專利名稱：使用單克隆抗體減少炎癥部位組織損傷的方法
技術領域：
本發明涉及體內給予對白細胞粘附促進分子特異的單克隆抗體、以減少因炎性白細胞激活所介導的組織損傷的方法。具體地說，本發明是涉及經體內給予可與人或動物源粒細胞和單核吞噬細胞表面決定基結合的選擇性單克隆抗體，從而特異性地抑制某些與心肌血管梗塞過程中組織損傷(但不僅限于此)有關的粘附依賴性白細胞功能，以大幅度減少白細胞對導致人體組織或其他部分損傷之類癥信號的炎性反應。
人或動物循環系統中的外周血主要是由紅細胞和白細胞組成的。一些科研單位已對白細胞的各種功能及其臨床關聯產生了很大興趣。白細胞家族是由嗜中性細胞、單核細胞、嗜曙紅細胞、嗜堿細胞和淋巴細胞組成的。淋巴細胞包括T淋巴細胞和B淋巴細胞兩種類型，它們又各有許多亞群。因嗜中性細胞、嗜曙紅細胞和嗜堿細胞含有胞質顆粒，故統稱為“粒性白細胞”。
鑒于嗜中性細胞、單核細胞、嗜曙紅細胞和嗜堿細胞在人類免疫系統中的主要功能是吞噬或攝入細菌、微生物及其他外來物質，所以又統稱為吞噬細胞。這些細胞由人或動物骨髓中的共同祖細胞產生并循環到外周血中，最后必要時進入組織以控制感染或參予任何類型的炎癥性反應。然而，這些吞噬細胞可作為相關聯的但獨立的系統，又各有其不同的功能。
嗜中性細胞是人和動物外周血中最常見的白細胞。1微升正常人全血平均含有5×103個白細胞，其中包括3075個嗜中性細胞、150個嗜曙紅細胞、25個嗜堿細胞、250個單核細胞以及1500個淋巴細胞。
在粒性白細胞或單核吞噬細胞對各種類型的感染或炎癥反應時，這些細胞首先被激活，移動到對化學吸引因子如某些細菌產物、補體成分及其他因子反應的適當區域。這種吸引過程稱為“趨化性”。一旦進入炎癥或感染區域，這些粒性白細胞和單核吞噬細胞必須確保能牢固地附著在它們的靶部位。為此，這些細胞都具有許多促進這種相互作用的特異性細胞表面受體糖蛋白，如補體、Fc和粘連蛋白受體。
細胞表面受體糖蛋白的一個很重要的家庭是白細胞粘附分子(LEU-CAM)(CD11/CD18)。該家族至少包括三種各有兩個亞單位的細胞表面蛋白。它們有一個共同的分子量為94，000道爾頓的β亞單位，并具有不同的α亞單位。該家族的已知成員包括LFA-1(CD11a/CD18)、Mol(CD11b/CD18)和P150，94(CD11c/CD18)，并已證明它們是分子量分別為180，000、155，000和150，000道爾頓的α亞單位。已經使用單克隆抗體特異地鑒定了這些細胞表面蛋白。已通過鑒定一種其中白細胞遺傳上缺乏這一抗原家族的人類疾病而認識到了該表面糖蛋白家族的生物學重要性(Arnaout，M.A.，Dana，N.，Pitt，J.andTodd，R.F.Ⅲ.，Deficiencyoftwohumanleukocytesurfacemembraneglycoproteins(MolandLFA-1)，Fed.Proc.，44∶2664-2670，1985)。該疾病的特征在于反復發作的嚴重細菌感染以及白細胞吞噬作用、嗜中性細胞在塑料平板上擴散、白細胞聚集作用及趨化性等粘附依賴性功能等的缺陷。
因為Mol糖蛋白具有能夠與一種稱為iC3b的補體成分(其為第三補體成分的片段)結合的特殊結構，故顯示出特殊的重要性(Arnaout，M.A.，Todd，R.F.Ⅲ，Dana，N.，Melamed，J.，Schlossman，S.F.，andColten，H.R.，InhibitionofphagocytosisofcomplementC3orIgG-coatedparticlesandofiC3bbindingbymonoclonalantibodiestoamonocyte-granulocytemembraneglycoprotein(Mol)，J.Clin.Invest.，72∶171-179，1983)。另外，在吞噬細胞的所有粘附依賴性功能上，Mol糖蛋白起到極為重要的作用。已有證據表明不同的單克隆抗體均可抑制Mol糖蛋白的功能。
