按標準方法使單鏈(ss)探針與從DNA庫中分離的單鏈DNA雜交。雜交條件可以是嚴格的或者比較隨意的，這將取決于探針長度、探針是由同種菌或由進化中形成的近親或遠親菌種(作為DNA庫)得到的某因素。本領域技術人員可根據已有知識選擇合適的條件(參見NucleicAcidHybridization，文獻同上)。基本要求是要有足夠嚴格的雜交條件，以便進行選擇性雜交;即雜交是由于核酸的充分同源性而發生的(如至少約有75%的同源性)，而不是非特異性結合。一旦經過陽性雜交鑒定了來自己篩選庫的克隆后，即可通過限制性酶切分析和DNA順序測定來進一步證實該克隆是否含有編碼所需蛋白質的基因。
另外，也可用合成方法而不是克隆技術制得編碼所需蛋白質的DNA順序。可根據特定的博德特氏菌氨基酸順序的適當密碼子設計該DNA順序。一般說來，若將該順序用于表達時，最好選擇宿主更易接受的密碼子。整個順序是由依照標準方法制得的交迭寡核苷酸組裝而成的完整編碼順序(如參見Edge，Nature(1981)292;756;Nam-bairetal.，Science(1984)2231299;Tayetal.，J.Biol.Chem.(1984)2596311)。
一旦制備和分離了所需蛋白質的編碼順序后，即可將其克隆到合適的載休或復制子中。許多克隆載體都是本領域內熟練技術人員已知的，問題在于要選擇更適用的克隆載體。例如，適用于克隆的重組DNA載體及可轉化的宿主細胞包括噬菌體λ(大腸桿菌)、pBR322(大腸桿菌)、pACYC177(大腸桿菌)、pKT230(革蘭氏陰性菌)、pGV1106(革蘭氏陰性菌)、pLAFR1(革蘭氏陰性菌)、pME290(大腸桿菌以外的革蘭氏陰性菌)、pHV14(大腸桿菌和枯草桿菌)、pBD9(芽胞桿菌)、pIJ61(鏈霉菌)、pUC6(鏈霉菌)、YIp5(酵母)、YCp19(酵母)及牛乳頭瘤病毒(哺乳動物)(參見DNACloningVols.Ⅰ&Ⅱ，文獻出處同上;Maniatis，T.，etal.文獻同上;perbal，B.，文獻同上)。
可將博德特氏菌外膜蛋白的編碼順序置于啟動子、核糖體結合位點(用于細菌表達)和操縱子(本文中總稱為“控制”元件)的控制下，從而使編碼該蛋白質的DNA順序能在被含該表達結構之載體轉化的宿主細胞內轉錄成RNA。編碼順序可含有或不含信號肽或引導順序。可使用天然博德特氏菌啟動子或能在革蘭氏陰性菌中發揮功能的其他已知啟動子如tac或trp啟動子表達本發明的全長博德特氏菌蛋白質。
當載體微生物中存在外膜抗原時，該抗原將在只允許在被免疫宿主體內表達的啟動子的控制下得以正常表達。但如果要大量生產蛋白質，則須外加一個調節順序，用以調節與宿主細胞生長有關的抗原順序的表達。調節順序對本技術領域內的熟練技術人員來說是已知的，它包括能在化學或物理刺激物(包括調節化合物)存在下，打開或關閉基因之表達的調節順序。載體中也可存在其他調節順序元件，如增強子順序。也可以融合蛋白的形式表達該目的蛋白質，其中異源氨基酸順序是在融合蛋白質的N端被表達的(如參見美國專利4431739號.4425437號)。
構建一個表達載體，以使特定的編碼順序定位于具有合適調節順序的載體中，該編碼順序的位置和方向要與控制順序相適應，以使編碼順序的轉錄處于控制順序的控制下(即使RNA聚合酶在控制順序處結合到DNA分子上，以轉錄編碼順序)。可望通過修飾特定目的抗原的編碼順序來達到這一目的。例如，在某些情況下，必須修飾該順序才能使其以合適的方向連接到控制順序上;即保持該讀碼不變。可在插入載體之前將控制順序及其他調節順序連接到編碼順序上。另一方法是，將編碼順序直接克隆到已含有控制順序和適當限制性酶切點的表達載體中。
在某些情況下，可望加入先導順序以使多肽由宿主生物體內分泌出來，然后再切掉該分泌信號(這種情況即使有也很少見)。可在轉譯后加工過程中從細菌宿主中除去先導順序(參見美國專利4431739號，4425437號、4338397號)。也可以產生目的抗原的突變型或類似物。可通過缺失部分抗原編碼順序。插入一段順序和/或替換順序中的一個或多個核苷酸來制備突變型或類似物。例如，用于免疫宿主的蛋白質可含有刺激輔助細胞的抗原決定基及刺激抑制細胞的抗原決定基。因此，缺失或修飾這些先導核苷酸是可行的。修飾核苷酸順序的方法，如定點誘變法是本領域內技術人員已知的(如參見Maniatis，T.etal.，文獻同上;DNACloning，VolsⅠ&Ⅱ，文獻同上;NucleicAcidHybridization，文獻同上)。
許多原核表達載體都是本領域中已知的(如參見美國專利4440859、4436815、4431740、4431739、4428941、4425437、4418149、4411994、4366246、4342832;和英國專利申請2121054、2008123、2007675以及歐洲專利申請EP103395。
