可消毒的氣體滲透性培養活細胞容器的制作方法

專利名稱：可消毒的氣體滲透性培養活細胞容器的制作方法
概括講，本發明涉及培養活細胞用容器;具體講，本發明涉及一種可消毒的氣體滲透性容器。
微生物污染是當今人們培養組織培養物時所遇到的難題之一。污染既浪費了時間和資金，又損失了有價值的組織培養物。除污染之外，植物組織培養人員面臨的是在培養之前對植物細胞進行“殺菌”處理所引出的一些問題。目前，根本沒有對植物組織殺菌而對植物組織本身又不損害的方便方法。
現在還沒有對裝有培養物的組織培養箱去污(消毒)的已知(即原位去污)方法，因為一些已知的去污法，例如蒸汽處理法或環氧乙烷處理法，均會破壞培養物。由于不能進行原位去污，所以人們采用各種方法來盡量減小組織培養物污染的機會。業已設計的培養箱能在培養容器上方提供垂直層流空氣。這種層流空氣流有助于防止空氣中的污染物與組織培養物接觸。有個制造廠家研制出一種帶有銅壁的在適當條件下具有殺菌作用和殺真菌作用的培養箱。但是，這樣一種培養箱卻不能破壞空氣中擱板上或各種組織培養容器上的污物。過去，人們在組織培養物上添加抗菌素來防止污染。但是，在細胞中可以發生遺傳或新陳代謝方面的變化，所以現在希望盡可能避免向生長培養基中加入抗菌素。因此，目前需要一種能夠對帶培養物的組織培養箱進行去污的適當方法。
現在，植物細胞培養人員在培養實驗之前仍要使用不完善的方法對植物細胞殺菌。目前的作法包括在稀的Chlorox(1%)、戊二醛或乙醇中將樣品浸泡達30分鐘。許多植物細胞不能暴露在這些消毒劑之中。但是現在卻沒有其它方法。為獲得純凈培養物而采用的一般方法仍在摸索。因此，目前需要一種在進行培養試驗之前能夠使植物細胞培養人員對植物細胞殺菌的方法。
已知很低濃度的氣相過氧化氫能有效地進行去污和滅菌。雖然過去為此目的使用過氣相過氧化氫，但是這種使用尚未涉及到活細胞。例如參見授予Coulter的題為“面包制品的貯存”的美國專利2，193，622號，授予Moore等人的題為“過氧化氫蒸氣消毒法”的第4169123號美國專利和授予Forstrom等人的題為“冷氣體消毒法”的第4，169，124號美國專利。在上述各專利中均采用氣相過氧化氫消毒，但不是用在對于包含活組織的環境進行消毒上。
人們使用液相過氧化氫于固定的全部細胞四周來增強充氧作用，但是卻未用于去污，見Holst文章“固定葡糖桿菌屬氧化用氧源-過氧化氫”，《應用微生物學和生物工藝學》，22，383-388頁。這種方法的主要缺點是在酶解過氧化氫為氧和水之前，液相中的過氧化氫濃度(34毫克/升)將大部分細胞破壞。
目前，市場上可買到各種帶有可以進行氣體交換用彎曲路徑的組織和細胞培養容器。但是這種容器在培養時，如上述被微生物所污染。人們知道，過氧化氫或派生出的游離羥基原子團在組織培養物中具有細胞毒性，因此也與染色單體損壞有關。
在上述共同待批申請中所述的去污方法之前，沒有對有組織和細胞培養物的組織培養箱進行直接去污的適當方法，因為已知的一些去污法，例如蒸汽或甲醛處理法均損壞培養物。因此，對于組織或細胞培養容器來說，也就不需要防止過氧化氫蒸汽進入其中。已知有各種物質催化過氧化氫降解為水和氧的反應，例如見Houlsby的美國專利4，521，375、Hata等人的美國專利4，368，081和Gaglia，Jr.的美國專利3，912，451。
本發明目的在于提供一種防止過氧化氫蒸汽進入其內的組織或細胞培養容器。本發明的另一目的在于提供這樣一種對其它氣體依然是滲透性的容器。
本發明目的是通過把容器改進為適于培養活細胞用的方法完成的。所說的容器包括一個可密封的部分、密封該可密封部分的裝置、氣體流入和流出容器的通道和設置在所說的通道的一個氣體滲透性過濾器使氣體只有通過所說的過濾器才能流入和流出容器。所說的過濾器結合有一種使過氧化氫降解為水和氧的材料來阻止過氧化氫進入容器。所說的材料最好能使氣相過氧化氫催化降解為水蒸汽和氧。
所說的過濾器可以是一條帶有粘合襯墊的帶，以便覆蓋由可密封的部分兔芊庾爸彌淶慕喚绱λ范ǖ耐ǖ啦糠幀；蛘咭部梢允顧檔墓似魃柚迷謁檔拿芊庾爸彌小 使過氧化氫降解為水和氧的所說材料，可以選自過氧化氫酶、活性炭、蒙乃爾合金、哈司特洛伊耐蝕鎳基合金C、鈷、丙酮酸鈉和二氧化錳。
為了便于清楚地理解和易于實施本發明，現在通過實例只參照


