專利名稱：鉑-(iv)-二胺復合物、制備該類化合物的方法、至少含有一個鉑化合物的具有抗腫瘤作用 ...的制作方法
技術領域：
本發明是關于鉑-(Ⅳ)-二胺復合物、制備該類化合物的方法、含有該類型化合物的具有抗腫瘤作用的制劑，以及具有抗腫瘤作用的成形制劑。
大約20年以前，美國生物化學家B。Rosenberg等發現，順式-二胺-二氯鉑(順式-鉑)具有很強的抗腫瘤活性(B.Rosenberg，L.VanCamp，J.Trosko和V.H。Mansour，Nature222，1969，385-386頁)。同時發現，在腫瘤治療中，尤其在卵巢瘤和睪丸瘤的治療中，該化合物與其他抗腫瘤劑并用具有重要的用途。但是順式-鉑有許多十分不良的付作用。它可引起患者嚴重的惡心，并伴有嘔吐。此外，它還有腎、骨髓和神經毒性，并可損害聽力。將D.Th.Sleijfer，S.Meijer和M.H.Mulder的文章Cis-platinareviewofclinicalapplicationsandrenaltoxicity(Pharm.Weekbl.〔Sci.〕1985，7237～244頁)收編在本申請中作為參考。從1970年以來，對于順式-鉑作用的機制，具有較高抗腫瘤活性和/或迄今抗腫瘤活性不敏感的類似物、降低毒付作用的類似物和/或改進物理和藥學性質的類似物進行了廣泛的研究。
許多鉑-二胺類復合物可以從文獻中查到。但是仍然十分需要已改進其特性的新的抗腫瘤劑，具體來說，十分需要對于順式-鉑有抗性的或有嚴重抗性的腫瘤具有活性的化合物。將兩篇近期的綜述、論文收編在本申請中作為參考，例如E.W.SternTheSearchforNewPlatinumAntitumorAgentsProgress，ProblemsandProspects，inPlatinumandotherMetalCoordinationCompoundsinCancerChemotherapy，由MarinoNicolini編輯，由MartinusNijhoff出版，波士頓，Dordrecht，蘭開斯特，ISBN0-89838-358-7，1988，519-526頁;H.A.Meinema，Platinaverbindingenterbestrijdingvanvankankersynthese，eigenschappenenstructuuractiviteitsrelaties(治療癌的鉑類化合物合成、性質及其結構-活性關系)，Pharm.Weekbl.123(1988)，549～552頁。
二胺-鉑復合物在德國專利申請79.04740中已有敘述，其特征在于，結構式1
中R1和R2相互獨立地代表氫原子，或者代表取代或未取代的烷基、環烷基、芳基或芳烷基，同時R1和R2與它們所連接的碳原子一起可以是取代或未取代的環烷基，R3和R4相互獨立地代表氫原子，或者代表取代或未取代的烷基、芳基或芳烷基，并且X代表陰離子基團。
二胺一鉑復合物在德國專利申請8204067中已有敘述，其特征在于，結構式圖式1中R1和R2均代表乙基，或者R1和R2與它們所連接的碳原子一起可以是苯基(這里需要指出的是，實例表明它不是苯基而是環烷基)，R3和R4均代表氫原子，并且各個X代表氯代乙酸酯基或硝酸酯基，或者兩個基團X一起代表丙二酸酯基，乙基丙二酸酯基、羥基丙二酸酯基、羧基鄰苯二甲酸酯基、環丁烷-1，1一二羰酸酯基或草酸酯基，或者上述基團的之一為鈉鹽。
國家癌癥研究所(NationalCancerInstitute，貝塞斯達，USA)和癌癥治療研究的歐州組織(EuropeanOrganizationforResearchontheTreatmentofCancer，布魯塞爾，比利時，)進行的廣泛研究表明，上述化合物對癌具有顯著的治療活性。與實際應用的治療癌的其他已知鉑復合物相比，上述復合物有較低的腎毒性。