根據選用的表達系統和宿主，可在目的蛋白質得以表達的條件下培養用上述表達載體轉化的宿主細胞，以生產本發明的蛋白質。然后從宿主細胞中分離特定的博德特氏菌蛋白并純化之。如果表達系統將蛋白質分泌到生長培養基中，即可直接從培養基中純化該蛋白質。如果蛋白質已被運輸到細胞周質中，則可用現有技術中已知的冷滲透體克方法，使其釋放到培養基中。如果該蛋白質沒有分泌出來或沒被運輸到細胞周質空間，則可以從細胞溶解產物中分離之。本領域技術人員可以選擇合適的培養條件和回收方法。
也可用現有技術中已知的標準蛋白質純化方法，由博德特氏菌培養物中分離本發明的抗原(如參見ProteinPurificationPriciplesandPractice(1987)，2nd.ed.，R.R.Scopes(ed.))。這些技術包括凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析、免疫吸附層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳及其他電泳方法、離心法、透析法及沉淀法。
也可根據已知的氨基酸順序或從目的基因的DNA順序推測的氨基酸順序，通過化學合成如固相肽合成法生產本發明的抗原。這些方法是本領域內技術人員已知的，如果所研究的抗原的小片段能在試驗對象體內產生免疫反應，則化學合成肽更為可取。
可用本發明的蛋白質或其片段生產多克隆或單克隆抗體。如需要得到多克隆抗體，可用本發明的抗原或其片段或突變抗原免疫選擇的鳥類或哺乳動物(如雞、火雞、小鼠、兔、羊、馬等)。按照已知方法收集并處理被免疫動物的血清。如含有抗目的蛋白之多克隆抗體中混有抗其他抗原的抗體，可按已知方法用免疫親合層析技術純化該多克隆抗體。
本專業熟練技術人員也能很容易地生產抗本發明蛋白質及其片段的單克隆抗體。用雜交瘤技術生產單克隆抗體的普通方法學是眾所周知的。可經細胞融合，及用致癌基因DNA直接轉化B淋巴細胞或用E-B病毒轉染等其他技術得到永久性抗體生成細胞系(如參見Schreier，M.etal.，HybridomaTechniques(1980);Hammerlingetal.，MonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomas(1981);Kennettetal.，MohoclonalAntibodies(1980);以及美國專利US4341761、4399121、4427783、4444887、4452570、4466917、4472500、4491632及4493890號)。可根據各種特性，如同型或抗原決定基親和性等篩選一組抗目的抗原或其片段的單克隆抗體。可使用免疫親和技術，用抗目的抗原的單克隆抗體來純化該抗原。
可用按上述方法生產的本發明外膜蛋白質免疫被試對象，以使其能抵抗博德特氏菌誘發的疾病。可借助無毒力載體微生物給予本發明的抗原。因為合適的載體微生物能侵入GALT和BALT并在其中增殖，所以這種使用方法是特別適宜的。抗原進入BALT或GALT細胞后，可誘發細胞產生上述的總體化分泌性免疫反應及體液和細胞免疫反應。
可將含目的蛋白質基因的重組質粒導入某種無毒力細菌的菌株中，這些菌株含有在靶宿主中長期存活所必須的突變基因。特別有用的是上述的cya、crp和asd突變株，但其他無毒力微生物也可用于本發明。如果用Asd-突變株，可用編碼粘附抗原和asd的載體將目的粘附抗原轉移到載體微生物中。因此，只有那些含所需粘附抗原的載體微生物才能存活，并可進一步在其中克隆編碼所需粘附抗原之基因的載體。然后將該載體轉移到Asd-載體微生物中。編碼所需抗原的重組基因的表達可依賴于連接該Asd基因的控制順序。這種連鎖關系是由載體中兩個基因的取向而決定的，從而使這兩個基因都處于相同控制因子即同一啟動子和操縱子的控制之下。用重組DNA技術構建具有這些特性的載體是本領域中已知的，并在待批專利申請251304號中作了詳細討論。
有用的無毒力微生物包括但不只限于沙門氏菌和大腸桿菌-沙門氏菌雜交株的突變衍生菌。優選的微生物是沙門氏菌屬的成員，如鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)、傷寒沙門氏菌(S.typhi)、付傷寒沙門氏菌(S.paratyphi)、雞沙門氏菌(S.gallinarum)、雛沙門氏菌(S.pullorum)、腸類沙門氏菌(S.enteritidis)、豬霍亂沙門氏菌(S.choleraesuis)、亞利桑那沙門氏菌(S.arizona)或都伯林沙門氏菌(S.dublin)。鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌的無毒力衍生株可用于許多宿主。雞沙門氏菌、雛沙門氏菌、亞利桑那沙門氏菌的無毒力衍生株特別適于免疫鳥類，而免疫人最好用鼠傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌和付傷寒沙門氏菌的無毒力衍生株，最好用豬霍亂沙門氏菌免疫豬，用都伯林沙門氏菌免疫牛。這些無毒力沙門氏菌菌株能夠定居到GALT和BALT上存活幾周而不使宿主致病。在共同待批專利申請251304號及Curtiss和Kelly的文獻(13)中已描述了產生這些突變菌的方法。