一些優選實施方案，其中圖1表示一種培養箱，這種培養箱具有一種使用本發明容器時能夠實施原位去污法的設備;
圖2是一種使用本發明容器時實施表面去污法所涉及步驟的流程圖;
圖3是表明氣相過氧化氫濃度與時間關系的曲線圖;
圖4是一種用于試驗表面去污法效能的培養箱;
圖5是一幅在帽上具有過濾器的一種本發明容器透視圖;
圖6是圖5容器沿Ⅵ-Ⅵ線表示帽和過濾器的局部剖面圖;
圖7是本發明容器第二種實施方案的透視圖，此容器的過濾器呈帶狀;
圖8是圖7容器的俯視圖;
圖9是圖7容器沿圖8中Ⅸ-Ⅸ線的截面圖。
在圖1中，培養箱10裝備有一臺用氣相過氧化氫能夠實施表面去污法的裝置12。應當知道，雖然在圖1中所示的裝置12(在虛線內列出的)是一種與培養箱10分開的部件，但是可以把包括裝置12的一些部件裝在培養箱10之中。對于培養箱10來說繪出裝置12僅僅是為了說明的目的。可以使用帶有高壓消毒鍋或任何其它類型密閉預定區域的裝置12。
所說的培養箱可以是一種傳統類型的、已知的、帶有進氣管14和排氣管16的培養箱。所說的進氣管14可以接受室內空氣或其它任何一種使用培養箱時所需的氣體。使用排氣管16排放培養箱10中的氣體。
裝置12具有在本實例中接收室內空氣的進氣管18。裝置12具有連接到培養箱10之進氣管14上的排氣管20。
進氣管18通過一個亞微空氣過濾器24連接到泵22上。作為泵22的替代物，可以把一個產生抽力的裝置安放在排氣管16之中。泵22的出口連接到蒸發室26上，而蒸發室26通過一個流量計28連接到排氣管20上。蒸發室26還通過閥門32連接到液相過氧化氫源30上。
蒸發室26裝有一個溫度敏感元件34以及一個由熱源38加熱的蒸發柵36。熱源38還可以加熱或預熱空氣流。蒸發室26按下述方式起作用。由熱源38使加熱柵36保持在預定溫度下。預定的溫度足夠高，使液相過氧化氫與蒸發柵36接觸而蒸發。閥32控制來自例如可以是一個過氧化氫貯罐的源30的液相過氧化氫流。通過控制閥32的位置，來控制被送到蒸發柵36上的液相過氧化氫量。通過所用的溫度敏感元件34調節蒸發柵36的溫度。下面，結合說明圖2，來討論使用溫度敏感元件34去調節蒸發柵36溫度以及控制閥門34的方式。
培養箱10的排氣管16，包含一個從被排氣體中除去氣相過氧化氫用的過氧化氫過濾器39。
裝置12可以手動控制或用微處理機42控制。微處理機接收一個來自代表蒸發柵36溫度的溫度敏感元件34的輸入信號TV，一個來自代表空氣流(由箭頭46表示的)溫度的溫度敏感元件40的輸入信號Ts以及一個來自代表空氣流量(由箭頭46表示的)的流量計28的輸入信號F。除了這些輸入信號之外，微處理機42還接收由輸入裝置44發出的輸入數據。所說的輸入數據可以包括培養箱10的容積、在容器30之中的液相過氧化氫濃度、所需的滅菌或去污時間以及在培養箱10中欲保持的所需氣相過氧化氫濃度。如果把裝置12裝在培養箱10中，則微處理機42可以放入貯存的預編程序，使操作人員選擇各種預置的操作條件。如果裝置12是可以與各種不同培養箱10和其它箱體結合使用的便攜式裝置，則輸入裝置44可以是輸入所需信息用的鍵盤。向微處理機42中輸入所需信息的方式，據認為屬于本領域所屬技術人員所能很好勝任的，所以無需對之作進一步描述。
裝置12能夠在培養箱10中進行組織培養的同時完成本發明的去污方法。圖1中，圖示的培養箱10有三層擱板48、49和50。在擱板49上放有兩個容器52和54。容器52是其中盛有組織培養物53的開口容器。容器54是帶有螺紋蓋55的閉合容器，當螺紋蓋未旋緊時為氣體提供一種彎曲路徑。容器54中盛有組織培養物56。擱板50上載有密閉容器57，容器57在開口處有一片膜58，此膜能吸附過氧化氫但是卻可以使必要的氣體進入和流出容器57。容器57中盛有組織培養物59。
人們知道，開口型容器52可以用于不受過氧化氫影響的植物細胞或其它細胞的滅菌，而具有彎曲的氣體通路的閉合容器54和帶有膜58的閉合容器，可以用于需要屏蔽過氧化氫的動物細胞或其它細胞培養。顯然，其它類型的容器也可以用于本發明。
現在看一下圖2，其中詳細說明了能使本發明得以實施的各步驟。圖2所示出的步驟，可借微處理機42或用手工操作完成。在圖2中，在步驟60讀取代表蒸發柵36溫度的溫度信號Tv;在步驟62，確定蒸發柵36的溫度是否足夠高;如果溫度未達所需值，則在步驟64打開加熱器38，并且繼續監測溫度直到使之達到足以立即蒸發液相過氧化氫時為止。