德國專利申請80，00032(現在專利號181.434)敘述了具有抗腫瘤作用的鉑復合物式2，
其中R1和R2相互獨立地代表氫原子，或者代表取代或未取代的烷基、環烷基、芳基或芳烷基，同時R1和R2與它們所連接的碳原子一起可以是取代或未取代的環烷基，R3和R4相互獨立地代表氫原子，或者代表取代或未取代的烷基或芳烷基，并且X和Y代表相同或不同的陰離子基團。上述化合物對許多類型的癌具有作用，并且有減低的腎毒性。
現已發現，結構式圖中式3化合物(TNO-40)對于順式-二胺-二氯-鉑(順式-鉑)已產生抗性的腫瘤細胞具有非常好的作用。
式3化合物對于不同類型的腫瘤具有顯著的作用。從帶有腫瘤的小白鼠的試驗結果表明，與未處理的對照組(C)相比，處理組(T)的存活時間明顯延長。T/C×100%(T/C%)值大于或等于125，表明具有顯著的治療活性。
抗L1210白血病的最大T/C(%)為193(4mg/kg)，而對照組試驗順式-鉑的最大T/C(%)為138(6mg/kg);抗B黑素瘤的最大T/C(%)為163(0.8mg/kg)，而順式-鉑的最大T/C(%)為171(1.6mg/kg)，抗皮下注射移植的M5076肉瘤，靜脈注射治療最大的T/C(%)為126(3mg/kg)，而順式-鉑最大的T/C(%)為135(4mg/kg)。
尤其使人感興趣的是該化合物(TNO-40)對于順式-鉑已產生抗性的人卵巢癌A2780的細胞系(A2780/124和2780/DDP)具有抗腫瘤作用。這里判斷標準是抑制細胞生長的濃度IC50A2780/124或IC50A2780/DDP與IC50A2780的比值≤4.0。對于TNO-40，比值分別為3.3和3.6。對于順式-鉑，相應的比值分別為10和12.6。
按照實質上已知的方法，將得到的有效化合物制成藥用制劑。其中可應用常用的添加劑。
本發明的有效化合物可以按照實質上已知的方法制備。以下述實例詳細敘述制備方法。
實例Ⅰa順式-二氯-1，1-雙(氨甲基)環戊烷-鉑-(Ⅱ)35.5g(0.086mol)氯亞鉑酸鉀(K2PtCl4)和17.2g1，1-雙(氨甲基)-環戊烷二鹽酸鹽溶于200ml蒸餾水中。
將溶液溫熱至90°-95℃。
以一定的速度加入6.9gNaOH在70ml蒸餾水中的溶液，以致于使PH≤7(最終PH＝7.5)。
生成的固體物質用抽濾法濾出，并用蒸餾水(50ml)和丙酮(25ml)漂洗。經干燥的固體物質溶于600～800ml液態氨中。濾去不溶部分。蒸發氨以后，產物用2NHCl(50ml)和蒸餾水(100ml)洗滌，并于干燥器中用氫氧化鉀干燥。干重為23g(68%)。
元素分析計算值(%，按重量計)C21.33H4.09N7.11實測值(%，按重量計)C21.25H4.13N7.27′H-NMR譜(溶劑為DMSO-d6，VARIAN T-60)(相對于TMS的化學位移，以ppm表示)CH2(環)1.46
CH2(NH2)2.18NH24.90(衛星信號4.30和5.)實例Ⅰb四氯-1，1-雙(氨甲基)環戊烷-鉑-(Ⅳ)3g(0.008mol)順式-二氯-1，1-雙(氨甲基)環戊烷-鉑-(Ⅱ)懸浮于40ml蒸餾水中。
將懸浮液溫熱至70℃，隨后邊攪拌邊通入氯氣1小時。
向反應混合物中通入空氣，以除去多余的氯氣(溫度＝70℃)。
使反應混合物冷卻，用抽濾法濾出固體物質，用蒸餾水洗滌，在減壓下用氫氧化鉀干燥，得到2.6g(73%)黃色固體物質。
元素分析計算值(%，按重量計)C1808H3.47N6.02實測值(%，按重量計)C18.06H3.46N6.14′H-NMR譜(溶劑為DMSO-d6，VARIAN T-60)(相對于TMS的化學位移，以ppm表示)CH2(環)1.50CH2(NH2)2.23NH26.80(衛星信號6.33和7.20)實例Ⅰc順式-硫酸根合-反式-二氯-1，1-雙(氨甲基)環戊烷-鉑-(Ⅳ)將3.5g(0.0075mol)四氯-1，1-雙(氨甲基)-環戊烷-鉑-(Ⅳ)懸浮于110ml蒸餾水中。向該懸浮液中加入2.21g(0.007mol)硫酸銀，混合物在避光下攪拌24小時。