為了更好地刺激GALT或BALT反應，最好通過口服、鼻內給藥、胃插管或氣霧劑等形式和氣囊接種(只用于鳥類)和氣管內接種等方法，將該微生物或基因產物直接導入消化道或支氣管內。其他合適的方法包括通過結合膜達到哈德氏腺給藥和乳腺接種。其他疫苗接種方法如靜脈、肌肉或皮下注射也是適用的。這些給藥途徑主要用于刺激如下所述的二次免疫反應。
通過飲水給藥是一種特別適用于鳥類的給藥方法。即將表達博德特氏菌外膜抗原的載體微生物直接放在這些動物的飲用水中。也可在卵孵化之前(一般約18天前)，將疫苗注入卵內達到卵內接種的目的。
一般說來，給人或其他哺乳動物使用表達博德特氏菌抗原的載體微生物時，要按已知方法用合適的明膠類物質包被或膠囊包裹之。
載體微生物進入動物體后，必須使動物免疫系統獲得該抗原。當載體微生物死亡并釋放出抗原分子時才能達到上述目的。當然，也可使用“滲透”型無毒力突變菌，該菌無需溶菌即可將內涵物釋放到周質中。另一種方法是選擇一個控制抗原產生的基因，以便在載體細胞死亡前，使由該細胞產生的抗原進入外界環境中。
也可不用載體微生物，而只通過給予目的蛋白質或其片段或其類似物，用本發明的抗原免疫被試對象。如使用抗原片段或類似物，它應包含一個或多個可與免疫對象的免疫系統相互作用的抗原決定基的氨基酸順序，從而達到預期的免疫效果。在免疫接種前，最好先增加博德特氏菌蛋白質或其類似物或其片段的免疫原性。此可用本領域內技術人員已知的任何一種方法來實現。例如使用連接到載體上的抗原肽，如將片段連接在大分子載體上。合適的載體一般是大的、代謝緩慢的分子，如蛋白質、多糖(如瓊脂糖、纖維素、纖維素小珠等)、多聚氨基酸(如多聚谷氨酸、多聚賴氨酸等)、氨基酸共聚物及無活性的病毒顆粒。特別有用的蛋白質底物是鑰孔 血蘭蛋白(KLH)、免疫球蛋白分子、甲狀腺球蛋白、大腸桿菌的熱不穩定性毒素或霍亂毒素的β亞單位，以及本領域內已知的其他蛋白質。
可使用天然形式的蛋白質底物，或者以化學方法對其功能性基因進行修飾，如賴氨酸殘基的琥珀酰化或與胱氨酸巰基內酯反應。也可利用氨基功能基與2-亞胺基硫代烴(2-iminothiolane)或3-(4-二硫代吡啶基)丙酸鹽的N-羥基琥珀酰亞胺酯反應，而將巰基摻入載體(或抗原)中。也可以修飾適當的載體，以加入一個空間臂(如環己二胺或其他有相似大小的雙功能分子)。
此外，在沒有載體微生物的情況下給藥時，可將博德特氏菌抗原以中性形式或鹽形式加到疫苗組合物中。醫藥上可接受的鹽包括酸加成鹽(與活性多肽的游離氨基形成的)和與無機酸(如鹽酸或磷酸)或有機酸(如乙酸、草酸、酒石酸、苯乙醇酸等)形成的鹽。也可以是游離羧基與無機堿(如氫氧化鈉、鉀、銨、鈣或氫氧化鐵)及有機堿(如異丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等)形成的鹽。
一般抗原在沒有無毒力載體的情況下使用時，可制成氣霧劑或經鼻內途徑使用。哺乳動物的鼻內用藥配方通常含有不會刺激鼻粘膜，也不會影響纖毛功能的載體。稀釋劑如水、鹽水或其他已知物質也可用于本發明。鼻內給藥的配方中還含有防腐劑，其包括但不僅限于氯丁醇和benzalkoniumchloride。可加入表面活性劑以增加鼻粘膜對目的蛋白質的吸收。
在進行口內、鼻內、胃或氣霧劑免疫接種之前，還可同時注射病原體衍生的基因產物。一旦用表達該病原體衍生之基因產物的載體微生物免疫接種以刺激GALT或BALT的淋巴樣細胞，并引發分泌性免疫系統后，這種腸胃道外免疫即可作為加強免疫手段，用于增強分泌性免疫反應的表達。增強反應可以是繼發反應、加強或既往反應，結果會延長對寄主的免疫保護作用。如反復進行加強免疫接種，效果可能更好。
如將疫苗制成用于加強免疫的可注射劑，其劑型可以是水溶液或懸浮液;也可制成固體形式的，注射前再加入液體載體配成溶液或懸浮液。也可使該制劑乳化或將活性成分包裹在脂質體載體中。活性免疫原成分通常與含醫藥上可接受之賦形劑的載體混合。適用的載體包括水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等或其混合物。此外，必要時還可含有少量輔助劑如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖劑、或能增強疫苗效力的佐劑。佐劑可包括胞壁酰二肽、avridine、氫氧化鋁、油、皂甙及其他已知物質。這些劑型的配制方法是已知的，或對本技術領域內普通技術人員來說是顯而易見的(如參見Remington′sPharmaceuticalSciences，MackPublishingCompany，Easton，PA，15thed.，1975)。無論如何，所使用的組合物或制劑均應含有足夠量，以使待處理對象達到所要求的免疫狀態。
使用的抗原量將取決于待處理對象，其免疫系統合成抗體的能力及期望達到的保護程度。本領域普遍技術人員通過測定劑量反應曲線的常規試驗即可很容易地確定有效劑量。至少使用一次含或不含載體微生物的特定抗原或其片段或類似物來免疫被試對象。用載體微生物時，一般劑量為1×106-1×1010個重組無毒力細菌/免疫對象。如使用無毒力微生物的蛋白質時，疫苗的初始劑量為0.001-1mg抗原/Kg體重。再者，當需要保護對博德特氏菌的免疫狀態時，可增加使用劑量及免疫次數。