一旦蒸發柵36的溫度達到所需值，則可以在步驟66關閉熱源38。在步驟68連通泵22以建立空氣流(由箭頭46表示)，使之通過蒸發室26進入培養箱10。接通泵22之后，由空氣流量計28產生的、代表通過蒸發室26之空氣流速信號F可以在步驟70讀取。作為由流量計提供代表空氣流速信號的替代方案，可以用由泵22制造廠家提供的數據按眾所周知的公式算出空氣流速。
讀出或算出空氣流速后，在步驟72借溫度敏感元件40讀取空氣流溫度。在步驟74，根據空氣流的速度信號F和溫度信號Ts算出可以通入培養箱10中的過氧化氫之最大理論流速。此計算在一些限定下進行，即通入培養箱室10中的過氧化氫量既不應造成氣相過氧化氫冷凝，也不應當使培養箱10中的壓力增高。假如允許氣相過氧化氫冷凝，則暴露的組織培養物就可能被破壞，而且不能均一地完成去污處理。如果允許培養箱中的壓力升高，則可能迫使氣相過氧化氫通過欲防止過氧化氫穿過的阻擋層。因此，最好使過氧化氫的通入速度既不會出現氣相過氧化氫的冷凝，也不會造成培養箱中壓力升高。
可以利用下列公式計算通入過氧化氫的最大理論速度m/t＝0.2427PYF/Ts……(1)式中m＝注入H2O2的量(克)，t＝時間(分)P＝H2O2-水溶液的分壓(乇)，Y＝H2O2在H2O2-水蒸汽中的摩爾分數，F＝空氣流速(英尺3/小時)，Ts＝空氣流溫度(°K)。
在方程1中，P和Y項數值可以從貯存在微處理機42中的適當表格中查出，例如參見在Shumb等著“過氧化氫”，1955，第226和227頁中的P和Y項數值表。或者可以根據該體系的已知條件，通過輸入設備44把P和Y項數值輸入。F和Ts項數值，分別由流量計28和溫度敏感元件40讀取。然后，可以按照方程1算出單位時間內注入的過氧化氫的理論最大值。
假如貯存在源30中的過氧化氫純度為100%，則由源30放出的含水過氧化氫流速就應當等于在步驟74中算出的理論最大值。但是，由于過氧化氫通常在很低濃度下貯存，因此過氧化氫水溶液的流速通常必須更高，以便達到在步驟74算出的注入速度。例如，假如過氧化氫水溶液濃度為30%，則此過氧化氫水溶液的流速必須大約為步驟74算出的最大流速的三倍才能達到步驟74計算出的速率。
在步驟76，自存貯器查尋在源30中貯存的液相過氧化氫濃度或自輸入設備44讀取該濃度。在步驟78，把在步驟74確定的單位時間內的理論最大質量速率，根據存在過氧化氫源30中的過氧化氫濃度轉變為達到在步驟74算出的所需注入速率所需的液體過氧化氫流速或滴速。
在假定空氣流溫度為37℃的條件下求解方程1，并且把所得結果根據30%過氧化氫水溶液換算成達到所需注入速率所需的過氧化氫水溶液流速。下表Ⅰ說明了這些結果。表Ⅰ說明，在不同的空氣流速下，可以把不同量30%過氧化氫水溶液送到蒸發柵36上，來達到向培養箱10中注入過氧化氫的理論最大速率值，也就是說保證氣相過氧化氫不冷凝，培養箱中壓力不增高的注入速率。
表Ⅰ在37℃下可以在空氣流中汽化的最大量30%H2O2溶液流速(英尺3/小時) 30%H2O2溶液的飽和限(毫克/分)17.2536.21072.415108.620144.8由表Ⅰ列出的過氧化氫水溶液流速得出氣相過氧化氫濃度為4.6毫克/升。通過把空氣流速換算為升/分，并將此值分成過氧化氫流速，可以求得上述濃度值。表Ⅱ列出的數據說明五種不同空氣流速下30%過氧化氫水溶液的最大流速。因此，在微處理機42控制下可以恰當地調節閥32，根據步驟74的計算結果和步驟78的換算結果提供所需的液體過氧化氫流速。顯然，當液體過氧化氫溶液具有較高濃度時，則此液體流速較低時就能達到同樣的過氧化氫注入速率。反之，如果液體過氧化氫濃度較低，則在較高的液體流速下才能達到同樣的過氧化氫注入速率。
在步驟79，查出所需的氣相過氧化氫濃度，(即室飽和度)和培養箱10容積。此信息可以存入微處理機存貯器中或通過輸入設備44輸入。在步驟80，根據下列方程可以算出氣相過氧化氫達到所需濃度所需的時間