Mol是一種存在于粒性白細胞、單核吞噬細胞及無表面標志細胞上的細胞表面糖蛋白(Todd，R.F.Ⅲ，Nadler，L.M.and Schlossman，S.F.，Antigens on Human Monocytes，Journal of Immunology，126∶1435-1442，1981)。人體中，Mol分子系由兩個分子量分別為155，000和94，000道爾頓的蛋白質分子經非共價連接而成的(Todd，R.F.Ⅲ，van Agthoven，A.，Schlossman，S.F.and Terhorst，C.，Structural analysis of differentiation antigens，Mol and Mo2 on human monocytes，Hybridoma，1∶329-337(1982))。已證明該復合物可介導細胞與其他粒性白細胞、內皮及惰性基質等各種表面的粘附。這些分子的遺傳缺陷可因粒性白細胞不能介導抗微生物的炎性反應而導致反復發作性細菌感染。缺少這些分子的病人特征是白細胞計數增加(稱為“白細胞增多”)及吞噬細胞功能缺陷，如體外檢測表現為對基質的聚集粘附能力、趨化性及對被調理之顆粒的吞噬能力降低或消失。用可溶性炎癥介質激活粒性白細胞和單核細胞可增加這些分子的表達(Todd，R.F.Ⅲ，Arnaout，M.A.，Rosin，R.E.，Crowley，C.A.，Peters，W.A.and Babior，B.M.，The subcellular localization of Mol(Mol α;formerly gp110)a surface glycoprotein associated with neutrophil adhesion，J.Clin.Invest.74∶1280-1290(1984);Arnaout，M.A.，Hakim，R.M.，Todd，R.F.，Dana，N.and Colten，H.R.，Increased expression of an adhesion-promotion surface glycoprotein in the granulocytopenia of hemodialysis，New Engl.J.Med.，312∶457-462(1985))。針對Mol糖蛋白的單克隆抗體可在體外有效地阻止嗜中性細胞聚集及吞噬作用。在嗜中性細胞介導的肺損傷(急性呼吸窒息綜合癥(ARDS))大鼠肺模型中，抗Mol單克隆抗體能顯著地抑制由激活的人嗜中性細胞引起的肺上皮損傷(Ismail，G.，Morganroth，H.L.，Todd，R.F.Ⅲ.andBoxer，L.A.，Preventionofpulmonaryinjuryinisolatedperfusedratlungsbyactivatedhumanneutrophilspreincubatedwithanti-Molmonoclonalantibody，Blood，69∶1167-1174，(1987))。
雖然白細胞的炎性反應對于清除入侵的微生物具有極為重要的作用，但有充實和令人信服的證據表明，當炎性吞噬細胞在體內被刺激病理過程后所產生的可溶性發炎因子激活時，這些細胞便引起各種器官和組織的損傷(Harlan，J.M.，LeukocyteEndothelialInteractions，Blood，65∶513-525(1985))。激活的嗜中性細胞及單核吞噬細胞在血管內皮細胞上的粘附和擴散以及繼后釋放毒性氧化代謝產物和蛋白酶的過程，參予了見于某些疾病如急性呼吸窒息綜合癥(ARDS;肺休克綜合癥)、腎小球性腎炎的器官損傷以及對局部缺血組織(如心、腸和中樞神經系統)進行再灌注后發生的炎性損傷(Harlan，J.M.