以上對本發明作了一般性的描述，下列實施例將更清楚地說明發明的技術內容。這些實施例決不構成對本發明范圍的限制。
用于實施本發明之菌株的寄存下列菌株的生物學純培養物已寄存在美國典型培養物保藏中心(ATCC)，12301ParklawnDrive，Rockville，Maryland。存活試驗后確定了寄存號并支付了保藏費用。根據37CFR1.14和35USC122的規定，在專利申請待批期間，專利局局長有權確定獲得該培養物的人，直到該申請被授予專利后才能取消對公眾獲得該培養物的所有限制。指定的寄存期自寄存日起30年，或到期后再延續5年，或美國專利的實施有效期(這一期限較長)。如果培養物未能存活或由于疏忽而受到損壞，或含質粒的菌株中質粒丟失，應用有相同分類描述的活的培養物替換之。
菌株寄存日期ATCC號chi4064July15，198753648chi4072Oct.6，198767538pYA292Asd+inchi6097Sept.26，198867813pYA2402inchi6121March.28，198967921pYA2336inchi3987March22，1990-pYA2326inLE392March22，1990-pYA2333inLE392March22，1990-pYA2337inLE392March22，1990-
pYA2338inLE392March22，1990-pYA2339inLE392March22，1990-C.實驗1.材料和方法除特別指出者外，每次實驗均使用下列材料和方法。
菌株、培養基和載體從得自Y.M.Saif(OH)的菌株197中分離鳥博德特氏菌GOBL124。已發現該菌株對幼小火雞、凝集的豚鼠紅血細胞有毒性，并通過對底物的氧化堿化鑒定其為鳥博德特氏菌。為達到最大粘附，在體外粘附試驗前，使GCBL124于37℃下在添加有15%去纖維羊血的Bordet-Gengou瓊脂(BGB瓊脂)上或心腦浸液培養基(BHI)上生長24小時。GOBL124是各種載體中使用的DNA染色體源。大腸桿菌菌株生長于LB培養基(1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl、0.1%葡萄糖、1.5%瓊脂)上。培養基中添加有適當的抗生素。自殺載體pRT733為攜帶TnphoA之pJM703.1(29)的衍生株，它是在其供體大腸桿菌菌株SM10-λ-pir中由J.J.Mekalanos(29)提供的。粘性質粒pYA2329是使1.8KbSacⅡ-KpnⅠ消化的、經T4DNA聚合酶處理的pUCD2之攜帶壯觀霉素抗性的DNA片段連接到SalI消化的經Klenow酶處理的pCP13上而構建的。
動物能育的Nicholas火雞卵得自Cargill.Inc.，Elgin，MO。能育的白色來享雞卵得自SPAFAS.Inc.，Roanoke，IL。在21型Humidaire孵化器中孵化至產出小雞。
試劑除另外指出者外，試劑均得自Sigma，St.Louis，MO。Bordet-Gengou瓊脂和用于配制LB、BHI培養基的試劑購自DifcoLabora-tories，Detroit，MI。羊血得自DrownLaboratories，Topeka，KS。限制性內切酶和T4DNA連接酶得自InternationalBiotechno-logies，Inc.，NewHavenCT，并按廠商推薦的方法使用之。辣根過氧化物酶連接的羊抗火雞免疫球蛋白得自ICNImmunochemicals，Lisle，IL。
含抗鳥博德特氏菌外膜蛋白抗體的多克隆血清在新西蘭白兔皮內注射純化的鳥博德特氏菌GOBL124外膜蛋白質，得到多克隆抗血清。按Rapp等人的方法(稍加改動)制備鳥博德特氏菌GOBL124外膜蛋白質(49)。于37℃下，在1升SSM-S培養基中振蕩過夜使鳥博德特氏菌菌GOBL124生長至滴度為9.9×108/ml。離心沉淀細胞，再懸浮于50mlpBS(pH7.5)中，并用Heat Systems-Ultrasonics Inc.Mode W185D超聲細胞破碎器(調至40瓦，輸出功率50%)進行超聲處理，共處理4次，每次間隔5分鐘。每次處理之間將處理物置于冰上保溫5分鐘。4℃下以2，000g離心沉淀細胞碎片20分鐘。取上清液，用SS34轉子4℃下以19，000rpm離心1小時，除去細胞膜。將沉淀物再懸浮于5ml PBS(pH7.5)中，測得蛋白質濃度為4mg/ml。向懸浮的膜中加入1體積2%十二烷基肌氨酸鈉(在PBS中，pH7.5)使其濃度達到1%。室溫下攪拌30分鐘，用SS34轉子以19，000rpm離心1小時，以沉淀不溶性外膜蛋白質。將沉淀的蛋白質懸浮在2mlPBS(pH7.5)中，測得蛋白質濃度為2.5mg/ml。