t＝(-V/F)ln(l-Ct/Cin)……(2)式中t＝達到所需濃度的時間V＝培養箱容積F＝流速Ct＝時間t時刻室中H2O2濃度Cin＝內流空氣中的H2O2濃度假設時間t＝0，Ct＝0，流入室內的僅僅是以恒定流速F和恒定濃度Cin充入過氧化氫的空氣，而且在室內立即完全混合(如果自然條件妨礙完全混合，則可以使用保證室內完全混合的裝置，例如風扇或導流板)。做了這些假設后，使用與上述同樣的溫度(37℃)和同樣的液體過氧化氫濃度(30%)，對三種不同尺寸的室解出方程(2)。使用不同的空氣流速F，針對三種不同的室容積求出氣相過氧化氫達到12.5%、25%、50%和90%室飽和度所需的時間，結果列于下列表Ⅱ、表Ⅲ和表Ⅳ之中。
表Ⅱ(室容積為3英尺3，37℃，30%H2O2)流速(英尺3/小時) 在所需的室飽和度(%)下達到穩態所需的時間(小時)12.525509010.400.862.086.9150.080.170.421.38100.040.090.210.69150.030.060.140.46200.020.040.110.35H2O2蒸氣濃度(毫克/升) 0.58 1.15 2.30 4.14
表Ⅲ(室容積6英尺3，37℃，30%H2O2)在所需室飽和度(%)下達到穩態所需的時間(小時)流速(英尺3/小時) 12.5 25 50 9010.801.734.1613.8250.160.350.832.76100.080.170.421.38150.050.120.280.92200.040.090.210.69H2O2蒸氣濃度(毫克/升) 0.58 1.15 2.30 4.14表Ⅳ(室容積12英尺3，37℃，30%H2O2)在所需室飽和度(%)下達到穩態所需的時間(小時)流速(英尺3/小時) 12.5 25 50 9011.603.458.3227.6350.320.691.665.53100.160.350.832.76150.110.230.551.84200.080.170.421.38H2O2蒸氣濃度(毫克/升)0.581.152.304.14
采用部分飽和(例如12.5%、25%、50%和90%)是為了防止氣相過氧化氫在可能比用于計算過氧化氫注入速率時所用溫度稍低的表面上，發生所不希望的冷凝作用。可以按下列方式使用表Ⅰ～表Ⅳ中列出的數據。假設空氣流速為10英尺3/小時，則從表Ⅰ得到的30%過氧化氫溶液的最大流速為72.4毫克/分。假定室容積為6英尺3，而且所需的室飽和度為50%，則由表Ⅲ知道，當空氣流速為10英尺3/小時時，需要0.42小時才能使室內達到50%飽和。這種時間期限在步驟80中算出。如果某些參數，例如空氣流溫度Ts和過氧化氫水溶液濃度保持恒定，當然可以制成與表Ⅰ～表Ⅳ類似的表格，并將其存入微處理機存貯器之中。在這種情況下，所說的計算步驟可以簡化為測量空氣流速F和從所貯存的表格中查出適用的值。這種操作方式據認為屬于本領域普通技術人員能力范圍之內的內容，所以進一步對之討論似無必要。
在步驟82，查出使室保持在所需飽和度百分數時所需的時間長度。此時間長度由使用者輸入，而且取決于幾個因素，其中包括欲破壞的有害的有機物性質、所需的有機體若暴露在過氧化氫中所具有的耐受性，預計過氧化氫蒸汽達到盛在有彎曲通路的容器中的所需有機體處花費的時間，或者所估計的過氧化氫蒸汽達到盛在帶過氧化氫過濾器的容器中的所需有機體花費的時間。
已證明，在組織培養物中存在過氧化氫和/或派生出的游離羥基原子團(-OH)會損壞染色單體，見Jones等人的論文“所加的過氧化氫酶對培養的小鼠細胞染色體穩定性和瘤轉移作用的影響”，《大不列顛癌雜志》，52，583-590頁，1985年。本發明的目的是在受控條件下利用極低濃度的過氧化氫蒸汽，以便防止其蒸汽向組織培養物介質中擴散或其蒸氣冷凝后與所研究的介質混合。將過氧化氫蒸氣保持在箱中的時間，僅能保證表面的去污或滅菌。然后，用室內空氣或經滅菌和濕化的空氣把其蒸氣從箱中沖洗出來。如果培養瓶的彎曲通路對過氧化氫蒸氣不能保持適當的阻擋作用，那么就應當使用帶有過氧化氫過濾器或只允許必要的氣體進出該燒瓶的吸附性通路的燒瓶。
用本發明可以使耐過氧化氫的植物細胞消毒或去污，因為能夠利用低濃度氧化劑和低溫度。據估計，大量不同種類的植物細胞可以最終證明是抗過氧化氫蒸氣的。其部分原因是某些植物具有當其細胞與過氧化氫接觸時一般處理過氧化氫的代謝途徑。另外，已知植物細胞具有堅硬細胞壁。最后，如果植物細胞能夠耐受現在用于使之消毒的苛性化學藥品，則可以預期它們定會耐受住消毒所必須的低濃度氣相過氧化氫。