，文獻同上)。幾項研究的結果已經證明心肌很容易遭受被激活之白細胞所介導的炎性反應的攻擊。這些研究結果表明，如果在誘發狗的心肌局部缺血并進行再灌注之前用嗜中性細胞特異性抗血清(Romson，J.L.etal.，Reductionoftheextentofischemicmyocardialinjurybyneutrophildepletioninthedog，Circulation，67∶1016-1023(1983)或氮芥(Mullane，K.M.etal.，Roleofleukocytesinacutemyocardialinfarctioninanesthetizeddogs∶Relationshiptomyocardialsalvagebyanti-inflammatorydrugs，J.Pharmacal.Exp.Ther.，228∶510-522(1984))清除體內循環的粒性白細胞，則其心肌梗塞的面積要比具有正常循環嗜中性細胞計數的狗小得多。許多其它的研究表明抑制嗜中性細胞激活的藥劑也可導致心肌梗塞面積的減小。(Romson，J.L.etal.，Theeffectofibuprofenonaccumulationof111-Indiumlabelledplateletsandleukocytesinexperimentalmyocardialinfarction，Circulation，66∶1002-1011(1982);Bednar，M.etal.，Nafazatrom-inducedsalvageofischemicmyocardiuminanesthetizeddogsismediatedthroughinhibitionofneutrophilfunction，Circ.Res，57∶131-141(1985))。
已證明有一種定名為MY904的單克隆抗體具有抑制粘附依賴性功能的能力，但并不影響與iC3b的結合(Dana，N.，Styrt，B.，Griffin，J.D.，Todd，R.F.Ⅲ，Klempner，M.S.，andArnaout，M.A.，TwofunctionaldomainsinthephagocytemembraneglycoproteinMolidentifiedwithmonoclonalantibodies，J.Immunol.，137∶3259-3263(1986))。因此，單克隆抗體MY904與嗜中性細胞的結合可特異地抑制嗜中性細胞向炎癥或感染區域移動。此外，MY904的這種特異性結合可抑制達到這個區域的激活的嗜中性細胞的粘附和擴散，進而阻斷粒性白細胞釋放的毒性物質的有害作用。
本發明的方法是利用MY904單克隆抗體的特異性優點來減少體內損傷。例如在急性冠狀動脈血栓形成過程中，可在恢復流向局部缺血心肌的血流之前體內給予MY904單克隆抗體，以抑制炎性白細胞介導的急性炎性反應。灌注影響外周血或組織中的吞噬細胞群的MY904抗體可抑制或減緩這些炎性細胞向受感染組織內之炎癥部位的移動;另外還可抑制嗜中性細胞在這一區域內的粘附，從而抑制或減小粘附細胞釋放的毒性物質的帶來的潛在的有害作用。例如，已證明這一方法可在心肌血流恢復之后，大大減輕心肌梗塞區域中的組織損傷。
簡單地說，本文將描述顯著地減少由炎性吞噬性白細胞介導之組織損傷(例如，但不僅限于心肌梗塞面積)的方法。可在發生由激活的吞噬性白細胞介導的潛在損傷性炎癥反應之前或其早期，如在心肌梗塞中使用血栓溶解劑或以手術方法恢復心肌血流(其因急性冠狀動脈血栓形成而被阻斷)之前，體內給予單克隆抗體MY904。MY904單克隆抗體可抑制通常能誘導炎癥部位(如在再灌注后伴有組織損傷的心肌局部缺血區域)組織損傷之粒性白細胞和單核吞噬細胞的某些功能。使用MY904單克隆抗體抑制再灌注心肌損傷的實驗表明，在對局部缺血心肌進行再灌注之前體內給予該單克隆抗體可有效地減小預計之心肌梗塞的面積，以致達到一個顯著的百分比率。