皮內注射500μg純化的外膜蛋白質(OMP)制劑(加有等體積完全弗氏佐劑)免疫兔。2周后，再次皮內注射500μgOMP制劑(與等體積不完全弗氏佐劑混合乳化)以加強免疫。抽小量兔血，用所得血清檢測產生鳥博德特氏菌外膜蛋白質的大腸桿菌重組體克隆(詳見下述)。定期用500μgOMP制劑(混有不完全弗氏佐劑)進行加強免疫，抽取大體積(40ml)兔血，并收集血清。將血清于-20℃下凍干或與等體積100%甘油混合，保存于-20℃下備用。
火雞恢復期血清使孵出4天的Nicholas火雞雛與已感染鳥博德特氏菌GOBL124的30天令火雞(已感染2天)接觸，并使之接觸感染。接觸40天后將小火雞麻醉并采血得到恢復期血清，用以檢測產生與其反應之蛋白質的大腸桿菌克隆。另外，也可用1.5×107個細菌經鼻內感染1天令的火雞雛，感染后1個月采血，得到抗鳥博德特氏菌抗血清。
Western免疫印跡法在樣品緩沖液(50mMTris-HCl，pH6.8，10%甘油、1%SDS、1%2-β-巰基乙醇、0.01%溴酚蘭)中煮沸整個細菌細胞以使之變性，并按Laemmli所述方法(24)進行SDS-10%聚丙烯酰胺凝膠電泳。用已知方法(40)將凝膠轉移到硝酸纖維素濾紙上。用緩沖液A(50mMTris、150mMNaCl、3%牛血清白蛋白，pH8)飽和濾紙，與抗鳥博德特氏菌的恢復期火雞抗血清或抗鳥博德特氏菌外膜蛋白質抗體保溫，在緩沖液A中洗滌，與辣根過氧化物酶結合的羊抗火雞免疫球蛋白保溫，并用4-氯-1-萘酚顯色。
2.鳥博德特氏菌的誘變按Bradley等人的平皿培養法(8)、經與pRT733的大腸桿菌菌株SM10-λ-pir供體接合，將TnphOA轉移到鳥博德特氏菌中。4小時后將細胞散布在添加有25μg/ml四環素、150μg/ml鏈霉素、75μg/ml卡那霉素和40mg/ml堿性磷酸酶的產色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽的BHI瓊脂上。37℃保溫5天后，收集蘭色的鳥博德特氏菌菌落。由于只有堿性磷酸酶位于外膜中或細胞外周質中時，該酶活性才得以表達，而且由于PhoA基因的啟動子和信號順序在TnphoA中丟失，所以蘭色菌落是在連有與蛋白質輸出有關之啟動子和信號順序的讀碼中發生了PhoA轉位和融合的菌落。
約0.2%的轉移接合體是蘭色的，因此PhoA是與編碼細菌膜外或周質中蛋白質之基因的啟動子和信號順序相聯接的。幾次實驗后，共收集到487個蘭色克隆。
3.鳥博德特氏菌粘附于氣管細胞的體外試驗由于鳥博德特氏菌對纖毛上皮細胞的粘附是很特異的(2)，故可用下述方法，根據TnphoA誘導的突變株與這些細胞的結合能力來篩選之。無菌分離1周令小雞或火雞的氣管，切成長2mm的環。使5×109個鳥博德特氏菌在BGB瓊脂上生長并懸浮于1ml緩沖液B(150mM NaCl、2.5mM KCl、10mM Na2HPO4，pH7.4)中，然后與氣管環3℃下保溫30分鐘。用緩沖液B洗5次以除去未粘附的細菌。在旋轉器(30rpm)上，將氣管環在100μl1%Triton X-100(在緩沖液中配制)中37℃保溫5分鐘，以回收粘附的細菌。將細菌懸液的系列稀釋液散布于BHI瓊脂上，37℃保溫24小時，并計數粘附細菌的數目。對每個菌株重復分析3次。
4.體內移殖分別將各菌株的1.5×107個或1.5×109個菌落形成單位(CFU)接種于5只1天令火雞鼻內，以體內檢測按上述方法選出的親代菌株和未粘附的突變株。2周后，CO2窒息殺死動物，無菌切除氣管，用OMNI混合器(Dupont，Wilmington，DE)在3ml緩沖液B中打成勻漿。將稀釋液散布在含25μg/ml四環素和150μg/ml鏈霉素的BH瓊脂上。
表1中給出了野生型菌株和4個非粘附(Adh-)突變菌株(分別定名為STL6、167、258和389)在分離的氣管環上的粘附結果。其他TnphoA產生的突變株粘附效力與野生型菌株相同。表1還給出了用這些菌株感染火雞的結果。雖然當給火雞接種1.5×107CFU后，從火雞組織上不能分離到突變菌，但當生物接種物為1.5×109CFU時，則可從所有火雞組織上分離到細菌。在氣管環粘附的體外試驗中，可見到這些回收的細菌是同野生型菌株一樣粘附的。
表1野生型和TnphoA誘導的鳥博德特氏菌突變株的粘附和移殖接種2周后從氣管環上回收的CFU(lOg)b菌株號表型對氣管環的粘附a1.5×107個 1.5×109接種物接種物GOBL124野生型1008.4±0.58.7±0.3
STL6 Adh-c10.1±1 NDdNDSTL167 Adh-7.6±1.7 NDd8.5±0.4eSTL258 Adh-8.8±1.4 NDd3.7±0.3eSTL389 Adh-0.9±0.3 NDd8.0±0.3ea.1周令火雞的氣管環接種5×109CFU(在PBS中)后37℃保溫30分鐘。洗滌后再與1%Triton X-100保溫，回收仍粘附的細菌。重復進行三次。
b.取出氣管環，破碎后檢查細菌數。
c.Adh-未粘附表型。
d.未檢出。
e.從火雞組織中回收的更易于在氣管環上集群生長的細菌。