但是，為了小心起見當細胞會暴露在過氧化氫蒸氣中時，如果沒有討論暴露時間的文獻供使用的話，最好對各別的培養物作安全暴露時間的試驗。可以用于確定安全暴露時間的一種方法，將于下面本文的“實驗結果”部分內，試驗8和9中闡明。但是注意到由于只需要低濃度過氧化氫蒸氣來去污或滅菌(0.5-10毫克/升)，而且本發明的去污法是一種低溫方法(室溫至80℃)，所以本發明可以用于很多種或幾乎是很多種活細胞的表面去污或滅菌而對細胞無傷害。
在步驟82查出的時間可以存入微處理機存貯器中或由使用人輸入輸入設備44中。把此時間與使室獲得所需濃度需要的時間相加，并且在步驟84按已知方式將微處理機內的計時器置于此總時間處。
在步驟86由微處理機42把閥32開啟到獲得在步驟78確定的液體過氧化氫流速所必須的位置上。
打開閥門32之后，在步驟88用微處理機監測各種操作參數，以便確保按所需方式實施本方法。這些監測步驟可以包括讀取溫度Tv來保證蒸發柵36保持在適當溫度下，讀取溫度Ts來保證空氣流溫度保持恒定，讀取流速信號F以保證空氣流速不變，或者完成其它任何所需的功能。監測各項功能期間，時爾在判斷步驟90處檢查計時器，以便確定在步驟84預置的時間限是否已過。如果時間限未滿，則微處理機可以繼續監測各項操作參數。如果時間限已過，則在步驟92處關閉閥門32。
當閥門32在步驟92關閉后，在步驟94再置計時器。步驟94輸入計時器的時間限是這樣一段時間，此時泵22是開啟的，但閥門32是關閉的。此時間限應當足夠長到將培養箱10中的氣相過氧化氫沖洗出來，所用過氧化氫蒸氣的暴露濃度低于約1ppm為止。在判斷步驟96，微處理機42確定由計時器計時的時間限是否已滿。當時間限已滿時，在步驟98由微處理機42關閉泵22，此時程序終止。
圖3給出培養箱10中氣相過氧化氫濃度隨時間的變化曲線。假定空氣流速為10英尺3/小時，從表Ⅰ我們知道液體過氧化氫溶液流到蒸發柵上的速度為72.4毫克/分。假定室容積為6英尺3，則由表Ⅲ我們知道在空氣流速為10英尺3/小時下需要0.42小時(25.2分鐘)才能達到所需的50%室飽和度。達到所需的室飽和度后，假定該飽和度下保持20分鐘以確保消毒。然后關閉閥32，同時使泵22保持10分鐘操作，以便從箱中沖洗出氣相過氧化氫。圖3中說明的情況，是反映上述條件的曲線示意圖。
圖3所說明的情況，僅僅是可以實現本發明方法的實際上無數方式中的一種方式。使室內達到所需百分飽和度所需的時間以及在該飽和度下花費的時間，取決于這樣一些因素，例如空氣流速、室大小、防止過氧化氫蒸氣與組織培養物接觸用的裝置以及組織培養物對過氧化氫的耐受量等等。
制作了一個如圖4所示的試驗室100，來試驗本發明效果。在此試驗室中放入兩個75cm2的聚苯乙烯組織培養瓶103(第一只)和104(第二只)，每個瓶有一個傾斜的瓶頸。在此瓶中注入50ml蒸餾水，蓋106和107分別旋緊在103和104瓶頸上，然后反向轉半圈為氣相過氧化氫提供彎曲通路。用微波預熱水至約37℃達10～20秒。
在瓶103中盛有一個蓋好的平皿109和一個敞開的平皿110。在瓶104中同樣盛有一個蓋好的平皿112和一個敞開的平皿113。這些皿是各裝10ml水的5cm直徑玻璃皿。
用15英尺3/小時的氣流處理試驗室，氣流方向由箭頭115表示。使此室保持在大約37℃溫度下，同時使蒸發器在97℃下工作。使用的空氣流溫度為37℃，空氣流速為15英尺3/小時，使用30%過氧化氫溶液，從表Ⅰ我們知道過氧化氫水溶液流速為108.6毫克/分，因而最大氣相過氧化氫濃度為4.6毫克/升。
按下述操作制備孢子取樣管(Bacillus subtilis var.niger)。用美國滅菌劑公司的10038OGL原料(HS群體為6.7×109/ml)制備原料懸浮液的106倍稀釋液，并將此稀釋液在80℃下熱振蕩20分鐘。制備104稀液，然后從每個稀釋液中取出10微升放在分開的具有1cm2面積的一些聚苯乙烯取樣管上。按這種方法準備具有102和104孢子群體的取樣管。使用前將這些取樣管空氣干燥過夜。