以下將通過實施例及相應附圖來描述本發明的優選實施方案
圖1A中圖解顯示了在實施本發明的方法中所獲得的平均動脈血壓(MAP)數據;
圖1B圖解顯示在實施所說的方法中獲得的心率(HR)數據;
圖1C圖解顯示在實施所說的方法中所獲得的左側環曲動脈血流(LCX)數據;
圖1D圖解顯示在實施所說的方法中獲得的心率血壓乘積(RPP)數據;
圖2圖解顯示的數據表明本發明的方法對所產生之心肌梗塞大小的影響;
圖3圖解顯示的數據是作為心電圖ST段抬高范圍的函數以表達梗塞大小;
圖4圖解顯示的數據表明心肌梗塞過程中循環的嗜中性細胞計數。
本發明方法中所使用的單克隆抗體被定名為MY904。其為按照Kohler和Millstein(Nature，256∶495-497(1975))所述的標準方法以免疫的小鼠脾細胞與人慢性粒細胞白血病(CGL)細胞相融合而產生的。用于免疫程序的粒細胞性白血病細胞是由新近診斷患有CGL(作為診斷判定的一部分)的病人體內得到的。經靜脈穿刺采血，并經Ficoll-Hypaque密度梯度離心(1.077g/cc)由粒性白細胞中分離出單核細胞和紅血細胞。單核細胞部分包含未成熟的粒性白細胞及母細胞。這些細胞均冷凍保存，并用10×106個融化的單核細胞經腹腔內注射免疫小鼠，每周一次共免疫四周。融合前三天在小鼠尾靜脈內注入10×106個以相似方法處理的CGL單核細胞。為進行融合，分離小鼠脾臟并制備脾細胞的單細胞懸液。然后在無血清培養基內將脾細胞與NS-1漿細胞瘤細胞系混合，兩者比例是8比1。離心得到細胞沉淀餅，將其懸浮于0.5ml 30%聚乙二醇中并于25℃放置8分鐘，將細胞在無血清培養基中洗一次并用HAT培養基稀釋，然后分配于微量滴定板的小井內。
輸注后14天用免疫熒光篩選法篩選與免疫細胞群體有反應性之產生單克隆抗體的雜交瘤克隆。與CGL細胞及正常人粒性白細胞、單核細胞和大顆粒淋巴細胞部分反應的抗體即鑒定為單克隆抗體MY904。單克隆抗體MY904與所有10個被試病人之90%以上的粒性白細胞反應，但不與T淋巴細胞或B淋巴細胞反應。該單克隆抗體可免疫沉淀一種來自表面標記之正常人粒性白細胞的含兩個亞單位(分子量分別為155，000道爾頓和94，000道爾頓)的糖蛋白(Dana，N.等，TwofunctionaldomainsinthephagocytemembraneglycoproteinMolidentifiedwithmonoclonalantibodies，J.Immunol.，137∶3259-3263，1986)。單克隆抗體MY904的反應性分布以及用該單克隆抗體鑒定之抗原的分子量表明該抗原為CD11b/CD18(“Mol”)糖蛋白。功能研究進一步證明，單克隆抗體MY904并不抑制與iC3b的結合，但為一種粘附依賴性過程(粒性白細胞在塑料平板上擴散及趨化性)的有效抑制物(Dana等，TwofunctionaldomainsinthephagocytemembraneglycoproteinMolidentifiedwithmonoclonalantibodies，J.ofImmunol.，137∶3259-3263，1986)。與其他抗Mol單克隆抗體比較，抗體904是唯一只抑制粘附依賴性功能但不抑制與iC3b結合的抗體。其他被試抗體包括單克隆抗體44、903、94、17、OKM10和Leu-15(Dana等，文獻同上)。
因此，單克隆抗體MY904可鑒定Mol粒性白細胞-單核細胞的細胞表面糖蛋白，并可進一步特異地結合該參予粒性白細胞/單核細胞活性粘附依賴性過程之糖蛋白上的抗原決定基。