5.電子顯微鏡觀察用電子顯微鏡觀察突變菌和野生菌的菌毛。將1滴BHI中生長的細菌加在用300-meshFormvar涂布的銅網上，靜止1小時。用3滴水洗該銅網，用濾低吸去過量的水，使銅網自然干燥。然后用2%脲-醛類樹脂粘合劑(Urac)將銅網復蓋30秒鐘，再用0.2%Urac沖洗。用濾紙除去過量的液體，使銅網自然干燥。用HitachiH-600透射電子顯微鏡檢查細菌制備物。四個未粘附突變株看起來與野生型菌株完全相同。更確切地說，可以很容易地看到突變株STL258的菌毛和鞭毛(如圖5所示)。這表明失活的蛋白質可能不是菌毛蛋白。
6.46KDa外膜粘附蛋白質的鑒定a.側接TnphoA之DNA順序的克隆ThphoA插入段含有一個卡那霉素抗性基因。因此，可根據卡那霉素抗性選擇含TnphoA插入段的克隆。用Sau3A部分消化鳥博德特氏菌TnphoA誘導之突變菌的染色體DNA，并用凝膠電泳法按大小分離各片段。因為TnphoA長約7.5Kb，克隆較大的片段可確保能根據卡那霉素抗性選擇出包含外周鳥博德特氏菌DNA的部分。從凝膠中切下大小約10-20Kb的片段，用電洗脫法從瓊脂糖中回收該片段，并且標準方法將其連接到BamHI消化的質粒pACYC184(59)上。用這些連接物轉化大腸桿菌HB101并選擇卡那霉素抗性菌落。
b.野生型鳥博德特氏菌粘性質粒庫的構建用XhoI部分消化鳥博德特氏菌GOBL124的染色體DNA，加于10-40%蔗糖梯度上按大小分離之。然后將大小為13-27Kb的片段與XhoI切割的粘性質粒(cosmid)pCP13(14)連接opCP13是有較寬宿主范圍的粘性質粒克隆載體，每個染色體的拷貝數相對較低(5-8個)。用λ體外包裝提取物(Packagene，PromegaBiotec.Madison，WI)將所制得的連接物包裹到噬菌體顆粒中。于37℃下使已包裹的粘性質粒在大腸桿菌LE392上吸附20分鐘，加入LB液體培養基，繼續保溫45分鐘后將細菌培養物散布于含15μg/ml四環素的LB平皿上。
用體外缺口轉譯試劑盒(BethesdaResearchLaboratories，Gaitnersburg，MD.)通過缺口轉譯對含有從突變株中分離之DNA的質粒進行32P標記，并用作探針與質粒庫進行原位菌落雜交，以檢測含野生型菌株之基因插入段的大腸桿菌克隆。具體地說，即用克隆pACYC184之各突變體的TnphoA突變順序所得到的4個探針與大腸桿菌中野生型鳥博德特氏菌的粘性質粒庫雜交。這4個探針均與同樣的粘性質粒克隆反應。所有這些粘性質粒都具有共同的17.6kbXhoIDNA片段(其酶切圖如圖1所示)。將這些pCP13克隆中的一個定名為pYA2402。
C.在Adh-突變株中丟失之蛋白質的鑒定為鑒定由非粘附突變株中丟失的粘附蛋白質，按上述方法對突變株和親代菌株的溶胞產物進行免疫印跡分析。如圖3所示，顯然在4個突變株中丟失了由野生型鳥博德特氏菌菌株產生的46KD蛋白質。另一方面，圖4中顯示了這種由質粒pYA2402限定的蛋白質是在攜帶相關粘性質粒克隆的大腸桿菌LE392中表達的，所說的質粒是由其質粒庫中分離的。
得自博德特氏菌屬各菌種的DNA具有高度同源性。而且，由鳥博德特氏菌引起的鳥氣管炎在生理病理學上與由百日咳博德特氏菌和付百日咳博德特氏菌引起的人百日咳及由支氣管博德特氏菌引起的豬萎縮性氣管炎相似。因此，所有這些菌均可能具有與鳥博德特氏菌中檢測到的46KDa粘附蛋白質相同或相似的毒性因子。
編碼該因子的基因，可與其基因組DNA進行Southern印跡雜交，以研究其他博德特氏菌中編碼該因子或其他相關抗原的基因。可使用由鳥博德特氏克隆的粘附基因的內在部分進行檢測。如上所述，可用抗鳥博德特氏菌粘附蛋白的免疫血清經Western免疫印跡雜交確定相關蛋白質的產生。如發現類似的粘附，則可在百日咳患者的恢復期血清或患有萎縮性氣管炎的豬血清中檢測到抗這些蛋白質的抗體。可將這些抗原用于疫苗組合物中，以產生抗各種博德特氏菌感染的免疫力。
7.抗鳥博德特氏菌外膜蛋白抗體反應的蛋白質的鑒定a.大腸桿菌中鳥博德特氏菌基因庫的構建用Hull等人的方法(50)從鳥博德特氏菌GOBL124中分離染色體DNA。用Sau3a、HindⅢ或XhoⅠ部分消化鳥博德特氏菌GOBL124DNA，通過蔗糖梯度分離按大小分離各片段，然后選出25-27kbSau3a、HindⅢ或XhoⅠ酶切之DNA片段用于連接。將按大小分離的、經Sau3a消化的鳥博德特氏菌DNA連接到經BamHⅠ消化的粘性質粒pYA2329DNA上，同時將按大小分離的、經HindⅢ和XhoⅠ消化的鳥博德特氏菌DNA連接到經HindⅢ和XhoⅠ消化的pCP13DNA上。將已連接的DNA包裹到由Promega提供的Packageneλ頭和尾蛋白質中，并使用promega方法轉染到大腸桿菌LE392中。將重組大腸桿菌克隆鋪敷在含50μg/ml四環素(選擇有pCP13載體的重組粘性質粒)或50μg/ml鏈霉素(選擇有pYA2329載體的重組粘性質粒)的LB瓊脂上。