在開口平皿109和113中各裝一只有102群體的取樣管和一只具有104群體的取樣管，還有一個縫合環，用以監測循環期內的漂白作用。在蓋好的平皿112和110中以及試驗瓶103和104中，只裝有上面提到過的水。
試驗1在第一個試驗中使用的循環時間為15分鐘。在此15分鐘期間內，用蒸發器產生過氧化氫蒸氣達8分左右。因此，在打開門之前有7分鐘時間向室中通氣。在8分鐘時間期間內有0.53克過氧化氫被送入蒸發器，因此過氧化氫的通入速度為0.53克/8分鐘或66.25毫克/分。此試驗中空氣流內達到的最大過氧化氫蒸氣濃度為2.8毫克/升，雖然多達4.6毫克/升過氧化氫蒸氣可以通入其中而不出現氣相過氧化氫冷凝。因此通入氣相過氧化氫的速率為最大速率的61%。
進行試驗后，分析四個平皿中的兩個平皿內和每個試驗瓶內的水，以確定每個容器中的過氧化氫濃度。利用分光光度法，在525nm吸收峰處測定過氧化氫和二甲酚橙之間的反應，借以確定過氧化氫濃度。測定結果列于下列的表Ⅴ中。
表Ⅴ容器稀釋度 A525 H2O2濃度(毫克/升)燒瓶10310°0.000.00燒瓶10410°0.170.09被蓋皿10910°0.2581.52被蓋皿112 10-10.068 4.00
放在平皿110和113中的具有102孢子群體的取樣管和具有104孢子群體的取樣管均是無菌的。
此試驗結果清楚地證明，燒瓶103和104等密閉燒瓶按本發明方法可以進行外部表面原位滅菌，以便破壞所說燒瓶外表面上的有害細菌。在培養器100的各內表面上作為其中空降污物的有害細菌也被破壞，而對所說燒瓶內的組織培養物無有害影響。
試驗2使用30分鐘循環時間，再次進行上述試驗。在30分鐘循環時間內，蒸發器操作約22分鐘，而其余8分鐘用于通氣。在蒸發器的22分鐘操作時間內輸送了1.29克過氧化氫，輸遠速率為58.64毫克/分，此值為飽和狀態下的最大速率的54%。被各容器中的水吸收的過氧化氫量列于下面的表Ⅵ之中。
表Ⅵ容器稀釋度 A525 H2O2濃度(毫克/升)燒瓶10310°0.0830.46燒瓶10410°0.0360.21密閉皿109 10-10.300 17.6密閉皿112 10-10.227 13.4表Ⅵ清楚地證明，在燒瓶103和104的水內測出的過氧化氫量極小。正如上試驗那樣，全部四個取樣管表明已達到完全滅菌。
試驗3、4和5為了確定在室內使孢子接種過的取樣管滅菌所需的最小接觸時間和測定在組織培養瓶103和104內部溶解在水中的過氧化氫量，完成了另一些試驗。在流速F為15英尺3/小時和空氣流溫度Ts為37℃條件下進行了這些試驗。燒瓶103和104均朝著過氧化氫氣流。下表Ⅶ中列出了三種不同循環時間下的輸送速率。
表Ⅶ循環時間 30%H2O2總溶液輸送量最大H2O2蒸氣量(克)(毫克/分)濃度(毫克/升)15分第8分停0.87108.74.3H2O212分第5分停0.53106.03.7H2O210分第3分停0.2893.32.5H2O2溶解在燒瓶103和104內水中的過氧化氫量匯集于下表Ⅷ之中。
表Ⅷ循環時間燒瓶稀釋度 A525 H2O2濃度(毫克/升)15分10310°0.0990.5915分10410°0.1030.6112分 103 10° 0＊012分10410°0010分10310°0010分10410°00＊全部零吸收實際上是負讀數。
對于各種循環時間和各種燒瓶位置而言，各孢子取樣管(含102和104孢子的群體)均得到消毒。因此，既使循環時間短至10分鐘，只要注入過氧化氫的時間超過3分鐘，而且僅輸送93.3毫克/分的過氧化氫，就可以使燒瓶四周區域完全消毒，同時在燒瓶內被水吸收的過氧化氫量少得不能檢出。
試驗6和7為了確定高達106孢子的孢子群體是否能被破壞，作了另兩個試驗。使用具有上述更高孢子群體的取樣管，按10和15分鐘循環時間重新進行了上述試驗。下表Ⅸ說明了過氧化氫的輸送速率。
表Ⅸ循環時間 30%H2O2使用的溶速率 H2O2蒸氣最大濃液(克)(毫克/分)度(毫克/升)15分第8分停0.7290.03.5H2O210分第3分停0.2996.72.7H2O2在燒瓶103和104內水中溶解的過氧化氫量匯集在下表Ⅹ中。
表Ⅹ循環時間燒瓶稀釋度 A525 H2O2濃度(毫克/升)15分10310°0.0930.5715分10410°0.1901.1610分10310°0010分10410°00