能夠產生MY904單克隆抗體的雜交細胞系樣品已寄存于美國典型培養物保藏中心(ATCC)，寄存號為ATCCHB9510。
體外研究表明，人、犬科動物及亞人類靈長目動物白細胞具有共同的Mol糖蛋白(Letvin，N.L.，Todd，R.F.Ⅲ，Palley，L.S.和Griffin，J.D.，Conservationofmyeloidsurfaceantigensonprimategranulocytes，Blood，61∶408-410，1983)。另外，一份研究報告述及狗的白細胞糖蛋白缺陷綜合癥與所見人體者相似(Giger，U.，Boxer，L.A.，Simpson，P.A.，Lucchesi，B.R.和Todd，R.F.Ⅲ，DeficiencyofleukocytesurfaceglycoproteinsMol，LFA-1andLeuM5inadogwithrecurrentbacterialinfection，Ananimalmodel，Blood，69∶1622-1630，1987)。已顯示單克隆抗體MY904能與狗及人白細胞表面糖蛋白的α亞單位(CD11b)結合。而且當體外用佛波醇(phorbol)酯PMA刺激時，MY904單克隆抗體與正常狗嗜中性細胞的結合并不能有效地抑制嗜中性細胞的體外聚集作用(Gigeretal.，文獻同上)。可以相信，使用本發明的方法，對患有吞噬細胞介導之炎性反應-如由心肌局部缺血并進行心肌再灌注后而誘發的這種炎性反應的人或動物，體內給予上述單克隆抗體，將會減小心肌損傷，而這一點正是本發明的方法所獨具的特征。
在一給予MY904抗體以減輕心肌再灌注損傷的實施例中，首先是制備一組23只成年狗的動物模型。對動物進行麻醉后，通過在第5肋間區作左胸廓開口術以暴露心臟并將心臟懸吊于心包懸帶中。用安裝于左環曲冠狀動脈內的標定的電磁流量探子連續記錄血流量。將導管插入主動脈以記錄血壓，插入左頸靜脈以灌注單克隆抗體并用于采集血樣。同時連續記錄標準肢體導程11心電圖。
將環曲冠裝動脈閉鎖90分鐘以造成心肌局部缺血，然后在血管極度狹窄情況下對心肌進行再灌注。這一方法可終止出血性梗塞形成并減少再灌注誘發的心室纖顫。心肌再灌注6小時后對心臟進行電擊除顫并切除之。以心肌梗塞危險區百分比及左心室總面積的百分比來估計梗塞大小。使用Romson等人(Thebeneficialeffectsoforalibuproteinoncoronaryarterythrombosisandmyocardialischemiaintheconsciousdog，J.Pharm.andExp.Therap.，215∶271，1980)所述的組織化學染色技術作體外雙重灌注。用預先經20mM磷酸鉀(pH7.4)緩沖的1.5%氯化三苯基四唑(TPT)溶液灌注裝有套管的環曲冠狀動脈，同時用引入主動脈的伊文思蘭染料灌注冠狀循環的其余部分。于37℃、在100毫米汞柱恒定壓力下灌注5分鐘，兩種溶液均分布于各自的結合部位。然后將心臟切成5或6厘米厚的橫切片并以面積儀測定梗塞大小。這種可行的測量梗塞大小的方法能通過TPT和心肌脫氫酶之間的組織化學反應將可見的和不可見的心肌組織準確劃分開。
使用上述動物模型，研究了兩組狗。一組11只動物作為對照組，接受5%人血清白蛋白(單克隆抗體的載體)。第二組9只動物，接受藥品級單克隆抗體MY904，于誘導心肌局部缺血后(對冠狀動脈血流再灌注之前45分鐘)，經10分鐘以上時間(45分鐘)靜脈內輸注1mg/kg。監測MY904抗體與狗白細胞Mol抗原的結合情況。所用的單克隆抗體MY904系由CoulterImmunologyDivision，CoulterCorporation(Hialeah，Florida)提供。