濾出生成的氯化銀，用蒸餾水(20ml)漂洗。
清晰的黃色濾液于減壓下蒸發，得到3.0g(81%)黃色固體物質。
元素分析計算值(%，按重量計)，含二個結晶水C5.98H3.83N5.32pt37.07Cl13.47O18.24S6.09實測值(%，按重量計)C16.05H3.94N5.35pt36.99Cl13.65O18.08S6.09′H-NMR譜(溶劑為D2O，VARIAN T-60)(相對于三甲基甲硅烷基丙烷磺酸鈉鹽的化學位移，以ppm表示)CH2(環)1.63CH2(NH2)2-2.6H2O/D2O4.73測定以上制備的化合物的生物效果。
體外細胞毒性評價鉑復合物在體外對下述細胞系的細胞毒性作用B16-F10鼠黑素瘤、HCT-116人結腸癌、A2780人卵巢癌以及對順式-鉑有抗性的A2780的兩個亞系。將B16-F10細胞系保存在由Earle氏鹽(Gibco)、2mmolL-谷氨酰胺、2.06mmol丙酮酸鈉、胰島素(0.26單位/ml)、青霉素/鏈霉素(分別為10單位/ml和10mcg/ml)、MEM非必需氨基酸(0.6%，按重量計，Gibco)和小牛血清(10%，按重量計，Hyclone)組成的伊格爾最低必需培養液(MEM)中。將HCT-116細胞培養在補充有2mmolL-谷氨酰胺、0.12mmolL-絲氨酸、0.17mmol天冬酰胺、1.5mmol丙酮酸鈉、MEM必需氨基酸(0.625%，按重量計，Gibco)、MEM非必需氨基酸(0.67%，按重量計，Gibco)、MEM維生素(0.6%，Gibco)、小牛血清(10%，按重量計，Hyclone)和青霉素/鏈霉素(分別為10單位/ml和10mcg/ml)的McCoy氏5A改良培養液(Gibco)中。將A2780細胞系培養在補充有小牛血清(10%，按重量計，Hyclone)、2mmolL-谷氨酰胺和青霉素/鏈霉素的RPMI培養液1640(Gibco實驗室)中。將所有的細胞系置于含5%(按體積計)CO2和高大氣濕度的恒溫箱中，于37℃保溫。
呈對數生長的細胞通過溫和的胰蛋白酶消化作用收集，并將4000個細胞加到96孔微量滴定板(Costar)中。將微量滴定板置于含5%(按體積計)CO2的恒溫箱中，于37℃保溫一夜，使細胞粘附在微量滴定板上。然后用鉑復合物或順式-鉑處理細胞，并保溫72小時。將微量滴定板翻轉過來并搖動，以除去培養基、有藥理學活性的化合物以及與滴定板粘附不牢的細胞。加入甲醛水溶液(10%)的磷酸鹽緩沖液-生理鹽水溶液，固定細胞10分鐘。除去固定物，在空氣中干燥微量滴定板，用0.0075%(按重量計)的結晶紫染色15分鐘，洗滌兩次，在空氣中干燥。色斑用0.2ml0.1M乙酸/乙醇(1∶1)溶解，用Dynatech MR 600型微量滴定板讀數計測定光密度。借助吸光度值的線性回歸分析，計算半數抑制濃度，即IC50值(引起50%細胞生長抑制的濃度，以mcg/ml表示)。
在體外細胞毒性試驗的結果列于表A。所研究的化合物對5種細胞系均有細胞毒作用。但是最重要的事實是對順式-鉑有抗性的A2780人卵巢癌的二個亞系細胞(A2780/124和A2780/DDP)對本發明化合物敏感，這可以由IC50比值等于或小于4.0證明。