兩種循環時間下，全部孢子取樣管均得到消毒。因此，短至10分鐘(其中注入過氧化氫達3分鐘)的循環時間在所說燒瓶的外部區域得到滅菌，而無可檢出量的過氧化氫被燒瓶內水所吸收。
總之，所完成的這些試驗清楚地證明，本發明方法可以使盛有組織培養物的容器外部、箱的內表面區域和箱內空氣滅菌，而裝有組織培養物的部分打開的燒瓶置于箱內。為了保證完全滅菌而不影響組織培養物，可以控制過氧化氫濃度和循環時間。因此，本發明明顯優于不能完成這種原位滅菌作用的已知技術。
試驗8和9為了確定兩種不同濃度(0.1和10.0毫克/升)過氧化氫的作用效果，對小鼠腹水腫瘤細胞進行了試驗。準備了盛有含106/毫升小鼠腹水腫瘤細胞的RPMI1640介質的六個試管(容積均為4ml)。在500轉/分轉速下將0.1ml所說細胞離心10分鐘。用巴斯德管除去介質，在細胞中加入一滴錐蟲蘭菌株，它只與結合有此菌株的死細胞混合。在37℃下培養的試管中加入上述濃度的過氧化氫水溶液。在培養期間，連續振蕩細胞以便幫助這些細胞處于懸浮狀態，并且每小時除去一些樣品。
將從試樣中取出的一小份濾出的細胞放在血細胞計數器中，隨機計數500個細胞確定每支試管中死亡的細胞數。對照試管也用此方法計數。試驗做雙份。表Ⅺ列出了在不同接觸時間后每支含過氧化氫的試管中之死細胞數以及對照試管中的死細胞數。
表Ⅺ500個總數中的死細胞數(Hrs)接觸時間0.1毫克/升10.0毫克/升對照0--91.54/1021/1429/52.56/730/7010/103.58/10106/2977/54.59/4432/4158/4表Ⅺ清楚地說明，細胞暴露在0.1毫克/升過氧化氫之中后，死細胞數不多于對照試管。反之，細胞暴露在10.0毫克/升過氧化氫中后，明顯出現了大量死細胞。因此，對于這種特定細胞來說，過氧化氫濃度不高于0.1毫克/升時，似乎不會導致組織培養物受破壞。正如表Ⅴ、Ⅷ和Ⅹ所表明的那樣，可以使用足以滅菌但又保持過氧化氫濃度低于所需的0.1毫克/升的各種循環時間和過氧化氫濃度。
以下列出的表Ⅻ和ⅩⅢ說明在組織培養介質中過氧化氫的殘留量。
表Ⅻ培養時間初始濃度為10毫克/升(小時)稀釋度A525濃度(毫克/升)0 10-10.290 11.91 10-10.272 11.13 10-10.227 9.34 10-10.217 8.95 10-10.211 8.6
表ⅩⅢ培養時間初始濃度0.1毫克/升(小時)稀釋度A525濃度(毫克/升)010°0.0440.18110°0.0390.16310°0.0140.06410°0.0110.04510°0.0000.00總之，上述方法可以選擇性破壞預定區域中的有機體。例如，通過在足以達到預定濃度的速率下向預定區域通入氣相過氧化氫，并且通過使該濃度維持達預定時間期間，可使處于組織培養燒瓶外部、培養箱全部內表面和培養箱中空氣空間內的有害有機體得以破壞，而不會傷害盛在燒瓶內的組織培養物。這說明本發明方法明顯優于其中不能完成這種原位滅菌的已有技術。
可以為裝置12編程序，每當門關閉后使之完成去污循環，以便破壞開門時進入的有害有機體，同時確保培養物不污染。或者可以每天在預定時刻，例如清晨時完成去污循環，以便不影響使用所說的培養器。
可以用此方法處理動物細胞，把動物細胞放入帶有彎曲通路或帶有保護瓶口的過氧化氫過濾器的燒瓶之中。此方法也可以用于例如雞蛋等有機體外表面的去污/消毒。此方法還可以用于處理對過氧化氫具有較高耐受性、因此可以直接暴露在其中的植物細胞培養物。除上述使周圍環境消毒的優點之外，按此方式還可以使植物細胞培養物滅菌。
圖5～圖9說明可以用于上述方法的本發明容器210的兩種具體實施方案。圖5和6中繪出的容器包括一個可密閉的部件或瓶212，此部件或瓶有帶有開口216的有螺紋的頸214。此容器還包括蓋狀密閉裝置218，此裝置與瓶212的帶螺紋頸按螺旋方式配合。彎曲通路220處于蓋218和頸214之間，通過此通路氣體可以流入或流出容器210。蓋218也有一個孔222，此孔與頸214的開口216同軸，氣體也流過此孔。放入蓋218中的過濾器224蓋住孔222并且延伸到通路220中，使得氣體流入和流出容器210時必須通過此過濾器224。一個密封環226也置于蓋218中，處于蓋內部和過濾器224之間并圍繞孔222。