向狗體內注入MY904抗體后0、85和120分鐘時，分別由實驗動物體內采集4ml靜脈血加于含EDTA的試管內，并以800g離心5分鐘。分離血漿并儲存以備繼后分析殘留單克隆抗體時使用。向細胞沉淀物內加氯化銨以溶解紅細胞，并以免疫熒光染色法分析殘留白細胞上是否先已存在結合的抗Mol抗體。將1-2×106個白細胞在單純緩沖液或含有飽和濃度之小鼠抗Mol抗體的緩沖液中于4℃保溫30分鐘。洗滌細胞并在含有飽和濃度結合了熒光素之羊抗小鼠免疫球蛋白的緩沖液內于4℃繼續保溫30分鐘。使用購自Coulter公司(Hialeah，Florida┑腅PICS C型流動血細胞計數器，于選擇性開通這些髓樣細胞后以流動細胞計數法經測定log前方位角對log直角光散射，來估計體內給予抗Mol抗體或體外暴露于另外的抗Mol抗體后抗體與狗嗜中性細胞及單核細胞的結合。以每測定5000個細胞的熒光強度作為單克隆抗體結合的定量量度單位。
為了證明給予MY904抗Mol單克隆抗體后足以在被治療狗的血漿或血清中產生過量抗Mol抗體，而對血漿(EDTA抗凝血)或血清樣品進行分析。這一分析使用了間接免疫熒光分析法，其中將1×10個Mol陽性試驗細胞、鈣離子載體A23187刺激的人嗜中性細胞在含有狗血漿或血清(1/2、1/4、1/8、1/16稀釋)的緩沖液中于4℃保溫30分鐘。然后洗細胞并在含有飽和濃度熒光素結合之羊抗小鼠免疫球蛋白的緩沖液中于4℃繼續保溫30分鐘。使用EPICS 儀按上述流動血細胞計數法定量分析結合了單克隆抗體的試驗細胞。
為估算心肌組織中嗜中性細胞積聚量，分別由中心梗塞區、危險區內未梗塞組織、梗塞區和危險區之間的心內膜至心外膜邊緣帶、以及正常未梗塞和未著色的心肌各取50-200mg心肌樣品。制備組織勻漿和依照Bradley，P.O.等人(Measurementofcutaneousinflammation∶Estimationofneutrophilcontentwithanenzymemarker，J.Invest.Derm.，78∶206-209，1982)所述方法檢測髓過氧化物酶含量。Bednar，M.等人(Circ.Res.，57∶131-141，1985)、Mullane，K.M.等人(J.PharmacologicalMethods，14∶157-167，1964)已描述了梗塞后心肌組織的髓過氧化物酶含量與嗜中性細胞浸潤之組織學證據之間的相互關聯。
為了獲得對梗塞程度以及心肌內嗜中性細胞積聚量的組織學估計，而由不知道這一特殊治療的有獨立工作資格的研究者用蘇木精和曙紅著染得自各心臟之有代表性的組織學切片并進行判斷。然后整理所獲數據。
為了判斷單克隆抗體對分離的嗜中性細胞之聚集作用的影響，使用Ficoll-hypaque梯度技術由未治療狗的靜脈血中分離嗜中性白細胞用緩沖的氯化銨溶解紅血細胞并以每毫升107個細胞的濃度重新懸浮于Hank氏平衡鹽溶液中。在PAP-3型血小板聚集輪廓記錄器(profiler)(BIO/DATA公司，Horsham，PA)中估計細胞的聚集情況。將嗜中性細胞的樣品與MY904及陰性對照抗體預保溫，然后用125mg/mlPMA激活之。
將所有數據與各自的對照組比較，其中P值小于0.05者被認為是有意義的。
如前面提到的，在估計抗Mol單克隆抗體對區域性心肌缺血并再灌注后所致心肌梗塞面積之影響的研究中，開始時使用了23只狗。23只狗中最后作心肌梗塞面積分析者為16只。其余的有3只狗因從心電圖改變沒有出現心肌缺血的客觀指征而被排除，還有3只未治療的和1只用抗Mol抗體治療的狗因發生心室纖顫而被排除。
實驗過程中定時測定平均動脈血壓(MAP)、心率(HR)、左環曲支(LCX)血流量及心率血壓乘積(RPP;MAPXHR/100)，以確定抗體對這些參數的影響。所得數據分別圖解顯示于圖1A、1B、1C和1D中。兩個治療組在實驗的基線處及每個時間點上均顯示有相似的MAP、HR、RPP和LCX血流量。因此，根據測得的LCX血流量以及所測得的RPP或HR或MAP數值可知，抗體的保護作用并不是由于心臟血液供應的改變，亦不是由于心肌需氧量的改變。