b.產生與抗鳥博德特氏菌外膜蛋白抗體和恢復期火雞血清反應之蛋白質的大腸桿菌重組粘性質粒克隆的鑒定以菌落免疫印跡分析法檢測能與抗鳥博德特氏菌外膜蛋白抗體反應、并與鳥博德特氏菌感染之火雞恢復期血清反應的重組大腸桿菌克隆。簡單地說，將重組大腸桿菌克隆鋪敷在含50μg/ml四環素的LB瓊脂上，再將菌落印跡轉移到硝酸纖維素濾紙上，經暴露于氯仿氣霧而溶菌，并與抗鳥博德特氏菌外膜蛋白抗體反應4小時。洗滌后除去殘留的第一抗體，使含有已溶解之重組克隆的濾紙與得自ICN公司的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔ⅠgG(親和純化的)反應4-5小時，保溫后用4-氯-1-萘酚底物顯色，并照相記錄實驗結果。
用相同方法鑒定產生能與恢復期火雞血清反應之鳥博德特氏菌蛋白質的大腸桿菌重組克隆，所不同的是用恢復期火雞血清作第一抗體，用Kappel公司的辣根過氧化物酶標記的羊抗火雞ⅠgG抗體作為第二抗體。
C.由大腸桿菌重組克隆產生之鳥博德特氏菌蛋白質的Western免疫印跡用菌落免疫印跡雜交法初步鑒定大腸桿菌LE392克隆后，用SDS-聚丙烯酰胺電泳法分析大腸桿菌陰性克隆。將煮沸的完整細胞蛋白質電轉移到硝化纖維素濾紙上，并按“材料和方法”部分所述進行Western免疫印跡分析。根據與抗鳥博德特氏菌外膜蛋白質的反應性，鑒定出5個重組粘性質粒克隆(圖6)。從XhoⅠ產生的粘性質粒庫中分離出這些大腸桿菌LE392克隆中的一個。該克隆可產生21KDa蛋白質，并被定名為pYA2320。重組克隆pYA2326是從HindⅢ產生的粘性質粒庫中分離得到的，它編碼40KDa蛋白質。稱為pYA2337、pYA2338和pYA2339的三個重組克隆是Sau3a產生的粘性質粒庫中分離出來的，并分別在LE392中表達37KDa、43KDa和46KDa蛋白質。
鑒定Sau3a產生之質粒庫中的一個重組粘性質粒克隆，該克隆可在LE392中表達能與恢復期火雞血清起反應的50KDa蛋白質，并將其稱為pYA2333(圖7)。
按實例C.3中所述方法，進一步檢驗這些蛋白質在氣管細胞上的粘附活性，以確定是否為外膜粘附蛋白質。
d.粘性質粒克隆pYA2320的特性分離pYA2320DNA，用BamHⅠ-PstⅠ消化，與BamHⅠ-PstⅠ消化的pYA2329連接，并將該重組體轉化到大腸桿菌LE292中。與抗鳥博德特氏菌OMP抗體進行菌落免疫印跡分析，篩選轉化體，以鑒定能產生21KDa蛋白質的大腸桿菌亞克隆。經菌落免疫印跡分析鑒定出一個轉化體，并經限制性核酸內切酶分析表明該重組克隆(稱為pYA2332)含有6KbBamHⅠ-PstⅠDNA片段。對含pYA2332的LE392完整細胞蛋白質進行Western免疫印跡分析，表明該克隆產生了21KDa蛋白質。這一結果表明6KbBamHⅠ-PstⅠDNA片段編碼21KDa蛋白質的整個基因，并提示該基因在大腸桿菌中的表達是由該克隆基因的啟動子操縱的。將6KbBamHⅠ-PstⅠ片段與作類似消化的pUC8-1DNA相連接，并轉化到大腸桿菌JM109中，以進行限制性核酸內切酶圖譜分析，并作進一步的操縱。該大腸桿菌克隆被定名為pYA2340。按Maniatis等人所述方法對pYA2340的質粒DNA進行限制性核酸內切酶圖譜分析。
8.大腸桿菌重組克隆的保留按下述方法，將能產生與抗鳥博德特氏菌外膜蛋白抗體或恢復期火雞血清反應之鳥博德特氏菌蛋白質的大腸桿菌重組克隆保存于-70℃下。即在含有合適抗生素的LB瓊脂培養基中使該大腸桿菌克隆37℃下生長過夜，與等體積80%甘油(在水中)混合后保存于-70℃下。
9.沙門氏菌重組疫苗菌株的生產經缺失分別編碼腺苷酸環化酶和cAMP受體蛋白質的cya和crp基因，使沙門氏菌成為無毒力的。這兩種蛋白質對許多基因及許多與分解代謝產物的運輸和分解有關的操縱子的轉錄都是必不可少的。而且，可以缺失編碼天冬氨酸-β-半醛脫氫酶的基因(asd基因)。該酶可用于催化二氨基庚二酸(DAP)(細菌細胞壁的成分)的合成。不能合成DAP的突變株則不能在沒有DAP的培養基中存活。已建立了幾個含有這些缺失突變的沙門氏菌菌株。特別有用的是菌株chi4064和chi4072(參見Curtiss和Kelly的文獻(13)及待批專利申請251304號)。試驗表明chi4064對1天令的小雞無毒力。可在其腸壁上寄生幾周。
也已表明這些寄生在GALT上的菌株可引起全身性免疫反應，在一些粘膜表面產生抗該克隆抗原的分泌型免疫球蛋白A(SIgA)。
為了將鳥博德特氏菌粘附抗原引入無毒力的沙門氏菌菌株中，可使用標準技術將該抗原克隆到Asd+載體pYA292中。待批專利申請251304號中已對這一載體作了描述，并在圖2中作了圖解說明。可將該載體引入上述的無毒力菌株chi4072中。