圖7～9繪出本發明容器210的第二種具體實施方案。可密封的部件是一個底座230，它有多數個高出的池(示出六個)來盛放培養的組織或細胞。密封裝置是一個具有側邊236和頂部238的蓋子234。在此蓋234頂部238和側邊236的各內角處有數個小薄片240，使蓋234的側邊236與底座230保持一段距離，限定出圍繞容器210周邊的開口242。彎曲通路244是由蓋234和基座230之間的交界所限定的。氣體通過開口242和通路244流入和流出池232。一條帶粘合襯墊的帶子封住開口242，使所有氣體必須通過此過濾器246流入和流出容器210。
過濾器224和246是氣體滲透性的，而且結合有一種使過氧化氫催化降解為水蒸汽和氧的材料。有許多已知材料能促進過氧化氫降解。具體實例有過氧化氫酶、活性炭、各種金屬和金屬合金(如蒙乃爾合金、哈司特鎳合金和鈷)和二氧化錳之類還原劑以及丙酮酸鈉。能使過氧化氫降解為水和氧以及對組織和細胞培養物無有害影響的任何材料均適用。這種材料優先使過氧化氫催化降解為水蒸汽和氧。
表ⅩⅣ給出在使用聚苯乙烯組織培養瓶時，37℃下和50分鐘過氧化氫蒸氣滅菌循環時間下進行一系列試驗得出的結果。
表ⅩⅣ(37℃下，50分鐘氣相H2O2滅菌循環期間內進入各種75cm2聚苯乙烯組織培養瓶中的H2O2量)蓋結構在50ml蒸餾水中的H2O2濃度(毫克/升)無蓋＞200WhatmanNo.2濾紙1.42(在濾紙中為22，000ppm)二層WhatmanNo.2濾紙1.382μm不銹鋼(FRIT)0.90活性炭過濾器0.26擰松半轉的蓋0.16(三個燒瓶的平均值)2μm哈司特鎳合金C(FRIT)0.10二層炭過濾器0.07二層乙酸鈷過濾器0.03擰緊的蓋0.01(三個燒瓶的平均值)二層過氧化氫酶過濾器0.00帶有可滲透氣體并且可降解過氧化氫的過濾器224或246的容器210，在組織或細胞培養期間其內部能夠被過氧化氫蒸氣消毒而不致因暴露在過氧化氫中而損傷活細胞。本發明的過濾器224或246優于吸附過氧化氫的過濾器(例如濾紙)，因為后者可以有可能使氧化劑在時間過后從濾紙向培養介質遷移。存在過濾器224或246并不妨礙在培養期間維持生長介質pH所需的氣體交換。能夠滅菌的可滲透氣體的容器不必在汽相過氧化氫滅菌期間密閉容器，而且也不必在完成滅菌循環后在無菌條件下重新蚩萜饕員閆褰換弧
權利要求
1.有關培養活細胞用容器方面的改進，所說的容器具有氣體流入和流出通路，其改進包括在所說通路中設置一個氣體可滲透的過濾器，使氣體必須經過所說過濾器才能流入和流出所說容器，所說的過濾器結合有一種使過氧化氫降解成水和氧的材料，阻止過氧化氫進入所說容器。
2.權利要求1所述的改進，其中所說的容器具有一個可密封的部件和密封所說可密封部件的裝置，所說的通路是一種在所說可密閉部件和所說密封裝置之間的結合處限定的彎曲通路，而且所說的過濾器是一條有粘著性襯墊的帶子，用于蓋住所說的結合處。
3.權利要求1所述的改進，其中所說的容器具有一個限定所說通路和所說的過濾器的蓋子。
4.一種用于培養活細胞用的容器，其中包括一個盛放活細胞用的可密封的部件，密封所說可密封部件的裝置，氣體流入和流出所說容器的通路，以及一個置于所說通路中的氣體滲透性過濾器，使氣體必須通過所說的過濾器流入和流出所說容器，所說的過濾器中結合有一種使過氧化氫降解成水和氧的材料。
5.權利要求4所述的容器，其中所說的通路是由在所說可密封的部件和所說密封裝置之間的結合處限定的一種彎曲通路。
6.權利要求4所述的容器，其中所說的材料選自由過氧化氫酶、活性炭、蒙乃爾合金、哈司特鎳合金C、丙酮酸鈉和二氧化錳組成的物質組。
7.權利要求4所述的容器，其中所說的材料將氣相過氧化氫催化降解為水蒸汽和氧。
全文摘要
培養活細胞用容器，包括一個可密封的部件或底座，和一個密封可密封部件用的蓋子，一條在可密封部件和蓋的結合處限定的通路以及一個置于通路中的氣體滲透性過濾器。氣體通過過濾器流入和流出所說的容器。氣相過氧化氫被一種結合在過濾器上的材料降解為水蒸汽和氧，以阻止過氧化氫進入所說容器。
文檔編號A61L2/20GK1036404SQ8810917
公開日1989年10月18日 申請日期1988年12月30日 優先權日1987年12月30日
發明者詹姆斯·R·里克洛夫 申請人:美國消毒器公司