由圖2的數據可以看出給予抗Mol抗體后梗塞大小較對照組減少了46%。相似地，在以占左心室總面積的百分比表示的梗塞范圍中，可以看出用單克隆抗體治療組的梗塞面積要比對照組小得多。左心室發生局部缺血的百分比，即危險區/左心室比例，在各治療組間是相似的。由圖3所示數據可以看出，當以心電圖上ST段抬高程度的函數來表達梗塞大小時，描述各治療組的不同回歸曲線之間有著很好的相互關聯。這些數據提示，在根據ST段升高測得有一給定的心肌缺血嚴重性的情況下，對照組所出現的心肌梗塞范圍要比單克隆抗體治療組大。因此，使用單克隆抗體治療以減小心肌梗塞范圍，與局部缺血的嚴重性無關。
借助免疫熒光分析，所有20個實驗對象之嗜中性白細胞所表達的抗原決定基均可用抗MolMY904單克隆抗體檢測出來。對接受了抗Mol單克隆抗體的9只狗，于給予抗體后不同時間(即給予抗體后40、75和405分鐘)對血清或血漿處理的Mol陽性試驗細胞作免疫熒光染色，以分析血清或血漿是否含有殘余抗Mol抗體。這一實驗表明輸入1mg/kg即可在體內產生過量抗體。發現9只狗中只有6只的白細胞上有可測出的亞飽和量已結合抗體，此可能是由于白細胞在與結合了熒光素的羊抗小鼠免疫球蛋白試劑共同保溫前，抗體即已由膜上解離了下來。
圖4的數據顯示心肌梗塞發生過程中，如在對照組中所見到的，嗜中性白細胞計數一般均有所增加。然而，將兩個組進行比較時則可見用抗Mol抗體治療即抑制了循環嗜中性白細胞計數的這一早期升高。這些數據連同對血液中過量抗體及與白細胞結合之抗體的檢測，進一步證實來自抗體治療組的嗜中性白細胞并沒有從循環中被清除。用抗體處理白細胞所遇到的一個問題是，因為抗體結合到細胞表面而可能使之很快被除去。但這些數據提示，用該抗體處理時并沒有導致循環嗜中性白細胞數目的顯著降低。
在另一項研究中，以完全相同的方式用陰性對照小鼠IgG1單克隆抗體，即與狗白細胞無反應性的單克隆抗體治療第3組5只狗。我們發現于再灌注后所產生的心肌梗塞面積與接受HSA稀釋劑的其他對照組沒有實質性差異。
由我們的方法所獲得的數據表明，使用抗白細胞粘附促進分子Mol的單克隆抗體MY904阻止嗜中性細胞粘附，能降低已明確特征化之心肌梗塞動物模型的再灌注損傷。由本發明方法所得數據顯示，給于抗Mol單克隆抗體MY904能減小心肌梗塞范圍，但這并不是由于減輕了心肌缺血的嚴重性而達到的。因為所有例子中局部缺血的時間都是90分鐘，所以MY904抗體的保護機制很可能是它對嗜中性白細胞粘附作用的影響致使減小了嗜中性細胞介導之局部缺血心肌的損傷。而以前則認為決定心肌梗塞大小的兩個主要因素是局部缺血的嚴重性及缺血的時間長短。
由實施本發明中所獲數據可以認識到，如在區域性心肌缺血的45分鐘之內，給實驗對象使用單克隆抗體MY904，可以顯著減小梗塞面積而且這種作用與局部缺血的嚴重性無關。另外，這些數據還表明，在發生區域性心肌缺血后用抗Mol單克隆抗體MY904抑制白細胞粘附，亦可減輕心肌再灌注損傷(即測得的梗塞面積減小)。與對照組比較，用MY904單克隆抗體治療可使心肌梗塞的范圍減小46%(以所占梗塞形成危險區面積的百分比表示)。
使用本發明的方法治療人冠狀動脈血栓形成的臨床經驗表明，對于發生胸前區疼痛或不適的病人，應在30至60分鐘之內送到醫院急診。應立即檢查病人以根據臨床資料證明急性心肌缺血的發生及冠狀血管閉塞部位，然后給予臨床處置。治療可包括輸注血栓溶解劑(如鏈激酶或組織纖維蛋白溶酶原激活劑(TPA))，用以溶解可能引起急性冠狀血管阻塞的血凝塊。另外就是外科治療，其中是將一氣球導管插入循環系統內并指向血凝塊區域，以排除阻塞。在進行兩種治療中，恰在出現缺血心肌的再灌注(即恢復冠狀動脈血流)之前，給病人靜脈內注射一定量的MY904單克隆抗體。可以靜脈內給予單一劑量或多劑量，以盡可能地減少炎性反應。從而MY904單克隆抗體即以本文所述方式發揮其減少組織損傷(梗塞大小)的作用，而與心肌缺血的嚴重程度無關。輸注MY904單克隆抗體的作用在于其通過抑制不需要的嗜中性細胞功能，以減小心肌再灌注損傷。