對L1210鼠白血病的作用研究鉑復合物對L1210鼠白血病的抗腫瘤作用。將L1210白血病的106腹水細胞通過腹膜內注射接種到體重為20g的CDF1小白鼠體內。在通過腹膜內接種腫瘤細胞的當天開始給予該活性復合物。通過腹膜內注射給予不同劑量的復合物。每個劑量用6只小白鼠為一組，給藥當天以單次劑量給予復合物。試驗中10只對照組小白鼠給予生理鹽水溶液。用順式-二胺-二氯-鉑(順式-鉑)處理的小白鼠作為陽性對照。處理前將小白鼠稱重，處理后第5天或第6天再次稱重，各組動物體重的平均變化作為評價毒性大小的指標。每天檢查動物的死亡率，在30天后結束試驗。根據T/C%確定抗腫瘤的活性，T/C%是用有效復合物處理組平均存活時間與用生理鹽水溶液處理的對照組平均存活時間的比值再乘以100而得到。用生理鹽水溶液處理的小白鼠平均存活時間一般為7天。當T/C≥125%時，受試化合物被認為是有效的。
表B總結了該復合物對L1210鼠白血病的抗腫瘤效果。表B還列出了各個試驗劑量測得的T/C%值。在本試驗觀察的各個劑量下，所研究的化合物TNO-40是有效的，在4mg/kg劑量下最大的T/C為193%。
抗B16黑素瘤的作用評價有效化合物(TNO-40)對B16黑素瘤的抗腫瘤作用。每組10只BDF1小白鼠經腹膜內注射接種0.5ml10%(重量/體積)B16黑素瘤的均勻組織勻漿懸液。在移入腫瘤細胞后1天開始經腹膜內注入該有效化合物，每天給藥一次，連續9天。在每次試驗中，對照組給予生理鹽水溶液，用順式-鉑處理組作為陽性對照。每天統計存活的小白鼠數，60天后停止試驗。用該有效化合物處理的小白鼠與對照組小白鼠的平均存活時間的比值(T/C%)作為抗腫瘤作用的指標。當T/C(%)為125時，受試化合物被認為是有效的。
表C總結了這些金屬復合物的試驗結果，表中還列出了各個劑量下測得的T/C(%)。每次注射量為0.4、0.8和1.6mg/Kg時，本發明化合物是有效的，每次注射0.8mg/Kg劑量時，最大T/C(%)為163。
抗M5076網狀細胞肉瘤的作用還評價了本發明的復合物對經皮下注射移植的M5076肉瘤的抗腫瘤作用。每組8只BDF1小白鼠，經皮下注射接種M5076腫瘤。在移植腫瘤之后第5天開始經靜脈給小白鼠復合物，并且在第9、13和17天再各給1次。因此總共給予4次復合物。試驗了復合物的4個劑量。本試驗還包括用生理鹽水溶液處理組和用順式-鉑處理組作為對照。每天統計小白鼠存活數，試驗在75～80天之后結束。根據a)和b)確定化合物的抗腫瘤作用，a)是用有效化合物處理的小白鼠與對照組小白鼠平均存活時間的比值(T/C%)，b)是用有效化合物處理的小白鼠經皮下移植的腫瘤長至重1g所需要的平均時間與對照組小白鼠經皮下移植的腫瘤達到重1g所需要的平均時間的差值(T-C)。如果T/C≥125%，或T-C≥13天，那么該復合物被認為是有效的。
用鉑復合物試驗的結果總結在表D中，表中給出了各個劑量下的T/C和T-C。每次注射量為3、4mg/Kg時，研究的化合物是有效的，其T/C%值分別為126%和125%，T-C值分別為16.8天和20.3天。
表B
＊腹膜內注射，劑量為mg/kg，1天1次。
表C對B16黑素瘤的抑制作用
＊腹膜內注射，每次注射的劑量為mg/kg，每1-9天給藥。
表D對M5076肉瘤的抑制作用
＊靜脈注射，劑量為mg/kg，第5、9、13和17天給藥。
說明書所提到的化合物的分子式如下
權利要求
1.結構式3所示的鉑-(Ⅳ)-二胺復合物。
2.制備式3化合物的方法，該方法的特征在于，使式4化合物
與氯亞鉑酸鉀(K2ptcl4)反應，將反應產物氯化，并且與硫酸銀反應。
3.具有抗腫瘤作用的制劑，其特征在于其中含有至少一種式3所示化合物作為有效化合物。
4.具有抗腫瘤作用的成形制劑，其特征在于其中含有式3所示化合物
全文摘要
本發明是關于鉑-(N)-二胺復合物(式3)，制備該化合物的方法，以及含有該化合物的具有抗腫瘤作用的制劑。此外，本發明還包括含有該化合物的具有抗腫瘤作用的制劑。
文檔編號A61P35/00GK1040591SQ89106648
公開日1990年3月21日 申請日期1989年8月30日 優先權日1988年8月31日
發明者弗朗西斯科·沃比克, 哈門·安尼·梅尼馬 申請人:荷蘭梯恩歐應用科學研究會