10.表達21KDa抗原之沙門氏菌重組疫苗菌株的構建將6Kb來自pYA2332的BamHI-PstI鳥博德特氏菌DNA片段連接到BamHI-PstI消化的pYA292上，并轉化到大腸桿菌chi6097中。與抗鳥博德特氏菌OMP抗體進行Western免疫印跡雜交(圖9)。結果發現所得到的含pYA2336重組質粒(圖8)的轉化株能產生21KDa蛋白質。將分離得到的pYA2336DNA轉化到鼠傷寒沙門氏菌chi3730中。當用上述Western免疫印跡法檢測時，發現所得轉化體[稱為chi3730(pYA2336)]也能產生21KDa蛋白質。按Davis，Botstein和Roth，AdrancedBac-terialGenetics，ColdSpringHarborLaboratories)所述方法，用噬菌體P22HⅠint以0.01多重性感染對數生長期的chi3730(pYA2336)，結果該轉化株產生噬菌體P22HⅠint溶菌產物。生長12-15小時后，用氯仿溶解被感染的細菌，離心除去細胞碎片，收獲并滴定該噬菌體溶菌產物。用上述感染對數生長期細菌(感染重復數為0.5)所產生的P22HⅠint溶胞產物轉染鼠傷寒沙門氏菌，然后在LB瓊脂中選擇轉導體。用抗鳥博德特氏菌OMP(圖9)抗體進行Western免疫印跡分析，發現該轉錄體能產生21KDa蛋白質。
11.用重組沙門氏菌菌株免疫雞和火雞按下述方法，用C.9和C.10中所述重組沙門氏菌菌株免疫雞和火雞。將該重組無毒力微生物加入飲用水中，經口和鼻內途徑免疫1-3天令的雛雞。檢測血清和呼吸道分泌物以確定抗體反應的類型[ⅠgY(ⅠgG、7SⅠg)、ⅠgM和ⅠgA(ⅠgB)]和程度。比較免疫和未免疫雞和火雞雛的體重減少量，以監測該疫苗可能產生的付作用。另外，將109個有毒力的鳥博德特氏菌經鼻內途徑接種，或使其接觸已被感染的雞，以攻擊雞和火雞幼雛，然后觀察被攻擊雞雛的發病和尸檢結果，并檢查氣管組織損傷和感染對象的滴度變化。
如果抗鳥博德特氏菌的粘膜免疫反應不足以保護小的雞和火雞，可用表達鳥博德特氏菌外膜抗原的無毒力沙門氏菌免疫有繁殖力的母雞，由雞卵傳遞母體抗體。當年青雞或小火雞成長后，這種處理便可增強對鳥博德特氏菌的免疫力。也可在幼禽成長過程中用相同的重組載體給予口服，以產生保護性免疫作用。
據此，本發明公開了博德特氏菌外膜抗原，含這些抗原的疫苗及其給藥方法。雖然對本發明的優選方案已作了較詳細的敘述，但在不脫離本發明的精神和待批權利要求之范圍的情況下，本領域技術人員可以作出較明顯的改動。
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權利要求
1.純化的博德特氏菌屬外膜蛋白質。
2.純化的鳥博德特氏菌外膜蛋白質。
3.根據權利要求1或2的蛋白質，其中蛋白質分子量約為21KDa、37KDa、40KDa、43KDa、46KDa或50KDa。
4.包括病原微生物之無毒力衍生株的用以表達博德特氏菌外膜蛋白質的載體微生物，該衍生株基本上不能產生功能性腺苷酸環化酶和功能性環AMP受體蛋白質，而能夠表達編碼該外膜蛋白質的重組基因。
5.根據權利要求4的載體微生物，其中所說的微生物還基本上不能產生功能性天冬氨酸-β-半醛脫氫酶、該重組體基因借助載體被引入所說的載體微生物中，且所說的載體攜帶與編碼所說外膜蛋白質的基因連接之編碼天冬氨酸-β-半醛脫氫酶或其功能性片段的蛋白質。
6.根據權利要求5的載體微生物，其中所說的外膜蛋白質來自鳥博德特氏菌(B.arium)。
7.用于表達分子為21KDa、37KDa、40KDa、43KDa、46KDa或50KDa之鳥博德特氏菌蛋白質的載體微生物，所說的載體微生物包括病原微生物的無毒力衍生株，所說的衍生株基本上不能產生功能性腺苷酸環化酶、功能性環AMP受體蛋白質和功能性天冬氨酸-β-半醛脫氫酶，其中所說的載體微生物包含攜帶編碼天冬氨酸-β-半醛脫氫酶或其功能性片段的基因，且該基因是與編碼鳥博德特氏菌蛋白質的基因相連的。
8.根據權利要求4、5、6或7中任一項的載體微生物，其中所說的微生物是沙門氏菌屬的成員。
9.根據權利要求4的載體微生物，其中所說的微生物是chi4064(ATCC53648)。
10.根據權利要求5的載體微生物，其中所說的微生物是chi4072(ATCC67538)或chi6987(ATCC_)。
11.包含表達暗盒的DNA構建體，其包括(a)編碼至少含一個博德特氏菌屬外膜蛋白質抗原決定基或至少一個鳥博德特氏菌外膜蛋白質抗原決定基之多肽的DNA編碼順序;及(b)可操作地連接到上述編碼順序上的控制順序，從而使所說的編碼順序能在宿主細胞內轉錄和轉譯，且所說的DNA編碼順序或控制順序中至少一個是與宿主細胞異源的。
12.被根據權利要求11的DNA構建體穩定轉化的宿主細胞。
13.一種產生重組多肽的方法，包括(a)提供權利要求12的宿主細胞群體，并(b)在適于由所說的表達暗盒編碼的多肽表達的條件下培養所說的細胞群體。
14.對博德特氏菌屬外膜蛋白質或鳥博德特氏菌外膜粘附蛋白質特異的純化的多克隆抗體。
15.對博德特氏菌屬外膜蛋白質或鳥博德特氏菌外膜蛋白質特異的單克隆抗體。
全文摘要
本發明公開了博德特氏菌屬外膜蛋白質、含有這些蛋白質的疫苗組合物及其使用方法。可用重組方法并在用于免疫特定個體的無毒力載體微生物中表達該外膜蛋白質。該目的抗原提供了預防和治療博德特氏菌屬誘發之疾病如火雞和雞和上呼吸道感染、豬和狗的萎縮性鼻炎和人百日咳等的方法。
文檔編號A61K39/116GK1046532SQ9010362
公開日1990年10月31日 申請日期1990年3月31日 優先權日1989年3月31日
發明者布科·讓·呂克, 科蒂斯三世·羅伊, 克勞迪婭·金特里, 威克斯 申請人:華盛頓大學