當然，在不違背待批權利要求中所述之發明范圍或特征的前提下可以對涉及實踐本發明之方法的若干步驟作某些改動。
權利要求
1.一種減少經歷吞噬細胞介導之炎癥狀態的人或動物體內任何部分炎癥部位發生之組織損傷的方法，所說的方法包括體內給予一種將與粒性白細胞及其吞噬細胞表面上表達之Mo1抗原結合的單克隆抗體，以抑制促成這種損傷之細胞的特異性免疫學炎癥反應功能。
2.根據權利要求1的方法，其中所說細胞的粘附依賴性功能是因結合了所說的單克隆抗體而受到抑制。
3.根據權利要求2的方法，其中所說的單克隆抗體是定名為MY904的單克隆抗體。
4.根據權利要求1的方法，其中所說的單克隆抗體與CD11b上的抗原決定基相結合，所說的CD11b為一種在這類細胞表面上表達之Mol糖蛋白的分子量為155，000道爾頓的肽分子。
5.根據權利要求2的方法，其中所說的炎癥部位位于身體某部分的血管內皮細胞接觸面或亞細胞基質處。
6.根據權利要求2的方法，其中所說的炎癥部位是在身體某部分的內皮組織中。
7.根據權利要求2的方法，其中所說的炎癥部位是在該身體部分的接合處。
8.根據權利要求2的方法，其中所說的炎癥部位是由心肌梗塞狀態而發展的。
9.根據權利要求2的方法，其中在發生所說的炎癥狀態之前或期間，于某一選定的時間經靜脈內給予單克隆抗體。
10.根據權利要求2的方法，其中所說的單克隆抗體并不影響與iC3b的結合。
11.根據權利要求10的方法，其中所說的單克隆抗體與嗜中性細胞的Mol糖蛋白結合。
12.一種減少發生于人體內炎癥部位之組織損傷的方法，所說的方法包括在出現所說的炎癥狀態之前或期間，將一定量能選擇性地與正常情況下表現免疫學炎性反應的吞噬性白細胞之Mol表面抗原上抗原決定基結合的單克隆抗體輸入體內，并抑制針對所說炎癥狀態的免疫學粘附依賴性功能反應。
13.根據權利要求12的方法，其中所說的單克隆抗體為定命為MY904的單克隆抗體。
14.根據權利要求12的方法，其中所說的單克隆抗體可與嗜中性細胞的Mol糖蛋白結合，但不影響與iC3b的結合。
15.一種減少患有急性冠狀動脈血栓形成之病人的心肌炎癥性損傷的方法，所說的病人最好已接受了旨在更新炎癥部位心肌血流的內科或外科治療，所說的方法包括至少在進行這種血流更新之前靜脈內給予一定量能與嗜中性白細胞之Mol表面抗原結合的單克隆抗體，從而抑制所說的部位嗜中性白細胞的粘附依賴性功能，并減小嗜中性白細胞在所說部位的有害作用。
16.根據權利要求15的方法，其中所說的單克隆抗體是MY904單克隆抗體。
17.根據權利要求15的方法，其中所說的單克隆抗體可與CD11b-一種在人和動物嗜中性白細胞上表達的Mol糖蛋白(CD11b/CD18)的155，000道爾頓多肽上的抗原決定基結合，而不影響iC3b結合。
全文摘要
使用單克隆抗體抑制特異性吞噬細胞功能以減小人或其他動物體內組織損傷的方法。選擇可結合于吞噬性白細胞上的單克隆抗體、以抑制細胞向體內炎癥部位移動，并抑制達到這一區域之激活的白細胞的粘附和擴散，進而阻止這些細胞釋放毒性物質。可在導致損傷性炎性反應的病理過程(如因急性冠狀動脈血栓形成所致心肌血流中斷的恢復過程)之前或早期體內給予單克隆抗體。
文檔編號A61KGK1033242SQ8810347
公開日1989年6月7日 申請日期1988年6月10日 優先權日1987年6月11日
發明者羅伯特·F·托德, 保羅·J·辛普生, 斯圖爾特·F·斯科洛斯曼, 本尼迪克特·R·露斯凱西, 杰姆斯·D·格里芬 申請人:密執安大學, 達娜—法勃腫瘤學會